|
Стр. 6
Идентификацию пиков проводят сопоставляя времена удерживания и
спектральное отношение с временами удерживания и спектральными
отношениями стандартного раствора пиридоксина (табл. 16).
Таблица 16
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПИКОВ ТИАМИНА И РИБОФЛАВИНА
-----------T-----------T----------------T---------------T--------¬
¦ Витамин ¦Время удер-¦Условия детек- ¦Условия детек- ¦Соотно- ¦
¦ ¦живания, ¦тирования - 1 ¦тирования - 2 ¦шение ¦
¦ ¦мин. ¦ ¦ ¦анали- ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦тических¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦сигналов¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦(1:2) ¦
+----------+-----------+----------------+---------------+--------+
¦Рибофлавин¦ 10,0-10,3 ¦лямбда = ¦лямбда = ¦ 1,12 ¦
¦ ¦ ¦ возб. ¦ возб. ¦ ¦
¦ ¦ ¦450 нм ¦465 нм ¦ ¦
¦ ¦ ¦лямбда = ¦лямбда = ¦ ¦
¦ ¦ ¦ эмисс. ¦ эмисс. ¦ ¦
¦ ¦ ¦521 нм ¦535 нм ¦ ¦
+----------+-----------+----------------+---------------+--------+
¦Тиамин ¦ 4,0-4,5 ¦лямбда = ¦лямбда = ¦ 1,01 ¦
¦ ¦ ¦ возб. ¦ возб. ¦ ¦
¦ ¦ ¦375 нм ¦395 нм ¦ ¦
¦ ¦ ¦лямбда = ¦лямбда = ¦ ¦
¦ ¦ ¦ эмисс. ¦ эмисс. ¦ ¦
¦ ¦ ¦435 нм ¦450 нм ¦ ¦
L----------+-----------+----------------+---------------+---------
Концентрацию витаминов в растворе пробы (С , мкг/куб. см)
пр
определяют по формуле:
С = k x S ,
пр гр пр
где:
S - площадь (высота) пика витаминов в растворе пробы;
пр
k - коэффициент градуировочного графика.
гр
За окончательный результат определения концентрации
пиридоксина в растворе пробы принимают среднее арифметическое
результатов параллельных измерений, допускаемое относительное
расхождение между которыми не должно превышать 5% от среднего
значения.
Обработка результатов
Содержание тиамина (рибофлавина) в 1 таблетке (драже) (мг):
k x S x V x k
гр пр разв
С = ---------------------,
пр m x 1000
где:
S - площадь (высота) пика витамина в пробе;
пр
k - коэффициент градуировочного графика;
гр
V - первоначальный объем гидролизата, куб. см;
k - конечное разведение гидролизата;
разв
m - навеска таблеток, взятая на анализ;
М - масса таблетки;
1000 - коэффициент пересчета мкг в мг.
Содержание тиамина (рибофлавина) в 1 капсуле (мг):
k x S x V x k
гр пр разв
С = ---------------------,
пр n x 1000
где:
S - площадь (высота) пика пиридоксина в пробе;
пр
k - коэффициент градуировочного графика;
гр
V - первоначальный объем гидролизата, куб. см;
k - конечное разведение гидролизата;
разв
n - количество капсул, взятых на анализ;
1000 - коэффициент пересчета мкг в мг.
Контроль погрешности результатов измерений
Для контроля погрешности результатов измерений массовой
концентрации пиридоксина с помощью ВЭЖХ используют метод добавок в
гидролизат.
Производят измерение концентрации тиамина или рибофлавина в
гидролизате пробы (С , мкг/куб. см), а затем с введенной в него
пр
добавкой (С , мкг/куб. см), который также анализируют (С',
д
мкг/куб. см). Величину добавки выбирают таким образом, чтобы
концентрация данного витамина в гидролизате увеличилась на 50-
150%. Для добавки используют калибровочные растворы.
Результаты контроля считают удовлетворительными, если
выполняется условие:
|С' - С - С | <= 0,01 x C x K ,
пр д д д
где:
К - норматив оперативного контроля погрешности (составляет
д
20%);
С - расчетное значение величины добавки, мкг/куб. см.
д
При превышении норматива оперативного контроля погрешности
эксперимент повторяют, выясняют причины, приводящие к
неудовлетворительным результатам контроля, и устраняют их.
