|
Стр. 4
C x V
М = -----,
Р
где:
V - вместимость колбы, куб. см;
Р - предполагаемое содержание общего сахара в объекте
исследования, %;
С - оптимальная для данного метода концентрация сахаров в
водной вытяжке на 100 куб. см (принимают равной 0,16 г).
Растворение навески и осаждение несахаров проводят следующим
образом. Образец измельченного исследуемого БАД взвешивают с
погрешностью не более 0,01 г из такого расчета, чтобы в 100 куб.
см полученного раствора содержалось 0,3-0,4 г редуцирующих
веществ. Массу навески М в граммах вычисляют по формуле:
С х V
М = -----,
P
где:
С - оптимальное содержание редуцирующих веществ в 100 куб. см
раствора навески, г;
V - вместимость мерной колбы, куб. см;
Р - предполагаемая массовая доля редуцирующих веществ в
исследуемом изделии, %.
Навеску растворяют в стакане в дистиллированной воде, нагретой
до 60-70 град. C. Если БАД растворяется без остатка, то полученный
в стакане раствор охлаждают и переносят в мерную колбу
вместимостью 250 куб. см, доводят объем раствора до метки
дистиллированной водой и хорошо перемешивают. Если БАД в своем
составе имеет вещества, нерастворимые в воде (мешающие несахара -
белки, жиры, пектины, крахмал и т.д.), то навеску в стакане
переносят в мерную колбу вместимостью 250 куб. см, смывая
нерастворимые частицы в колбу дистиллированной водой примерно до
половины объема колбы. Органические кислоты, содержащиеся в
навеске, нейтрализуют раствором углекислого натрия до pH 7,0,
применяя для контроля универсальную индикаторную или лакмусовую
бумагу. Колбу помещают в водяную баню, нагретую до 60 град. C, при
этой температуре, временами взбалтывая, выдерживают в течение 15
мин. Охладив раствор до комнатной температуры, осаждают мешающие
несахара, прибавляя к раствору в колбе 10 куб. см 1 М раствора
сульфата цинка, если масса навески была менее 5 г, и 15 куб. см,
если масса навески была более 5 г, и такой объем 1 М раствора
гидроксида натрия, который установлен отдельным опытом при
титровании соответствующего объема раствора сульфата цинка с
фенолфталеином.
Содержимое колбы взбалтывают, доводят дистиллированной водой до
метки, перемешивают и фильтруют в сухую колбу, которую
предварительно ополаскивают 1-2 раза небольшой порцией фильтрата.
Допускается осаждение несахаров другими осадителями: растворами
ацетата свинца и фосфата (или сульфата) натрия и растворами
гексацианоферрата (II) калия и ацетата цинка. При осаждении
несахаров ацетатом свинца к охлажденному до комнатной температуры
раствору прибавляют мерным цилиндром 7 куб. см раствора ацетата
свинца, хорошо перемешивают и оставляют стоять 5 мин. Появление
прозрачного слоя жидкости над осадком указывает на полноту
осаждения, в противном случае вносят дополнительно по каплям
раствор ацетата свинца до появления прозрачного слоя жидкости.
Затем в эту же колбу для удаления избытка ацетата свинца вносят 18-
20 куб. см раствора фосфата (или сульфата) натрия.
Содержимое колбы взбалтывают, осадку дают отстояться. Для
осаждения избытка ацетата свинца фосфатом натрия достаточно 10
мин. При осаждении сульфатом натрия при мутном растворе жидкость
отстаивается 24 ч. После отстаивания проверяют полноту осаждения,
приливая по стенке горлышка колбы несколько капель раствора
фосфата или сульфата натрия. При помутнении жидкости прибавляют
дополнительно один из указанных выше растворов (1-2 куб. см),
затем содержимое колбы взбалтывают, дают отстояться и снова
проверяют полноту осаждения. При отсутствии помутнения в месте
соприкосновения жидкостей содержимое колбы доводят до метки
дистиллированной водой, перемешивают и фильтруют в сухую колбу.
При осаждении несахаров раствором гексацианоферрата (II) калия
к охлажденному до комнатной температуры раствору прибавляют
пипеткой 2 куб. см раствора гексацианоферрата (II) калия,
взбалтывают, добавляют 2 куб. см раствора ацетата цинка, снова
взбалтывают и дают отстояться 5 мин. Если раствор над осадком
остается мутным, добавляют большее количество указанных растворов
в равных объемах. Содержимое колбы доводят водой до метки,
перемешивают и фильтруют в сухую колбу. Во всех случаях фильтрат
должен быть прозрачным.
