|
Стр. 9
полярографировании, мм;
V - объем испытуемого раствора, приготовленного из озоленной
1
навески, куб. см;
V - объем испытуемого раствора после внесения добавки, куб.
2
см;
М - масса навески БАД, взятая для озоления, г;
V - объем БАД, взятый для озоления, куб. см;
Х - масса свинца в контрольном растворе, мкг.
к
Вычисление производят до четвертого десятичного знака.
За окончательный результат принимают среднее арифметическое (X)
результатов двух параллельных определений.
Метрологические характеристики
Относительное допустимое расхождение между результатами двух
параллельные определений, выполненных в одной лаборатории, по
отношению к среднему арифметическому значению (Rr) и относительное
допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в
двух разных лабораториях, по отношению к среднему арифметическому
значению (RR) приведены в табл. 33.
Таблица 33
ОТНОСИТЕЛЬНЫЕ ДОПУСТИМЫЕ ВНУТРИЛАБОРАТОРНЫЕ (Rr)
И МЕЖЛАБОРАТОРНЫЕ (RR) РАСХОЖДЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
---------------------------------------------------------T------T------¬
¦ Показатель ¦Свинец¦Кадмий¦
+--------------------------------------------------------+------+------+
¦Относительная внутрилабораторная сходимость Rr, % ¦ 30 ¦ 30 ¦
+--------------------------------------------------------+------+------+
¦Относительное межлабораторное расхождение RR, % ¦ 60 ¦ ¦
L--------------------------------------------------------+------+-------
III. Методы определения микроэлементов
1. Определение йода титрометрическим методом
Принцип метода
Метод основан на взаимодействии йодата калия с йодидом калия в
кислой среде (1) и титровании выделившегося йода тиосульфатом
натрия (2).
(1) IO3- + 5I- + 6Н + (3I2 + 3H2O (из соли) (из KI) (из H2SO4)
(2) 2Na2S2O3 + I2 (2NaI + Na2S4O6 (тиосульфат (йодат
(тетратионат натрия) натрия) натрия)
Специфические аппаратура, материалы и реактивы
1. Калий йодистый (KI) по ГОСТ 4232-74.
2. Кислота серная (H2SO4) по ГОСТ 4204-77.
3. Натрий серноватистокислый пятиводный (тиосульфат натрия,
Na2S2O3(5H2O) по ГОСТ 27068-86 или фиксанал 0,1 г-экв.
4. Крахмал растворимый по ГОСТ 10163-76.
5. Натрия хлорид, ЧДА, ГОСТ 4233-77.
Приготовление реактивов
0,005 М тиосульфат натрия (Na2S2O3(5H2O)). 1,24 г Na2S2O3(5H2O)
развести в 1000 куб. см дистиллированной свежепрокипяченной воды.
Т.к. кристаллический тиосульфат при хранении набирает влагу, что
требует введения поправки на его титр, то в случае возникновения
сомнений рекомендуется использовать фиксанал Na2S2O3(5H2O) 0,1 г -
эквивалент, который растворяют в дистиллированной воде, доводя
конечный объем до 1000 куб. см, и полученный раствор разводят в 20
раз (50 куб. см раствора + 950 куб. см воды) до конечной
концентрации 0,005 М.
Полученный раствор хранят в прохладном темном месте. Его объем
достаточен для анализа 100-200 проб в зависимости от содержания в
них йода. При соблюдении условий хранения раствор стабилен не
менее одного месяца.
2 Н серная кислота (H2SO4). 6 куб. см концентрированной H2SO4
медленно доливают в 90 куб. см воды, затем доводят раствор водой
до конечного объема 100 куб. см. Полученное количество достаточно
для анализа 100 проб. Раствор сохраняет свои свойства
неопределенно долгое время.
Примечание. Во всех случаях кислоту надо наливать в воду, а не
наоборот, во избежание чрезмерного повышения температуры смеси и
разбрызгивания кислоты. Во время добавления кислоты раствор
следует непрерывно перемешивать.
10%-ный йодид калия (KI) свежеприготовленный. 10 г KI
растворяют в 100 куб. см воды. Хранят в прохладном темном месте.
Его количества достаточно для анализа 20 проб.
Насыщенный раствор хлорида натрия (NaCl). В колбу объемом 250
куб. см с 80 куб. см воды постепенно добавляют при перемешивании
и/или нагревании NaCl до тех пор, пока не прекратится его
растворение. Хранят под пробкой. Раствор сохраняет свои свойства
по крайней мере в течение года.
Индикаторный раствор крахмала. В колбу объемом 250 куб. см
вносят 1 г растворимого крахмала, добавляют 10 куб. см воды и
нагревают до растворения крахмала. В полученную горячую смесь
добавляют 90 куб. см насыщенного раствора NaCl и перемешивают.
Полученного объема достаточно для анализа 50 проб. Готовый раствор
хранят в прохладном темном месте. Раствор остается стабильным на
протяжении месяца.
Примечание. В день проведения анализа раствор необходимо
прогреть (но не кипятить) для ресуспендирования возможного осадка.