Таблица 17
МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕТОДА
---------------------T-------------------T-----------------------¬
¦ Характеристика ¦ Тиамин ¦ Рибофлавин ¦
+--------------------+-------------------+-----------------------+
¦Предел обнаружения ¦0,005 мкг в 1 мл ¦0,006 мкг в 1 мл ¦
¦ ¦гидролизата ¦гидролизата ¦
+--------------------+-------------------+-----------------------+
¦Воспроизводимость, %¦ 3 ¦ 3 ¦
+--------------------+-------------------+-----------------------+
¦Правильность, % ¦ 98,1 ¦ 98,7 ¦
L--------------------+-------------------+------------------------
4. Флуориметрический метод определения
рибофлавина (витамин В-2) титрованием
рибофлавинсвязывающим апобелком
Принцип метода основан на способности рибофлавинсвязывающего
апобелка при связывании с рибофлавином полностью тушить его
флуоресценцию.
Реактивы и их приготовление
0,1 н. соляная кислота (НСl).
К дистиллированной воде добавляют 0,8 куб. см концентрированной
(ро = 1,19 г/куб. см) соляной кислоты по ГОСТ 3118-77, объем
доводят до 100 куб. см.
Стандартный раствор рибофлавина (С17Н20N4О6) концентрацией 100
мкг/куб. см.
5 мг рибофлавина растворяют при нагревании на водяной бане при
70 град. C в 45 куб. см 0,1 н соляной кислоты (раствор 1). После
охлаждения объем доводят до 50 куб. см. Концентрацию рибофлавина
уточняют спектрофотометрически по коэффициенту молярной экстинкции
(Прилож. 3). Раствор можно хранить в холодильнике в течение 6 мес.
Рабочий стандартный раствор (концентрация рибофлавина 2
мкг/куб. см).
Перед определением к 1 куб. см стандартного раствора добавляют
дистиллированную воду в мерной колбе до объема 50 куб. см.
4 М фосфат калия однозамещенный (K2HPO4).
54,4 г К2НРO4 растворяют в дистиллированной воде, объем доводят
до 100 куб. см.
Рибофлавинсвязывающий апобелок (РбСБ) со связывающей
способностью 5-15 мкг рибофлавина на 1 мг белка.
Можно использовать коммерческий препарат (Sigma, США, R 8628)
или выделить его из белка куриного яйца по методу, изложенному в
Прилож. 3.
Средства измерений
Спектрофлуориметр F-2000 (Hitachi, Япония) или аналогичный по
оптическим характеристикам.
Условия измерения
Интенсивность флуоресценции измеряют в кварцевой кювете
объемом 3 куб. см с длиной оптического пути 1 см при длине волны
возбуждающего света лямбда = 465 нм, испускаемого лямбда
возб. фл
= 525 нм.
Приготовление кислотного гидролизата
3 таблетки (драже) или содержимое 3 капсул растирают и
тщательно перемешивают в ступке. При расчете массы навески исходят
из того, чтобы в 1 куб. см гидролизата содержалось не более 5 мкг
рибофлавина. К навеске (100-500 мг в зависимости от содержания
витамина) добавляют 100 куб. см 0,1 н. НСl и помещают на кипящую
водяную баню на 40 мин. Затем пробы охлаждают до комнатной
температуры, доводят объем дистиллированной водой до 100 куб. см и
при необходимости фильтруют.
В случае необходимости разводят гидролизат до концентрации
рибофлавина около 0,5 мкг/куб. см или уменьшают количество
гидролизата, взятого на анализ, с таким расчетом, чтобы
интенсивность флуоресценции опытной пробы (о - к) была сопоставима
с интенсивностью флуоресценции добавленного в пробу стандарта (с -
о).
Ход определения
К 0,1 куб. см кислотного гидролизата добавляют равный объем 4 М
К2НРO4 и дистиллированную воду до 3 куб. см, измеряют
флуоресценцию (о), добавляют 0,03 куб. см стандартного раствора
рибофлавина концентрацией 2 мкг/куб. см. После перемешивания
повторяют измерение (с). Затем добавляют по 0,03 куб. см раствора
РбСБ, перемешивают, измеряют флуоресценцию после каждой добавки
белка. Добавление белка продолжают до тех пор, пока флуоресценция
после двух добавок перестает снижаться (к). Разница интенсивности
флуоресценции (о - к) пропорциональна количеству рибофлавина в
гидролизате. Необходимое количество РбСБ подбирают эмпирически.
