|
Стр. 17
силикагеля).
5.5. Очистка продуктов омыления
Очистку продуктов омыления проводят с помощью колоночной
хроматографии. Для хроматографии используют растворители,
очищенные путем дистилляции. Безводный сернокислый натрий и
силикагель промывают последовательно бензолом и ацетоном, затем
высушивают на воздухе и прокаливают в сушильном шкафу при 100
град. C в течение часа.
На дно стеклянной колонки помещают кусочек ваты, 3-5 куб. см
бензола, безводный сульфат натрия (толщина слоя 5 мм, очищенный,
как указано выше), заливают суспензию 2 г (3,6 куб. см) силикагеля
в бензоле, не давая бензолу стечь (колонка закрыта снизу),
высыпают омыленную пробу на силикагеле по п. 5.4. и после оседания
твердых частиц насыпают безводного сульфата натрия (10 мм). Дают
бензолу стечь и колонку промывают последовательно 25 куб. см смеси
бензол - ацетон (95:5) (элюат отбрасывают) и 70 куб. см смеси
бензол - ацетон (1:1). Элюат собирают в круглодонную колбу,
упаривают на ротационном испарителе до объема 1 куб. см. Остаток
переносят в вайл (емкость вместимостью 4-6 куб. см с герметично
завинчивающейся крышкой) или в пробирку вместимостью 5 куб. см с
НШ 14,5, упаривают досуха в токе азота и остаток растворяют в 0,02
куб. см бензола, очищенного дистилляцией над металлическим натрием
(раствор А).
5.6. Получение ТФА-производных
5.6.1. Получение стандартного раствора 3-О-метил-Т-2-тетраола
5.6.1.1. Метелирование Т-2-токсина
1 г Т-2-токсина помещают в круглодонную колбу вместимостью 250
куб. см, добавляют 3 куб. см очищенного перегонкой йодистого
метила, 300 мг оксида серебра (катализатор) и кипятят на
глицериновой бане (температура бани 60 град. C) с обратным
холодильником в течение 2-4 ч (контроль продуктов реакции по ТСХ
на пластинках "Силуфол" в системе бензол - ацетон (5:1), эталон -
исходный Т-2-токсин). После окончания реакции содержимое
реакционной колбы охлаждают до комнатной температуры и упаривают
досуха (от избытка йодистого метила) на ротационном испарителе.
Остаток растворяют в 3 куб. см бензола.
5.6.1.2. Очистка 3-О-Ме-Т-2-токсина от исходного Т-2-токсина
Продукт реакции 3-О-Ме-Т-2-токсин необходимо очистить от
исходного Т-2-токсина с помощью колоночной хроматографии. Для
этого на дно стеклянной колонки размером 300х22 мм помещают
кусочек ваты, приливают 5-10 куб. см бензола (колонка закрыта
снизу), присыпают безводный сульфат натрия (толщина слоя 5 мм),
заливают суспензию 20 г силикагеля в бензоле и насыпают слой
безводного сульфата натрия (20 мм). Дают бензолу стечь и на
колонку наносят раствор продуктов реакции в бензоле по п. 5.6.1.1.
(3 куб. см). Реакционную колбу ополаскивают бензолом (0,5 куб. см)
и раствор также наносят на колонку. Колонку последовательно
промывают:
- бензолом - 100 куб. см;
- 2%-ным раствором ацетона в бензоле - 200 куб. см;
- 4%-ным раствором ацетона в бензоле - 100 куб. см;
- 5%-ным раствором ацетона в бензоле - 600 куб. см;
- 10%-ным раствором ацетона в бензоле - 300 куб. см;
- 15%-ным раствором ацетона в бензоле - 200 куб. см.
Отбирают фракции, содержащие чистый 3-О-Ме-Т-2-токсин (5%-ная
смесь ацетона в бензоле) и Т-2-токсин (10-15%-ная смесь ацетона в
бензоле). Контроль реакции проводят с помощью ТСХ на пластинках
"Силуфол" в системе бензол - ацетон (5:1). Выход 3-О-Ме-Т-2-
токсина после упаривания растворителя досуха на ротационном
испарителе и высушивания остатка в вакууме составляет порядка 0,5
г (50%). Возврат Т-2-токсина - 50%.
5.6.1.3. Омыление Ме-Т-2-токсина
К высушенному остатку 3-О-Ме-Т-2-токсина добавляют 10 куб. см
метанола, 2 куб. см воды и 3 куб. см раствора 3Н К2СО3. Смесь
нагревают 2 ч при 40 град. C при перемешивании на магнитной
мешалке. Контроль продуктов реакции проводят с помощью ТСХ на
пластинках "Силуфол" в системе бензол - ацетон (1:1). По окончании
реакции смесь охлаждают, разбавляют 70 куб. см воды и нейтрализуют
добавлением 0,4 куб. см ледяной уксусной кислоты до слабокислой
среды (контроль по универсальной индикаторной бумажке).
