|
Стр. 2
¦15,1 ¦0,0022¦16,1 ¦0,0017¦17,1 ¦0,0013¦18,1 ¦0,0008¦19,1 ¦0,0004¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦15,2 ¦0,0021¦16,2 ¦0,0017¦17,2 ¦0,0012¦18,2 ¦0,0008¦19,2 ¦0,0004¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦15,3 ¦0,0021¦16,3 ¦0,0016¦17,3 ¦0,0012¦18,3 ¦0,0007¦19,3 ¦0,0003¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦15,4 ¦0,0020¦16,4 ¦0,0016¦17,4 ¦0,0011¦18,4 ¦0,0007¦19,4 ¦0,0003¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦15,5 ¦0,0020¦16,5 ¦0,0016¦17,5 ¦0,0011¦18,5 ¦0,0007¦19,5 ¦0,0002¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦15,6 ¦0,0019¦16,6 ¦0,0015¦17,6 ¦0,0011¦18,6 ¦0,0006¦19,6 ¦0,0002¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦15,7 ¦0,0019¦16,7 ¦0,0015¦17,7 ¦0,0010¦18,7 ¦0,0006¦19,7 ¦0,0001¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦15,8 ¦0,0018¦16,8 ¦0,0014¦17,8 ¦0,0010¦18,8 ¦0,0005¦19,8 ¦0,0001¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦15,9 ¦0,0018¦16,9 ¦0,0014¦17,9 ¦0,0009¦18,9 ¦0,0005¦19,9 ¦0,0000¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦ прибавить к показателю преломления ¦
+-----T------T-----T------T-----T------T-----T------T-----T------+
¦20,0 ¦0,0000¦22,0 ¦0,0009¦24,0 ¦0,0018¦26,0 ¦0,0026¦28,0 ¦0,0035¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦20,1 ¦0,0000¦22,1 ¦0,0009¦24,1 ¦0,0018¦26,1 ¦0,0027¦28,1 ¦0,0036¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦20,2 ¦0,0001¦22,2 ¦0,0010¦24,2 ¦0,0018¦26,2 ¦0,0027¦28,2 ¦0,0036¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦20,3 ¦0,0001¦22,3 ¦0,0010¦24,3 ¦0,0019¦26,3 ¦0,0028¦28,3 ¦0,0037¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦20,4 ¦0,0002¦22,4 ¦0,0011¦24,4 ¦0,0019¦26,4 ¦0,0028¦28,4 ¦0,0037¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦20,5 ¦0,0002¦22,5 ¦0,0011¦24,5 ¦0,0020¦26,5 ¦0,0029¦28,5 ¦0,0037¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦20,6 ¦0,0003¦22,6 ¦0,0011¦24,6 ¦0,0020¦26,6 ¦0,0029¦28,6 ¦0,0038¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦20,7 ¦0,0003¦22,7 ¦0,0012¦24,7 ¦0,0021¦26,7 ¦0,0029¦28,7 ¦0,0038¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦20,8 ¦0,0004¦22,8 ¦0,0012¦24,8 ¦0,0021¦26,8 ¦0,0030¦28,8 ¦0,0039¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦20,9 ¦0,0004¦22,9 ¦0,0013¦24,9 ¦0,0022¦26,9 ¦0,0030¦28,9 ¦0,0039¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦21,0 ¦0,0004¦23,0 ¦0,0013¦25,0 ¦0,0022¦27,0 ¦0,0031¦29,0 ¦0,0040¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦21,1 ¦0,0004¦23,1 ¦0,0014¦25,1 ¦0,0022¦27,1 ¦0,0031¦29,1 ¦0,0040¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦21,2 ¦0,0005¦23,2 ¦0,0014¦25,2 ¦0,0023¦27,2 ¦0,0032¦29,2 ¦0,0040¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦21,3 ¦0,0006¦23,3 ¦0,0015¦25,3 ¦0,0023¦27,3 ¦0,0032¦29,3 ¦0,0041¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦21,4 ¦0,0006¦23,4 ¦0,0015¦25,4 ¦0,0024¦27,4 ¦0,0033¦29,4 ¦0,0041¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦21,5 ¦0,0007¦23,5 ¦0,0015¦25,5 ¦0,0024¦27,5 ¦0,0033¦29,5 ¦0,0042¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦21,6 ¦0,0007¦23,6 ¦0,0016¦25,6 ¦0,0025¦27,6 ¦0,0033¦29,6 ¦0,0042¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦21,7 ¦0,0007¦23,7 ¦0,0016¦25,7 ¦0,0025¦27,7 ¦0,0034¦29,7 ¦0,0043¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦21,8 ¦0,0008¦23,8 ¦0,0017¦25,8 ¦0,0026¦27,8 ¦0,0034¦29,8 ¦0,0043¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦21,9 ¦0,0008¦23,9 ¦0,0017¦25,9 ¦0,0026¦27,9 ¦0,0035¦29,9 ¦0,0044¦
L-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+-------
Отсчет показателя преломления раствора жира можно также
производить при любой комнатной температуре без учета поправки на
температуру при условии одновременного определения показателя
преломления растворителя при той же температуре.