При анализе окрашенных БАД (сокосодержащих и т.п.) необходимо
связать красящие вещества и нейтрализовать органические кислоты
раствором 1 М гидроксида натрия или 1 М гидроксида калия и связать
дубильные вещества ацетатом свинца. Для этого добавляют к пробе по
капле раствор карбоната натрия или 1 М раствор гидроксида натрия
до слабокислой или нейтральной реакции и 30%-ный раствор ацетата
свинца. После тщательного перемешивания и отстаивания добавляют по
каплям раствор сульфата натрия до прекращения образования осадка,
для связывания избытка ацетата свинца. Доводят водой до метки,
отстаивают и фильтруют.
Проведение анализа
Определение восстанавливающих сахаров
В коническую колбу вместимостью 100-150 куб. см вносят 10 куб.
см раствора пробы, 6 куб. см дистиллированной воды и затем 25 куб.
см щелочного раствора гексацианоферрата калия. Колбу нагревают до
кипения за 3 мин., кипятят 1 мин., охлаждают и измеряют оптическую
плотность при лямбда = 440 нм. Раствор сравнения -
дистиллированная вода. Кювету берут размером, аналогичным взятому
для построения градуировочного графика. Если оптическая плотность
раствора не попадает в интервал 0,3-0,6, необходимо взять меньшую
аликвоту пробы или поменять разведение, сохраняя постоянный объем
жидкости в реакционной колбе равным 41 куб. см. Результаты
вычисляют, пользуясь градуировочным графиком и нижеприведенной
формулой.
Определение общего сахара
Для определения общего сахара проводят гидролиз сахарозы. В
реакционную коническую колбу вместимостью 100-150 куб. см
отмеривают пипеткой 10 куб. см приготовленной вытяжки объекта и 4
куб. см 1 М раствора хлороводородной кислоты. Колбу ставят на
электроплитку, жидкость доводят до кипения и кипятят 1 мин.,
охлаждают до комнатной температуры. Затем в колбу вносят 2 куб. см
2 М раствора гидроксида натрия (или калия) для нейтрализации
кислоты и затем 25 куб. см щелочного раствора гексацианоферрата
(III) калия. Содержимое колбы доводят до кипения и кипятят 1 мин.
После охлаждения заполняют полученным раствором кювету и
определяют оптическую плотность так же, как и при снятии
градуировочного графика. Так как при значении оптической плотности
в интервале 0,3-0,6 получаются более точные результаты, то при
других значениях оптической плотности анализ повторяют,
соответственно изменив объем вводимой водной вытяжки объекта
исследования, добавив в воду так, чтобы общий объем оставался
равным 10 куб. см.
Обработка результатов
Расчет содержания сахара
Содержание сахара Х (в %), выраженное в глюкозе, вычисляют
рс
по формуле:
M x V x 100
X = -----------,
рс V x m
1
где:
М - количество глюкозы, найденное по градуировочному графику,
мг;
V - объем исследуемого раствора, приготовленного из навески,
куб. м;
V - объем раствора, взятый для реакции с гексацианоферратом
1
калия, куб. см;
m - масса навески объекта исследования, мг.
Для определения содержания общего сахара, выраженного в
сахарозе, результат, полученный по формуле, умножают на 0,95. Если
калибровку проводят с использованием раствора гидролизованной
сахарозы, результат сразу выражают в % сахарозы. Для расчета
содержания сахарозы из данных анализа общего сахара, выраженного в
глюкозе, вычитают результат анализа содержания восстанавливающих
сахаров и разницу умножают на коэффициент 0,95.
Вычисления проводят до второго десятичного знака. За результат
измерения принимают среднее арифметическое значение результатов
двух параллельных определений (X ) и выражают целым числом с одним
1
десятичным знаком.
Метрологические характеристики
Допустимые расхождения между результатами двух параллельных
(r) определений не должны превышать:
r = 0,02 + 0,03 x X ,
1
но не более 0,5% абсолютного содержания сахара в БАД, где X -
1
среднее арифметическое значение двух параллельных определений.
Допустимое расхождение между результатами измерений,
выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать:
R = 0,04 + 0,05 x X ,
2
но не более 1,0% абсолютного значения содержания сахара в
продукте, где Х - среднее значение результатов измерений,
2
проведенных в двух разных лабораториях.
4.2. Титрометрический метод
Метод основан на титровании избытка гексацианоферрата калия
стандартным раствором глюкозы в присутствии метиленового голубого
до полного обесцвечивания.
Подготовку к анализу проводят так же, как и в колориметрическом
методе.
Проведение анализа
Определение восстанавливающих сахаров
В коническую колбу вместимостью 100-150 куб. см вносят 10 куб.
см раствора пробы, 25 куб. см щелочного раствора гексацианоферрата
калия. Колбу нагревают до кипения за 3 мин., кипятят ровно 3 мин.