5.6.1.4. Очистка 3-О-Ме-Т-2-тетраола на патроне Supelclean LC-
18
Полученный раствор по п. 5.6.1.3. пропускают через
концентрирующий патрон Supelclean LC-18 (толщина слоя 1 см), элюат
отбрасывают. Патрон промывают 50 куб. см метанола. Элюат содержит
неполярные примеси и следовые количества продукта, и его
отбрасывают. 3-О-Ме-Т-2-тетраол смывают 10 куб. см смеси метанол -
вода (5:1) и экстрагируют этилацетатом (5 куб. см х 3 раза). При
плохом расслоении жидкостей в элюат добавляют хлорид натрия или
центрифугируют. Этилацетатные экстракты объединяют, упаривают
досуха и 3-О-Ме-Т-2-тетраол кристаллизуют из бензола с добавлением
петролейного эфира до помутнения. Выход 3-О-Ме-Т-2-тетраола
составляет порядка 70%.
5.6.1.5. Приготовление стандартного рабочего раствора 3-О-метил-
Т-2-тетраола
625 мг 3-О-Ме-Т-2-тетраола помещают в мерную колбу вместимостью
25 куб. см, содержащую до половины бензол, перемешивают до полного
растворения вещества и доводят бензолом до метки, тщательно
перемешивают. Концентрация 3-О-Ме-Т-2-тетраола в полученном
растворе 25 мг/куб. см.
5.6.2. Получение трифторацетильных производных стандартной
смеси Т-2-тетраола и 3-О-метил-Т-2-тетраола
В вайл (емкость вместимостью 4-6 куб. см с герметично
завинчивающейся крышкой) или пробирку вместимостью 5 куб. см с НШ
14,5 помещают 0,02 куб. см рабочего раствора Т-2-тетраола (1 мкг)
и 0,04 куб. см рабочего раствора 3-О-метил-Т-2-тетраола (1 мкг) в
бензоле, добавляют 0,1 куб. см бензола, предварительно очищенного
дистилляцией над металлическим натрием, 30-50 мг свежепрокаленного
углекислого натрия и 0,05 куб. см трифторуксусного ангидрида.
Пробирку плотно закрывают стеклянной притертой пробкой и нагревают
при 60 град. C в течение 0,5 часа при периодическом встряхивании.
Содержимое пробирки разбавляют бензолом до 1 куб. см и фильтруют
через химическую воронку с кусочком ваты в другую пробирку
вместимостью 5 куб. см с НШ 14,5. Углекислый натрий на фильтре
промывают 0,5 куб. см бензола. Объединенные бензольные фильтраты
упаривают досуха в токе азота (при отсутствии баллона с азотом
можно упарить досуха на ротационном испарителе). Остаток
растворяют в 0,02 куб. см бензола и анализируют с помощью ГЖХ.
5.6.3. Получение ТФА-производных продуктов омыления
К 0,02 куб. см раствора продуктов омыления экстракта по п. 5.5.
(раствор А) добавляют 0,04 куб. см стандартного раствора 3-О-метил-
Т-2-тетраола (1 мкг, внутренний стандарт) в бензоле, 30-50 мг
свежепрокаленного углекислого натрия и 0,05 куб. см
трифторуксусного ангидрида. Пробирку плотно закрывают стеклянной
притертой пробкой и проводят получение ТФА-производных согласно п.
5.6.2. при периодическом встряхивании.
5.7. ГЖХ анализ ТФА-производных
Условия ГЖХ анализа: колонка капиллярная, длина колонки 25
м, жидкая фаза SE-54, температура колонки - 210 град. C,
температура термостата детектора - 240 град. C, температура
инжектора - 300 град. C, скорость газа-носителя - 2 куб. см/мин.,
скорость продувочного газа - 6 куб. см/мин., шкала
-12
чувствительности - 2х10 (на блоке ИМТ).
В инжектор газового хроматографа с помощью микрошприца
вместимостью 1 или 10 мкл последовательно вводят две аликвоты
(около 0,2-0,5 мкл) стандартной смеси ТФА-производных
Т-2-тетраола и 3-О-метил-Т-2-тетраола по п. 5.6.2. При
использовании метода внутреннего стандарта нет необходимости
вводить в хроматограф точные количества проб. В каждом случае
регистрируют время выхода растворителя бензола и время выхода
ТФА-Т-2-тетраола и ТФА-3-О-метил-Т-2-тетраола. Определяют
относительное приведенное время удерживания токсина (наиболее
воспроизводимая величина для идентификации) и площади пиков
токсинов (S и S ). Относительные приведенные времена
ст вн.ст
удерживания определяют по следующей формуле:
t - t
ст 0
t' = -----------,
t - t
вн.ст 0
где:
t' - относительное приведенное время удерживания, мин.;
t - время удерживания растворителя, мин.;
0
t - время удерживания Т-2-тетраола, мин.;
ст
t - время удерживания 3-О-метил-Т-2-тетраола, мин.