Обработка результатов
Массовую долю жира (X) в процентах в пересчете на сухое
вещество вычисляют по формуле:
V x ж П - П 100
р р рж
X = ------ x -------- x 100 x -------,
M П - П 100 - W
рж ж
где:
V - объем растворителя, взятого для извлечения жира, куб. см;
p
ж - относительная плотность жира при 20 град. C;
П - коэффициент преломления растворителя;
р
П - коэффициент преломления раствора жира в растворителе;
рж
П - коэффициент преломления жира;
ж
М - масса изделия, г;
W - влажность изделия, %.
За окончательный результат испытания принимают среднее
арифметическое (X ) двух параллельных определений.
1
Метрологические характеристики
Допустимое расхождение двух параллельных определений (r) не
должно превышать значений, рассчитанных по формуле:
r = 0,03 + 0,035 x Х ,
1
но не более 0,6% абсолютного содержания жира, где X - среднее
1
арифметическое результатов двух параллельных определений, %.
Допустимое расхождение между результатами испытаний,
выполненных в двух разных лабораториях (R), не должно превышать
значений, рассчитанных по формуле:
R = 0,04 + 0,06 x Х ,
2
но не более 1,2% абсолютного содержания жира, где X - среднее
2
арифметическое результатов анализов, выполненных в двух разных
лабораториях, %.
При вычислении процентного содержания жира пользуются
показателями преломления и плотности жиров, указанными в табл. 4
Таблица 4
КОЭФФИЦИЕНТЫ ПРЕЛОМЛЕНИЯ ЖИРОВ
----------------------T---------------------------T--------------¬
¦ Наименование жира ¦ Коэффициент преломления ¦ Плотность ¦
+---------------------+---------------------------+--------------+
¦Кунжутное масло ¦ 1,4730 ¦ 0,919 ¦
+---------------------+---------------------------+--------------+
¦Подсолнечное масло ¦ 1,4748 ¦ 0,919 ¦
+---------------------+---------------------------+--------------+
¦Коровье масло ¦ 1,4605 ¦ 0,920 ¦
+---------------------+---------------------------+--------------+
¦Маргарин ¦ 1,4690 ¦ 0,928 ¦
+---------------------+---------------------------+--------------+
¦Арахисовое масло ¦ 1,4696 ¦ 0,917 ¦
+---------------------+---------------------------+--------------+
¦Горчичное масло ¦ 1,4720 ¦ 0,918 ¦
L---------------------+---------------------------+---------------
Примечания. 1. Если в исследуемом образце находится неизвестный
жир или имеется смесь жиров, поступают следующим образом: 1-5 г
измельченного изделия заливают трехкратным количеством
растворителя (хлороформа, тетрахлоруглерода и др.), взбалтывают в
течение 15 мин., вытяжку фильтруют в колбочку, растворитель
полностью отгоняют, остаток подсушивают и определяют коэффициент
преломления смеси жиров или неизвестного жира.
2. Для смеси жиров или неизвестного жира плотность принимается
равной 0,920.
3. При хорошем растирании навески с растворителем в ступке,
когда смесь перенесена на фильтр, разрешается стекающие из воронки
капли раствора жира и растворитель наносить на призму
рефрактометра, не дожидаясь, пока профильтруется вся смесь.
4. Вся работа с органическими растворителями проводится в
вытяжном шкафу или хорошо вентилируемой камере.
