|
Стр. 10
скорость подвижной фазы 1,0-1,5 мл/мин., аликвота, вводимая в
инжектор, 10-15 мкл; чувствительность рефрактометрического
детектора устанавливают таким образом, чтобы ввод 100 мкг
фруктозы, глюкозы или сахарозы соответствовал отклонению пера на
полную шкалу самописца при уровне шума от 1 до 3% от полной шкалы;
входное напряжение регистрирующего потенциометра (самописца) или
интегратора 10 mV.
Ориентировочный порядок времен удерживания углеводов в минутах
при использовании амино-фазы: фруктоза - 6 +/- 2, сорбит - 6,5 +/-
2, глюкоза - 7,5 +/- 1, сахароза - 10 +/- 1.
Анализ ВЭЖХ с использованием колонки и предколонки с
++
катионитом в форме Са
Условия ВЭЖХ: катионообменная колонка и предколонка "Rezex
++
RCU-USP Sugar Alcohols" в форме Са , температура колонки 80-90
град. C, подвижная фаза бидистиллированная, деионизированная и
фильтрованная вода, скорость подвижной фазы 0,4-0,8 мл/мин.,
аликвота, вводимая в инжектор, 10-15 мкл; чувствительность
хроматографа устанавливается таким образом, чтобы 30 мкг фруктозы,
глюкозы и сорбита соответствовало отклонению пера на полную шкалу
самописца при уровне шума от 1 до 3% от полной шкалы; входное
напряжение регистрирующего потенциометра (самописца) или
интегратора 10 mV.
Ориентировочный порядок времен удерживания углеводов в минутах
++
при использовании колонки и предколонки с катионитом в форме Са :
сахароза - 10 +/- 1, глюкоза - 12 +/- 0,5, фруктоза - 14,5 +/-
0,2, сорбит - 22 +/- 0,5.
Предел обнаружения метода 0,02-0,05%. Стандартное отклонение
сходимости (Sr) при концентрации сахаров 10% не превышает 0,05-
0,07. Среднее значение открываемости от внесенного количества
сахаров - 97-99%.
Перед работой хроматограф калибруют, для чего в инжектор с
помощью микрошприца вводят 0,002, 0,005 и 0,01 куб. см стандартной
смеси углеводов, что соответствует количествам 20, 50 и 100 мкг
фруктозы, глюкозы и сахарозы (детектор RIDK 102) или 6, 15 и 30
мкг (детектор MERK L 7490). Для каждого количества углеводов
определяют площадь пика на хроматограмме. Аналогичным образом
проводят калибровку стандартного раствора сорбита.
Количественное определение углеводов
Идентификацию и количественное определение углеводов
осуществляют методом внешних стандартов.
В инжектор хроматографа вводят 0,01 куб. см (10 мкл) фильтрата.
Определяют площадь пика углевода, соответствующего по времени
удерживания одному из стандартов. Расчет концентрации фруктозы,
глюкозы, сорбита и сахарозы проводят по формуле:
V х m х S
1 обр
С = --------------------, %,
V x M x S x 10000
2 ст
где:
С - концентрация углевода в образце, %;
V - объем, до которого доведена навеска при разбавлении
1
водой, куб. см (100 куб. см);
V - объем фильтрата, внесенный в хроматограф, 0,01 куб. см;
2
m - масса стандарта, введенного в хроматограф, мкг;
М - навеска образца, взятая для анализа, г.
Если пик углевода в образце выходит за пределы шкалы
самописца, анализ проводят повторно после разбавления фильтрата
водой, т.е. после увеличения объема V .
1
5. Определение массовой концентрации кофеина,
теобромина, теофиллина
Принцип метода
Метод определения массовой концентрации кофеина, теобромина,
теофиллина в пищевых продуктах, БАД и безалкогольных напитках
основан на применении высокоэффективной жидкостной хроматографии
(ВЭЖХ).
Метод анализа кофеина и теофиллина в БАД включает следующие
этапы:
- экстракцию пуриновых алкалоидов из БАД в дистиллированной
воде при нагревании;
- фильтрование полученного раствора;
- обнаружение и количественное определение с помощью ВЭЖХ с УФ-
детектором с использованием метода внешнего стандарта.
Метод анализа теобромина, теофиллина и кофеина в пищевых
продуктах и БАД на основе какао включает следующие этапы:
- экстракцию в дистиллированной воде, pH 7,3-7,8, при
нагревании;
- переэкстракцию в хлороформ;
- переэкстракцию в фосфатный буфер, pH 3,0;
- фильтрование полученного раствора;
- обнаружение и количественное определение пуриновых алкалоидов
с помощью ВЭЖХ с УФ-детектором с использованием метода внешнего
стандарта.