Проведение анализа
Этап 1. Навеску исследуемой пробы массой 10 г растворяют в 100
куб. см дистиллированной воды в конической колбе объемом 250 куб.
см. Если полученный раствор мутный, его необходимо профильтровать.
Этап 2. К полученному раствору добавляют 1 куб. см 2 н. H2SO4,
перемешивают, добавляют 5 куб. см 10%-ного раствора KI,
перемешивают, закрывают колбу пробкой и помещают на 10 мин. в
темное место.
Этап 3. К исследуемому раствору, приобретшему темно-желтую
окраску, добавляют из бюретки при перемешивании 0,005 М Na2S2O3 до
перехода окраски в светло-желтую. Добавляют в исследуемый раствор
примерно 2 куб. см индикаторного раствора крахмала, от чего смесь
должна приобрести темно-синюю окраску, и продолжают титрование до
тех пор, пока последняя не исчезнет.
Отмечают объем раствора тиосульфата, пошедший на титрование.
Требования к безопасности:
- до начала титрования реакционную смесь следует хранить в
темном месте ввиду возможности побочного процесса под воздействием
света, который вызывает окисление ионов йодида до йода;
- при использовании не вполне остывшего раствора крахмала
точность определений понижается;
- если индикаторный раствор добавлен слишком рано, происходит
образование прочного, очень медленно реагирующего комплекса йода с
крахмалом, что приводит к завышению результатов анализа;
- реакция должна проходить при умеренной комнатной температуре
(ниже 30 град. C), поскольку йод характеризуется повышенной
летучестью, а индикаторный раствор при нагревании теряет
чувствительность.
Обработка результатов
Количество йода, мг/кг, исследуемой соли вычисляют по формуле:
X = V x 0,1057 x 100 / 10 = V x 10,57,
где:
V - объем 0,005 М Na2S2O3, пошедший на титрование, куб. см;
10 - навеска соли, взятой на анализ, г;
100 - пересчет на 100 г соли;
0,1057 - количество йода из йодата калия исследуемого образца
соли, соответствующее 1 куб. см пошедшего на титрование этого
образца 0,005 М Na2S2O3.
Примечание. Из уравнений реакций (1) и (2), лежащих в основе
данного метода определения йода в соли, обогащенной КIO3, следует,
что из общего количества йода, оттитровываемого тиосульфатом
натрия в исследуемой пробе, на долю йода, происходящего из КIO3,
приходится 1/6 часть, т.е. не 0,6345, а 0,1057 мг.
2. Определение селена спектрофлуориметрическим методом
Принцип метода
Метод основан на флуориметрическом определении комплекса
селенистой кислоты с 2,3-диаминонафталином - пиазоселенола,
получаемого при мокром сжигании образца смесью азотной и хлорной
кислот, с последующим восстановлением соляной кислотой
шестивалентного селена до четырехвалентного и образованием
комплекса с 2,3-диаминонафталином.
Подготовка к испытанию
Рабочие растворы
0,1 М раствор соляной кислоты: 1 куб. см 36% HCl разбавляют до
100 куб. см водой.
0,6 М раствор соляной кислоты: 51 куб. см 36% HCl разбавляют до
100 куб. см водой.
Раствор аммиака: 25% раствор аммиака разбавляют водой (1:1).
Раствор тетранатриевой соли этилендиамин тетрауксусной кислоты
(ЭДТА): 1,25 г ЭДТА растворяют в 100 куб. см воды.
Раствор 2,3-диаминонафталина (ДАН) готовят в день определения:
0,1 г ДАН растворяют в 100 куб. см 0,1 М соляной кислоты при
слабом нагревании. Раствор трижды экстрагируют гексаном, фильтруют
через складчатый фильтр и хранят под слоем гексана в темноте при
температуре 0-4 град. C до момента флуориметрического определения.
Не допускается облучение прямым светом и использование смазки для
шлифов.
Основной стандартный раствор, содержащий 1 мкМ селена/куб. см:
0,01729 г Na2SeO3 растворяют в небольшом количестве 0,1 М соляной
кислоты в мерной колбе на 100 куб. см, доводят объем до метки
соляной кислотой этой же концентрации. Раствор хранят в темноте не
более 1 месяца.
Рабочий стандартный раствор, содержащий 1 нМ селена/куб. см:
пипеткой вносят 5 куб. см основного стандартного раствора в мерную
колбу на 500 куб. см и доводят объем до метки 0,1 М соляной
кислотой. Раствор хранят в темноте не более 1 месяца.
Мокрое сжигание. Взвешивают и переносят в пробирки для сжигания
от 50 до 100 мг БАД и соответствующий образец сравнения. Для
построения калибровочного графика в 7 пробирок вносят: 0
(контроль): 0,1; 0,2; 0,4; 0,5; 0,6 мл стандартного рабочего
раствора, что соответствует 0; 0,1; 0,2; 0,4; 0,5; 0,6 нМ селена в
пробе. Во все пробирки добавляют 1,5 мл смеси, содержащей азотную
и хлорную (42%-ные) кислоты в соотношении 1:0,7, и оставляют при
комнатной температуре на 12-18 час., затем пробирки помещают в
блок для сжигания и минерализуют при 120 град. C - 1 час, 150
град. C - 1 час, 180-185 град. C - 1,5 часа. При наличии
обугливания сжигание повторяют с новой навеской, увеличив
количество хлорной кислоты до 1,0-1,4 куб. см.