В. Бутирометрический метод
Метод основан на растворении исследуемой навески в 60%-ной
серной кислоте и отделении слоя жира в молочном бутирометре
центрифугированием в присутствии изоамилового спирта, который
образует с серной кислотой изоамилово-серный эфир, уменьшающий
величину поверхностного натяжения жировых шариков и способствующий
слипанию их в единый жировой слой.
Объем выделившегося жира измеряют в градуированной части
бутирометра.
Проведение испытания
Из средней пробы готовых образцов отбирают по две навески
массой по 2 г каждая. Навески помещают в фарфоровые стаканчики и
заливают 9 куб. см 60%-ной серной кислоты.
Стаканчики погружают в водяную баню с температурой воды 80
град. C и производят растворение навески в серной кислоте в
течение 20 мин. при периодическом перемешивании стеклянной
палочкой.
После растворения навески темную жидкость переносят в молочные
бутирометры, смывая остатки из стаканчика с помощью 10 куб. см 60%
серной кислоты.
В бутирометры осторожно (чтобы не замочить горлышко) приливают
по 1 куб. см изоамилового спирта, плотно закрывают резиновыми
пробками, плавно перемешивают в течение 3 мин. и помещают в гнезда
водяной бани с температурой воды 80 град. C на 5 мин. (пробками
вниз).
По истечении 5 мин. бутирометры вынимают из водяной бани,
размещают в молочной центрифуге (пробками к периферии) и
центрифугируют 5 мин. После центрифугирования бутирометры снова
помещают на 5 мин. в водяную баню с температурой воды 80 град. C
(пробками вниз), после чего вынимают и отмечают высоту желтого
жирового слоя над темной жидкостью по числу малых делений
градуированной части бутирометра.
Обработка результатов
Массовую долю жира (X) в процентах в пересчете на сухое
вещество вычисляют по формуле:
N x 0,01133 x 100 x 100
X = -----------------------,
Q x (100 - W)
где:
N - высота жирового слоя в бутирометре по числу малых делений;
0,01133 - количество жира, соответствующее одному малому
делению бутирометра, г;
W - влажность, %;
Q - навеска изделия, г.
Для удобства и ускорения расчета можно использовать данные
табл. 5.
Таблица 5
ПОКАЗАНИЯ БУТИРОМЕТРА В ЗАВИСИМОСТИ
ОТ СОДЕРЖАНИЯ ЖИРА
--------T-------T-------T-------T-------T-------T-------T--------¬
¦Показа-¦Массо- ¦Показа-¦Массо- ¦Показа-¦Массо- ¦Показа-¦Массовая¦
¦ния бу-¦вая до-¦ния бу-¦вая до-¦ния бу-¦вая до-¦ния бу-¦ доля ¦
¦тиро- ¦ля жи- ¦тиро- ¦ля жи- ¦тиро- ¦ля жи- ¦тиро- ¦жира, % ¦
¦метра ¦ра, % ¦метра ¦ра, % ¦метра ¦ра, % ¦метра ¦ ¦
+-------+-------+-------+-------+-------+-------+-------+--------+
¦1 ¦ 0,57 ¦ 11 ¦ 6,23 ¦ 21 ¦ 11,90 ¦ 31 ¦ 17,56 ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦2 ¦ 1,13 ¦ 12 ¦ 6,80 ¦ 22 ¦ 12,46 ¦ 32 ¦ 18,13 ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦3 ¦ 1,70 ¦ 13 ¦ 7,36 ¦ 23 ¦ 13,03 ¦ 33 ¦ 18,69 ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦4 ¦ 2,27 ¦ 14 ¦ 7,93 ¦ 24 ¦ 13,60 ¦ 34 ¦ 19,26 ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦5 ¦ 2,83 ¦ 15 ¦ 8,50 ¦ 25 ¦ 14,16 ¦ 35 ¦ 19,82 ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦6 ¦ 3,40 ¦ 16 ¦ 9,06 ¦ 26 ¦ 14,73 ¦ 36 ¦ 20,39 ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦7 ¦ 3,96 ¦ 17 ¦ 9,63 ¦ 27 ¦ 15,29 ¦ 37 ¦ 20,96 ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦8 ¦ 4,53 ¦ 18 ¦ 10,19 ¦ 28 ¦ 15,66 ¦ 38 ¦ 21,53 ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦9 ¦ 5,10 ¦ 19 ¦ 10,76 ¦ 29 ¦ 16,42 ¦ 39 ¦ 22,09 ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦10 ¦ 5,66 ¦ 20 ¦ 11,33 ¦ 30 ¦ 17,00 ¦ 40 ¦ 22,66 ¦
L-------+-------+-------+-------+-------+-------+-------+---------
Для дальнейшего пересчета на сухое вещество умножают массовую
долю жира в процентах, найденную по таблице, на 100 и делят на
разность (100 - W). За окончательный результат испытания принимают
среднее арифметическое (X ) результатов двух параллельных
1
определений.