Средства измерений, материалы и реактивы
Жидкостной хроматограф с насосом высокого давления с подачей
растворителя от 0,1 до 5,0 куб. см/мин., оборудованный
спектрофотометрическим детектором с переменной длиной волны и
системой для сбора и обработки хроматографических данных
МультиХром, версия 1,5х (Амперсенд, Россия).
Колонка и предколонка хроматографические с силикагелем,
химически связанным с октадецилсиланом (силикагель С18), с
размером частиц 5 мкм; длина колонки - 25 см, предколонки - 4,5
см, внутренний диаметр колонок - 0,46 см.
Микрошприцы МШ-10 и МШ-25 для жидкостной хроматографии.
Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С, ТУ 64-1-2451-78.
Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим
пределом взвешивания 200 г и погрешностью +/- 0,0001 г.
Дистиллятор.
pH-метр, модель "pH 150М".
Колбы мерные наливные 2-50-2, 2-100-2, 2-250-2, 1-1000-2 по
ГОСТ 1770.
Пипетки 4-1-2 или 5-1-2, 4-2-10 или 5-2-10, 4-2-25 или 5-2-25
по ГОСТ 29227.
Термометр жидкостный стеклянный с пределами измерения 0-100
град. C и ценой деления 1 град. C по ГОСТ 28498.
Ацетонитрил, ч., ТУ 6-09-3534-74.
Бумага фильтровальная "красная лента" и "синяя лента" по ТУ 6-
09-1678-95.
Баллон с сжатым азотом марки ПНГ.
Вода дистиллированная, ГОСТ 6709.
Калий фосфорнокислый однозамещенный, ч., ГОСТ 6552, раствор
массовой концентрацией 2,72 г/куб. дм, доведенный до pH 3,2
добавлением 2-2,5 куб. см ортофосфорной кислоты.
Кислота уксусная, ГОСТ 61-75, ч.д.а.
Кислота о-фосфорная, ч., ГОСТ 6552.
Кофеин, теобромин, теофиллин по действующей нормативно-
технической документации.
Натрий гидроокись, х.ч., ГОСТ 4228, раствор массовой
концентрации 0,4 г/куб. дм.
Натрий хлористый, х.ч., ГОСТ 4233.
Подготовка к проведению измерений
Приготовление рабочих растворов кофеина, теобромина, теофиллина
(400 мг/куб. см)
Навески массой по 100,0 +/- 0,1 мг помещают в мерные колбы
вместимостью 250 куб. см, до половины заполненные дистиллированной
водой. Перемешивают до полного растворения, затем доводят
дистиллятом до метки и перемешивают.
Приготовление стандартных растворов кофеина, теобромина,
теофиллина (0,004 мг/куб. см)
Отмеряют пипеткой по 2,0 куб. см каждого рабочего раствора
кофеина, теобромина, теофиллина концентрациями 400 мг/куб. см,
переносят в мерные колбы вместимостью 250 куб. см, доводят до
метки дистиллированной водой и перемешивают.
Приготовление подвижной фазы
Приготовление подвижной фазы для анализа кофеина
50 куб. см ацетонитрила помещают в мерную колбу вместимостью
1000 куб. см, добавляют 10 куб. см уксусной кислоты, доводят
дистиллированной водой до метки и перемешивают. Полученный раствор
фильтруют через фильтровальную бумагу "красная лента".
Приготовление подвижной фазы для анализа смеси алкалоидов
2,72 г калия фосфорнокислого однозамещенного помещают в мерную
колбу вместимостью 1000 куб. см, растворяют в дистиллированной
воде, перемешивают до полного растворения, доводят
дистиллированной водой до метки. Полученный раствор ортофосфорной
кислотой доводят до pH 3,2 (2-2,5 куб. см). 850 куб. см
полученного буферного раствора смешивают с 150 куб. см
ацетонитрила и полученный раствор фильтруют через фильтровальную
бумагу "красная лента".
Подготовка образцов
Образцы тонизирующих напитков ("Кола", тоники) подвергают по
необходимости дегазации по ГОСТ 6687.2 при температуре не более 25
град. C и отфильтровывают через бумажный фильтр. Аликвоту напитков
(2-5 куб. см) помещают в мерную колбу вместимостью 250 куб. см,
доводят дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивают.
Навеску пищевого продукта (2-5 +/- 0,01 г) (например, чай,
кофе), БАД на основе натуральных растительных компонентов гуараны,
орехов колы, листьев матэ и др. (5-10 капсул или таблеток,
растертых в ступке) помещают в мерную колбу вместимостью 250 куб.
см, добавляют до половины объема подогретой до 70-80 град. C
дистиллированной воды, встряхивают на аппарате для встряхивания в
течение 15-20 мин., охлаждают до комнатной температуры, доводят
дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают.
Фильтруют через бумажный фильтр с размером пор 0,5 мкм.
