|
Стр. 16
устанавливают эмиссионный фильтр с границей пропускания от 415 до
420 нм. Входное напряжение самописца 10 мВ, чувствительность
детектора устанавливают таким образом, чтобы 5 нг охратоксина А
соответствовало отклонение пера на полную шкалу самописца при
уровне шума от 3 до 5% от полной шкалы.
Для калибровки прибора в инжектор с помощью микрошприца вводят
0,002, 0,003 и 0,005 куб. см (2, 3 и 5 нг) рабочего раствора
охратоксина А для ВЭЖХ. Для каждого количества введенного
охратоксина А определяют высоту пика. При описанных выше условиях
коэффициент емкости (К') для охратоксина А составляет примерно 1,9-
2,5. В инжектор хроматографа вводят с помощью микрошприца 0,02
куб. см раствора охратоксина А в метаноле. При наличии пика,
совпадающего по времени удерживания с охратоксином А, определяют
его высоту (h).
Расчет концентрации охратоксина А в образце производят по
формуле:
V x V x m x h
1 3
С = C = --------------------------,
10 x K x V x V x M x h
2 4 ст
где:
С - концентрация охратоксина А в образце, мг/кг;
V - объем хлороформа для экстракции образца, куб. см (125
1
куб. см);
V - объем хлороформного фильтрата, взятый для анализа, куб.
2
см (50 куб. см);
V - объем экстракта (раствор А) перед ВЭЖХ, куб. см (0,4 куб.
3
см);
V - объем экстракта (раствор А), введенный в хроматограф,
4
куб. см (0,02 куб. см);
m - масса стандарта охратоксина А, введенного в хроматограф,
нг;
h - высота пика, соответствующая данной массе стандарта, мм;
ст
h - высота пика охратоксина из образца, мм;
М - навеска образца для анализа, г (25 г);
К - степень извлечения охратоксина А по табл. 51.
Если пик охратоксина А в образце выходит за пределы шкалы
самописца, анализ с помощью ВЭЖХ проводят повторно после
разбавления экстракта (раствор А) метанолом (после увеличения
объема V ).
3
Метрологические характеристики
Относительное допустимое расхождение между результатами двух
параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, по
отношению к среднему арифметическому значению (Rr) и относительное
допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в
двух разных лабораториях, по отношению к среднему арифметическому
значению (RR), а также предел определения, по данным авторов
методов анализа охратоксина А, приведены в табл. 51, в которой
приведены также относительные внутрилабораторные (Rs ) и
r
межлабораторные (RS ) среднеквадратичные отклонения и средняя
R
степень извлечения микотоксинов.
Таблица 51
ОТНОСИТЕЛЬНЫЕ ДОПУСТИМЫЕ ВНУТРИЛАБОРАТОРНЫЕ (Rr)
И МЕЖЛАБОРАТОРНЫЕ (RR) РАСХОЖДЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ,
ВЕЛИЧИНА ПРЕДЕЛА ОПРЕДЕЛЕНИЯ И СТЕПЕНЬ ИЗВЛЕЧЕНИЯ
ДЛЯ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОХРАТОКСИНА А
--------T-----T------T------T-----T-----T------------T-----------¬
¦Уровень¦Метод¦Rs , %¦RS , %¦ Rr, ¦ RR, ¦ Предел ¦ Степень ¦
¦загряз-¦ ¦ r ¦ R ¦ % ¦ % ¦определения,¦извлечения,¦
¦нения, ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ мг/кг ¦ % ¦
¦мг/кг ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-------+-----+------+------+-----+-----+------------+-----------+
¦0,1 ¦ТСХ ¦ 26 ¦ 43 ¦ 73 ¦ 120 ¦ 0,015 ¦ 90 ¦
+-------+-----+------+------+-----+-----+------------+-----------+
¦ ¦ВЭЖХ ¦ 9 ¦ 19 ¦ 25 ¦ 53 ¦ 0,0013 ¦ 90 ¦
+-------+-----+------+------+-----+-----+------------+-----------+
¦0,03 ¦ТСХ ¦ 34 ¦ 50 ¦ 95 ¦ 140 ¦ 0,015 ¦ 90 ¦
+-------+-----+------+------+-----+-----+------------+-----------+
¦ ¦ВЭЖХ ¦ 19 ¦ 24 ¦ 53 ¦ 67 ¦ 0,0013 ¦ 90 ¦
L-------+-----+------+------+-----+-----+------------+------------
3. Метод обнаружения, идентификации
и определения содержания дезоксиниваленола (вомитоксина)
и зеараленона в БАД на зерновой основе
Экстракция
Навеску 25 г измельченной отобранной пробы помещают в
плоскодонную коническую колбу на 250 куб. см, добавляют 125 куб.