вн.ст
Площадь пиков определяют по показанию интегратора или
умножением высоты пика на ширину пика на половине его высоты.
Затем в газовый хроматограф вводят 0,2-0,5 мкл раствора
ТФА-производного продуктов омыления экстракта по п. 5.6.3. При
наличии пика, соответствующего относительному приведенному времени
удерживания ТФА-производного Т-2-тетраола, определяют его площадь
(S ).
обр
Относительное приведенное время удерживания Т-2-тетраола в
зависимости от условий хроматографии может меняться в пределах
0,59-0,62.
5.8. Обработка результатов анализа
Расчет содержания Т-2-тетраола в анализируемой смеси проводят
по формуле:
K x m x S
вн.ст
М = --------------,
S
вн.ст
где:
М - масса анализируемого вещества (Т-2-тетраола), мкг;
m - масса введенного внутреннего стандарта
вн.ст
(3-О-метил-Т-2-тетраола), мкг;
S - площадь пика анализируемого вещества (Т-2-тетраола), кв.
мм;
S - площадь пика внутреннего стандарта
вн.ст
(3-О-метил-Т-2-тетраола), кв. мм;
К - поправочный коэффициент вещества (Т-2-тетраола) по
внутреннему стандарту (3-О-метил-Т-2-тетраолу).
Поправочный коэффициент определяют в соответствии с
параметрами калибровочной смеси по следующей формуле:
m x S
вн.ст
К = ----------,
m x S
вн.ст
где:
m - масса Т-2-тетраола, нг;
m - масса 3-О-метил-Т-2-тетраола, нг;
вн.ст
S - площадь 3-О-метил-Т-2-тетраола, кв. мм;
вн.ст
S - площадь Т-2-тетраола, кв. мм.
Пересчет количества Т-2-тетраола на кг исследуемого образца
проводят следующим образом:
М х 1000
M = --------,
1 m
где:
M - содержание суммы трихотеценовых микотоксинов группы А
1
(Т-2-токсин, НТ-2-токсин, Т-2-тетраол и др.), мкг/кг;
М - масса анализируемого вещества (Т-2-тетраола), определенная
во вколе, мкг;
m - масса анализируемой пробы, соответствующая 70 куб. см
фильтрата (14 г) по п. 5.1., г.
5.9. Метрологические характеристики метода
Предел обнаружения Т-2-тетраола во вколе при ГЖХ с
использованием детектора электронного захвата (ДЭЗ) - 0,5-1 нг;
общий предел обнаружения 20 мкг/кг (0,02 мг/кг); относительное
стандартное отклонение 0,28-0,35 (при уровне загрязнения 0,1
мг/кг).
II. Метод определения нитратов и нитритов
Метод определения нитратов и нитритов распространяется на БАД
на растительной основе, определение проводится либо методом
фотометрии в соответствии с ГОСТ 8558.1-78, либо методом
ионометрии по ГОСТ 29270-95 "Продукты переработки плодов и овощей.
Методы определения нитратов и нитритов".
III. Метод определения N-нитрозаминов
Для определения N-нитрозаминов используют ГЖХ-
хемилюминесцентный метод. Метод идентификации и количественного
определения НА состоит в выделении летучих НА путем перегонки с
паром или в вакууме, экстракции хлористым метиленом НА из водного
дистиллята, концентрировании экстракта, разделении смеси методом
газожидкостной хроматографии и количественном определении
немодифицированных НА с помощью высокоселективного и
высокочувствительного хемилюминесцентного (термоэнергетического)
детектора ТЕА-502.
Идентификацию НА осуществляют по времени удерживания в
сравнении с параметрами удерживания стандартных НА. Количественное
определение проводят методом абсолютной калибровки с
систематическим контролем калибровочного коэффициента.
1. Аппаратура, материалы, реактивы
Весы технические и весы аналитические.
Шкаф сушильный, нагревательные приборы (электронагреватель,
колбонагреватель или электроплитка).
Ротационный испаритель с ловушкой.
Насос водоструйный.
Контактные термометры.
Микрошприц МШ-10 на 10 мкл или калиброванные стеклянные
капилляры.
Система для отгонки нитрозаминов с водяным паром,
принципиальная схема которой представлена на рис. 23.
Газовый хроматограф любой марки.
Детектор хемилюминесцентный - анализатор термической энергии
типа ТЕА-502 фирмы "Теrmо Electron Corporation" (США).
Самописец любой марки.
Колонка газохроматографическая стеклянная длиной 3 м и
диаметром 2 мм, заполненная 15% Carbowax-20M, нанесенном на
Chromaton N-AW-DMCS (80-100 меш.).
Азот газообразный (ос.ч. или поверочный нулевой газ) или аргон
газообразный, ос.ч.
Кислород газообразный, ос.ч.
Азот жидкий.
N-нитрозодиметиламин (НДМА).
N-нитрозодиэтиламин (НДЭА).
N-нитрозодипропиламин (НДПА).
N-нитрозодибутиламин (НДБА).