Навеску кондитерского изделия (10-20 +/- 0,01 г), содержащего
какао-порошок (карамели, шоколад, ореховые пасты, глазурь и др.),
измельченную на терке или в ступке, помещают в коническую колбу
вместимостью 250 куб. см и добавляют 100 куб. см дистиллированной
воды, подщелоченной 5-10 каплями раствора гидроокиси натрия (pH
7,5-8,0). Смесь подогревают до температуры 45-50 град. C,
перемешивают на аппарате для встряхивания 20-30 мин., фильтруют
через бумажный фильтр "красная лента" и отбирают 80 куб. см
фильтрата. Если фильтрация затруднена, смесь центрифугируют при
2000 об./мин. и также отбирают 80 куб. см. К фильтрату добавляют
1,5-2 г хлористого натрия, перемешивают до растворения соли и
переносят в делительную воронку. Пуриновые алкалоиды из водного
раствора экстрагируют 50 куб. см хлороформа. Хлороформный раствор
отделяют и встряхивают с 50 куб. см раствора калия фосфорнокислого
однозамещенного, pH 3,2, после чего водный экстракт фильтруют
через бумажный складчатый фильтр "синяя лента". Остатки хлороформа
из фильтрата удаляют в токе азота. Аликвоту полученного экстракта
вводят в хроматограф. При анализе используют метод внешнего
стандарта.
Проведение анализа ВЭЖХ и расчет
концентрации пуриновых оснований
Условия ВЭЖХ для хроматографического анализа кофеина: подвижная
фаза ацетонитрил - вода дистиллированная - уксусная кислота
(15:84:1). Скорость потока 0,7 куб. см/мин. Обнаружение по
поглощению в УФ-области спектра при длине волны 272 нм, шкала
чувствительности 0,01 е.о.п. Вводимый объем образца 10,0 куб. мм.
Условия ВЭЖХ для хроматографического анализа смеси алкалоидов:
подвижная фаза раствор калия фосфорнокислого однозамещенного, pH
3,2, - ацетонитрил (85:15), скорость потока 0,8 куб. см/мин., УФ-
детектирование, длина волны 272 нм, шкала чувствительности 0,01
е.о.п. Вводимый объем образца 10,0 куб. мм.
Примерные времена удерживания пуриновых алкалоидов: теобромин -
4,9 +/-0,1, теофиллин - 7,7 +/- 0,1, кофеин - 12,0 +/- 0,1.
Расчет концентраций пуриновых оснований
Массовую концентрацию теобромина, теофиллина или кофеина
рассчитывают по формуле:
S x m x V
обр ст 1
X = ----------------------, мг/кг,
1000 x S x V x M
ст 2 обр
где:
S - площадь пика исследуемого компонента;
обр
S - площадь пика соответствующего стандарта;
ст
V - объем анализируемого раствора пробы, куб. мм;
1
V - объем экстракта, введенного в хроматограф, куб. мм;
2
m - масса стандарта пуринового алкалоида, введенная в
ст
хроматограф, нг;
М - навеска образца, взятая для анализа и соответствующая
обр
объему фильтрата после экстракции подщелоченной водой, г (8 г).
Вычисления проводят до второго десятичного знака. За результат
принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных
измерений и выражают целым числом с одним десятичным знаком.
Относительное допустимое расхождение между результатами двух
параллельных определений при доверительной вероятности Р = 0,95 не
должно превышать 13%.
Характеристика погрешности измерений
При соблюдении всех регламентируемых методикой условий
проведения измерений относительная характеристика погрешности
(стандартное отклонение сходимости) результата анализа при
концентрации кофеина в БАД 2,0 мг/таблетку или капсулу не
превышает 0,154 (3,43%), при концентрации теобромина в пищевом
продукте 5 мг/100 г - 0,066 (4,89%).
Предел обнаружения метода определения пуриновых алкалоидов
(теобромина, теофиллина, кофеина) в пищевых продуктах составляет
1,0-2,0 мг/кг. Диапазон определяемых концентраций от 1,0 до 1000
мг/кг.
Среднее значение открываемости пуриновых алкалоидов в БАД при
концентрациях от 2,0 до 20 мг/таблетку составляет 87-95%, в
пищевых продуктах при концентрациях от 5,0 до 25 мг/100 г - 82-
90%.
6. Определение массовой концентрации хинина
Приготовление стандартных растворов
Приготовление градуировочного раствора хинина (800 мг/куб. см)
Навеску хинина массой 200,0 мг помещают в мерную колбу
вместимостью 250 куб. см, до половины заполненную
бидистиллированной водой. Перемешивают до полного растворения,
затем доводят бидистиллятом до метки и перемешивают.
Приготовление градуировочного раствора хинина (0,008 мг/куб.
см).
Отмеряют пипеткой 2,0 куб. см градуировочного раствора хинина
концентрации 800 мг/куб. см, переносят в мерную колбу вместимостью
100 куб. см, доводят до метки бидистиллированной водой и
перемешивают.