Удаление следов азотной кислоты
Блок сжигания охлаждают до 150 град. C, добавляют к пробам 1-2
капли перекиси водорода и выдерживают при указанной температуре в
течение 10 мин. Затем пробы сразу же вынимают из блока сжигания.
Восстановление селената
К пробам добавляют по 1 куб. см 6 М соляной кислоты и
выдерживают при 110 град. C в течение 10 мин. Затем сразу же
вынимают из блока сжигания и добавляют 1 куб. см дистиллированной
воды.
Конденсация селенистой кислоты с ДАН
В каждую пробирку добавляют по 0,5 куб. см раствора ЭДТА и по 1
куб. см раствора аммиака, быстро доводят pH до 1-2 по
универсальному индикатору, добавляя при необходимости по каплям
раствор аммиака или 0,1 М соляную кислоту. К полученным растворам
приливают по 1 куб. см раствора ДАН и выдерживают 30 мин. при 50-
55 град. C, закрыв предварительно пробирки от прямого света. По
окончании реакции пробы охлаждают до комн. температуры и каждую
интенсивно встряхивают с 2,5 куб. см гексана в течение 50-60 сек.
Спектрофлуориметрический анализ
Определение интенсивности флуоресценции осуществляют при длине
волны возбуждающего света 376 нм и эмиссионного света 519 нм.
Дополнительный контроль за полнотой сжигания осуществляют по
спектрам флуоресценции в диапазоне 450-600 нм. Полученный спектр
должен иметь один максимум 519 нм.
Обработка результатов
Содержание селена, мкг/кг или мкг/л (X), вычисляют по формуле:
X = 79 х С / a,
где:
С - количество селена, нМ, в пробе, определенное по
калибровочному графику;
79 - атомная масса селена;
а - навеска образца, г или куб. см.
За окончательный результат принимается среднее арифметическое
двух параллельных определений.
Метрологические характеристики
Относительное стандартное отклонение в интервале 1-600 мкг/кг -
не более 10%.
3. Определение токсичных элементов
Анализируют согласно методам главы 2, раздела II и согласно
нормативным документам "Сырье и продукты пищевые. Подготовка проб.
Минерализация для определения содержания токсичных элементов",
межгосударственному стандарту ГОСТ 26929-94, ГОСТ 26927-86 "Сырье
и продукты пищевые. Атомно-абсорбционный метод определения
токсичных элементов", межгосударственному стандарту ГОСТ 30178-96
"Методические указания по обнаружению и определению общей ртути в
пищевых продуктах методом беспламенной атомной абсорбции N 5178-
90", ГОСТ 26930-86 "Сырье и продукты пищевые. Метод определения
мышьяка".
Глава 3. МИНОРНЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ БАД
(МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОДЛИННОСТИ БАД)
1. Определение антоцианинов
Антоцианины являются водорастворимыми пигментами,
обусловливающими красную, синюю и фиолетовую окраску фруктов. Они
относятся к классу флавоноидов и представляют собой гликозиды
катиона флавония (рис. 1) <*>.
------------------------------------
<*> Рисунки не приводятся.
----------------T----------------T------------------T------------¬
¦ R1 ¦ R2 ¦ Агликон ¦Сокращенное ¦
¦ ¦ ¦ ¦ название ¦
+---------------+----------------+------------------+------------+
¦ Н ¦ Н ¦ пеларгонидин ¦ Pgd ¦
+---------------+----------------+------------------+------------+
¦ ОH ¦ Н ¦ цианидин ¦ Cyd ¦
+---------------+----------------+------------------+------------+
¦ ОМе ¦ Н ¦ пеонидин ¦ Pnd ¦
+---------------+----------------+------------------+------------+
¦ ОН ¦ ОН ¦ дельфинидин ¦ Dpd ¦
+---------------+----------------+------------------+------------+
¦ ОМе ¦ ОН ¦ петунидин ¦ Ptd ¦
+---------------+----------------+------------------+------------+
¦ ОМе ¦ ОМе ¦ мальвидин ¦ Mvd ¦
+---------------+----------------+------------------+------------+
¦R3 и R4 - Н или гликозид ¦
L-----------------------------------------------------------------
1.1. Методика определения качественного
и количественного состава антоцианиновых
пигментов с помощью ВЭЖХ
Образцы БАД с антоцианинсодержащими компонентами (экстракты
черники, красного винограда и т.д.) экстрагируют дистиллированной
водой; образцы соковых концентратов или сиропов разбавляют
дистиллированной водой таким образом, чтобы суммарная концентрация
антоцианинов составляла 0,05-0,2 мг в куб. см. Пробы фильтруют
через мембранный фильтр Zetapor с диаметром пор 0,2 мкм.