и вводят 2 капли метиленового голубого, дотитровывают без
прекращения кипячения раствором глюкозы до исчезновения синей
окраски. Содержание сахаров определяют по формуле, представленной
выше.
Холостой опыт проводят в тех же условиях, отбирая вместо 10
куб. см раствора пробы 10 куб. см стандартного раствора глюкозы.
Количество стандартного раствора глюкозы V , пошедшее на
1
титрование 25 куб. см щелочного раствора гексацианоферрата (III)
калия, суммируется как 10 куб. см глюкозы, взятых на анализ, и
объем глюкозы, который пошел на дотитровывание.
Определение общего сахара
Проводят предварительный гидролиз сахарозы. Затем вносят 25
куб. см щелочного раствора гексацианоферрата (III) калия и далее
проводят кипячение и титрование как и для определения
восстанавливающих сахаров.
Расчет общего сахара
Содержание общего сахара (Х ) в %, выраженное в глюкозе,
ос
вычисляют по формуле:
1,6 (V - V ) V 100
1 2 к
X = --------------------,
ос V M
в
где:
V - количество стандартного раствора глюкозы, пошедшее на
1
титрование 25 куб. см щелочного раствора гексацианоферрата (III)
калия в холостом опыте, куб. см;
V - количество стандартного раствора глюкозы, пошедшее на
2
дотитровывание, куб. см;
1,6 - количество глюкозы в 1 куб. см раствора, мг;
V - вместимость мерной колбы, используемой для приготовления
к
водной вытяжки, куб. см;
М - масса навески объекта исследования, мг.
Для получения содержания общего сахара, выраженного в
сахарозе, результат, полученный по формуле, умножают на 0,95. Если
калибровку проводят с использованием раствора гидролизованной
сахарозы, результат сразу выражают в % сахарозы. Для расчета
содержания сахарозы из данных анализа общего сахара, выраженного в
глюкозе, вычитают результат анализа содержания восстанавливающих
сахаров и разницу умножают на коэффициент 0,95.
Вычисления проводят до второго десятичного знака. За результат
измерения принимают среднее арифметическое значение результатов
двух параллельных определений (Х ) и выражают целым числом с одним
1
десятичным знаком.
Метрологические характеристики фотометрического
и титрометрического методов
Допустимые расхождения между результатами двух параллельных
(r) определений не должны превышать:
r = 0,03 + 0,035 x X ,
1
но не более 0,5% абсолютного содержания сахара в БАД, где X -
1
среднее арифметическое значение двух параллельных определений.
Допустимое расхождение между результатами измерений,
выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать:
r = 0,04 + 0,05 x X ,
2
но не более 1,0% абсолютного содержания сахара в БАД, где Х -
2
среднее значение результатов измерений, проведенных в двух разных
лабораториях.
5. Определение содержания нерастворимых
и растворимых пищевых волокон (ферментативный метод)
Сущность метода заключается в гидролизе и удалении белковых и
крахмалистых веществ ферментами, аналогичными ферментам
пищеварительного тракта человека из БАД на растительной основе.
Метод позволяет определять растворимые (в этиловом спирте) и
нерастворимые пищевые волокна, отличающиеся физиологическим
действием.
Специфическая аппаратура, материалы, реактивы
Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом
взвешивания 200 г второго класса точности по ГОСТ 24104-80.
Шкаф сушильный лабораторный.
Спектрофотометр СФ-26 или другой с аналогичными
характеристиками.
Водяная баня любого типа, обеспечивающая температуру нагрева 37
+/- 0,2 град. C, 40 +/- 0,2 град. C, 60 +/- 0,2 град. C, 100 град.
C, или термостат.
Прибор для определения pH среды с диапазоном измерений 0-14 с
погрешностью измерения +/- 0,1 ед. pH.
Воронки стеклянные с пористым фильтром N 40, N 100 по ГОСТ
25336-82.
Спирт этиловый по ГОСТ 5962-67 или ГОСТ 18300-72 и раствор с
массовой долей этилового спирта 700 г/куб. дм.
Панкреатин, фармзавод Лейрас, А/О Хухтамяки, медицинский
препарат, активность которого гарантирована в пределах
установленных сроков хранения.
Глюкоамилаза очищенная по ТУ 64-13-18-88.
Гемоглобин бычий окисленный лиофилизированный МБ по ТУ 6-09-10-
656-77.
Протеаза N Р-3910, Sigma Chemical Co. (хранится только в
холодильнике), или другой протеолитический ферментный препарат
аналогичной активности, например пепсин А из слизистой оболочки
желудка свиньи, активность которого устанавливают следующим
образом. Сначала готовят 2%-ный раствор гемоглобина. Для этого 300
мг гемоглобина растворяют в 12,9 куб. см дистиллированной воды (до
полного растворения), приливают 2,1 куб. см раствора соляной
кислоты концентрации 0,3 М.