Приготовление подвижной фазы
2,72 г калия фосфорнокислого однозамещенного (KH2PO4) помещают
в мерную колбу вместимостью 1000 куб. см, растворяют в
бидистиллированной воде, перемешивают до полного растворения.
Полученный раствор ортофосфорной кислотой (Н3РО4) доводят до pH
3,0 и фильтруют через фильтровальную бумагу с диаметром пор 0,5
мкм. 760 куб. см полученного буферного раствора смешивают с 240
куб. см ацетонитрила (C2H3N). Срок годности полученного раствора
не более недели.
Подготовка образца
Образцы напитков подвергают дегазации по ГОСТ 6687.2 при
температуре не более 25 град. C и отфильтровывают через бумажный
фильтр.
Проведение анализа
Условия хроматографического анализа
Подвижная фаза 24% ацетонитрила, 76% 0,02 М раствора КН2РО4,
доведенного ортофосфорной кислотой до pH 3,0. Скорость потока 2,0
мл/мин. УФ-детектирование, длина волны 254 нм.
Массовую концентрацию хинина рассчитывают сравнением площадей
пиков образца и стандарта хинина по аналогии с формулой в разделе
5.
7. Определение содержания коэнзима Q10
Метод основан на определении высокоэффективной жидкостной
хроматографией.
Оборудование и реактивы
Жидкостной хроматограф с УФ-детектором.
Стандартный раствор Коэнзим Q10 концентрацией 100 мкг/мл
готовят в смеси этанол - эфир (1:1).
Подготовка проб
Коэнзим Q10 - убихинон, нерастворим в воде, но хорошо растворим
в спирте и эфире.
Из образца (обычно это капсулы) его выделяют растворением в
смеси: 96%-ный этанол - эфир (1:1). Капсулы прокалывают в
нескольких местах иглой, заливают смесью растворителей и оставляют
при комнатной температуре в темном месте в плотно укупоренной
склянке на сутки. Через сутки пробы хроматографируют.
Проведение испытания
Условия ВЭЖХ: колонка из нержавеющей стали, длина 150 мм,
диаметр 4-6 мм. Сорбент - Сепарон SGX С18, размер частиц 7 мкм.
Перед работой новую колонку промывают 40 мл изопропанола, затем 80
мл деионизированной воды, после чего уравновешивают колонку
подвижной фазой до стабильной нулевой линии.
Подвижная фаза: 96% этанол, очищенный перегонкой.
Детектирование: спектрофотометр, длина волны УФ 290 нм, шкала
чувствительности 0,05 AUFS, скорость потока 10 мл/мин., время
удерживания коэнзима Q 8,2 мин.
Обработка результатов: стандартный образец и испытываемую пробу
хроматографируют не менее трех раз. Расчет содержания Коэнзима Q
производят методом абсолютной калибровки. Ошибка метода +/- 5%.
8. Определение L-карнитина
(гамма-триметил-р-гидроксибутиробетаин)
L-карнитин - гигроскопические кристаллы, хорошо растворимые в
воде, в этаноле. Малорастворим в ацетоне, изопропаноле,
нерастворим в эфире.
Метод определения массовой концентрации L-карнитина в БАД и
пищевых продуктах основан на применении высокоэффективной
жидкостной хроматографии.
Метод анализа включает следующие этапы:
- экстракцию L-карнитина из БАД и пищевых продуктов
подщелоченной дистиллированной водой при нагревании;
- осаждение высокомолекулярных составляющих экстракта ацетатом
цинка;
- фильтрование полученного раствора;
- обнаружение и количественное определение с помощью ион-парной
ВЭЖХ с УФ-детектором и использованием метода внешнего стандарта.
Средства измерений, материалы и реактивы
Жидкостной хроматограф с насосом высокого давления с подачей
растворителя от 0,1 до 5,0 куб. см/мин., оборудованный
спектрофотометрическим детектором с переменной длиной волны и
системой для сбора и обработки хроматографических данных
МультиХром, версия 1,5х (Амперсенд, Россия).
Колонка и предколонка хроматографические с силикагелем,
химически связанным с октадецилсиланом (силикагель С18), с
размером частиц 5 мкм; длина колонки - 25 см, предколонки - 4,5
см, внутренний диаметр колонок - 0,46 см.
Микрошприцы МШ-10 и МШ-25 для жидкостной хроматографии.
Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С, ТУ 64-1-2451-78.
Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим
пределом взвешивания 200 г и погрешностью +/- 0,0001 г.
Дистиллятор.
pH-метр, модель "pH 150М".
Колбы мерные наливные 2-50-2, 2-100-2, 2-250-2, 1-1000-2 по
ГОСТ 1770.
Пипетки 4-1-2 или 5-1-2, 4-2-10 или 5-2-10, 4-2-25 или 5-2-25
по ГОСТ 29227.