N-нитрозопиперидин (НПип).
N-нитрозопирролидин (НПир) фирмы "Fluka" (Швейцария).
Гексановый раствор НДПА (0,2 мкг/куб. см) - внутренний
стандарт.
Гексановый раствор смеси стандартных НА (НДМА, НДЭА, НДБА,
НПип, НПир) по 0,2 мкг каждого НА в 1 куб. см раствора.
Ацетонитрил, х.ч.
Бензол, х.ч.
Вода дистиллированная.
н-Гексан, х.ч.
Кальция хлорид прокаленный, ч.
Кислота соляная, х.ч., и ее водный раствор 0,1 н.
Кислота серная, х.ч., и ее водные растворы 1 н. и 5 н.
Кислота уксусная ледяная, х.ч.
Метилена хлорид, х.ч.
Натрия гидроокись, х.ч., и его водный раствор 0,1 н.
Натрий сернокислый прокаленный, х.ч.
Натрий углекислый кислый, х.ч.
Натрий хлористый, х.ч.
Спирт этиловый.
2. Требования техники безопасности
при проведении испытаний
Помещение, в котором производят определение нитрозаминов,
обязательно должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией.
Работу с нитрозаминами, стандартами, другими химическими
соединениями и растворителями проводить в вытяжном шкафу с
использованием индивидуальных средств защиты (очки, перчатки и
др.).
В лаборатории, где проводится работа с канцерогенными летучими
НА, необходимо всегда иметь 2-3%-ный раствор газообразного НВr в
уксусной кислоте для разрушения НА при попадании их на рабочие
места и пол. В целях разрушения летучих НА в воздухе по окончании
работы помещение необходимо обработать ультрафиолетовым светом.
Транспортировка и хранение НА осуществляются в стеклянных
запаянных ампулах, обернутых в асбестовую ткань и упакованных в
металлическую тару, которую также заплавляют парафином.
НА хранят в специальном холодильнике в отсутствие анализируемых
проб.
1,0 куб. см раствора НДПА из ампулы с концентрацией 0,2 мг/куб.
см переносят в мерную колбу на 100 куб. см и доводят гексаном до
метки. Полученный раствор с концентрацией 2 мкг/куб. см используют
при анализе в качестве внутреннего стандарта.
3. Выделение нитрозаминов
3.1. Выделение нитрозаминов путем перегонки с паром
Навеску 50-100 г измельченного в гомогенизаторе БАД помещают в
круглодонную колбу на 500 куб. см, соединенную с паровиком и
прямым холодильником (принципиальная схема установки представлена
на рис. 31). К образцу добавляют 10 г хлористого натрия, 10 г
сульфата натрия или магния, 25-50 куб. см дистиллированной воды (в
зависимости от влажности образца), 5 куб. см 2% раствора
сульфаминовой (или сульфаниловой) кислоты, 5-10 куб. см 1 н.
раствора серной кислоты до pH < 3,0; 1 куб. см гексанового
раствора ДПНА и НА отгоняют с водяным паром, собирая 200-230 куб.
см дистиллята. Если перегонка с паром сопровождается вспениванием
массы, добавляют 5-10 куб. см насыщенного раствора апиезона в
изопропиловом спирте, а в случае спекания образцов в процессе
дистилляции - мелкие керамические крошки или кусочки стеклянных
трубочек. Для наиболее полного выделения НА из БАД, содержащих
спирт, необходимо разбавить образец водой до получения 20%
концентрации в нем спирта. Дистиллят переносят в делительную
воронку и нитрозамины экстрагируют свежеперегнанным хлористым
метиленом 4-5 раз по 15 куб. см.
Объединенные хлорметиленовые экстракты высушивают прокаленным
сульфатом магния, отфильтровывают, осушитель промывают небольшим
объемом хлористого метилена, объединенные фильтраты помещают в
круглодонную колбу на 100-150 куб. см, снабжают дефлегматором (или
воздушным холодильником), помещают в водяную баню и упаривают
хлористый метилен до 5-7 куб. см выдерживанием при температуре
бани 55-65 град. C. Целесообразно пропускание тока инертного газа
через хлорметиленовый раствор. По достижении объема раствора 5-7
куб. см дефлегматор смывают 2 куб. см гексана и продолжают
концентрировать пробу до 2 куб. см.
3.2. Выделение нитрозаминов перегонкой в вакууме
Пробу исследуемого образца массой 20-50 г, отвешенную с
погрешностью 0,1 г, помещают в круглодонную колбу вместимостью 200
куб. см, добавляют 75-80 куб. см дистиллированной воды, 1 куб. см
гексанового раствора НДПА, 4 куб. см 0,1 н. раствора гидроокиси
натрия и 20 куб. см парафинового или вазелинового масла для
предотвращения перебрасывания массы во время дистилляции и
присоединяют к вакуумной системе (принципиальная схема установки
изображена на рис. 32).