Разделение проводят на хроматографической колонке PLRP-S
(полистирол-дивинилбензол) (PolymerLabs, Великобритания), 100
ангстрем, 5 мкм, 250х4,6 ID мм, элюент: 4 об. % ортофосфорная
кислота, ацетонитрил, 90:10 об. %, скорость подачи элюента 1,0
куб. см/мин. Детектирование фотометрическое, лямбда = 520 нм.
Идентификацию пиков проводят путем сравнения с хроматограммами
ягод с известным составом антоцианиновых пигментов и с
литературными данными. Относительное содержание индивидуальных
пигментов определяют как отношение площади хроматографического
пика и суммы площадей пиков всех идентифицированных антоцианинов.
Факторы удерживания антоцианинов приведены в табл. 34.
Таблица 34
ФАКТОРЫ УДЕРЖИВАНИЯ АНТОЦИАНИНОВЫХ ПИГМЕНТОВ
----T------------------------------------------------T-----------¬
¦ N ¦ Антоцианины ¦ k ¦
+---+---------------T--------------------------------+-----------+
¦1. ¦Cyd-3-sop-5-glu¦цианидин-3-софорозид-5-глюкозид ¦ 1,9 ¦
¦2. ¦Dpd-3-gal ¦дельфинидин-3-галактозид ¦ 3,0 ¦
¦3. ¦Dpd-3-glu ¦дельфинидин-3-глюкозид ¦ 3,6 ¦
¦4. ¦Cyd-3-sop ¦цианидин-3-софорозид ¦ 3,9 ¦
¦5. ¦Cyd-3-glu-rut ¦цианидин-3-глюкорутинозид ¦ 4,0 ¦
¦6. ¦Dpd-3-rut ¦дельфинидин-3-рутинозид ¦ 4,2 ¦
¦7. ¦Cyd-3-gal ¦цианидин-3-галактозид ¦ 5,2 ¦
¦8. ¦Dpd-3-аrа ¦дельфинидин-3-арабинозид ¦ 5,5 ¦
¦9. ¦Cyd-3-glu ¦цианидин-3-глюкозид ¦ 5,9 ¦
¦10.¦Cyd-3-xyl-rut ¦цианидин-3-ксилозорутинозид ¦ 6,1 ¦
¦11.¦Cyd-3-rut ¦цианидин-3-рутинозид ¦ 7,0 ¦
¦12.¦Ptd-3-gal ¦петунидин-3-галактозид ¦ 7,5 ¦
¦13.¦Cyd-3-ara ¦цианидин-3-арабинозид ¦ 7,9 ¦
¦14.¦Ptd-3-glu ¦петунидин-3-глюкозид ¦ 8,4 ¦
¦15.¦Pgd-3-glu ¦пеларгонидин-3-глюкозид ¦ 9,6 ¦
¦16.¦Pnd-3-gal ¦пеонидин-3-галактозид ¦ 10,0 ¦
¦17.¦Pgd-3-аrа ¦пеларгонидин-3-арабинозид ¦ 11,9 ¦
¦18.¦Pnd-3-glu ¦пеонидин-3-глюкозид ¦ 12,3 ¦
¦19.¦Mvd-3-glu ¦мальвидин-3-глюкозид ¦ 16,1 ¦
¦20.¦Pnd-3-аrа ¦пеонидин-3-арабинозид ¦ 16,2 ¦
L---+---------------+--------------------------------+------------
На рис. 2 приведена хроматограмма антоцианинов сока черники,
для которой характерен самый богатый профиль пигментов.
Систематизированные литературные и экспериментальные данные по
составу антоцианиновых пигментов окрашенных соков представлены в
табл. 35, являются основой при оценке подлинности и качества
соков, сокосодержащей продукции и БАД.