Термометр жидкостный стеклянный с пределами измерения 0-100
град. C и ценой деления 1 град. C по ГОСТ 28498.
Ацетонитрил, ч., ТУ 6-09-3534-74.
Бумага фильтровальная "красная лента" и "синяя лента" по ТУ 6-
09-1678-95.
Баллон с сжатым азотом марки ПНГ.
Вода дистиллированная, ГОСТ 6709.
Кислота о-фосфорная, ч., ГОСТ 6552.
Додецилсульфат, натриевая соль, SERVA, раствор 0,005 М в
дистиллированной воде.
L-карнитин по действующей нормативно-технической документации.
Натрий гидроокись, х.ч., ГОСТ 4228, раствор массовой
концентрации 0,4 г/куб. дм.
Натрий хлористый, х.ч., ГОСТ 4233.
Цинк уксуснокислый 2-водный, ч.д.а., ГОСТ 5823-78, раствор 30%-
ный в дистиллированной воде.
Подготовка к проведению измерений
Приготовление рабочего раствора L-карнитина (400 мг/куб. см)
Навеску L-карнитина массой 100,0 +/- 0,1 мг помещают в мерную
колбу вместимостью 250 куб. см, до половины заполненную
дистиллированной водой. Перемешивают до полного растворения, затем
доводят дистиллятом до метки и перемешивают.
Приготовление стандартного раствора L-карнитина (0,004 мг/куб.
см)
Отмеряют пипеткой 2,0 куб. см рабочего раствора L-карнитина
концентрацией 400 мг/куб. см, переносят в мерную колбу
вместимостью 200 куб. см, доводят до метки дистиллированной водой
и перемешивают.
Приготовление подвижной фазы
1,44 г додецилсульфата натрия помещают в мерную колбу
вместимостью 1000 куб. см, растворяют в дистиллированной воде,
перемешивают до полного растворения, доводят дистиллированной
водой до метки. Полученный раствор ортофосфорной кислотой доводят
до pH 2,5 (2,5-3,06 куб. см). 850 куб. см полученного буферного
раствора смешивают с 350 куб. см ацетонитрила и полученный раствор
фильтруют через фильтровальную бумагу "красная лента".
Подготовка проб
Выделение L-карнитина осуществляли следующим образом: навеску
(2 г) измельченного БАД или продукта помещали в мерную колбу
вместимостью 250 куб. см, добавляли 125 куб. см горячей (60-65
град. C) дистиллированной воды, подщелоченной раствором NaOH
массовой концентрации 0,4 г/куб. дм (pH 8,0-8,5), встряхивали на
аппарате для встряхивания 30 минут, охлаждали до комнатной
температуры, добавляли 30 куб. см 30%-ного раствора ацетата цинка,
доводили дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивали и
фильтровали через бумажный фильтр "красная лента" или через
капроновый фильтр марки 0,45 мкм RC.
Проведение испытания
Условия ВЭЖХ: подвижная фаза раствор 0,005 М додецилсульфоната
натрия - ацетонитрил (65:35). Скорость потока 1,0 куб. см/мин.
Обнаружение по поглощению в УФ-области спектра при длине волны 210
нм, шкала чувствительности 0,01 е.о.п. Вводимый объем образца 10,0
куб. мм. Время удерживания карнитина - 7,5 +/- 1,0 мин.
Расчет концентраций L-карнитина
Массовую концентрацию L-карнитина рассчитывают по формуле:
S x m x V
обр ст 1
X = -----------------------, мг/100 г,
10000 x S x V x M
ст 2 обр
где:
S - площадь пика исследуемого компонента;
обр
S - площадь пика стандарта;
ст
V - объем анализируемого раствора пробы, куб. мм;
1
V - объем экстракта, введенного в хроматограф, куб. мм;
2
m - масса стандарта, введенная в хроматограф, мг;
ст
М - навеска образца, взятая для анализа.
обр
Обработка результатов.
Характеристика погрешности измерений
За результат принимают среднее арифметическое результатов трех
параллельных измерений и выражают целым числом с одним десятичным
знаком. Относительное допустимое расхождение между результатами
параллельных определений при доверительной вероятности Р = 0,95 не
должно превышать 13%. Ошибка метода +/- 5%.
Среднее значение открываемости L-карнитина в БАД при
концентрациях 10-20 мг/таблетку или в пищевых продуктах при
концентрациях от 100 мг % составляет 85-93%.
9. Определение полифенольных соединений
Принцип метода
Суммарное содержание фенольных соединений определяют
модифицированным методом Фолина - Чокальтеу. Полифенольные
соединения окисляются реактивом Фолина - Чокальтеу, состоящим из
смеси фосфорно-вольфрамовой H2PW12O40 и фосфорно-молибденовой
H3Pmo12O40 кислот, который, в свою очередь, восстанавливается в
смесь окислов вольфрама (W8O23) голубого цвета и молибдена
(Mo8O23). Абсорбция раствора при 750 нм пропорциональна содержанию
фенольных соединений. В качестве полифенольного стандарта
используют галловую кислоту.