Обработка результатов
Содержание рибофлавина в 1 таблетке (мг):
(о - к) х 0,06 х V x M
С = -----------------------,
рб (c - o) x V x m x 1000
1
где:
0,06 - количество рибофлавина, внесенное в кювету, мкг;
V - исходный объем гидролизата, куб. см;
М - масса таблетки БАД, г;
V - объем гидролизата, внесенного в пробу, куб. см;
1
m - навеска измельченных таблеток, взятая на анализ, г;
1000 - перевод мкг в мг.
Таблица 18
МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕТОДА
-----------------------------------T-----------------------------¬
¦Предел обнаружения ¦0,03 мкг в 1 мл гидролизата ¦
+----------------------------------+-----------------------------+
¦Воспроизводимость, % ¦ 6,4 ¦
+----------------------------------+-----------------------------+
¦Правильность, % ¦ 97,1 ¦
+----------------------------------+-----------------------------+
¦Относительная сходимость, % ¦ 18 ¦
L----------------------------------+------------------------------
5. Метод определения аскорбиновой кислоты
(витамин С)
Определение витамина С в биологически активных добавках к пище
основано на определении непосредственно аскорбиновой кислоты (АК)
без учета окисленной формы витамина С - дегидроаскорбиновой
кислоты (ДАК).
Для целей рутинного анализа наиболее легко и доступно
определение методом визуального титрования с использованием
количественного окисления АК раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята
натрия. Однако этот метод применим только для объектов
исследования, дающих светлоокрашенные экстракты. В других случаях
используют метод потенциометрического титрования,
спектрофотометрические и флуорометрический методы анализа, которые
применимы для любых объектов исследования.
Аппаратура, материалы и реактивы
Спектрофотометр с диапазоном измерения от 220 до 1100 нм или
фотоэлектроколориметр с диапазоном измерения от 364 до 2980 нм с
диапазоном измерения коэффициента пропускания от 100 до 1%.
Флуориметр типа "Квант" с набором светофильтров или
спектрофлюориметр.
Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с
наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.
Весы лабораторные общего назначения 4-го класса точности с
наибольшим пределом взвешивания 500 г по ГОСТ 24104.
Секундомер 2-го класса или часы 2-го класса.
pН-метр-милливольтметр лабораторный для измерения pH и
окислительно-восстановительных потенциалов с диапазонами от минус
1 до плюс 14 мВ и погрешностью не более +/- 0,05 при измерении pH
и диапазонами от минус 100 до плюс 1400 мВ и погрешностью не более
+/- 5 мВ при измерении окислительно-восстановительных потенциалов.
При измерении окислительно-восстановительных потенциалов
используют электроды: измерительный - платиновый, вспомогательный
- хлорсеребряный.
Термостат с поддержанием заданного режима от 0 до 60 град. C с
погрешностью +/- 0,8 град. C.
Термометр жидкостный с диапазоном измерения от 0 до 100 град. C
с ценой деления шкалы 1 град. C.
Мешалка магнитная с плавным регулированием частоты вращения.
Воронки стеклянные лабораторные типа В по ГОСТ 25336.
Колбы мерные лабораторные стеклянные номинальной вместимостью
50, 100, 500, 1000 куб. см по ГОСТ 1770.
Колбы типа Кн исполнения 2 номинальной вместимостью 50, 100,
250, 750 куб. см по ГОСТ 25336.
Микробюретка по ГОСТ 20292 с ценой деления не более 0,01 куб.
см.
Палочки стеклянные.
Пипетки мерные лабораторные стеклянные по ГОСТ 20292
номинальной вместимостью 1, 2, 5, 10 куб. см ценой деления шкалы
0,1 куб. см.
Стаканы типа В исполнения 1 номинальной вместимостью 50, 100,
400, 1000 куб. см по ГОСТ 25336.
Ступка фарфоровая с пестиком по ГОСТ 9147.
Цилиндры мерные лабораторные стеклянные вместимостью 100, 250
куб. см по ГОСТ 1770.
Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.