Таблица 35
----------T---------------------------------------------------------------------------------------------------¬
¦ Сок ¦ Относительное содержание антоцианинов, % ¦
¦ +----T----T----T----T----T----T----T----T----T----T----T----T----T----T----T----T----T----T----T----+
¦ ¦Cyd-¦Dpd-¦Dpd-¦Cyd-¦Cyd-¦Dpd-¦Cyd-¦Dpd-¦Cyd-¦Cyd-¦Cyd-¦Ptd-¦Cyd-¦Ptd-¦Pgd-¦Pnd-¦Pgd-¦Pnd-¦Mvd-¦Pnd-¦
¦ ¦3- ¦3- ¦3- ¦3- ¦3- ¦3- ¦3- ¦3- ¦3- ¦3- ¦3- ¦3- ¦3- ¦3- ¦3- ¦3- ¦3- ¦3- ¦3- ¦3- ¦
¦ ¦sop-¦gal ¦glu ¦sop ¦glu-¦rut ¦gal ¦ara ¦glu ¦xyl-¦rut ¦gal ¦ara ¦glu ¦glu ¦gal ¦ara ¦glu ¦glu ¦ara ¦
¦ ¦5- ¦ ¦ ¦ ¦rut ¦ ¦ ¦ ¦ ¦rat ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦glu ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+---------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+
¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦ 7 ¦ 8 ¦ 9 ¦ 10 ¦ 11 ¦ 12 ¦ 13 ¦ 14 ¦ 15 ¦ 16 ¦ 17 ¦ 18 ¦ 19 ¦ 20 ¦ 21 ¦
+---------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+
¦Гранат ¦30 ¦24 ¦ ¦21 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦25 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+---------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+
¦Черника ¦ ¦10 ¦14 ¦ ¦ ¦ ¦8 ¦9 ¦18 ¦ ¦ ¦10 ¦9 ¦3 ¦ ¦ ¦ ¦8 ¦10 ¦ ¦
+---------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+
¦Красный ¦ ¦ ¦22 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦3-2 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦20- ¦ ¦ ¦ ¦4-5 ¦52- ¦ ¦
¦виноград ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦22 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦38 ¦ ¦
+---------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+
¦Черная ¦ ¦ ¦18 ¦ ¦ ¦44 ¦ ¦ ¦6 ¦ ¦32 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦смородина¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+---------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+
¦Красная ¦ ¦ ¦ ¦1 ¦12 ¦ ¦ ¦ ¦1 ¦70 ¦10 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦смородина¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+---------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+
¦Слива ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦53 ¦ ¦47 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+---------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+
¦Клюква ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦16 ¦ ¦4 ¦ ¦ ¦ ¦20 ¦ ¦ ¦33 ¦ ¦10 ¦ ¦17 ¦
+---------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+
¦Клубника ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦2 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦92 ¦ ¦6 ¦ ¦ ¦ ¦
+---------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+
¦Черешня ¦ ¦ ¦ ¦15 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦45 ¦ ¦40 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+---------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+
¦Вишня ¦ ¦ ¦ ¦2 ¦74 ¦ ¦ ¦ ¦4 ¦ ¦20 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+---------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+
¦Малина ¦ ¦ ¦ ¦25 ¦6 ¦ ¦ ¦ ¦39 ¦ ¦6 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+---------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+
¦Ежевика ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦94 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦1 ¦ ¦ ¦
+---------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+
¦Брусника ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦83 ¦ ¦5 ¦ ¦ ¦ ¦12 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+---------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+
¦Арония ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦60 ¦ ¦2 ¦ ¦ ¦ ¦32 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦3 ¦ ¦ ¦
+---------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+
¦Крыжовник¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦4 ¦ ¦ ¦14 ¦ ¦80 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦черный ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+---------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+
¦Калина ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦98 ¦2 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+---------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+
¦Ирга ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦75 ¦ ¦17 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦8 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
L---------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+-----
1.2. Суммарное содержание антоцианиновых пигментов
Суммарное содержание антоцианиновых пигментов определяли
методом pH-дифференциальной спектрофотометрии. Известно, что
поглощение антоцианиновых пигментов сильно зависит от pH раствора:
в сильнокислой среде окраска большинства антоцианинов ярко-
красная, при увеличении pH она постепенно переходит в темно-синюю.
Это связано с изменением структуры входящего в состав пигмента
агликона. Различие в адсорбции при лямбда = 510 нм и pH 1 и 4,5
пропорционально содержанию антоцианина. Так как различие в
величинах молярной адсорбции индивидуальных антоцианинов
незначительно, суммарную концентрацию пигментов можно определять
относительно одного из них, например цианидин-3-глюкозида (эпсилон
= 26900):
A = (A - A ) - (A - A ) ,
510nm 700nm pH1,0 510nm 700nm pH4,5
A x MW x F x V
C (СИГМА ) = --------------- x 100%,
антоционин, масс. % эпсилон х l x m
где:
A - поглощение;
эпсилон и MW - коэффициент молярного поглощения и молекулярная
масса антоцианина, используемого в качестве стандарта (для
цианидин-3-глюкозида 26900 и 449,2 соответственно);
AF - разведение;
AV - объем, мл;
Al - длина кюветы, см;
m - масса образца, мг.
Метрологическая характеристика метода
Предел обнаружения метода 0,001%. Стандартное отклонение
сходимости (Sr) не превышает 0,1-0,15. Среднее значение
открываемости - 92-95%.
Систематизированные литературные и экспериментальные данные по
составу антоцианиновых пигментов окрашенных соков представлены в
табл. 35, являются основой при оценке подлинности и качества
соков, сокосодержащей продукции и БАД.
2. Определение органических кислот с помощью ВЭЖХ
Принцип метода
Органические кислоты определяют в условиях обращеннофазной
высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ). Разделение
органических кислот происходит в хроматографической колонке,
наполненной октадецилсиликагелем. Концентрации определяют с
помощью спектрофотометрического детектора при лямбда = 210 нм по
методу внешнего стандарта.
Приборы и реагенты
Хроматографическая система: насос высокого давления Altex 110A
(США), инжектор Rheodyne 7125 (США), колонка Kromasil C18, 5 мкм,
250 x 4,6 ID мм (MetaChem, США), спектрофотометрический детектор
Spectroflow 757 (Kratos, США), система для обработки
хроматографических данных МультиХром,1,5х (Амперсенд, Россия).