Приборы и реактивы
Спектрофотометр СФ-26, СФ-46 или подобный, позволяющий
проводить измерения при длинах волн 200 - 350 нм, с допустимой
абсолютной погрешностью измерений коэффициента пропускания не
более 1%.
Колориметр фотоэлектрический лабораторный КФК-2 (или
аналогичный), ГОСТ 12083.
Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С, ТУ 64-1-2451-78.
Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с пределом
взвешивания 200 г и погрешностью +/- 0,0001 г.
pH-метр лабораторный ЭВ-74 (или аналогичный) по ТУ 25-05-27-57.
Дистиллятор.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Колбы мерные наливные 2-50-2, 2-100-2, 2-250-2, 1-1000-2 по
ГОСТ 1770.
Пипетки 4-1-2 или 5-1-2, 4-2-10 или 5-2-10, 4-2-25 или 5-2-25
по ГОСТ 29227.
Стакан мерный В-1-500ТС вместимостью 500 куб. см по ГОСТ 25336.
Цилиндры 2-1000 и 2-100 по ГОСТ 1770.
Натрия вольфрамат по ГОСТ 18289.
Натрия молибдат по ГОСТ 10931.
Кислота ортофосфорная 85%-ная по ГОСТ 6552.
Кислота соляная конц. по ГОСТ 3118.
Литий сернокислый (сульфат лития).
Натрий углекислый (карбонат натрия) по ГОСТ 83.
Водорода перекись по ГОСТ 177.
Бром по ГОСТ 4109.
Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962.
Галловая кислота по действующей нормативно-технической
документации.
Подготовка к выполнению измерений
Приготовление реактива Фолина
100 г вольфрамовокислого натрия и 25 г молибденовокислого
натрия растворяют в 700 куб. см дистиллированной воды. Добавляют
50 куб. см 85%-ной фосфорной кислоты (d = 1,71 г/куб. см), 100
куб. см концентрированной соляной кислоты (d = 1,19 г/куб. см) и
кипятят на водяной бане в колбе с обратным холодильником под тягой
в течение 10 ч. Добавляют 150 г сернокислого лития, несколько
капель брома и снова кипятят в течение 15 мин. Смесь охлаждают до
комнатной температуры, переносят в мерную колбу вместимостью 1
куб. дм и доводят объем до метки дистиллированной водой. Хранят
реактив в темной бутылке со шлифом в холодильнике.
Приготовление раствора карбоната натрия
В мерную колбу вместимостью 1 куб. дм наливают около 500 куб.
см дистиллированной воды и растворяют 200 г карбоната натрия при
встряхивании. Доводят до метки дистиллированной водой и
перемешивают. Получают раствор карбоната натрия с концентрацией
20%.
Раствор галловой кислоты
В мерный стакан вместимостью 500 куб. см помещают 50 куб. см
этилового спирта, доводят до метки 400 куб. см дистиллированной
водой. Погружают в стакан электроды pH-метра и добавляют соляную
кислоту до значения pH 3,2-3,25. Переносят полученный раствор в
мерную колбу вместимостью 500 куб. см, при встряхивании растворяют
15 мг галловой кислоты и доводят дистиллированной водой до метки.
Концентрация галловой кислоты 0,03 мг/куб. см.
Построение градуировочной кривой
1, 2, 5, 10, 20 куб. см раствора галловой кислоты помещают в 5
мерных колб вместимостью 100 куб. см. В шестую колбу вносят 1 куб.
см дистиллированной воды - контрольный раствор.
В каждую мерную колбу добавляют по 1 куб. см реактива Фолина -
Чокальтеу, по 10 куб. см раствора карбоната натрия, доводят
дистиллированной водой до метки и перемешивают.
Через 20-30 мин. измеряют оптическую плотность растворов в
кювете 10 мм при длине волны 750 нм против контрольного раствора.
По полученным данным строят градуировочную кривую, откладывая
по оси абсцисс массовую концентрацию галловой кислоты, а по оси
ординат - оптическую плотность.
Выполнение измерений
БАД на растительной и фруктовой основе (таблетки, капсулы)
растирают в ступке, навеску 1-2 г помещают в мерную колбу
вместимостью 100 куб. см, заполненную до половины дистиллированной
водой, нагретой до 40 град. C, и встряхивают на аппарате для
встряхивания в течение 45-60 мин., периодически подогревая колбу.
Сокосодержащие БАД (растворы, сиропы) разбавляют в 5-10 раз
дистиллированной водой.