Колбу с исследуемым образцом помещают на песочную баню, под
которой устанавливают газовую горелку; приемную колбу охлаждают
смесью сухого льда и гексана (ацетона) или жидким азотом.
Установив в системе вакуум до 0,1 атм., проводят дистилляцию до
получения 50 куб. см дистиллята. Чтобы избежать потери НА,
обязательно проводят дистилляцию в закрытой системе. Герметичность
системы можно сохранить, используя чистую вакуумную смазку или
тефлоновые манжеты для шлифов. После окончания дистилляции снимают
обогрев, охлаждение, отсоединяют шланг вакуумной системы. После
оттаивания приемной колбы систему перегонки разбирают, насадку
ополаскивают несколькими куб. см дистиллированной воды, которые
добавляют к дистилляту. В круглодонную колбу с дистиллятом
добавляют 1-2 куб. см этанола, 0,5 куб. см 5 н. серной кислоты и
экстрагируют трижды по 7-10 куб. см хлористым метиленом. Экстракт
высушивают прокаленным сульфатом магния и концентрируют аналогично
п. 3.1. до 2 куб. см.
4. Подготовка к испытанию и проведение анализа
Анализ НА осуществляют с помощью ГЖХ без дополнительной
обработки хлорметиленового или гексанового раствора при следующих
условиях: колонка стеклянная (длина 3 м с диаметром 2 мм),
заполненная 15% Carbowax-20M, нанесенном на Chromaton N-AW-DMCS
(80-100 меш.). Может быть использована другая по размеру набивная
колонка, например, с содержанием Carbowax 10%, газ-носитель - азот
или аргон, скорость - 20 куб. см/мин., температура колонки - 125
град. C (изотермический режим); температура испарителя - 220 град.
C, температура каталитической печи - 450 град. C, давление азота -
0,5 атм. (или расход - 40 куб. см/мин.), давление кислорода - 0,6
атм., температура охлаждающей ловушки - 110-130 град. C, объем
вводимой в хроматограф пробы - 1-10 мкл.
Записывают хроматограмму эталонной смеси НА и раствора
внутреннего стандарта в начале и в конце каждой серии анализов.
Идентификацию НА в пробе осуществляют по времени удерживания
стандартов. Количество НА в пробе оценивают сравнением величины
аналитических сигналов, полученных при анализе образцов и
стандартных растворов.
Оценивают также полноту извлечения НА из БАД по внутреннему
стандарту (НДПА), вносимому в продукт перед выделением НА.
Содержание НА в пробе рассчитывают по формуле:
S x V x n x 100
1 2
С = -----------------,
S x V x m x A
2 1
где:
С - содержание исследуемого НА в образце, мкг/кг;
S - площадь под интегральной кривой, полученной при анализе
1
образца, кв. мм;
S - площадь под интегральной кривой соответствующего
2
стандартного НА, кв. мм;
V - объем пробы, введенной в хроматограф, мкл;
1
V - объем анализируемого экстракта, мкл;
2
n - количество стандартного НА, введенного в хроматограф, нг;
m - масса пробы, взятой на анализ, г;
А - степень извлечения внутреннего стандарта (70-95%).
5. Метрологические характеристики
Относительное допустимое расхождение между результатами двух
параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, по
отношению к среднему арифметическому значению (Rr) и относительное
допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в
двух разных лабораториях, по отношению к среднему арифметическому
значению (RR), а также предел определения приведены в табл. 56.
Таблица 56
ОТНОСИТЕЛЬНЫЕ ДОПУСТИМЫЕ ВНУТРИЛАБОРАТОРНЫЕ (Rr)
И МЕЖЛАБОРАТОРНЫЕ (RR) РАСХОЖДЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
И ВЕЛИЧИНА ПРЕДЕЛА ОПРЕДЕЛЕНИЯ
----------------------------T--------------------T-------T-------¬
¦ Метод ¦Предел определения, ¦ Rr, % ¦ RR, % ¦
¦ ¦ мкг/кг ¦ ¦ ¦
+---------------------------+--------------------+-------+-------+
¦Хемилюминесцентный ¦ 0,1 ¦ 20 ¦ 45 ¦
L---------------------------+--------------------+-------+--------
IV. Метод определения биогенных аминов
1. Колориметрический метод определения гистамина
Принцип метода
В основе колориметрического метода определения гистамина лежит
измерение величины абсорбции окрашенного производного при
взаимодействии гистамина с диазореактивом. Предел обнаружения - 10
мг/кг, относительное стандартное отклонение при определении
гистамина в интервале 20-75 мг/кг изменяется от 0,08 до 0,25,
степень извлечения добавленного к образцу стандарта гистамина - 94-
99%.
Специфические приборы, реактивы, материалы
Колориметр фотоэлектрический по ГОСТ 12083-78 со светофильтром
= 490 + 10 нм, спектрофотометр СФ-26 или аналогичный.
Микроизмельчитель тканей РТ-2 по МРТУ 64.1-1505-63.
Гистамин или гидрохлорид гистамина.