Бумага масштабно-координатная (миллиметровая) по ГОСТ 334.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Ацетон по ГОСТ 2603.
Кислота азотная по ГОСТ 4461 плотностью 1,41 г/куб. см, раствор
с объемной долей 25%.
Кислота аскорбиновая по ГФ XI изд., растворы массовых
концентраций 1,0 и 0,1 г/куб. дм.
Кислота борная, ч.
Кислота серная ос.ч. или ч.д.а. (предпочтительней по Савалю).
Кислота соляная плотностью 1,19 г/куб. см, х.ч., раствор с
массовой долей 2%.
Кислота трихлоруксусная, х.ч., раствор с массовой долей 3%.
Кислота фосфорная (мета), ч. по ГОСТ 841, растворы с массовой
долей 3 и 6%.
Кислота уксусная ледяная, ч.д.а. или х.ч. по ГОСТ 61, раствор с
массовой долей 3%.
Кислота хлорная, раствор молярной концентрации 0,1 моль/куб.
дм. Готовят перед обработкой электродов.
Кислота щавелевая, раствор с массовой долей 2%.
Ксилол.
Натрий 2,6-дихлорфенолиндофенолят. х.ч., Serva.
Натрий уксуснокислый, 3-водный, ч.д.а. по ГОСТ 199.
О-Фенилендиамин, раствор 0,2 г/куб. дм.
Формальдегид, 36-40%-ный раствор.
Уголь активированный.
L-цистеин солянокислый или L-цистеин, 50 мг в 1 куб. см 2%-ного
раствора соляной кислоты.
Этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) или трилон Б (динатриевая соль
этилендиамина-N,N',N'-тетрауксусной кислоты, 2-водная, ч.д.а.).
Эфир уксусной кислоты бутиловый (бутилацетат), х.ч.
Допускается применение других средств измерений с
метрологическими характеристиками и оборудования с техническими
характеристиками не хуже, а также реактивов и материалов по
качеству не ниже вышеуказанных.
Хранение растворов по ГОСТ 4212.
Методы отбора проб
Подготовка средней пробы к анализу
Подготовка проб к анализу производится непосредственно перед
анализом. Выделение витамина необходимо осуществлять возможно
быстрее, без использования повышенной температуры, не на ярком
свету и при минимальном контакте образца с кислородом воздуха.
Дражированная форма
Из средней пробы драже отбирают 10-15 шт., взвешивают их и
определяют вес одной штуки, затем тщательно растирают и
перемешивают в фарфоровой ступке.
Таблетированная форма
Из средней пробы таблеток отбирают 3-7 шт., взвешивают их и
определяют вес одной штуки, затем тщательно растирают и
перемешивают в фарфоровой ступке.
Капсулированная форма
Из средней пробы капсул с порошкообразным содержимым отбирают 3-
7 шт., взвешивают их и определяют вес одной штуки за вычетом массы
оболочки, затем содержимое капсул тщательно растирают и
перемешивают в фарфоровой ступке.
Из средней пробы "жировых" капсул отбирают 3-7 шт., взвешивают
их, затем осторожно вскрывают, содержимое капсул тщательно
перемешивают. Оболочки капсул отмывают органическим растворителем
(ацетоном, гексаном и др.), высушивают и взвешивают. Затем
высчитывают массу содержимого одной капсулы.
Кристаллические витаминные препараты (субстанции и премиксы)
Пробу витаминных препаратов отбирают в количестве 5-10 г и
тщательно перемешивают.
Порошкообразная форма
Среднюю пробу порошкообразных веществ (сухие напитки, сухие
молочные смеси и каши для детского питания и т.д.) отбирают в
количестве 25-50 г. Перед взятием пробы порошок тщательно
перемешивают.
Примечание. При исследовании равномерности перемешивания
сыпучих продуктов, расфасованных в порционные упаковки,
целесообразно при проведении анализа использовать порционную
упаковку исследуемого образца целиком.
Жидкие витаминные препараты и обогащенные продукты
Жидкие витаминные препараты и обогащенные продукты в количестве
50-100 куб. см осторожно, избегая аэрации, перемешивают путем
многократного переворачивания склянки, содержащей пробу.
Витаминизированные кондитерские изделия (конфеты, вафли,
батончики, бисквиты и др.)