Метрологические характеристики
Допустимое расхождение двух параллельных определений (r) не
должно превышать значений, рассчитанных по формуле:
r = 0,02 + 0,02 x Х ,
1
но не более 0,4% абсолютного содержания жира, где X - среднее
1
арифметическое результатов двух параллельных определений, %.
Допустимое расхождение между результатами испытаний,
выполненных в двух разных лабораториях (R), не должно превышать
значений, рассчитанных по формуле:
R = 0,04 + 0,04 x X ,
2
но не более 0,8% абсолютного содержания жира, где Х - среднее
2
арифметическое результатов анализов, выполненных в двух разных
лабораториях, %.
1.3. Определение массовой доли жира
в БАД с высоким содержанием жира методом экстракции
в аппарате Сокслета
Метод предназначен для определения массовой доли жира в БАД с
высоким содержанием жира при проведении исследований и
арбитражного анализа.
Диапазон измеряемых концентраций от 40 до 85%.
Метод основан на экстракции растворителем в аппарате Сокслета.
Подготовка к испытанию
Гигроскопическую вату и фильтровальную бумагу помещают в
аппарат Сокслета и экстрагируют этиловым эфиром в течение 2-3 ч.
Подготовка экстракционных патронов
Патроны для экстракционных насадок типа НЭТ готовят, как
указано выше.
Подготовка БАД к экстракции
В фарфоровую ступку взвешивают по разности 5 г БАД с записью
значения массы до четвертого десятичного знака. Смешивают с 15 г
прокаленного сульфата натрия и переносят в подготовленный
экстракционный патрон, после чего ступку и шпатель с помощью
пинцета протирают несколько раз ватой, сначала сухой, а затем
смоченной этиловым эфиром. Всю вату помещают в тот же патрон.
Сверху кладут небольшой слой ваты, затем края патрона завертывают.
Экстракция жира
Патрон с навеской БАД помещают в экстрактор. К экстрактору
присоединяют чистую колбу, предварительно высушенную в течение 1 ч
при 100-105 град. C и взвешенную после охлаждения. Через
холодильник при помощи воронки наливают в экстрактор этиловый эфир
так, чтобы патрон в экстракторе был полностью покрыт слоем эфира.
В колбу наливают также эфир на 1/3 ее объема.
Колбу собранного аппарата нагревают на закрытой водяной бане,
обеспечивающей равномерное, не слишком сильное кипение эфира.
Через 3 ч проверяют полноту экстракции. Для этого, охладив колбу,
отсоединяют ее на мгновение от остальной части прибора и 1-2 капли
эфира с нижнего конца сифона экстрактора наносят на чистое часовое
стекло или кусочек фильтровальной бумаги. Экстракцию считают
законченной, если после испарения эфира не остается масляных пятен
на стекле или бумаге.
По окончании аппарат разбирают, вынимают патрон из экстрактора,
последний присоединяют снова к колбе и отгоняют растворитель на
водяной бане. Колбу сушат с жиром в сушильном шкафу в течение 1 ч
при температуре 100-105 град. C. Колбу взвешивают после охлаждения
ее в эксикаторе. Последующие взвешивания производят через каждые
15 мин. сушки. Масса считается постоянной, если отличается от
предыдущей не более чем на 0,0004 г.
Расчет результата определения
Массовую долю жира в БАД в % (X) вычисляют по формуле:
(M - M ) x 100
1 2
X = ---------------,
M
где:
M - масса колбы с высушенным жиром, г;
1
М - масса пустой колбы, г;
2
М - навеска БАД, г.