Определение активности проводят следующим образом: 68,5 мг
пепсина растворяют в 10 куб. см раствора соляной кислоты
концентрации 0,03 М; 0,2 куб. см полученного раствора пепсина
приливают к 1 куб. см субстрата гемоглобина, предварительно
нагретого на водяной бане в течение 5 мин. при температуре 37
град. C. Инкубируют смесь при той же температуре в течение 10 мин.
(по секундомеру). Реакцию останавливают путем приливания 5 куб. см
раствора соляной кислоты концентрации 100 г/куб. дм. Смесь
выдерживают на водяной бане еще 5 мин. Фильтруют через плотный
бумажный фильтр (фильтраты должны быть абсолютно прозрачными).
Одновременно с опытными готовят контрольную пробу. Для этого к 1
куб. см субстрата гемоглобина приливают 0,2 куб. см раствора
соляной кислоты концентрации 0,03 М и 5 куб. см 10% раствора
трихлоруксусной кислоты, затем инкубируют смесь и фильтруют по
предложенной выше схеме. Содержание пепсина определяют
спектрофотометрически: оптическую плотность опытных и контрольных
фильтратов измеряют против дистиллированной воды при длине волны
280 нм в кюветах 1 см на СФ-26 или другом с подобными
характеристиками.
Построение калибровочного графика: готовят ряд растворителей
рабочего стандарта пепсина с концентрацией фермента 50, 100, 150,
200, 250 мкг/куб. см. Для этого пользуются следующими данными,
приведенными в табл. 9.
Таблица 9
КОЛИЧЕСТВО ФЕРМЕНТОВ
---------------------------------------T-----T----T-----T----T---¬
¦Концентрация фермента, мкг/куб. см ¦50 ¦100 ¦150 ¦200 ¦250¦
+--------------------------------------+-----+----+-----+----+---+
¦Количество раствора рабочего стандарта¦0,1 ¦0,2 ¦0,3 ¦0,4 ¦0,5¦
¦пепсина, куб. см ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+--------------------------------------+-----+----+-----+----+---+
¦Количество раствора соляной кислоты с ¦9,9 ¦9,8 ¦9,7 ¦9,6 ¦9,5¦
¦концентрацией 0,03 М, куб. см ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
L--------------------------------------+-----+----+-----+----+----
Во всех растворах, приготовленных по таблице, определяют
содержание пепсина, как описано выше, и строят график, откладывая
на оси ординат величины оптической плотности, а на оси абсцисс -
концентрацию пепсина в мкг. По калибровочному графику определяют
количество активного пепсина в исследуемом препарате. Результаты
измерений выражают в протеиназных единицах (по гемоглобину), ПЕ .
нв
За протеиназную единицу принимают действие такого количества
фермента, которое в данных условиях опыта и измерений за 1 мин.
приводит к увеличению оптической плотности фильтрата на единицу.
Например, по предложенному калибровочному графику 250 мкг пепсина
увеличивают оптическую плотность фильтрата на 0,5 за 10 мин.,
следовательно, 5000 мкг пепсина приводит к увеличению оптической
плотности на единицу за 1 мин. (1 ПЕ = 5000 мкг, или 1 мкг = 5 х
нв
-3
10 ПЕ ).
нв
Подготовка к испытанию
Приготовление фосфатного буферного раствора панкреатина
Готовят 0,05 М фосфатный буфер, pH 6,0 (0,875 г дигидрофосфата
и 6,05 г натрия гидрофосфата растворяют в примерно 700 куб. см
дистиллированной воды в колбе на 1 куб. дм, затем доводят до метки
дистиллированной водой).
Готовят раствор панкреатина с концентрацией панкреатина в 0,05
М фосфатном буфере 5 мг/куб. см.
Приготовление 0,5%-ного водного раствора глюкоамилазы
Растворяют 500 мг глюкоамилазы в 100 куб. см дистиллированной
воды.
Подготовка образцов к испытанию
Исследуемый сухой материал измельчают на лабораторной мельнице,
просеивают через сито, собирая фракцию с размером частиц не более
1 мм; влажный материал гомогенизируют в гомогенизаторе или
микроизмельчителе тканей.
При содержании жира в образцах более 5% проводят обезжиривание.
Для этого навеску образца, предназначенную для определения пищевых
волокон, заливают трехкратным объемом петролейного эфира (к массе
образца), перемешивают в течение 15 мин. периодически и затем
отстаивают не менее 1 мин. Прозрачный раствор петролейного эфира
декантируют и повторяют экстракцию с тем же количеством эфира 2
раза. Обезжиренный образец высушивают на воздухе.
Ориентировочное содержание крахмала в образце устанавливают по
справочным таблицам или другим любым приемлемым методом.