Пробу штучных изделий берут в количестве не менее 100-200 г (в
зависимости от содержания витамина), взвешивают, определяют вес
единицы изделия, а затем подвергают размельчению и растиранию в
ступке.
Подготовка аналитической пробы
Из измельченной и перемешанной пробы берут навеску не менее 0,5-
1 г, взвешенную с погрешностью +/- 0,0001 г. При расчете массы
необходимой навески можно пользоваться следующей формулой:
10 x V
общ
m = ------------,
V x B
пр заявл
где:
m - навеска исследуемого образца, г;
V - общий объем экстракта, мл;
общ
V - объем экстракта, взятого на титрование, мл;
пр
В - заявленное содержание АК в исследуемом образце,
заявл
мг/100 г.
Навески жидких проб (витаминизированные соки, напитки и т.п.)
отбирают пипеткой. Навески проб густой консистенции (сиропы,
концентраты и пр.), плохо стекающие из пипетки, берут весовым
путем подобно твердым продуктам. Затем в этих пробах определяют по
общим правилам плотность для пересчета содержания витамина на
единицу объема.
5.1. Определение витамина С в образцах,
дающих неокрашенные или слабоокрашенные экстракты
Сущность метода
Определение витамина С в образцах, дающих неокрашенные или
слабоокрашенные экстракты основано на экстрагировании аскорбиновой
кислоты или ее солей раствором кислоты (соляной, щавелевой,
трихлоруксусной, метафосфорной или смесью уксусной и
метафосфорной) с последующим визуальным титрованием раствором 2,6-
дихлорфенолиндофенолятом натрия до установления светло-розовой
окраски.
Подготовка к выполнению измерения (испытанию)
Выбор экстрагирующего раствора
Таблица 19
ЭКСТРАГИРУЮЩИЕ АГЕНТЫ
------------------------T----------------------------------------¬
¦ Экстрагирующий агент ¦ Область применения ¦
+-----------------------+----------------------------------------+
¦ 1 ¦ 2 ¦
+-----------------------+----------------------------------------+
¦2% соляная кислота ¦Дражированные, таблетированные, ¦
¦ ¦капсулированные, кристаллические формы ¦
¦ ¦БАД, обогащенные продукты питания, без ¦
¦ ¦длительного хранения экстрактов. ¦
¦ ¦Исключая продукты с высоким содержанием ¦
¦ ¦белка ¦
+-----------------------+----------------------------------------+
¦2% щавелевая кислота ¦То же, но возможно хранение экстрактов в¦
¦ ¦течение 4-5 ч ¦
+-----------------------+----------------------------------------+
¦3% трихлоруксусная ¦Для всех видов БАД и обогащенных ¦
¦кислота ¦продуктов питания, включая продукты с ¦
¦ ¦высоким содержанием белка ¦
+-----------------------+----------------------------------------+
¦Смесь уксусной и ¦То же ¦
¦метафосфорной кислот ¦ ¦
+-----------------------+----------------------------------------+
¦6% метафосфорная ¦То же, возможно хранение экстракта в ¦
¦кислота ¦течение 4-5 ч ¦
L-----------------------+-----------------------------------------
При выборе экстрагирующего агента также следует учитывать
влияние мешающих определению компонентов исследуемой матрицы
(табл. 20).