Конечным результатом считают среднее арифметическое двух
параллельных определений (X ) отдельных проб БАД. Вычисления
1
проводят до второго десятичного знака.
Метрологические характеристики
Допустимое расхождение двух параллельных определений (r) не
должно превышать значений, рассчитанных по формуле:
r = 0,02 + 0,01 x Х ,
1
но не более 0,4% абсолютного содержания жира, где X - среднее
1
арифметическое результатов двух параллельных определений, %.
Допустимое расхождение между результатами испытаний,
выполненных в двух разных лабораториях (R), не должно превышать
значений, рассчитанных по формуле:
R = 0,04 + 0,02 x Х ,
2
но не более 0,8% абсолютного содержания жира, где Х - среднее
2
арифметическое результатов анализов, выполненных в двух разных
лабораториях, %.
2. Методы определения жирнокислотного состава
Метод основан на разделении метиловых эфиров жирных кислот,
полученных из липидов БАД, с помощью газожидкостной хроматографии.
Выделение липидов из БАД
Липиды выделяют экстракционным методом, предложенным для данной
группы БАД, исключающим термическое воздействие на объект и
изложенным в вышеприведенных разделах.
Получение метиловых эфиров жирных кислот
Метанолиз в щелочной среде нейтральных масел и жиров проводят
по ГОСТ 30418-96 "Масла растительные. Метод определения
жирнокислотного состава". Получение метиловых эфиров жирных кислот
может быть проведено метанолизом в кислой среде или
переэтерификацией липидов метанолом в среде хлористого водорода по
ГОСТ Р 51486-99 "Масла растительные и жиры животные. Получение
метиловых эфиров жирных кислот".
Для определения абсолютных количеств жирных кислот проводится
анализ с применением внутреннего стандарта. В качестве внутреннего
стандарта используют маргариновую кислоту или дибутилфталат.
Анализ метиловых эфиров жирных кислот
методом ГЖХ
Метод основан на использовании газожидкостной хроматографии
(ГЖХ) метиловых эфиров жирных кислот по ГОСТ Р 51483-99 "Масла
растительные и жиры животные. Определение методом газовой
хроматографии массовой доли метиловых эфиров индивидуальных жирных
кислот к их сумме". Результаты выражают в массовых долях каждого
индивидуального компонента БАД.
Эталонный стандарт - смесь метиловых эфиров известного состава,
желательно, аналогичного составу анализируемого вещества.
Идентификацию пиков метиловых эфиров жирных кислот проводят по
относительным приведенным временам удерживания или эквивалентным
длинам цепи (ЭДЦ).
В качестве неподвижных жидких фаз используют полиэфиры типа
полиэтиленгликольадипат, полипропиленгликольадипат,
диэтиленгликольсукцинат, цианосиликоны (SP-100, FFAP, силары OV-
275, Sil-88) или другие жидкости, дающие необходимое
хроматографическое разделение.
Комментарий к условиям анализа
Температура термостата колонок:
а) при анализе смесей метиловых эфиров жирных кислот с длиной
цепи более 14 углеродных атомов 170-190 град. C (изотермический
режим). Условия подбирают таким образом, чтобы метилолеат выходил
из колонки за 15 мин.;
б) при анализе смесей метиловых эфиров, содержащих
низкомолекулярные компоненты, температуру термостата программируют
в пределах от 120 до 195 град. C со скоростью 6-8 град. C в 1 мин.
(при наличии метилового эфира масляной кислоты начальная
температура программирования 70 град. C).
Величина вводимой пробы - около 1-2 мкл раствора метиловых
эфиров в гексане для набивных колонок и 0,2-0,3 мкл для
капиллярных.
В случае необходимости рекомендуется производить анализ на двух
зафиксированных фазах с различными полярностями с целью проверки
отсутствия скрытых пиков (для рыбьего жира или в случае
одновременного присутствия С18:3, С20:0, С20:1).