Подвижная фаза: 0,2 М фосфатный буфер, pH 2,6. Объемная
скорость: 1,0 куб. см/мин. Перед использованием подвижную фазу
фильтруют через нейлоновый фильтр (диаметр пор 0,45 мю м) или
бумажный фильтр ("синяя лента").
Реагенты: калия дигидрофосфат (КН2РО4), фосфорная кислота
(Н3РО4, 85%), ацетонитрил (CH3CN), дистиллированная вода.
Приготовление проб и стандартов
Стандартные растворы кислот готовят путем растворения точных
навесок соответствующих кислот (purum, >= 99%, Fluka или Sigma) в
мерных колбах. Градуировочные графики строят в координатах S
(площадь пика) - С (концентрация кислоты), г/куб. дм, в интервале
концентраций: 0,1-30 г/куб. дм для яблочной кислоты, 0,1-40 г/куб.
дм для лимонной кислоты, 0,1-1 г/куб. дм для аскорбиновой кислоты,
0,05-0,5 г/куб. дм для изолимонной кислоты, 0,01-0,1 г/куб. дм для
фумаровой кислоты. Растворы фильтруют через нейлоновый фильтр
(диаметр пор 0,45 мкм) или бумажный фильтр ("синяя лента").
Пробы готовят растворением сухих или разбавлением жидких
концентратов БАД в 10-25 раз дистиллированной водой.
Приготовленные растворы фильтруют через нейлоновый фильтр (диаметр
пор 0,45 мкм) или бумажный фильтр ("синяя лента").
ВЭЖХ определение органических кислот
Перед проведением анализа хроматографическую колонку
кондиционируют подвижной фазой ацетонитрил - вода (70:30 об. %),
затем систему промывают фосфатным буфером до установления ровной
базовой линии. Стандартные растворы (5-20 мкл) вводят в
хроматограф попеременно через каждые 2-3 пробы (10 мкл). Порядок
элюирования органических кислот в условиях ОФ ВЭЖХ следующий:
Винная < хинная < янтарная < гидроксилимонная < яблочная <
изолимонная < шикимовая < аскорбиновая < фумаровая < лимонная.
Коэффициенты емкости основных органических кислот, определяемых
в БАД на основе фруктов и ягод, представлены в табл. 36.
Таблица 36
----------------------------------------T------------------------¬
¦ Кислота ¦ k' ¦
+---------------------------------------+------------------------+
¦Винная ¦ 0,4 ¦
+---------------------------------------+------------------------+
¦Хинная ¦ 0,6 ¦
+---------------------------------------+------------------------+
¦Янтарная ¦ 0,8 ¦
+---------------------------------------+------------------------+
¦Гидроксилимонная ¦ 1,1 ¦
+---------------------------------------+------------------------+
¦Яблочная ¦ 1,2 ¦
+---------------------------------------+------------------------+
¦Изолимонная ¦ 1,4 ¦
+---------------------------------------+------------------------+
¦Шикимовая ¦ 1,5 ¦
+---------------------------------------+------------------------+
¦Аскорбиновая ¦ 1,8 ¦
+---------------------------------------+------------------------+
¦Фумаровая ¦ 3,9 ¦
+---------------------------------------+------------------------+
¦Лимонная ¦ 4,4 ¦
L---------------------------------------+-------------------------
Концентрации органических кислот в пробах рассчитываются по
площадям или высотам хроматографических пиков.
Примеры хроматограмм органических кислот апельсина и клюквы
приведены на рис. 3 и 4.
3. Определение 5-оксиметилфурфурола в БАД
на основе меда и углеводных сиропов
Принцип метода
Метод определения массовой концентрации 5-оксиметилфурфурола в
соках, напитках и меде основан на применении высокоэффективной
жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Метод включает следующие этапы:
- разбавление аликвоты или навески жидкого БАД дистиллированной
водой; растворение навески меда или медосодержащего БАД в
дистиллированной воде;
- фильтрование полученного раствора;
- обнаружение и количественное определение ОМФ с помощью ВЭЖХ с
УФ-детектором с использованием метода внешнего стандарта.
Средства измерений, вспомогательное оборудование,
материалы и реактивы
Жидкостной хроматограф с насосом высокого давления с подачей
растворителя от 0,1 до 5,0 куб. см/мин., оборудованный
спектрофотометрическим детектором с переменной длиной волны и
системой для сбора и обработки хроматографических данных
МультиХром, версия 1,5х (Амперсенд, Россия).
Колонка и предколонка хроматографические с силикагелем,
химически связанным с октадецилсиланом (силикагель С18), с
размером частиц 5 мкм; длина колонки - 25 см, предколонки - 4,5
см, внутренний диаметр колонок - 0,46 см.
Микрошприцы МШ-10 и МШ-25 для жидкостной хроматографии.
Спектрофотометр СФ-26, СФ-46 или подобный, позволяющий
проводить измерения при длинах волн 200-350 нм, с допустимой
абсолютной погрешностью измерений коэффициента пропускания не
более 1%.
Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С, ТУ 64-1-2451-78.
Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим
пределом взвешивания 200 г и погрешностью +/- 0,0001 г.
Весы лабораторные с наибольшим пределом взвешивания до 200 г, с
пределом допустимой погрешности +/- 0,0005 г по ГОСТ 2404-80.