см смеси ацетонитрил - вода (84:16). Встряхивают на аппарате для
встряхивания проб в течение 30 мин. Полученную смесь фильтруют
через бумажный складчатый фильтр в мерный цилиндр. Отбирают 25
куб. см фильтрата для анализа на дезоксиниваленол и 50 куб. см
фильтрата для анализа на зеараленон.
Обнаружение, идентификация и определение
содержания дезоксиниваленола в экстракте
Очистка экстракта
В стеклянную хроматографическую колонку на дно помещают кусочек
ваты, насыпают 0,75 г порошка активированного угля и сверху - слой
0,75 г оксида алюминия.
Над слоем оксида алюминия помещают кусочек ваты. Осторожно
наливают в колонку 25 куб. см экстракта, соответствующие 5 г
исходного образца. Отбирают элюат и, не давая колонке просохнуть,
добавляют 10 куб. см смеси ацетонитрил - вода (84:16).
Объединенные элюаты фильтруют через бумажный складчатый фильтр
в грушевидную колбу на 50 куб. см, бумажный фильтр промывают 5-10
куб. см изопропилового спирта в ту же колбу и фильтрат упаривают
на ротационном испарителе до объема 5-7 куб. см. Добавляют около
20 куб. см изопропилового спирта и повторно упаривают на
ротационном испарителе досуха. Остаток в колбе после упаривания не
должен содержать капель воды. Остаток растворяют в 0,2 куб. см
смеси бензол - ацетонитрил (5:1) и плотно закрывают стеклянной
пробкой (раствор А). Для обращеннофазной ВЭЖХ остаток растворяют в
0,2 куб. см ацетонитрила (раствор A1).
Обнаружение и количественное определение дезоксиниваленола с
помощью одномерной ТСХ
Пластинку "Силуфол" размечают в соответствии с рис. 28. На
линию, проведенную в 1,5 см от нижнего края пластинки, с помощью
микрошприца наносят 0,002, 0,005, 0,01 и 0,02 куб. см раствора А.
Между пятнами экстракта на расстоянии 1 см от них на ту же линию
наносят 0,002, 0,004, 0,006 куб. см стандартного раствора
дезоксиниваленола (50, 100 и 150 нг дезоксиниваленола). Пластинку
помещают в камеру для ТСХ и элюируют в системе гексан - ацетон
(3:2) на расстояние 15 см. Пластинку извлекают из камеры, сушат на
воздухе 3-4 мин. и опрыскивают 10% раствором хлористого алюминия в
этаноле. Пластинку нагревают в сушильном шкафу в течение 5-7 мин.
при 105 град. C, затем рассматривают в длинноволновом УФ-свете.
Дезоксиниваленол проявляется в виде пятен с синей флуоресценцией с
Rf 0,25-0,30. Наличие в экстракте пятен, соответствующих по цвету
флуоресценции и хроматографической подвижности стандарту
дезоксиниваленола, свидетельствует о возможном наличии этого
токсина в образце. Для количественного определения сравнивают
интенсивность флуоресценции разных количеств стандартов
дезоксиниваленола с интенсивностью флуоресценции их пятен в
образце, визуально оценивая количество нг токсинов в нанесенных на
пластинку объемах раствора А. Концентрацию дезоксиниваленола в
образце рассчитывают по формуле:
V x m
1
С = С = ---------------, мг/кг,
10 х K х V х М
2
где:
V - объем раствора А, куб. см (0,2 куб. см);
1
V - объем раствора А, нанесенный на пластинку, куб. см;
2
m - масса дезоксиниваленола в V куб. см раствора А, оцененная
2
визуальным сравнением со стандартом на ТСХ-пластинке, нг;
М - аликвотная навеска образца, соответствующая раствору А (5
г для пшеницы, 3 г для кукурузы);
К - степень извлечения дезоксиниваленола по табл. 54.
Если интенсивность флуоресценции пятна дезоксиниваленола в
экстракте выше интенсивности флуоресценции пятна дезоксиниваленола
соответствующего 0,006 куб. см стандартного раствора, то следует
разбавить раствор А смесью бензол - ацетонитрил (5:1), т.е.
увеличить объем V , внеся соответствующие коррективы в расчетную
1
формулу. Окончательное заключение о наличии и уровне загрязнения
образца дезоксиниваленолом принимается только на основе данных
двумерной ТСХ.