Кислота соляная по ГОСТ 3118-77, х.ч., раствор 3,75 г/л (0,1 н
раствор).
Кислота трихлоруксусная по ТУ 6-09-1926-77, раствор 50 г/л (5%
раствор).
Натрий азотистокислый по ГОСТ 4197-77, раствор 50 г/л (5%
раствор).
Натрия гидроокись по ГОСТ 4328-77, ч.д.а., раствор 200 г/л (5%
раствор).
Натрий сернокислый безводный по ГОСТ 4166-76, х.ч.,
прокаленный.
Натрий углекислый по ГОСТ 83-79, х.ч., раствор 40 г/л (4%
раствор).
Пара-нитроанилин, ч.д.а.
Этилацетат по ГОСТ 22300-76, ч.д.а.
Подготовка к испытанию
Приготовление раствора пара-нитроанилина
Пара-нитроанилин очищают путем перекристаллизации в воде. Для
этого его растворяют в горячей дистиллированной воде и охлаждают
раствор до комнатной температуры. Выпавшие кристаллы
отфильтровывают и высушивают при 80 град. C в течение 10-15 мин.
0,1 г пара-нитроанилина растворяют в 100 куб. см 0,1 н соляной
кислоты. Хранят раствор в холодильнике до момента употребления.
Приготовление диазореактива
Диазореактив получают непосредственно перед использованием
путем смешивания 10 куб. см раствора 1 г/куб. дм пара-нитроанилина
в 0,1 н соляной кислоте и 1 куб. см раствора 50 г/куб. дм
азотистокислого натрия и охлаждают до 0 град. C.
Приготовление н-бутанола, насыщенного водой
Для приготовления н-бутанола, насыщенного водой, встряхивают 50
куб. см н-бутанола и 20 куб. см дистиллированной воды в
делительной воронке. После разделения фаз отделяют верхний
бутанольный слой.
Экстракция
Навеску 10 г (с точностью до 0,01 г) приготовленного образца
помещают в сосуд микроизмельчителя тканей, добавляют 25 мл 5%
раствора трихлоруксусной кислоты и перемешивают 5 мин. Полученную
смесь переносят в плоскодонную коническую колбу на 100 куб. см,
ополаскивают сосуд смесителя дважды 5-10 куб. см 5%-ного раствора
трихлоруксусной кислоты и растворы объединяют. Колбу снабжают
воздушным холодильником и выдерживают на водяной бане при 60 град.
C в течение 15 мин. Охлажденную смесь переносят количественно в
цилиндр, доводят до 50 куб. см 5%-ным раствором трихлоруксусной
кислоты и фильтруют через складчатый фильтр (фильтрат 1).
Построение калибровочной кривой
Готовят стандартные растворы гистамина с концентрацией 5, 10,
20, 40 мкг/куб. см в 5%-ной трихлоруксусной кислоте. Для
приготовления основного раствора гистамина с концентрацией 40
мкг/куб. см 4,0 мг гистамина помещают в мерную колбу вместимостью
100 куб. см, растворяют в 5%-ной трихлоруксусной кислоте и доводят
объем до метки. Рабочие растворы гистамина с концентрациями 20, 10
и 5 мкг/куб. см получают путем разбавления 5%-ным раствором
трихлоруксусной кислоты основного раствора в 2, 4 и 8 раз
соответственно. Основной раствор гистамина хранят в холодильнике
неделю, рабочие растворы готовят в день проведения анализа.
5 куб. см каждого стандартного раствора помещают в пробирки с
притертыми пробками, добавляют 1 куб. см 20%-ного раствора
гидроксида натрия и вносят в раствор при перемешивании безводный
углекислый натрий до получения насыщенного раствора. Добавляют 5
куб. см н-бутанола, насыщенного водой. Энергично встряхивают
пробирки в течение 30 сек. После разделения фаз отбирают пипеткой
или шприцем 3 куб. см верхнего бутанольного слоя и переносят в
другую пробирку с притертой пробкой, содержащую 3 куб. см 0,1 н
раствора соляной кислоты. Встряхивают содержимое пробирки в
течение 30 сек. После разделения фаз отбирают 2 куб. см нижнего
водного слоя в другую пробирку. Добавляют 2 куб. см 4%-ного
раствора углекислого натрия и выдерживают 5 мин. при 0 град. C.
Добавляют 4 куб. см этилацетата и энергично встряхивают в течение
30 сек. После разделения фаз сухой пипеткой отбирают верхний слой
и переносят в пробирку, содержащую безводный сульфат натрия
(раствор окрашенного производного в этилацетате должен быть
прозрачным). Измеряют величину абсорбции раствора при 495 нм в
кювете толщиной 1 см. В качестве раствора сравнения используют
этилацетат.
На основании полученных данных строят калибровочную кривую
зависимости абсорбции от концентрации гистамина в растворе.
Проведение испытаний
5 куб. см фильтрата 1 помещают в пробирку и проводят процедуру,
описанную выше, начиная с добавления раствора гидроокиси натрия.