1 куб. см полученных растворов помещают в мерные колбы
вместимостью 100 куб. см и далее выполняют действия как в разделе
"Построение градуировочной кривой".
Вычисление результатов определения
Значение массовой концентрации фенольных веществ (С) в мг/куб.
дм по галловой кислоте определяют по градуировочной кривой.
Полученную величину умножают на коэффициент разведения - 100, если
экстракт разбавляли в 5 раз, или вычисляют по формуле:
С = А x ОП,
где:
А - коэффициент разбавления;
ОП - оптическая плотность.
Вычисления проводят до первого десятичного знака и округляют до
целого числа. За окончательный результат принимают среднее
арифметическое результатов двух параллельных определений.
Характеристика погрешности измерений
Допустимое значение погрешности измерений массовой концентрации
фенольных соединений в БАД на растительной основе или
сокосодержащих БАД не должно превышать:
для диапазона концентраций в экстракте или растворе 100-600
мг/куб. дм - +/- 8 мг/куб. дм;
для диапазона концентраций в экстракте или растворе 600-3000
мг/куб. дм - +/- 33 мг/куб. дм.
10. Определение флавоноидов
10.1. Введение
Флавоноиды представляют собой большую группу природных
полифенольных соединений с двумя ароматическими кольцами, имеющими
основную структуру С6 - С3 - С6. Флавоноиды являются мощными
природными антиоксидантами, обладающими широким спектром
биологической активности. Особенно богаты флавоноидами высшие
растения, относящиеся к семействам розоцветных (различные виды
боярышников, черноплодная рябина), бобовых (софора японская,
стальник полевой, солодка), гречишных (различные виды горцев -
перечный, почечуйный, птичий; гречиха), астровых (бессмертник
песчаный, сушеница топяная, пижма), яснотковых (пустырник
сердечный) и др.
В основе структуры большинства флавоноидов лежат производные
флавана (2-фенил-хроман или 2-фенил-бенз-гамма-пиран),
приведенного на рис. 7, которые, в свою очередь, разделяются на
производные хромана и хромона.
К производным хромана относятся катехины, лейкоантоцианидины и
антоцианидины.
Катехины. Основные структуры катехинов (флаван-3-олов)
приведены на рис. 8.
Лейкоантоцианидины. Как видно из приведенной структуры на рис.
9, лейкоантоцианидины или проантоцианидины (флаван-3,4-диолы)
представляют собой 4-гидроксипроизводное катехина.
Антоцианидины. Особенность строения антоцианидинов (рис. 10) в
том, что кислород в пирановом кольце в кислой среде образует
оксониевый катион. Поэтому антоцианидины в кислом растворе ведут
себя как катионы и образуют соли с кислотами, а в щелочном
растворе - как анионы и образуют соли с основаниями. Антоцианидины
являются интенсивно окрашенными природными пигментами, их окраска
изменяется в зависимости от pH среды. Оксониевые формы (соли
катионов) антоцианидинов окрашены в красный цвет с оттенками:
желтоватыми (пеларгонидин), фиолетовым (цианидин), синеватым
(дельфинидин). Щелочные соли окрашены в синий цвет.
Антоцианидины являются агликонами большого класса природных
красителей - антоцианинов (см. раздел 1).
Среди других представителей этой группы следует отметить 2-
фенилпроизводные хромана: флаваноны и флаванонолы, структуры
которых представлены на рис. 11.
К флаванонам относятся нарингенин - 5,7,4'-тригидроксифлаванон,
гесперетин - 5,7,3'-тригидрокси-4'-метоксифлаванон и эриодиктиол -
5,7,3',4'-тетрагидроксифлаванон. Наиболее распространенными в
экстрактах цитрусовых являются 7-О-гликозил-нарингенин - нарингин
и 7-О-гликозилгесперетин - геспередин (см. раздел 11.2.).
В БАД на основе экстрактов лиственницы и ряда других растений
содержатся производные флаванон-3-олов: дигидрокверцетин -
5,7,3',4'-тетрагидроксифлаванон-3-ол и дигидрокемпферол - 5,7,4'-
тригидроксифлаванон-3-ол (см. раздел 11.3.).
Из производных хромона, представленных на рис. 12, наиболее
распространены в растениях соединения типа флавона и флавонола,
имеющих непредельную связь в положении 2, 3. В отличие от их
гидрированных аналогов - флаванонов и флаванонолов - это наиболее
устойчивые флавоноиды.
Флавоноиды, у которых фенильная группа с С2 смещена к С3,
называются изофлавоноидами (рис. 13).
Структуры и наименования основных флавонолов представлены на
рис. 14, структуры флавонов - на рис. 15.