Подтверждение наличия и количественное определение
дезоксиниваленола с помощью двумерной ТСХ
Пластинку "Силуфол" размечают тонкими карандашными линиями, не
повреждая слоя силикагеля, согласно рис. 30. В правом нижнем углу
на расстоянии 1,5 см от краев пластинки наносят с помощью
микрошприца 0,02 куб. см раствора А. В левом нижнем углу пластинки
наносят 0,002, 0,004 и 0,006 куб. см стандартного раствора
дезоксиниваленола, 0,002 и 0,005 куб. см раствора А. В верхнем
правом углу пластинки наносят 0,002, 0,004 и 0,006 куб. см
стандартного раствора дезоксиниваленола, 0,01 и 0,02 куб. см
раствора А. Пластинку помещают в камеру для ТСХ со смесью гексан -
ацетон (3:2) и элюируют ее в первом направлении до достижения
фронтом растворителя тонкой карандашной линии, проведенной в 5,5
см от верхнего края, пластинку извлекают из камеры и сушат на
воздухе. Затем проводят элюирование пластинки во втором
направлении смесью хлороформ - ацетон - изопропиловый спирт
(78:12:10). Для элюирования пластинки во втором направлении можно
также использовать смесь: эфир - гексан - изопропиловый спирт -
вода (77:18:4,5:0,5). После достижения фронтом растворителя
карандашной линии, проведенной в 5,5 см от верхнею края пластинки,
ее извлекают из камеры и сушат на воздухе.
Обнаружение и количественное определение проводят аналогично
описанному выше.
Обнаружение и количественное определение дезоксиниваленола с
помощью ВЭЖХ
Условия и параметры анализа дезоксиниваленола с помощью ВЭЖХ
приведены в табл. 52.
Таблица 52
УСЛОВИЯ АНАЛИЗА ДЕЗОКСИНИВАЛЕНОЛА
-----------T----------------------T--------------T---------------¬
¦ Вариант ¦ Сорбент ¦Подвижная фаза¦ Примерный ¦
¦ ВЭЖХ ¦ ¦ ¦ коэффициент ¦
¦ ¦ ¦ ¦ емкости К' ¦
+----------+----------------------+--------------+---------------+
¦Нормально-¦Силикагель ¦Гексан - ¦ 1,3-2,0 ¦
¦фазный ¦ ¦изопропиловый ¦ ¦
¦ ¦ ¦спирт - вода ¦ ¦
¦ ¦ ¦(75:25:1,5) ¦ ¦
+----------+----------------------+--------------+---------------+
¦Обращен- ¦ОДС-силикагель С18 ¦Метанол - вода¦ 1,0-1,5 ¦
¦нофазный ¦ ¦(25:75) ¦ ¦
+----------+----------------------+--------------+---------------+
¦Обращен- ¦ОДС-силикагель С18 ¦Ацетонитрил - ¦ 1,5-2,0 ¦
¦нофазный ¦ ¦вода (10:90) ¦ ¦
L----------+----------------------+--------------+----------------
Расход подвижной фазы 1,0 куб. см/мин. Рекомендуется
использовать перегнанные растворители, фильтруя их через бумажный
складчатый фильтр перед использованием. УФ-детектор устанавливают
на длину волны 220-224 нм, шкала чувствительности 0,01 или 0,005
е.о.п. Для калибровки прибора в инжектор с помощью микрошприца
вводят по 0,002 и 0,004 куб. см стандартных растворов, что
соответствует 50 и 100 нг дезоксиниваленола (при обращеннофазной
ВЭЖХ 1 куб. см стандартного раствора дезоксиниваленола в смеси
бензол - ацетонитрил (5:1), упаривают досуха в токе азота и
растворяют в 1 куб. см ацетонитрила).
Для каждого количества стандарта определяют высоту пика на
хроматограмме. В инжектор хроматографа вводят 10 мкл раствора А
(или A1). При наличии пика, совпадающего по времени удерживания со
стандартом дезоксиниваленола, определяют его высоту (h). Расчет
концентрации дезоксиниваленола в образце проводят по формуле:
V х m х h
1
С = ---------------------,
10 x K x V x M x h
2 ст
где:
С - концентрация дезоксиниваленола в образце, мг/кг;
V - объем раствора А, куб. см (0,2 куб. см);
1
V - объем раствора А, внесенный в хроматограф, куб. см (0,01
2
куб. см);
m - масса стандарта дезоксиниваленола, введенная в
хроматограф, нг;
М - аликвотная навеска образца, соответствующая раствору А (5
г);
h - высота пика, соответствующая данной массе стандарта, мм;
ст
h - высота пика дезоксиниваленола из образца, мм;
К - степень извлечения дезоксиниваленола - по табл. 54.
Если пик дезоксиниваленола в образце выходит за пределы шкалы
самописца, анализ проводят повторно после разбавления раствора A
(A1) смесью бензол - ацетонитрил (при нормальнофазной ВЭЖХ) или
ацетонитрилом (при обращеннофазной ВЭЖХ), т.е. после увеличения
объема V .