Таблица 20
КОМПОНЕНТЫ, МЕШАЮЩИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЮ АК
----------------------------T------------------------------------¬
¦ Компоненты, мешающие ¦ Устранение влияния мешающих ¦
¦ определению ¦ компонентов ¦
+---------------------------+------------------------------------+
¦Диоксид серы (SO2) ¦В экстракт добавляют объем ацетона, ¦
¦ ¦равный 1/5 части массы навески ¦
+---------------------------+------------------------------------+
¦Наличие ионов двухвалентных¦Экстрагирование проводят смешивая ¦
¦ 2+ 2+ 2+ ¦равные объемы 0,18% раствора ЭДТА и ¦
¦металлов (Fe , Cu , Sn ¦6% раствора метафосфорной кислоты ¦
¦и др.) ¦(3% раствора ТХУ) ¦
+---------------------------+------------------------------------+
¦Высокое содержание жира ¦Использование в качестве ¦
¦ ¦экстрагирующего агента смеси 6% ¦
¦ ¦раствора метафосфорной кислоты и ¦
¦ ¦ацетона в соотношении 1:3 ¦
+---------------------------+------------------------------------+
¦Жирорастворимые витамины в ¦Аналитическую пробу исследуемого БАД¦
¦составе "жировых" капсул ¦перед проведением экстракции следует¦
¦ ¦предварительно растворить в неболь- ¦
¦ ¦шом объеме органического растворите-¦
¦ ¦ля (эфир, хлороформ, гексан) ¦
+---------------------------+------------------------------------+
¦Восстанавливающие сахара ¦Обработка экстракта формалином при ¦
¦(редуктоны) ¦pH 3,5 приводит к полной дезактива- ¦
¦ ¦ции АК, при pH 0 - редуктонов ¦
+---------------------------+------------------------------------+
¦Сульфгидрильные соединения ¦Обработка экстракта 5% раствором ¦
¦(цистеин, глутатион ¦уксуснокислого свинца ¦
¦восстановленный, белки, ¦ ¦
¦танин и т.п.) ¦ ¦
+---------------------------+------------------------------------+
¦Наличие в исследуемом ¦В процессе экстрагирования следует ¦
¦образце большого количества¦добавить к объекту исследования 2- ¦
¦зерновых ¦5 куб. см метанола ¦
L---------------------------+-------------------------------------
Приготовление экстрагирующего раствора
Приготовление водного раствора соляной кислоты массовой
концентрации 20 г/куб. дм (2%)
47,5 куб. см 36%-ной соляной кислоты доводят до метки в 1000
куб. см мерной колбе дистиллированной водой.
Приготовление водного раствора трихлоруксусной кислоты массовой
концентрации 30 г/куб. дм (3%)
30 г кристаллической трихлоруксусной кислоты доводят до метки в
1000 куб. см мерной колбе дистиллированной водой.
Приготовление водного раствора метафосфорной кислоты массовой
концентрации 60 г/куб. дм
Взвешивают 60,00 г растертой в ступке метафосфорной кислоты на
весах 4-го класса точности, растворяют без нагревания в 100-200
куб. см дистиллированной воды в мерной колбе вместимостью 1000
куб. см, доводят дистиллированной водой до метки, перемешивают и
фильтруют. Раствор хранят при (6 +/- 2) град. C не более 7 сут.
Приготовление водного раствора метафосфорной кислоты массовой
концентрации 30 г/куб. дм
Необходимый для измерения объем водного раствора метафосфорной
кислоты массовой концентрации 60 г/куб. дм смешивают с
дистиллированной водой в соотношении 1:1. Раствор готовят
непосредственно перед применением.
Приготовление водного раствора трилона Б
(этилендиаминтетраацетат натрия) молярной концентрации с = 0,05
моль/куб. дм
Взвешивают 1,8 г трилона Б на весах 2 класса точности и
растворяют в 100-300 куб. см дистиллированной воды в мерной колбе
вместимостью 1000 куб. см, доливая дистиллированную воду до метки.
Приготовление смеси водного раствора трилона Б
(этилендиаминтетраацетат натрия) молярной концентрации с = 0,05
моль/куб. дм и раствора метафосфорной кислоты массовой
концентрации 60 г/куб. дм или раствора трихлоруксусной кислоты
массовой концентрации 30 г/куб. дм (раствор осадителя)
Отмеряют цилиндром 300 куб. см водного раствора метафосфорной
кислоты массовой концентрации 60 г/куб. дм (или водного раствора
трихлоруксусной кислоты массовой концентрации 30 г/куб. дм) и 300
куб. см раствора трилона Б (этилендиаминтетраацетат натрия)
молярной концентрации с = 0,05 моль/куб. дм в коническую колбу
объемом 750 куб. см и перемешивают. Раствор готовят
непосредственно перед применением.
Приготовление смеси уксусной и метафосфорной кислот
К раствору 15 г метафосфорной кислоты в 200 куб. см
дистиллированной воды добавляют 40 куб. см ледяной уксусной
кислоты и доводят дистиллированной водой до 500 куб. см. Хранят в
склянке с притертой пробкой в холодильнике в течение 7 дней.