Дистиллятор.
Колбы мерные наливные 2-50-2, 2-100-2, 2-250-2, 1-1000-2 по
ГОСТ 1770.
Пипетки 4-1-2 или 5-1-2, 4-2-10 или 5-2-10, 4-2-25 или 5-2-25
по ГОСТ 29227.
Термометр жидкостный стеклянный с пределами измерения 0-100
град. C и ценой деления 1 град. C по ГОСТ 28498.
Ацетонитрил, ч., ТУ 6-09-3534-74.
Фильтры обеззольные ФО-ФС-15 "синяя лента" по ТУ 2642-001-
42624157-98.
Вода дистиллированная, ГОСТ 6709.
Калий железистосинеродистый 3-водный по ГОСТ 4207, х.ч.,
раствор концентрацией 150 г/куб. дм (раствор Карреза I).
Цинк уксуснокислый 2-водный по ГОСТ 5823, ч.д.а., раствор
концентрацией 300 г/куб. дм (раствор Карреза II).
Фильтр нейлоновый имп. на шприце в обойме 25 мм, размер пор
0,45 мкм.
Бензол для хроматографии, х.ч. по ТУ 6-09-779-76.
Метанол - яд, для жидкостной хроматографии, ос.ч. по ТУ 6-09-14-
2192-85.
Кислота уксусная > 99,8%, ос.ч., ГОСТ 18270-72.
Баллон с сжатым азотом, ос.ч. по ГОСТ 9293-74.
5-оксиметилфурфурол (ОМФ) кристаллический,
перекристаллизованный из метанола при температуре 64-65 град. C и
атмосферном давлении.
Подготовка к проведению измерений
Приготовление стандартного раствора 5-оксиметилфурфурола
Приготовление основного стандартного раствора 5-ОМФ
0,05 г кристаллического 5-оксиметилфурфурола количественно
переносят в мерную колбу вместимостью 250 куб. см, растворяют в 25
куб. см ацетонитрила, доводят бензолом до метки и тщательно
перемешивают. Получают стандартный раствор в смеси бензол -
ацетонитрил (9:1) с массовой долей 5-оксиметилфурфурола 0,2
мкг/куб. см.
Приготовление рабочего стандартного раствора 5-ОМФ
Аликвоту в 1 куб. см основного стандартного раствора ОМФ
переносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см, растворитель
отдувают досуха в токе азота, доводят метанолом до метки и
тщательно перемешивают. Получают рабочий стандартный раствор ОМФ
концентрацией 0,002 мкг/куб. см, который используют при
градуировке хроматографа.
Основной и рабочий стандартные растворы 5-оксиметилфурфурола
хранят в стеклянной посуде (пикнометре, мерной колбе) с притертой
пробкой в прохладном месте (при температуре около 0 град. C).
Сроки годности основного раствора 1 год, рабочего - 1 неделя.
Установление массовой доли 5-оксиметилфурфурола в рабочем
стандартном растворе
Установление точной массовой доли 5-оксиметилфурфурола в
рабочем стандартном растворе производят с помощью УФ-
спектрофотометрии согласно данным о коэффициенте молярной
экстинкции 5-оксиметилфурфурола в максимуме поглощения в УФ-
спектре. Снимают УФ-спектр рабочего стандартного раствора в
метаноле и измеряют его оптическую плотность. Рассчитывают
концентрацию ОМФ в рабочем стандартном растворе по формуле:
D x M x 1000
С = ------------,
L x E
где:
С - концентрация исследуемого раствора, мкг/куб. см или нг/мкл;
D - оптическая плотность раствора;
М - молекулярная масса 5-оксиметилфурфурола (126);
Е - коэффициент молярной экстинкции для метанольного раствора
(16830);
L - толщина слоя раствора в см.
Значение относительной погрешности при определении массовой
доли 5-оксиметилфурфурола в растворе с помощью УФ-
спектрофотометрии не превышает 5% для доверительной вероятности
0,95.
Приготовление подвижной фазы
В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 150 куб. см
метанола, примерно 500 куб. см бидистиллированной воды и 10 куб.
см уксусной кислоты, перемешивают и выдерживают до комнатной
температуры, затем доводят до метки бидистиллированной водой,
тщательно перемешивают.
Подготовка образца
10 куб. см сокосодержащего БАД или концентрата фруктового сока
помещают в мерные колбы вместимостью 100 куб. см или 250 куб. см,
доводят дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают.
Полученные растворы фильтруют через бумажный фильтр "синяя лента"
или нейлоновый фильтр.
5-10 г меда, медосодержащего пищевого продукта или БАД помещают
в мерные колбы вместимостью 100 куб. см или 250 куб. см, добавляют
около 50 куб. см дистиллированной воды, перемешивают до
растворения, последовательно добавляют по 5 куб. см растворов
Карреза I и Карреза II, каждый раз перемешивая смесь, доводят
дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают.
Фильтруют через бумажный фильтр "синяя лента" или нейлоновый
фильтр. Аликвоту полученных фильтратов вводят в хроматограф.