Обработка результатов
Качественный анализ
Анализируют эталонную смесь метиловых эфиров. Строят график
зависимости логарифма времени удерживания от числа углеродных
атомов в цепи. Получают ряд параллельных прямых для насыщенных,
моно-, ди- и т.д. ненасыщенных метиловых эфиров кислот или находят
величины эквивалентной длины цепи ЭДЦ для ненасыщенных и
разветвленных жирных кислот по формуле:
lg V - lg V
x n
ЭДЦ = n + ---------------,
lg V - lg V
n+1 n
где:
n - число атомов углерода в насыщенной кислоте нормального
строения, находящейся на хроматограмме перед неизвестным
компонентом;
lg V - логарифм времени удерживания кислоты с n-числом атомов
n
углерода;
lg V - логарифм времени удерживания кислоты с (n+1)-числом
n+1
атомов углерода;
lg V - логарифм времени удерживания неизвестного компонента.
x
Идентифицируют пики на хроматограмме анализируемой смеси по
полученному графику или по величинам ЭДЦ. Следует избегать условий
анализа, при которых происходит наложение пиков метиловых эфиров
различных кислот (например, метиллинолената и метиларахината).
Количественный анализ и способы расчета
За исключением специальных анализов расчет проводят методом
внутренней нормализации, когда все компоненты смеси представлены
на хроматограмме и площадь всех пиков компонентов составляет 100%.
При наличии интегратора пользуются полученными с его помощью
цифрами. При отсутствии интегратора площади пиков измеряют,
умножая высоту пика на его ширину (или ширину пика на половине его
высоты) и учитывая переключения чувствительности усилителя,
используемые во время записи хроматограммы.
Расчет без использования поправочных коэффициентов
Расчет массовой доли i-го компонента в % проводят по формуле:
S
i
С = ------,
SUM S
i
где:
С - массовая доля i-го компонента;
S - площадь пика i-го компонента;
i
SUM S - сумма всех площадей пиков.
i
За результат анализа принимают среднее арифметическое (X ) из
1
двух параллельных измерений.
Расчет с использованием поправочных коэффициентов
В случае, когда в анализируемой смеси присутствуют кислоты с
12 и менее углеродными атомами в цепи, расчет ведется с
применением поправочных коэффициентов.
Поправочные коэффициенты (K ) рассчитывают по хроматограммам
i
эталонных смесей известного состава, полученным в условиях,
применяемых для анализа образца по формуле:
M x SUM S
i i
K = -----------,
i S x SUM M
i i
где:
M - масса i-го компонента в эталонной смеси, г;
i
SUM M - масса эталонной смеси, г.
i
Часто используют относительные поправочные коэффициенты (K")
i
по отношению к поправочному коэффициенту метилпальмитата (К ):
C16
R
i
K" = ----.
i K
C16
Массовую долю i-го компонента анализируемой смеси определяют
по формуле:
K x S
i i
C = ----------- x 100.
i SUM K x S
i i
За результат анализа принимают среднее арифметическое из двух
параллельных измерений с записью до первого десятичного знака.
Расчет с применением внутреннего стандарта
В случаях, когда не все компоненты в анализируемой смеси
элюируются из колонки или присутствуют очень летучие компоненты,
используют для расчета метод внутреннего стандарта.
В качестве внутреннего стандарта применяют метиловые эфиры
кислот, отсутствующие в анализируемой смеси. При анализе проб,
содержащих масляную кислоту, в качестве внутреннего стандарта
используют валериановую кислоту, в остальных случаях -
пентадекановую или маргариновую кислоту. Массовую долю i-го
компонента пробы определяют по формуле:
M x K x S
s i i
C = ------------ x 100 x m,
i M x K x S
s s
где:
m - содержание липидов в продукте, мг в 100 г;
M - масса внутреннего стандарта, мг;
s
М - масса образца, мг;
K - поправочный коэффициент внутреннего стандарта;
s
S - площадь пика внутреннего стандарта.
s
Метрологические характеристики
Допустимые расхождения содержания жирных кислот в продукте
рассчитывают (в %) по следующим формулам:
r = 0,225 + 0,04 x Х ,
1
но не более 1% абсолютного содержания кислоты;
R = 0,310 + 0,075 x Х ,
2
но не более 3% абсолютного содержания кислоты.
3. Методы определения стеринов
3.1. Колориметрический метод определения содержания
стеринов после омыления проб
Метод основан на колориметрической реакции стеринов,
извлекаемых диэтиловым эфиром из омыленных проб растительных
масел, с уксусным ангидридом в присутствии концентрированной
серной кислоты.