1
Обнаружение, идентификация и определение
содержания зеараленона
Очистка экстракта
В делительную воронку на 500 куб. см помещают 50 куб. см
фильтрата (раздел "Экстракция"), добавляют 50 куб. см гексана (или
гептана), насыщенного ацетонитрилом. Встряхивают, после разделения
слоев отбрасывают верхний гексановый слой. Нижний ацетонитрильный
слой дважды встряхивают с 30 куб. см гексана, насыщенного
ацетонитрилом, каждый раз отбрасывая верхний гексановый слой. К
обезжиренному ацетонитрильному экстракту в делительной воронке
добавляют 150 куб. см дистиллированной воды и 60 куб. см бензола.
Встряхивают и после разделения слоев отделяют верхний бензольный
слой. Если полного расслоения жидкостей не происходит, добавляют
10 куб. см насыщенного раствора хлорида натрия и смесь еще раз
слегка встряхивают. Водный слой экстрагируют еще дважды 30 куб. см
бензола, бензольные слои объединяют и сушат безводным сульфатом
натрия.
После фильтрования упаривают в грушевидной колбе на 100 куб. см
на ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 45
град. C. Сульфат натрия промывают 10 куб. см бензола в ту же
грушевидную колбу и упаривают раствор досуха. Остаток растворяют в
0,5 куб. см бензола - раствор В.
Обнаружение и идентификация зеараленона с помощью одномерной
ТСХ
Пластинку "Силуфол" размечают в соответствии с рис. 28. На
линию, проведенную в 1,5 см от нижнего края пластинки, с помощью
микрошприца наносят 0,005 и 0,01 куб. см раствора В. Между пятнами
экстракта на расстоянии 1 см от них на ту же линию наносят 0,005,
0,01 и 0,02 куб. см рабочего раствора зеараленона (50, 100 и 200
нг зеараленона соответственно). Аналогично готовят вторую
пластинку "Силуфол". Обе пластинки помещают в камеру для ТСХ и
элюируют в системе гексан - ацетон (7:3). Пластинки извлекают,
сушат на воздухе 3-4 мин. Для обнаружения пятен зеараленона на
первой пластинке используют опрыскивание 10% раствором хлорида
алюминия в этиловом спирте с последующим нагреванием в сушильном
шкафу при температуре 100-105 град. C в течение 10 мин.
Обнаружение на пластинке пятен, соответствующих по цвету
флуоресценции (синий) и хроматографической подвижности пятнам
стандартов зеараленона, свидетельствует о возможном наличии
зеараленона в образце.
Для подтверждения наличия зеараленона вторую ТСХ-пластинку
опрыскивают 1% раствором прочной синей В-соли или прочной
фиолетовой В-соли в дистиллированной воде, затем пластинку
немедленно опрыскивают 5%-ным раствором углекислого натрия до
появления красно-бордовой окраски пятен стандарта зеараленона.
Обнаружение на пластинке пятна, соответствующего по цвету и
хроматографической подвижности стандартам зеараленона,
подтверждает наличие зеараленона в образце.
Количественное определение зеараленона с помощью двумерной ТСХ
Пластинку "Силуфол" размечают тонкими карандашными линиями, не
повреждая слоя силикагеля, согласно рис. 30. В правом нижнем углу
на расстоянии 1,5 см от краев пластинки наносят с помощью
микрошприца 0,02 куб. см раствора В. В правом верхнем углу наносят
0,003 и 0,007 куб. см рабочего раствора зеараленона, 0,01 и 0,02
куб. см раствора В; в левом нижнем углу наносят 0,005 и 0,01 куб.
см рабочего раствора зеараленона, 0,002 и 0,005 куб. см раствора
В. Пластинку помещают в камеру для ТСХ со смесью гексан - ацетон
(7:3) и элюируют в первом направлении до достижения фронтом
растворителя тонкой карандашной линии, проведенной в 5,5 см от
верхнего края пластинки. Пластинку извлекают и сушат на воздухе 5
мин. Затем проводят хроматографию во втором направлении в системе
толуол - этилацетат - хлороформ - 85%-ная муравьиная кислота
(45:25:25:5) до достижения карандашной линии, проведенной в 5,5 см
от верхнего края пластинки. Пластинку извлекают из камеры, сушат и
обнаруживают пятна по флуоресценции после обработки раствором
хлорида алюминия, как описано выше. Сравнивая интенсивность
флуоресценции разных количеств стандарта зеараленона с
интенсивностью флуоресценции пятна зеараленона в экстракте
(раствор В), определяют количество нг зеараленона в экстракте.
Содержание зеараленона в образце рассчитывают по формуле:
V x V x m
1 3
С = --------------------,
10 x K x V x V x M
2 4
где:
С - концентрация зеараленона в образце, мг/кг;
V - объем водно-ацетонитрильной смеси для экстракции, куб. см
1
(125 куб. см);
V - объем водно-ацетонитрильного фильтрата, взятый для
2
анализа, куб. см (50 куб. см);
V - объем очищенного экстракта перед ТСХ (раствор В), куб. см
3
(0,5 куб. см);
V - объем очищенного экстракта (раствор В), наносимый на
4
пластинку, куб. см (0,02 куб. см);
М - навеска образца, взятая для анализа, г (25 г);
m - масса зеараленона в V куб. см очищенного экстракта,
4
оцененная по ТСХ, нг;
К - степень извлечения зеараленона по табл. 54.