Для определения концентрации гистамина в экстракте используют
калибровочную кривую.
Обработка результатов
Содержание гистамина в образце (мг/кг) вычисляют по формуле:
с x V
Г = ----- x Ф,
m
где:
с - концентрация гистамина, найденная по калибровочной кривой,
мкг/куб. см;
V - объем экстракта, куб. см (50 куб. см);
m - навеска образца БАД, г (10 г);
Ф - фактор разбавления:
V + V
мл фильтрата1 мл ТХУ кислоты
Ф = --------------------------------.
V
мл фильтрата1
Вычисления проводят до единиц. За окончательный результат
принимают среднее арифметическое значение результатов трех
параллельных определений.
Метрологические характеристики
Допустимое расхождение между результатами параллельных
определений не должно превышать 20% по отношению к
среднеарифметическому значению.
2. Определение содержания биогенных
аминов с помощью ВЭЖХ
Принцип метода
Метод определения содержания биогенных аминов устанавливает
хроматографическую методику выполнения измерений массовых
концентраций биогенных аминов (тирамина, кадаверина, путресцина,
спермидина, спермина, гистамина) в биологически активных добавках
к пище и предназначены для проведения лабораторных исследований
пищевой продукции и биологически активных добавок в соответствии с
СанПиН 2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования безопасности и
пищевой ценности пищевых продуктов".
Специфические приборы, реактивы, материал
Жидкостной хроматограф с насосом высокого давления с подачей
растворителя от 0,1 до 5,0 куб. см/мин., оборудованный
спектрофотометрическим детектором с переменной длиной волны и
системой для сбора и обработки хроматографических данных
МультиХром, версия 1,5х (Амперсенд, Россия).
Колонка и предколонка хроматографические с силикагелем с
размером частиц 5 мкм; длина колонки - 25 см, предколонки - 4,5
см, внутренний диаметр колонок - 0,46 см.
Микрошприцы МШ-10 и МШ-25 для жидкостной хроматографии.
Микроизмельчитель тканей РТ-2 по МРТУ 64.1-1505-63.
Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С, ТУ 64-1-2451-78.
Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим
пределом взвешивания 200 г и погрешностью +/- 0,0001 г.
Весы лабораторные с наибольшим пределом взвешивания до 200 г, с
пределом допустимой погрешности +/- 0,0005 г по ГОСТ 2404-80.
Колбы мерные наливные 2-50-2, 2-100-2 по ГОСТ 1770.
Центрифуга лабораторная.
Пипетки 4-1-2 или 5-1-2, 4-2-10 по ГОСТ 29227.
Кислота трихлоруксусная по ТУ 6-09-1926-77, раствор 50 г/л (5%-
ный раствор).
Кислота соляная по ГОСТ 3118, х.ч., раствор 0,1Н.
Натрий сернокислый безводный по ГОСТ 4166-76, х.ч.,
прокаленный.
Натрий углекислый по ГОСТ 83-79, х.ч., насыщенный раствор.
Натрий хлористый по ГОСТ 4233-77, х.ч., насыщенный раствор.
Этилацетат по ГОСТ 22300-76, ч.д.а.
Гексан по ТУ 6-09-3375-73, ч.
Бензол для хроматографии, х.ч. по ТУ 6-09-779-76.
Ацетон по ГОСТ 2603-71, ч.д.а.
5-диметиламино-нафталинсульфонил хлорид (дансилхлорид), Serva,
раствор 5 г/л в ацетоне.
Фильтры обеззольные ФО-ФС-15 "синяя лента" по ТУ 2642-001-
42624157-98.
Фильтр нейлоновый имп. на шприце в обойме 25 мм, размер пор
0,45 мкм.
Вода дистиллированная, ГОСТ 6709.
Баллон с сжатым азотом, ос.ч. по ГОСТ 9293-74.
Тирамин, кадаверин, путресцин, спермидин, спермин, гистамин или
их гидрохлориды.
Подготовка к испытанию
Приготовление основных стандартных растворов биогенных аминов
(БА)
Навески по 0,25 г аминов или соответствующие навески аминов
гидрохлоридов помещают в мерные колбы вместимостью 50 куб. см,
растворяют в 0,1 М растворе соляной кислоты, доводят этим же
раствором до метки и тщательно перемешивают. Получают стандартный
раствор аминов в 0,1 М HCl с массовыми долями каждого амина
(тирамин, кадаверин, путресцин, спермидин, спермин, гистамин) 5
мг/куб. см.
Приготовление рабочих стандартных растворов биогенных аминов
Аликвоты в 1 куб. см основного стандартного раствора каждого
биогенного амина переносят в мерные колбы вместимостью 50 куб. см,
доводят 0,1 М HCl до метки и тщательно перемешивают. Получают
рабочие стандартные растворы биогенных аминов концентрацией 0,1
мкг/куб. см.