Условия проведения анализа
Экстракцию неомыленных веществ следует проводить по возможности
быстро, предохраняя пробы от попадания на них прямого солнечного
света.
Отгонку диэтилового эфира из проб следует проводить под
вакуумом водоструйного насоса при комнатной температуре.
Подготовка к проведению анализа
Приготовление и очистка реактивов
Безводный сернокислый натрий прокаливают в течение 1-1,5 ч при
температуре 110 град. C. Диэтиловый эфир обрабатывают
марганцовокислым калием (5 г на л) и гидратом окиси калия (10 г на
1 куб. дм) в течение суток, а затем перегоняют. Этиловый спирт
ректификованный технический освобождают от альдегидов. Начальную и
конечную порции отгона отбрасывают. Хлороформ сушат в течение
суток под хлористым кальцием и перегоняют.
Построение градуировочного графика
Градуировочный график строят на основании результатов анализа
проб с известным содержанием чистого бета-ситостерина.
В мерную колбу вместимостью 100 куб. см отвешивают 0,15-0,20 г
бета-ситостерина (с записью результата до 4-го знака после
запятой). Навеску растворяют в 100 куб. см хлороформа. Из
полученного раствора готовят серию стандартных растворов с
содержанием бета-ситостерина 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,10; 0,12;
0,14; 0,16; 0,18; 0,20 г/куб. дм. Из каждого раствора отбирают
пипеткой 3 куб. см, добавляют 2 куб. см уксусного ангидрида и 6
капель серной кислоты. Через 10 мин. после добавления кислоты
измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при 690
нм. В качестве контроля служит раствор, состоящий из 3 куб. см
хлороформа, 2 куб. см уксусного ангидрида и 6 капель
концентрированной серной кислоты.
Градуировочный график строят в координатах: оптическая
плотность (D) - концентрация стандартных растворов бета-
ситостерина. Градуировочный график строят для каждого
спектрофотометра и проверяют при смене партий путем определения
оптической плотности стандартных растворов двух разных
концентраций.
Проведение анализа
Испытуемый образец (1-3 г) взвешивают в колбе вместимостью 100
куб. см (с записью результата взвешивания до 4-го знака после
запятой), добавляют 0,1-0,3 г аскорбиновой кислоты и 10-30 куб. см
свежеприготовленного 2 н. спиртового раствора KOH. Смесь нагревают
с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 30 мин.
Содержимое колбы охлаждают и количественно переносят в
делительную воронку с 30-90 куб. см дистиллированной воды.
Неомыляемые вещества экстрагируют диэтиловым эфиром 3-4 раза
порциями по 20-60 куб. см. Объединенный эфирный экстракт промывают
в делительной воронке дистиллированной водой до нейтральной
реакции промывной воды по фенолфталеину. Промытую эфирную вытяжку
помещают в коническую колбу, засыпают 5-10 г безводного сульфата
натрия и оставляют в темном месте на 30 мин., периодически
взбалтывая. Затем содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр
в другую колбу, фильтр ополаскивают эфиром. Эфир отгоняют под
вакуумом при температуре не выше 25-30 град. C.
Остаток в колбе после отгонки эфира растворяют в зависимости от
навески исследуемого образца в 1-3 куб. см бензола. Затем
производят разделение компонентов смеси неомыляемых веществ
методом тонкослойной хроматографии. Для этого на пластинку
"Силуфол" наносят 50-150 мкл бензольного раствора неомыляемых
веществ в виде полоски, отстоящей на 2 см от нижнего и боковых
краев пластинки.
На одном уровне с пробой на расстоянии 1 см от краев пластинки
наносят по капле раствор бета-ситостерина. Пластинку помещают
вертикально в хроматографическую камеру, в которую заранее
наливают смесь диэтилового и петролейного эфиров, взятых в
соотношении 1:1. Количество растворителя зависит от размеров
хроматографической камеры и регулируется высотой его слоя, равной
1 см.