При приведенных в скобках объемах и навесках формула
содержания зеараленона выражается следующим образом:
m
С = 0,25 х -, мг/кг.
K
Если интенсивность флуоресценции пятна зеараленона в экстракте
выше интенсивности флуоресценции пятна стандарта, соответствующего
0,02 куб. см стандартного раствора (200 нг зеараленона), то на
пластинку следует нанести либо меньшее количество экстракта
(уменьшить объем V ), либо разбавить раствор В бензолом (увеличить
4
объем V ), внеся соответствующие коррективы в расчетную формулу.
3
Обнаружение и количественное определение зеараленона с помощью
ВЭЖХ
Условия и параметры анализа зеараленона с помощью ВЭЖХ
приведены в табл. 53.
Таблица 53
УСЛОВИЯ АНАЛИЗА ЗЕАРАЛЕНОНА
-----------T----------T-----------------T------------T-----------¬
¦ Вариант ¦ Сорбент ¦ Подвижная фаза ¦ Расход ¦ Примерный ¦
¦ ВЭЖХ ¦ ¦ ¦ подвижной ¦коэффициент¦
¦ ¦ ¦ ¦ фазы, ¦ емкости ¦
¦ ¦ ¦ ¦куб. см/мин.¦ ¦
+----------+----------+-----------------+------------+-----------+
¦Нормально-¦Силикагель¦Гексан - эфир - ¦ 1,5 ¦ 2,0-2,5 ¦
¦фазный ¦ ¦уксусная кислота ¦ ¦ ¦
¦ ¦ ¦(65:35:1) ¦ ¦ ¦
+----------+----------+-----------------+------------+-----------+
¦Нормально-¦Силикагель¦Петролейный эфир ¦ 2 ¦ 2,0-2,5 ¦
¦фазный ¦ ¦- эфир - уксусная¦ ¦ ¦
¦ ¦ ¦кислота ¦ ¦ ¦
¦ ¦ ¦(50:50:1) ¦ ¦ ¦
+----------+----------+-----------------+------------+-----------+
¦Обращенно-¦ОДС- ¦Метанол - вода - ¦ 1 ¦ 1,0-1,3 ¦
¦фазный ¦силикагель¦ацетонитрил ¦ ¦ ¦
¦ ¦С18 ¦(61:35:4) ¦ ¦ ¦
L----------+----------+-----------------+------------+------------
Рекомендуется использовать перегнанные гексан и метанол или
петролейный эфир и эфир, профильтрованный через слой оксида
алюминия (5 см). УФ-детектор устанавливают на длину волны 283 нм,
шкала чувствительности 0,005 е.о.п. Шкала самописца 10 мВ. Если
используют флуориметрический детектор, то длину волны на линии
возбуждения устанавливают около 283 нм, а на линии эмиссии -
фильтр от 420 нм (или 440 нм в случае монохроматора на линии
эмиссии).
Для калибровки прибора в инжектор с помощью микрошприца вводят
0,002 и 0,005 куб. см рабочего раствора зеараленона, что
соответствует 20 и 50 нг зеараленона. Для каждого количества
стандарта определяют высоту пика на хроматограмме.
В инжектор хроматографа вводят 0,01 куб. см раствора В. При
наличии пика, совпадающего по времени удерживания со стандартом,
определяют его высоту (h).
Расчет концентрации зеараленона в образце проводят по формуле:
V x V x m x h
1 3
С = --------------------------,
10 x K x V x V x M x h
2 4 ст
где:
С - концентрация зеараленона в образце, мг/кг;
V - объем водно-ацетонитрильной смеси для экстракции, куб. см
1
(125 куб. см);
V - объем водно-ацетонитрильного фильтрата, взятый для
2
анализа, куб. см (50 куб. см);
V - объем очищенного экстракта перед ВЭЖХ (раствор В), куб.
3
см (0,5 куб. см);
V - объем очищенного экстракта (раствор В), внесенный в
4
хроматограф, куб. см (0,02 куб. см);
М - навеска образца, взятая для анализа, г (25 г);
m - масса стандарта зеараленона, введенная в хроматограф, нг;
h - высота пика, соответствующая данной массе стандарта, мм;
ст
h - высота пика зеараленона из образца, мм;
К - степень извлечения зеараленона по табл. 54.
Если пик зеараленона в образце выходит за пределы шкалы
самописца, анализ проводят повторно после разбавления раствора В
бензолом, т.е. после увеличения объема V .