Проведение испытания
0,5 г тонкоизмельченного образца, взвешенного с точностью до
0,0001 г, помещают в химический стакан и суспендируют в 30 куб. см
дистиллированной воды при 40 град. C в течение 1,5 ч.
Полученную суспензию после настаивания нагревают на кипящей
водяной бане для клейстеризации крахмала 30 мин. при условии, что
температура суспензии достигает 90 град. C.
После охлаждения смеси до комнатной температуры устанавливают
pH 1,5 +/- 0,1 раствором соляной кислоты концентрацией 5 М,
-3
добавляют 100 мг пепсина (активность 1 мкг эквивалентна 5 х 10
ПЕ )и ставят на инкубацию при температуре 40 град. C в течение 1-
нв
1,5 ч при периодическом помешивании. При недостаточной активности
пепсина необходимо скорректировать его количество по вышеописанной
методике при проведении ферментолиза.
Смесь охлаждают до комнатной температуры, затем устанавливают
pH 6,8 +/- 0,1 раствором гидроксида натрия концентрацией 3 М и
приливают 10 куб. см 0,05 молярного буферного раствора
панкреатина. Смесь инкубируют в течение 1-1,5 ч при помешивании
при температуре 40 град. C. Охлаждают полученную смесь до
комнатной температуры, приливают 1,0 куб. см водного раствора
глюкоамилазы концентрацией 50 мг/куб. см (рекомендуется
использовать 100 единиц активности глюкоамилазы на расщепление 1 г
крахмала), устанавливают pH 4,8 +/- 0,1 раствором соляной кислоты
концентрацией 5 М и инкубируют при температуре 40 град. C в
течение 12 ч.
Полноту гидролиза крахмала определяют йодной пробой. Для этого
несколько капель смеси помещают на стекло, добавляют каплю йода в
водном растворе йодида калия. О присутствии крахмала в препарате
пищевых волокон судят по наличию окрашенных в синий цвет
крахмальных зерен. В случае положительной реакции на крахмал
проводят обработку смеси дополнительным количеством глюкоамилазы
(приливают к смеси 5 куб. см водного раствора глюкоамилазы
концентрацией 5 мг/куб. см и инкубируют 1 ч при аналогичных
условиях: pH 4,8 +/- 0,1, температура 60 град. C).
Полученную смесь фильтруют через предварительно доведенный до
постоянной массы фильтр N 100 или предварительно высушенный и
взвешенный обеззоленный фильтр. Нерастворимые пищевые волокна,
оставшиеся на фильтре, промывают последовательно 25 куб. см 70%-
ного раствора этилового спирта (в 2 приема) и 25 куб. см ацетона
(в 2 приема). Фильтрат должен быть прозрачным.
Фильтр помещают в сушильный шкаф при температуре 105 +/- 1
град. C и высушивают до постоянной массы. Фильтрат делят на 2
равные части. В одной части фильтрата осаждают растворимые пищевые
волокна 4-кратным количеством 96%-ного этилового спирта, взятого к
объему фильтрата. Смесь оставляют для осаждения на 10-12 ч, затем
фильтруют через доведенный до постоянной массы стеклянный пористый
фильтр N 40 (при необходимости используют слабый вакуум) до
получения прозрачного фильтрата. Остаток на фильтре промывают
последовательно 25 куб. см 70%-ного раствора этилового спирта и 25
куб. см ацетона, затем высушивают в сушильном шкафу при
температуре 105 +/- 1 град. C до постоянной массы.
В полученных препаратах нерастворимых пищевых волокон
определяют содержание непереваренного белка по методу Кьельдаля и
золы по ГОСТу 10847-74. Для корректировки данных по содержанию
пищевых волокон от возможного осаждения остатка ферментов на
растворимые и нерастворимые пищевые волокна параллельно проводят
холостой опыт по вышеизложенной схеме, но без навески образца.
Холостой опыт важно проводить при использовании новых партий
ферментов.
Обработка результатов
Содержание пищевых волокон в БАД определяют по следующим
формулам.
Для нерастворимых пищевых волокон:
M - (B + C) - M
1 2
X = ----------------- x 100.
1 M
Для растворимых пищевых волокон:
М - М
3 2
X = ------- x 100 x 2,
2 М
где:
X - содержание нерастворимых пищевых волокон, %;
1
Х - содержание растворимых пищевых волокон, %;
2
М - навеска образца, г;
M и М - масса остатка нерастворимых или растворимых пищевых
1 3
волокон после высушивания соответственно, г;
M - масса остатка в холостом опыте после высушивания, г;
2
В - содержание белка в препарате пищевых волокон, г;
С - содержание золы в препарате пищевых волокон, г.
Общее содержание пищевых волокон (X) вычисляют суммированием
величин X и Х .