Развитие хроматограммы продолжается до тех пор, пока фронт
растворителя не поднимается на 10-12 см. Обычно это занимает 10-12
мин. Затем пластинку вынимают из камеры и подсушивают на воздухе
до исчезновения запаха эфира. Края хроматограммы шириной 2 см
опрыскивают 5%-ным спиртовым раствором фосфорно-молибденовой
кислоты, после чего пластинки помещают на 1-5 мин. (до проявления)
в термостат с температурой около 90 град. C. На уровне окрашенного
пятна свидетеля соскребают слой адсорбента. Адсорбент элюируют
хлороформом 6-8 раз порциями по 1 куб. см. После каждого
элюирования адсорбент отделяют центрифугированием или фильтрацией.
Объединенный элюат собирают в градуированную пробирку и упаривают
до объема 3 куб. см. К хлороформному раствору стеролов приливают 2
куб. см уксусного ангидрида и 6 капель концентрированной серной
кислоты (по капле). Через 10 мин. измеряют оптическую плотность
раствора на спектрофотометре при 690 нм.
Контролем служит раствор, состоящий из 3 куб. см хлороформа, 2
куб. см уксусного ангидрида и 6 капель концентрированной серной
кислоты.
Обработка результатов
Массовую долю стеринов в пробе (X, %) рассчитывают по формуле:
V x V x C x 100
1
Х = ----------------,
V х М
2
где:
V - объем хлороформного раствора, взятого для проведения
колориметрической реакции, куб. см;
V - объем бензольного раствора неомыляемых веществ, куб. см;
1
V - объем бензольного раствора неомыляемых веществ,
2
нанесенный на пластинку, куб. см;
С - концентрация стеролов, определяемая по градуировочному
графику, г/куб. дм;
М - масса образца, г.
За окончательный результат испытания принимают среднее
арифметическое (X) результатов двух параллельных определений.
Метрологические характеристики
Относительное допустимое расхождение между результатами двух
параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, по
отношению к среднему арифметическому значению (Rr) и относительное
допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в
двух разных лабораториях, по отношению к среднему арифметическому
значению (RR) приведены в табл. 6.
Таблица 6
ОТНОСИТЕЛЬНЫЕ ДОПУСТИМЫЕ ВНУТРИЛАБОРАТОРНЫЕ (Rr)
И МЕЖЛАБОРАТОРНЫЕ (RR) РАСХОЖДЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
----------------------------T-----------------T------------------¬
¦ Содержание в продукте, % ¦ Rr, % ¦ RR, % ¦
+---------------------------+-----------------+------------------+
¦Менее 0,5 ¦ 20 ¦ 40 ¦
¦ ¦ ¦ ¦
¦0,5-1,0 ¦ 15 ¦ 30 ¦
¦ ¦ ¦ ¦
¦Более 1,0 ¦ 10 ¦ 20 ¦
L---------------------------+-----------------+-------------------
3.2. Определение состава стеринов методом ГЖХ
Метод основан на прямом газохроматографическом анализе
стеринов, выделенных из липидов путем тонкослойной хроматографии
фракции неомыляемых веществ.
Условия проведения анализа
Выделение липидов проводят одним из унифицированных методов,
предложенных для данного продукта и исключающих разрушение
стеринов.
Экстракцию неомыляемых веществ следует проводить по возможности
быстро, предохраняя пробы от попадания на них прямого солнечного
света.
Отгонку диэтилового эфира из проб следует проводить под
вакуумом водоструйного насоса при комнатной температуре.
Подготовка к проведению анализа
Подготовку проводят по п. "Колориметрический метод определения
содержания стеринов".
Проведение анализа
Выделение стеролов из липидов
Омыление липидов, экстракцию неомыляемых веществ, выделение
стеринов методом тонкослойной хроматографии проводят по п.
"Колориметрический метод определения содержания стеринов".
Газохроматографический анализ
Аппаратура, используемая для проведения анализа, выбор
оптимальных условий для разделения стеринов, определение
эффективности хроматографических колонок изложены в п. выше.
Устанавливают следующие условия анализа на хроматографе:
стеклянная или стальная колонка длиной 1,5-2,0 м и внутренним
диаметром 3-4 мм, заполненная силанизированным целитом 545 (60-100
меш.), обработанным 3% полиметилсилоксаном SE-30 или аналогичной
неподвижной фазой. Скорость потока газа-носителя 60-100 куб.
см/мин. Температура термостата колонки 250-270 град. C, инжектора
300 град. C, детекторов 280 град. C.
Вводят в хроматограф около 3 мкл каждого компонента.
Обработка результатов
|