3
При ВЭЖХ зеараленона чувствительность УФ- и флуориметрического
детекторов примерно одинакова. Преимуществом флуориметрического
детектора является его селективность (меньшее количество
посторонних пиков на хроматограмме).
Метрологические характеристики
Относительное допустимое расхождение между результатами двух
параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, по
отношению к среднему арифметическому значению (Rr) и относительное
допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в
двух разных лабораториях, по отношению к среднему арифметическому
значению (RR), а также предел определения, по данным авторов
методов анализа дезоксиниваленола и зеараленона, приведены в табл.
54, в которой указаны также относительные внутрилабораторные (Rs )
r
и межлабораторные (RS ) среднеквадратичные отклонения и средняя
R
степень извлечения дезоксиниваленола (вомитоксина) и зеараленона.
Таблица 54
ОТНОСИТЕЛЬНЫЕ ДОПУСТИМЫЕ ВНУТРИЛАБОРАТОРНЫЕ
(Rr) И МЕЖЛАБОРАТОРНЫЕ (RR) РАСХОЖДЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
ОПРЕДЕЛЕНИЯ, ВЕЛИЧИНА ПРЕДЕЛА ОПРЕДЕЛЕНИЯ И СТЕПЕНЬ ИЗВЛЕЧЕНИЯ
ДЛЯ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДЕЗОКСИНИВАЛЕНОЛА И ЗЕАРАЛЕНОНА
-----------T-------T-------T------T------T---T---T-------T-------¬
¦Наименова-¦Уровень¦ Метод ¦Rs , %¦RS , %¦Rr,¦RR,¦Предел ¦Степень¦
¦ние за- ¦загряз-¦ ¦ r ¦ R ¦ % ¦ % ¦опреде-¦извле- ¦
¦грязнителя¦нения, ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ления, ¦чения, ¦
¦ ¦мг/кг ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦мг/кг ¦% ¦
+----------+-------+-------+------+------+---+---+-------+-------+
¦Дезокси- ¦ 2,0 ¦ТСХ ¦ 29 ¦ 46 ¦81 ¦129¦ 0,150 ¦ 80 ¦
¦ниваленол ¦ +-------+------+------+---+---+-------+-------+
¦ ¦ ¦ВЭЖХ ¦ 11 ¦ 20 ¦31 ¦56 ¦ 0,060 ¦ 80 ¦
¦ +-------+-------+------+------+---+---+-------+-------+
¦ ¦ 0,4 ¦ТСХ ¦ 41 ¦ 58 ¦115¦162¦ 0,150 ¦ 80 ¦
¦ ¦ +-------+------+------+---+---+-------+-------+
¦ ¦ ¦ВЭЖХ ¦ 19 ¦ 27 ¦53 ¦76 ¦ 0,060 ¦ 80 ¦
+----------+-------+-------+------+------+---+---+-------+-------+
¦Зеараленон¦ 1,0 ¦ТСХ ¦ 26 ¦ 48 ¦73 ¦134¦ 0,060 ¦ 85 ¦
¦ ¦ +-------+------+------+---+---+-------+-------+
¦ ¦ ¦ВЭЖХ- ¦ 12 ¦ 20 ¦34 ¦56 ¦ 0,004 ¦ 85 ¦
¦ ¦ ¦флуор. ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+----------+-------+-------+------+------+---+---+-------+-------+
¦Зеараленон¦ 0,1 ¦ВЭЖХ-УФ¦ 12 ¦ 20 ¦34 ¦56 ¦ 0,010 ¦ 85 ¦
¦ ¦ +-------+------+------+---+---+-------+-------+
¦ ¦ ¦ТСХ ¦ 44 ¦ 54 ¦132¦152¦ 0,060 ¦ 85 ¦
¦ ¦ +-------+------+------+---+---+-------+-------+
¦ ¦ ¦ВЭЖХ- ¦ 17 ¦ 26 ¦48 ¦73 ¦ 0,004 ¦ 85 ¦
¦ ¦ ¦флуор. ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦ +-------+------+------+---+---+-------+-------+
¦ ¦ ¦ВЭЖХ- ¦ 17 ¦ 26 ¦48 ¦73 ¦ 0,010 ¦ 85 ¦
¦ ¦ ¦УФ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
L----------+-------+-------+------+------+---+---+-------+--------
4. Метод обнаружения, идентификации
и количественного определения патулина в БАД
на плодоовощной основе
Подготовка проб
Навеску жидких БАД массой 50 г или фруктового порошка массой 25
г помещают в стеклянный стакан, смешивают с небольшим количеством
дистиллированной воды и количественно переносят в мерную колбу
вместимостью 250 куб. см. В мерную колбу вносят 15 куб. см
раствора Карреза I и 15 куб. см раствора Карреза II. Содержимое
колбы доводят дистиллированной водой до метки, тщательно
перемешивают и фильтруют в мерный цилиндр через бумажный
складчатый фильтр. Отбирают 50 куб. см фильтрата.