1 2
За окончательный результат определения массовой доли
нерастворимых или растворимых пищевых волокон принимают среднее
арифметическое результатов двух параллельных определений.
Вычисление проводят до второго десятичного знака с последующим
округлением до первого десятичного знака.
Метрологические характеристики
Относительное допустимое расхождение между результатами двух
параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, по
отношению к среднему арифметическому значению (Rr) и относительное
допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в
двух разных лабораториях, по отношению к среднему арифметическому
значению (RR) приведены в табл. 10.
Таблица 10
ОТНОСИТЕЛЬНЫЕ ДОПУСТИМЫЕ ВНУТРИЛАБОРАТОРНЫЕ (Rr)
И МЕЖЛАБОРАТОРНЫЕ (RR) РАСХОЖДЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
--------------------------T------------------T-------------------¬
¦ Вид пищевых волокон ¦ Rr, % ¦ RR, % ¦
+-------------------------+------------------+-------------------+
¦Растворимые ¦ 15 ¦ 20 ¦
¦ ¦ ¦ ¦
¦Нерастворимые ¦ 10 ¦ 30 ¦
L-------------------------+------------------+--------------------
Глава 2. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКРОНУТРИЕНТОВ
I. Методы определения витаминов
1. Одновременное определение витаминов А, Е
и каротиноидов в БАД методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии
Сущность метода
Метод определения витаминов А, Е и каротиноидов, включая бета-
каротин, альфа-каротин, ликопин, криптоксантин, лютеин,
зеаксантин, при совместном присутствии в биологически активных
добавках (витаминное драже, таблетки, порошки и кристаллические
витаминные препараты, их растворы или суспензии в жирах) основан
на экстракции микронутриентов органическим растворителем после
щелочного омыления субстрата (1) или непосредственного
растворения, упаривании полученного экстракта и переводе сухого
остатка в другой растворитель, введении экстракта на ВЭЖХ колонку
для хроматографического разделения и последующего определения с
помощью флуоресцентного и спектрофотометрического детекторов (2).
Определение массовой концентрации витаминов и каротиноидов
основано на измерении площади (или высоты) пика при
соответствующей каждому соединению длине волны детектирования
после введения в хроматографическую систему анализируемых проб и
градуировочных растворов.
Характеристика погрешности измерений
Настоящая методика измерений массовой концентрации
жирорастворимых витаминов А, Е и каротиноидов в биологически
активных добавках с вероятностью Р = 0,95 обеспечивает выполнение
анализа с погрешностями +/- 15% во всем диапазоне измерений.
Средства измерений, вспомогательные устройства,
реактивы и материалы
Спектрофотометр, например, "СФ-46" с диапазоном измерения от
190 нм до 700 нм с допустимой абсолютной погрешностью измерений
коэффициента пропускания не более 1% по ТУ 3-3.1841-84; кюветы
кварцевые рабочей длиной 10 мм.
Спектрофотометрический детектор для ВЭЖХ (типа "Джаско 870-UV",
Япония) с проточной кюветой объемом 8 мкл (длина оптического пути
10 мм), уровнем относительной погрешности измерения не более 2% с
программируемой сменой длин волн, позволяющий проводить
исследования в видимом и ультрафиолетовом диапазоне спектра (от
190 до 600 нм).
Спектрофлуориметрический детектор для ВЭЖХ (типа "Джаско" 821-
FP) с проточной кварцевой кюветой объемом 16 мкл (длина
оптического пути 10 мм), уровнем относительной погрешности
измерения интенсивности флуоресценции не более 2%, с
программируемой сменой длин волн, позволяющий проводить
исследования в видимом и ультрафиолетовом диапазоне спектра
возбуждения и эмиссии (от 220 до 650 нм).
Насос для ВЭЖХ (типа "Джаско" 880-PU), позволяющий осуществлять
расход элюента 0,5-1,0 куб. см/мин. с возможностью работы при
давлении не менее 300 кг/кв. см, погрешностью поддержания скорости
подачи растворителя 0,6 куб. см/мин. не более 2,5%.
Микрошприц (типа "Гамильтон", США) вместимостью 100 куб. мм для
ввода проб в жидкостный хроматограф.
Регистрирующее устройство: интегратор (типа "Шимадзу C-R6A",
Япония) или самописец, позволяющий проводить измерение с
погрешностью не более 0,5%.
Дозатор автоматический типа ПЛ-01-200.
Колбы мерные 2-100-2, 2-50-2 по ГОСТ 1770-74Е.
Цилиндры вместимостью 100 куб. см по ГОСТ 1770-74Е.
Пробирки П-4-10-14/23 ХС по ГОСТ 25336.
Линейка металлическая с ценой деления 1 мм по ГОСТ 427-75.