10.2. Методы определения флавоноидов
В основе количественного определения флавоноидов лежит
спектрофотометрия при длине волны 415 нм продуктов взаимодействия
с раствором хлорида алюминия. К флавоноидам относятся производные
флавона: флавонолы (рутин - рутинозид кверцетина, гиперозид -
галактозид кверцетина, морин, кверцетин, мирицетин, кемпферол,
кверцитрин, галангин) и флавоны (хризин, апигенин, лютеолин,
изовитексин, изоориентин). Для определения производных флавана:
флаванон-3-олов (дигидрокверцетин или таксифолин, дигидрокемферол,
силибин), флаванонов (нарингин, (+/-)-нарингенин, гесперетин)
используется спектрофотометрия при длине волны 495 нм продуктов их
реакции с 2,4-динитрофенилгидразином.
-----------------T----------------T--------------T---------------¬
¦ Флавон ¦ R1 ¦ R2 ¦ R3 ¦
+----------------+----------------+--------------+---------------+
¦Апигенин ¦Н ¦Н ¦Н ¦
+----------------+----------------+--------------+---------------+
¦Лютеолин ¦Н ¦Н ¦ОН ¦
+----------------+----------------+--------------+---------------+
¦Изовитексин ¦Глюкозил- ¦Н ¦Н ¦
+----------------+----------------+--------------+---------------+
¦Витексин ¦Н ¦Глюкозил- ¦Н ¦
+----------------+----------------+--------------+---------------+
¦Изоориентин ¦Глюкозил- ¦Н ¦ОН ¦
+----------------+----------------+--------------+---------------+
¦Ориентин ¦Н ¦Глюкозил- ¦ОН ¦
L----------------+----------------+--------------+----------------
Принцип колориметрического метода, основанного на
взаимодействии с алюминий хлоридом, заключается в том, что реагент
образует кислотоустойчивые комплексы с С-4 кето группой и или с С-
3, или С-5 гидроксильной группой флавонов и флавонолов, имеющие
максимумы поглощения в диапазоне длин волн 415-440 нм.
Принцип взаимодействия с 2,4-динитрофенилгидразином основан на
его реакции с кетонами и альдегидами с образованием 2,4-
динитрофенилгидразонов. Следовательно, флавоны, флавонолы и
изофлавоны с С2-С3 двойной связью не способны реагировать с 2,4-
динитрофенилгидразином, в то время как гидразоны и флавононы
образуют соединения, имеющие максимум поглощения при 495 нм.
Приборы и реактивы
Спектрофотометр СФ-26, СФ-46 или подобный (Shimadzu UV-160A,
Япония), позволяющий проводить измерения при длинах волн 190-900
нм, с допустимой абсолютной погрешностью измерений коэффициента
пропускания не более 1%.
Метанол - яд, для жидкостной хроматографии, ос.ч. по ТУ 6-09-14-
2192-85.
Спирт этиловый ректификованный, очищенный дистилляцией.
Алюминий хлористый, 6-водный, х.ч., ГОСТ 3759-75, раствор 10%-
ный в 95%-ном этаноле.
2,4-динитрофенилгидразин (2,4-Д), раствор: 1 г 2,4-Д растворяют
в 2 куб. см 96%-ной серной кислоты и доводят метанолом до объема
100 куб. см, концентрация полученного раствора 10 мг/куб. см.
Натрия гидроокись, х.ч.: 1%-ный раствор в 70%-ном метаноле.
Натрия ацетат, 1 М раствор.
Приготовление стандартных растворов
для калибровки спектрофотометра
10 +/- 0,1 мг кверцетина растворяют в 80%-ном этаноле и затем
разбавляют в мерных колбах до концентраций 25, 50 и 100 мкг/куб.
см.
20 +/- 0,1 мг (+/-)-нарингенина растворяют в метаноле и затем
разбавляют до концентрации 500, 1000 и 2000 мкг/куб. см.
Подготовка образца
1,0 г измельченного образца кипятят в 30 куб. см 90%-ного
этилового спирта, содержащего 0,5% концентрированной серной
кислоты, на кипящей водяной бане с обратным холодильником в
течение 30 мин. Надосадочную жидкость сливают в мерную колбу
вместимостью 100 куб. см и экстракцию повторяют еще раз.
Объединенную смесь охлаждают, фильтруют и доводят объем до 100
куб. см 90%-ным этанолом (раствор А).
Колориметрический метод с алюминий хлоридом
(суммарное определение флавонолов)
По 0,5 куб. см каждого разбавленного стандарта кверцетина
смешивают с 1,5 куб. см 95%-ного этанола, 0,1 куб. см 10%-ного
хлорида алюминия, 0,1 куб. см 1 М ацетата натрия и 2,8 куб. см
дистиллированной воды. Смесь инкубируют при комнатной температуре
30 мин. и измеряют оптическую плотность полученного раствора при
415 нм. Для приготовления раствора сравнения используют
разбавленный в дистиллированной воде 10%-ный хлорид алюминия.
Колориметрический метод с 2,4-динитрофенилгидразином
|