Экстракция
Фильтрат из цилиндра переносят в делительную воронку, добавляют
50 куб. см этилацетата и смесь интенсивно встряхивают. После
разделения слоев отделяют верхний этилацетатный слой и переносят
его в сухую плоскодонную колбу. Затем экстракцию проводят еще раз
со свежей порцией этилацетата. Если полного расслоения жидкостей
не происходит, в делительную воронку добавляют 10-12 г хлорида
натрия и смесь слегка встряхивают. Этилацетатные экстракты
объединяют, сушат безводным сульфатом натрия и фильтруют через
кусочек ваты в грушевидную колбу. Сульфат натрия промывают 10 куб.
см этилацетата и фильтруют в ту же колбу. Экстракт упаривают на
ротационном испарителе досуха. Остаток растворяют в 1 куб. см
этилацетата.
Очистка экстракта
В стеклянную хроматографическую колонку на дно помещают кусочек
ваты и 5 куб. см бензола, насыпают слой безводного сульфата натрия
(5 мм) и наливают суспензию 2 г (3,6 куб. см) силикагеля в 15 куб.
см бензола. Не давая колонке просохнуть (колонка закрыта снизу),
насыпают слой безводного сульфата натрия (10 мм). Бензолу дают
стечь, на верхний слой сорбента наносят экстракт, дают впитаться в
фильтрующий слой. Отгонную колбу ополаскивают 5 куб. см
этилацетата, переносят раствор на колонку и дают этилацетату
полностью впитаться в фильтрующий слой. Колонку промывают 25 куб.
см бензола. Патулин элюируют 75 куб. см смеси этилацетат - бензол
(25:75). Элюат упаривают досуха на ротационном испарителе. Остаток
растворяют в 0,2 куб. см смеси бензол - ацетонитрил (9:1) для
анализа методом ТСХ или в 0,2 куб. см метанола для анализа методом
ВЭЖХ (раствор А).
Обнаружение и количественное определение
патулина с помощью двумерной ТСХ
Пластинку "Силуфол" размечают тонкими карандашными линиями
согласно рис. 29. В правом нижнем углу на расстоянии 1,5 см от
краев пластинки наносят с помощью микрошприца 0,02 куб. см
раствора А. В левом нижнем углу пластинки наносят 0,002 и 0,004
куб. см стандартного раствора патулина, что соответствует 20 и 40
нг стандарта. В верхнем правом углу пластинки наносят 0,006 и
0,008 куб. см стандартного раствора патулина, что соответствует 60
и 80 нг стандарта. Пластинку помещают в камеру для ТСХ со смесью
хлороформ - ацетон (4:1) и элюируют в первом направлении до
достижения фронтом растворителя верхней карандашной линии.
Пластинку извлекают из камеры и сушат на воздухе. Затем проводят
элюирование пластинки во втором направлении смесью толуол -
этилацетат - муравьиная кислота (5:4:1). После достижения фронтом
растворителя карандашной линии ее извлекают из камеры и сушат на
воздухе до исчезновения запаха растворителя. На дно эксикатора
помещают стеклянный стакан вместимостью 150 куб. см с 25 куб. см
раствора марганцовокислого калия, осторожно приливают 25 куб. см
соляной кислоты, быстро устанавливают вставку эксикатора и на нее
хроматографическую пластинку, плотно закрывают эксикатор. Через 15
мин. пластинку извлекают из эксикатора и оставляют выветриваться в
вытяжном шкафу еще на 15-20 мин. до полного исчезновения запаха
хлора. (Работу с хлором следует проводить в вытяжном шкафу
лаборатории с использованием индивидуальных средств защиты.) Затем
пластинку опрыскивают раствором бензидина, выдерживают 20-30 мин.
и рассматривают в длинноволновом УФ-свете. Патулин обнаруживается
в виде желтых флуоресцирующих пятен. Наличие на пластинке пятна,
соответствующего по цвету флуоресценции и хроматографической
подвижности пятнам стандарта патулина, свидетельствует о его
наличии в анализируемом продукте. Сравнивая интенсивность
флуоресценции пятна патулина в пробе (в растворе А) с
интенсивностью флуоресценции стандартов, оценивают количество.
Содержание патулина в анализируемом продукте определяют по
формуле:
V x V x m
1 3
С = --------------------,
10 x K x V x V x M
2 4
где:
С - содержание патулина в продукте, мг/кг;
V - объем раствора, до которого доведена исходная навеска
1
продукта, куб. см (250 куб. см);
V - объем фильтрата, отобранный на анализ, куб. см (50 куб.