Вспомогательные устройства и материалы
Встряхиватель типа АВУ-6с по ТУ 64-1-2451-78.
Центрифуга ОПн-8-У4.2 по ТУ 5.375-4261-76.
Баллон с газообразным азотом квалификации ос.ч. по ГОСТ 9293-
74.
Реактивы
Метанол (СН3ОН) для жидкостной хроматографии ос.ч. по ТУ 6-09-
2192-85.
Ацетонитрил (CH3CN) для жидкостной хроматографии ос.ч. по ТУ 6-
09-14-2167-84.
Метилен хлористый (CH2Cl2), ос.ч. по ТУ 6-09-14-2149-83.
Гексан (C6H6), х.ч. для хроматографии по ТУ 6-00-4521.
Спирт этиловый (C2H5OH) ректификованный технический по ГОСТ
18300-87.
Полностью транс-ретинол (C20H30O) кристаллический, номер по
каталогу 124769 фирмы "Мерк" (Германия).
Ретинола ацетат (C22H32O2) по Госфармакопея, X изд., ст. 578.
Ретинола пальмитат (C26H60O2) по ФС 42-2229-84.
DL-альфа-токоферол (C29H50O2), номер по каталогу Т3251 фирмы
"Сигма".
альфа-токоферола ацетат (C31H52O2) по ФС 42-2495-87.
Каротиноиды: лютеин (С40Н56O2), ликопин (C40H56), альфа-каротин
(C40H56), бета-каротин (C40H56), соответствующие номера Х6250,
L9879, С0251, С9750 по каталогу фирмы "Сигма" (США), зексантин
(С40Н56О2), бета-криптоксантин (С40Н56О) фирмы "Рош" (Швейцария).
Калия гидроокись по ГОСТ 24363, ч.д.а.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72.
Средства измерения должны быть поверены в установленные сроки.
Допускается использование других средств измерения,
вспомогательного оборудования и реактивов, имеющих аналогичные или
лучшие характеристики.
Условия выполнения измерений
Для предотвращения разрушения витаминов и каротиноидов анализ
БАД и стандартов проводят в присутствии антиоксиданта -
аскорбиновой кислоты, предохраняя пробы от попадания на них
прямого солнечного света.
Подготовка к выполнению измерений
Приготовление растворов
1. Приготовление раствора гидроокиси калия с массовой долей 50%
50 г гидроокиси калия растворяют в 50 куб. см дистиллированной
воды.
2. Подвижная фаза для хроматографии
В мерную колбу на 500 куб. см помещают 250 куб. см
ацетонитрила, 25 куб. см дихлорметана и доводят объем смеси до
метки метанолом. Раствор тщательно перемешивают. Срок хранения в
темноте при 2-8 град. C - 1 год.
Количественное определение витаминов А, Е и бета-каротина
Количественное определение проводят методом абсолютной
калибровки, для чего проводят определение градуировочного
коэффициента.
Для определения градуировочного коэффициента готовят несколько
(не менее 4) калибровочных растворов витамина А (полностью транс-
ретинол кристаллический; ретинола ацетат по Госфармакопея, X изд.,
ст. 578; ретинола пальмитат по ФС 42-2229-84) с концентрацией от
0,3 до 3 мкг/куб. см, витамина Е с концентрацией от 2 до 20
мкг/куб. см (DL-альфа-токоферол; альфа-токоферола ацетат по ФС 42-
2495-87), бета-каротина с концентрацией от 0,2 до 1,5 мкг/куб. см.
Приготовление градуировочных растворов витамина А
Для приготовления градуировочных растворов из ретинола 0,01 г
витамина А количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100
куб. см, добавляют 50 куб. см этанола. Содержимое колбы тщательно
перемешивают до полного растворения кристаллов ретинола, после
чего объем в колбе доводят до метки этиловым спиртом и содержимое
колбы вновь тщательно перемешивают. После введения в колбу на 100
куб. см аликвоты раствора витамина А в этаноле (0,3; 0,5; 1,0;
1,5; 2,0 куб. см) добавляют растворитель до метки.
Для приготовления калибровочных растворов из ацетата ретинола
(пальмитата ретинола) 0,01 г витамина А помещают в коническую
колбу вместимостью 100 куб. см, прибавляют 30 куб. см этанола, 3
куб. см 50% раствора гидроокиси калия и нагревают в течение 30
мин. на водяной бане с обратным холодильником при температуре 63-
68 град. C. Содержимое колбы быстро охлаждают до комнатной
температуры, количественно переносят 50 куб. см воды в делительную
воронку и извлекают 150 куб. см гексана (3 раза по 50 куб. см) в
течение двух минут. Объединенные гексановые экстракты промывают
водой по 50 мл до исчезновения щелочной реакции промывных вод (по
индикаторной бумаге). Промытые гексановые экстракты количественно
переносят в колбу вместимостью 200 куб. см и доводят объем
раствора до метки тем же растворителем. Из полученного раствора
отбирают 1, 2, 3, 4, 5 куб. см раствора в мерные колбы
вместимостью 100 куб. см, упаривают в токе азота, сухой остаток
растворяют в этаноле и доводят объемы до метки тем же
растворителем.