Приготовление стандартного раствора АК
Растворяют 0,1000 г (точная навеска) аскорбиновой кислоты,
отвечающей требованиям ГФ XI, в мерной колбе емкостью 100 куб. см
в выбранном экстрагирующем растворе и доводят тем же раствором до
метки, 10 куб. см полученного раствора АК помещают в мерную колбу
на 100 куб. см и доводят до метки раствором, используемым в
качестве экстрагирующего. Раствор готовят непосредственно перед
применением.
Приготовление раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия
(раствор красителя) и определение его титра
Взвешивают 0,100 г 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия на весах
2 класса точности, растворяют, тщательно перемешивая, в 250 куб.
см свежекипяченой дистиллированной воды температурой (90 +/- 5)
град. C, содержащей около 50 мг бикарбоната натрия. После
охлаждения раствора до (20 +/- 5) град. C доводят до метки
дистиллированной водой в мерной колбе вместимостью 500 куб. см,
затем фильтруют через складчатый фильтр в склянку из темного
стекла. Раствор хранят при (6 +/- 2) град. C не более 1 месяца.
Определение титра
К 1 мл стандартного раствора АК добавляют 9 куб. см выбранного
экстрагирующего раствора и титруют раствором
2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия до розового окрашивания, не
исчезающего в течение 15-20 с (V ). Таким же образом титруют 10
т
куб. см экстрагирующего раствора (V ). Поправку к титру раствора
к
(Т) в мг АК, эквивалентных 1 мл раствора
2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия, вычисляют по формуле:
K
T = ---------,
(V - V )
т к
где К - количество АК в 1 мл стандартного раствора, мг.
Приготовление раствора ацетатного буфера с pH 4,0
Растворяют 30 г безводного уксуснокислого натрия в 70 куб. см
дистиллированной воды и, добавляя ледяную уксусную кислоту (около
100 куб. см), потенциометрически доводят pH до 4,0.
Приготовление раствора ацетатного буфера с рH 5,0
Растворяют 30 г безводного уксуснокислого натрия в 70 куб. см
дистиллированной воды и, добавляя ледяную уксусную кислоту (около
50 куб. см), потенциометрически доводят pH до 5,0.
Приготовление 1,0 М раствора соляной кислоты
17,2 мл 36% соляной кислоты разбавляют дистиллированной водой в
мерной колбе емкостью на 200 куб. см и доводят до метки
дистиллированной водой.
Приготовление 1,0 М раствора ацетата натрия
82,0 г безводного ацетата натрия растворяют в мерной колбе
емкостью 1000 куб. см дистиллированной водой и доводят до метки.
Приготовление солянокислого буфера с pH 5,2
К 40 куб. см 1,0 М раствора соляной кислоты приливают 200 куб.
см 1,0 М раствора ацетата натрия и доводят до метки
дистиллированной водой в мерной колбе емкостью 1000 куб. см.
Проведение испытания
Экстрагирование
Для приготовления экстракта рассчитанную массу навески
взвешивают с погрешностью +/- 0,0001 г. Затем гомогенизируют ее с
небольшим количеством выбранного экстрагирующего агента. После
чего полученный гомогенат количественно переносят в мерную колбу
или мерный цилиндр объемом V , доводят до метки экстрагирующим
общ
агентом, тщательно перемешивают, настаивают 5-10 мин. и
фильтруют через складчатый фильтр или центрифугируют. Для жидких
пищевых добавок необходимое количество материала отмеривают
пипеткой и доводят до метки экстрагирующим агентом в
соответствующей мерной колбе.
Визуальное титрование
Для определения АК 1-10 мл экстракта с общим содержанием АК
около 0,1 мг вносят пипеткой в коническую колбу вместимостью 50
или 100 куб. см, доводят объем экстрагентом до 10 куб. см и
титруют раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия до слабо-
розового окрашивания, не исчезающего в течение 15-20 с. Аналогично
титруют равный объем экстрагирующего агента (контроль на
реактивы)*.
Обработка результатов измерения
Содержание АК (X), выраженное в мг на 1 г пищевой добавки,
вычисляют по формуле:
T x (V - V ) x V
т к общ
X = --------------------,
V x m
пр
где:
Т - титр раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия, мг/куб.
см ;
V - объем раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия,
т
пошедший на титрование исследуемого раствора, куб. см;
V - объем раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия,
к
пошедший на контрольное испытание, куб. см;
остальные обозначения см. выше.