Получение стандартных растворов ДНС-производных биогенных
аминов
Для получения стандартных растворов ДНС-производных биогенных
аминов отбирают по 0,05 куб. см каждого рабочего стандартного
раствора БА (5 мкг амина), помещают в вайл вместимостью 4-6 куб.
см, добавляют 0,5 куб. см насыщенного раствора бикарбоната натрия
(pH 8,5-9) и 1 куб. см ацетонового раствора ДНС-хлорида с
концентрацией 5 г/л. Смесь перемешивают и выдерживают при
комнатной температуре 12-14 ч или 1 ч при 45-50 град. C.
В реакционную смесь добавляют 1 куб. см дистиллированной воды и
отдувают ацетон в токе азота. При этом можно вайл поместить в
водяную баню, нагретую до 35-40 град. C. ДНС-амиды экстрагируют
бензолом (3x1 куб. см), каждый раз стеклянной пипеткой отбирая
верхний бензольный слой. Объединенные бензольные экстракты сушат
безводным сульфатом натрия, декантируют в сухой вайл, осушитель
промывают бензолом, также декантируют и упаривают досуха. Перед
анализом стандартные растворы ДНС-производных биогенных аминов
растворяют в 1 куб. см бензола.
Подготовка проб к анализу
Экстракция
Навеску 20 г пищевого продукта, взятую с точностью до 0,01 г,
размельченного в мясорубке или гомогенизаторе, или 20-40 таблеток
или капсул БАД (в зависимости от веса таблетки), размельченных в
ступке, помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см.
Добавляют соответственно 100 куб. см и 50 куб. см 5%-ного раствора
трихлоруксусной кислоты, снабжают воздушным холодильником,
перемешивают и выдерживают 15 мин. при температуре 60 град. C на
водяной бане, периодически встряхивая содержимое колбы. Полученную
смесь охлаждают и фильтруют через складчатый фильтр.
Получение дансильных производных биогенных аминов из образца
Аликвоту экстракта 0,5 куб. см, соответствующую 0,1 г исходного
образца, помещают в вайл вместимостью 4-6 куб. см, добавляют 0,5
куб. см насыщенного раствора бикарбоната натрия (pH 8,5-9) и 1
куб. см ацетонового раствора ДНС-хлорида с концентрацией 5 г/л.
Смесь перемешивают и выдерживают при комнатной температуре 12-14 ч
или 1 ч при 45-50 град. C.
В реакционную смесь добавляют 1 куб. см насыщенного раствора
натрия хлорида и отдувают ацетон в токе азота. При этом можно вайл
поместить в водяную баню, нагретую до 35-40 град. C. ДНС-амиды
экстрагируют бензолом (3х1 куб. см), каждый раз стеклянной
пипеткой отбирая верхний бензольный слой. Если расслоение
жидкостей происходит трудно, смесь центрифугируют в лабораторной
центрифуге. Объединенные бензольные экстракты сушат безводным
сульфатом натрия, декантируют в сухой вайл, осушитель промывают
бензолом, также декантируют и упаривают досуха. Перед анализом
сухой остаток растворяют в 1 куб. см бензола.
Проведение испытаний
Условия хроматографического анализа
Насос высокого давления с верхним пределом давления не менее 25
МПа, диапазоном регулирования подачи растворителя не менее 0,1-5,0
куб. см/мин.
Петлевое устройство ввода проб с рабочим объемом петли 0,020 куб. см.
Флуориметрический детектор, длина волны возбуждающего
излучения 335 нм, длина волны эмиссии 470 нм, проточная кварцевая
кювета объемом 0,015-0,025 куб. см, с уровнем флуктуационных
-5
шумов не более 8 х 10 ед. флуоресценции, относительной
погрешностью измерения интенсивности флуоресценции не более 2%.
Подвижная фаза: гексан - этилацетат, 55:45.
Скорость потока 1,0 мл/мин.
Выполнение измерений
В инжектор хроматографа микрошприцем вводят 0,005 куб. см
каждого стандартного раствора ДНС-производного биогенных аминов и
определяют времена удерживания и площади пиков на хроматограмме.
Градуировку проводят через каждые 6 часов работы прибора.
В инжектор хроматографа микрошприцем вводят 0,005 куб. см
экстракта пищевого продукта или БАД. На хроматограмме определяют
площади пиков, соответствующие по временам удерживанию стандартным
ДНС-производным биогенных аминов. Если пик на хроматограмме
экстракта выходит за пределы шкалы, анализ проводят повторно после
разбавления исходного раствора.
Вычисление результатов анализа
Содержание каждого биогенного амина в анализируемой пробе
рассчитывают по формуле:
m x S x V x V
обр общ обр
М = ----------------------,
S x V x V x P
ст э a
где:
М - массовая концентрация БА, мг/кг или ppm;
m - массовая доля внешнего стандарта ДНС-амида, введенного для
калибровки хроматографа, нг;
S - площадь пика исследуемого компонента;
обр
S - средняя площадь пика внешнего стандарта ДНС-амида,
ст
|