Приготовление градуировочных растворов витамина Е
Для приготовления градуировочных растворов из альфа-токоферола
0,02 г витамина Е количественно переносят в мерную колбу
вместимостью 100 куб. см, добавляют 2 куб. см дихлорметана.
Содержимое колбы тщательно перемешивают до полного растворения
токоферола, после чего объем в колбе доводят до метки этиловым
спиртом и содержимое колбы вновь тщательно перемешивают. После
введения в колбу на 100 куб. см аликвоты раствора витамина Е в
этаноле (1, 3, 5, 7, 10 куб. см) добавляют растворитель до метки.
Для приготовления градуировочных растворов из ацетата альфа-
токоферола 0,02 г витамина Е количественно переносят в коническую
колбу вместимостью 100 куб. см, добавляют 0,2 г аскорбиновой
кислоты, 30 куб. см этанола, 3 куб. см 50%-ного раствора
гидроокиси калия и нагревают в течение 30 мин. на водяной бане с
обратным холодильником при температуре 63-68 град. C. Содержимое
колбы быстро охлаждают до комнатной температуры, количественно
переносят 50 куб. см воды в делительную воронку и извлекают 150
куб. см гексана (3 раза по 50 куб. см) в течение двух минут.
Объединенные гексановые экстракты промывают водой по 50 мл до
исчезновения щелочной реакции промывных вод (по индикаторной
бумаге). Промытые гексановые экстракты количественно переносят в
колбу вместимостью 200 куб. см и доводят объем раствора до метки
тем же растворителем. Из полученного раствора отбирают 2, 4, 6, 8,
10 куб. см раствора в мерные колбы вместимостью 100 куб. см,
упаривают в токе азота, сухой остаток растворяют в 1 куб. см
дихлорметана и доводят объемы до метки этанолом.
Приготовление градуировочных растворов каротиноидов
Для приготовления градуировочных растворов бета-каротина 5 мг
кристаллического бета-каротина количественно переносят в мерную
колбу вместимостью 50 куб. см, добавляют 1 мл дихлорметана.
Содержимое колбы тщательно перемешивают до полного растворения
кристаллов, после чего объем в колбе доводят до метки этанолом и
содержимое колбы вновь тщательно перемешивают. После введения в
колбу на 100 куб. см аликвоты раствора бета-каротина в этаноле
(0,3; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 куб. см) добавляют растворитель до метки.
Градуировочные растворы других каротиноидов (альфа-каротина,
ликопина, бета-криптоксантина, лютеина, зеаксантина) готовят
аналогично раствору бета-каротина.
Полученные растворы хранят в холодильнике при 2-8 град. C не
более 6 месяцев.
Массовую концентрацию витаминов и каротиноидов в градуировочных
растворах (С, мкг/куб. см) уточняют спектрофотометрическим
методом. Для этого определяют оптическую плотность (D) слоя
градуировочного раствора толщиной 1 см по отношению к растворителю
при длине волны, указанной в таблице, и рассчитывают по формуле:
4
D x 10
С = ---------,
1%
E x 1
1 см
где:
1% -1 -1
Е - коэффициент светопоглощения, куб. см x мкг x см ;
1 см
1 - толщина слоя раствора, см;
4
10 - коэффициент пересчета.
Таблица 11
УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИХ ИЗМЕРЕНИЙ
-------------------T--------T------------------T-------T---------¬
¦ Витамин ¦Раство- ¦ЛЯМБДА , ] нм ¦ 1% ¦Литера- ¦
¦ (каротиноид) ¦ритель ¦ макс. ¦ Е ¦турный ¦
¦ ¦ ¦ ¦ 1 см ¦источник ¦
+------------------+--------+------------------+-------+---------+
¦Ретинол ¦ этанол ¦ 325 ¦ 1832 ¦ [2] ¦
+------------------+--------+------------------+-------+---------+
¦альфа-токоферол ¦ этанол ¦ 292 ¦ 75,8 ¦ [2] ¦
+------------------+--------+------------------+-------+---------+
¦бета-каротин ¦ этанол ¦ 453 ¦ 2620 ¦ [3] ¦
+------------------+--------+------------------+-------+---------+
¦альфа-каротин ¦ гексан ¦ 445 ¦ 2710 ¦ [3] ¦
+------------------+--------+------------------+-------+---------+
|