Для пищевых добавок, содержащих редуцирующие примеси, вместо
контроля на реактивы проводят контрольное испытание на присутствие
этих примесей. Для этого в колбу помещают такой же объем
экстракта, как для определения АК, прибавляют равный ему объем
ацетатного буферного раствора с pH 4,0, 36-40%-ный раствор
формальдегида в объеме, равном половине объема буферного раствора,
перемешивают и выдерживают в течение 10 мин., закрыв
предварительно колбу пробкой. Затем содержимое титруют раствором
2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия.
За окончательный результат принимают среднее арифметическое
результатов двух параллельных определений и не менее чем с двумя
различными навесками, различающимися не более чем на 10%.
Чувствительность визуального титрования составляет 5 мкг/куб. см.
5.2. Определение витамина С в образцах,
дающих окрашенные экстракты
Флуориметрический метод определения
Этот метод рассмотрен в "Руководстве по методам анализа
качества и безопасности пищевых продуктов", 1998.
Метод индофенол-ксилольной экстракции
Этот метод рассмотрен в сборнике научных трудов "Теоретические
и клинические аспекты науки о питании", т. VIII, 1987, с. 178-180.
Колориметрический анализ АК в водной среде
Приготовление экстракта и реактивов см. в п. 5.2.
Проведение анализа. Готовят растворы в следующей
последовательности (табл. 21).
Таблица 21
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ДОБАВЛЕНИЯ РЕАГЕНТОВ
В КОЛОРИМЕТРИЧЕСКОМ МЕТОДЕ
------T----------------------T-----------------------------------¬
¦N ¦ Реагент ¦ N раствора (колбы) ¦
¦опе- ¦ +------T------T------T------T-------+
¦ра- ¦ ¦ 1 ¦ 1* ¦ 2 ¦ 3 ¦ 3* ¦
¦ции ¦ +------+------+------+------+-------+
¦ ¦ ¦конт- ¦проба ¦стан- ¦экс- ¦проба ¦
¦ ¦ ¦роль ¦срав- ¦дарт ¦тракт ¦сравне-¦
¦ ¦ ¦ ¦нения ¦ ¦ ¦ния ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦экс- ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦тракта ¦
+-----+----------------------+------+------+------+------+-------+
¦1. ¦Ацетатный буфер, pH ¦2,5 мл¦2,5 мл¦2,5 мл¦2,5 мл¦2,5 мл ¦
¦ ¦5,0* ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-----+----------------------+------+------+------+------+-------+
¦2. ¦Экстракт ¦- ¦- ¦- ¦5 мл ¦5 мл ¦
+-----+----------------------+------+------+------+------+-------+
¦3. ¦Стандартный раствор АК¦- ¦- ¦0,5 мл¦- ¦- ¦
+-----+----------------------+------+------+------+------+-------+
¦4. ¦Экстрагирующий агент ¦5 мл ¦5 мл ¦4,5 мл¦- ¦- ¦
¦ ¦(3% НРО3 или 2% НСl) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-----+----------------------+------+------+------+------+-------+
¦5. ¦Дистиллированная вода ¦- ¦2 мл ¦- ¦- ¦2 мл ¦
+-----+----------------------+------+------+------+------+-------+
¦6. ¦Фенолят ¦2 мл ¦- ¦2 мл ¦2 мл ¦- ¦
L-----+----------------------+------+------+------+------+--------
При экстракции 2% НСl на анализ берут по 5 куб. см ацетатного
буфера.
При большой концентрации АК или интенсивной окраске экстракта
берут меньше 5 куб. см экстракта, добавляя в растворы N 3 и 3*
количество экстрагирующего агента, равное 5 куб. см, минус объем
пробы. Измеряют поглощение фенолята (избытка) в пробах N 1-3 при
лямбда = 540 нм.
Содержание АК (X), выраженное в мг на 100 г исследуемого
образца, рассчитывают по формуле:
K x (D - D ) x V x 100
1 3 общ
X = --------------------------,
D x V x m
1-2 пр
где:
К - количество АК в 0,5 куб. см стандартного раствора, взятого
на определение, мг;
D - поглощение фенолята в контрольном растворе (N 1) против
1-2
поглощения фенолята в растворе стандарта (N 2);
D - поглощение фенолята в контрольном растворе N 1 (кювета
|