Выполнение измерений и вычисление результатов анализа
Условия хроматографического анализа
Подвижная фаза метанол - вода - уксусная кислота (15:84:1),
скорость потока 1,0 мл/мин., обнаружение по поглощению в УФ-
области спектра при длине волны 284 нм, чувствительность
устанавливают 0,01 единицы адсорбции на всю шкалу, вводимый объем
образца 5-15 мкл.
Вычисление результатов анализа
Массовую концентрацию 5-оксиметилфурфурола рассчитывают по
формуле:
m x H x V
обр общ
M = -----------------------,
H x V x P x 1000
ст вкола
где:
М - массовая концентрация 5-оксиметилфурфурола, мг/куб. дм или
мг/кг (ррm);
m - массовая доля внешнего стандарта ОМФ, введенного для
калибровки хроматографа, нг;
Н - высота пика исследуемого компонента, соответствующая
обр
определенной массовой концентрации компонента в исследуемом
образце, мм;
Н - средняя высота пика внешнего стандарта ОМФ, введенного
ст
для калибровки хроматографа, мм;
V - общий объем анализируемой пробы, мкл;
общ
V - объем аликвоты, введенной в хроматограф, мкл;
вкола
Р - навеска или объем пробы, куб. см или г.
Вычисления проводят до второго десятичного знака. За результат
принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных
измерений и выражают целым числом с одним десятичным знаком.
Основные характеристики метода
Предел обнаружения метода составляет 1,0 мг/кг.
Диапазон определяемых концентраций от 1,0 до 1000 мг/кг.
При соблюдении всех регламентируемых методикой условий
проведения измерений относительная характеристика погрешности
(стандартное отклонение сходимости) результата анализа при
концентрации ОМФ в жидких БАД 2,0 мг/л не превышает 0,124 (3,43%)
и при концентрации ОМФ в меде и медосодержащих БАД 5,0 мг/кг -
0,072 (5,34%).
Среднее значение открываемости ОМФ при концентрациях от 2,0 до
25 мг/кг составляет 87-95%.
4. Определение состава моно- и дисахаридов с помощью ВЭЖХ
Принципиальная схема метода
Метод заключается в пробоподготовке путем разбавления
дистиллированной водой образцов жидких БАД или экстракции сухих
БАД дистиллированной водой до концентрации сахаров примерно 2-10
мг/мл, фильтрования полученного раствора, разделении и
количественном определении сахаров с помощью ВЖХ.
Приготовление стандартных растворов
Аналитические образцы фруктозы, глюкозы, сорбита и сахарозы
сушат до постоянного веса согласно ГОСТ 12570-67 "Сахар-песок и
сахар-рафинад. Метод определения содержания влаги".
Готовят стандартные растворы фруктозы, глюкозы, сорбита и
сахарозы с концентрациями от 3 до 10 мг/куб. см в зависимости от
чувствительности рефрактометрического детектора. Для этого навески
сахаров массой 1 +/- 0,001 г или 0,3 +/- 0,001 г помещают в мерные
колбы вместимостью 100 куб. см, доводят бидистиллированной или
дистиллированной фильтрованной через капроновый фильтр марки 0,45
мкм RC водой до метки и тщательно перемешивают.
Готовят стандартный раствор смеси фруктозы, глюкозы и сахарозы
с массовыми долями каждого компонента 10 мг/куб. см или 3 мг/куб.
см. Для этого навески сахаров массой 1 +/- 0,001 г или 0,3 +/-
0,001 г помещают в одну мерную колбу вместимостью 100 куб. см,
доводят бидистиллированной или дистиллированной фильтрованной
через капроновый фильтр марки 0,45 мкм RC водой до метки и
тщательно перемешивают.
Приготовление исследуемого образца
Анализируемый образец БАД растирают в ступке. Навеску массой 5
+/- 0,01 г помещают в мерную колбу вместимостью 250 куб. см,
добавляют 150 куб. см подогретой до 75-80 град. C дистиллированной
воды и встряхивают на аппарате для встряхивания 20-30 мин.
Добавляют 15 куб. см 30%-ного раствора ацетата цинка, встряхивают,
охлаждают до комнатной температуры, доводят дистиллированной водой
до метки и тщательно перемешивают. Фильтруют через капроновый
фильтр марки 0,45 мкм RC или складчатый бумажный фильтр "синяя
лента". Аликвоту фильтрата вводят в хроматограф.
20 куб. см сокосодержащего БАД или 10 г углеводсодержащего
сиропа помещают в мерную колбу вместимостью 100 куб. см, доводят
бидистиллированной водой до метки, тщательно перемешивают и
фильтруют через капроновый фильтр марки 0,45 мкм RC или через
складчатый бумажный фильтр обеззоленный марки ФОМ. Аликвоту
фильтрата вводят в хроматограф.
Анализ с помощью ВЭЖХ
Анализ ВЭЖХ с использованием амино-фазы
Условия ВЭЖХ: подвижная фаза ацетонитрил - вода (77:23),
скорость подвижной фазы 1,0-1,5 мл/мин., аликвота, вводимая в
|