2
см);
V - объем очищенного хлороформного экстракта перед ТСХ, куб.
3
см (0,2 куб. см);
V - объем хлороформного экстракта, нанесенный на пластинку,
4
куб. см (0,02 куб. см);
m - количество патулина, обнаруженное в пятне, нг;
М - масса образца, взятая на анализ, г;
К - степень извлечения патулина по табл. 55.
Если интенсивность флуоресценции пятна патулина в экстракте
выше интенсивности флуоресценции пятна стандарта, соответствующего
0,008 куб. см стандартного раствора (80 нг патулина), то на
пластинку следует либо нанести меньшее количество экстракта
(уменьшить объем V ), либо разбавить раствор А хлороформом
4
(увеличить объем V ), внеся соответствующие коррективы в расчетную
3
формулу.
Обнаружение и количественное определение
патулина с помощью ВЭЖХ
Условия ВЭЖХ: подвижная фаза изопропанол - гексан (1:4); расход
подвижной фазы 1,0 куб. см/мин. Рекомендуется использовать
перегнанные растворители. УФ-детектор устанавливают на длину волны
276 нм, шкала чувствительности 0,005 е.о.п. Шкала самописца 10 мВ.
Для калибровки прибора в инжектор с помощью микрошприца вводят
0,002, 0,005 и 0,015 куб. см рабочего раствора патулина, что
соответствует 4, 10 и 30 нг патулина. Для каждого количества
стандарта определяют высоту пика на хроматограмме. При описанных
условиях ВЭЖХ коэффициент емкости (К') для патулина составляет 2,3-
2,7.
В инжектор хроматографа вводят 0,01 куб. см раствора А. При
наличии пика, совпадающего по времени удерживания со стандартом,
определяют его высоту (h ). Расчет концентрации патулина в
обр
образце проводят по формуле:
V x V x m x h
1 3 обр
С = --------------------------,
10 x K x V x V x M x h
2 4 ст
где:
С - концентрация патулина в образце, мг/кг;
V - объем, до которого доведена навеска при экстракции водой,
1
куб. см (250 куб. см);
V - объем фильтрата, взятый для анализа, куб. см (50 куб.
2
см);
V - объем очищенного экстракта перед ВЭЖХ (раствор А), куб.
3
см (0,2 куб. см);
V - объем очищенного экстракта (раствор А), внесенный в
4
хроматограф, куб. см (0,02 куб. см);
М - навеска образца, взятая для анализа, г (50 или 25 г);
m - масса стандарта патулина, введенная в хроматограф, нг;
h - высота пика, соответствующая данной массе стандарта, мм;
ст
h - высота пика патулина из образца, мм;
обp
К - степень извлечения патулина по табл. 55.
Если пик патулина в образце выходит за пределы шкалы
самописца, анализ проводят повторно после разбавления раствора А
метанолом, т.е. после увеличения объема V .
3
Метрологические характеристики
Относительное допустимое расхождение между результатами двух
параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, по
отношению к среднему арифметическому значению (Rr) и относительное
допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в
двух разных лабораториях, по отношению к среднему арифметическому
значению (RR), а также предел определения, по данным авторов
методов анализа патулина, приведены в табл. 55, в которой
приведены также относительные внутрилабораторные (Rs ) и
r
межлабораторные (RS ) среднеквадратичные отклонения и средняя
R
степень извлечения патулина.
Таблица 55
ОТНОСИТЕЛЬНЫЕ ДОПУСТИМЫЕ ВНУТРИЛАБОРАТОРНЫЕ (Rr)
И МЕЖЛАБОРАТОРНЫЕ (RR) РАСХОЖДЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ,
ВЕЛИЧИНА ПРЕДЕЛА ОПРЕДЕЛЕНИЯ И СТЕПЕНЬ ИЗВЛЕЧЕНИЯ
ДЛЯ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАТУЛИНА
---------T------T------T------T----T----T------------T-----------¬
¦Уровень ¦Метод ¦Rs , %¦RS , %¦ Rr,¦ RR,¦ Предел ¦ Степень ¦
¦загряз- ¦ ¦ r ¦ R ¦ % ¦ % ¦определения,¦извлечения,¦
¦нения, ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ мг/кг ¦ % ¦
¦мг/кг ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+--------+------+------+------+----+----+------------+-----------+
¦0,1 ¦ ТСХ ¦ 42 ¦ 65 ¦118 ¦182 ¦ 0,012 ¦ 75 ¦
+--------+------+------+------+----+----+------------+-----------+
¦ ¦ ВЭЖХ ¦ 13 ¦ 18 ¦ 36 ¦ 50 ¦ 0,005 ¦ 75 ¦
L--------+------+------+------+----+----+------------+------------
5. Метод обнаружения, идентификации
и определения содержания трихотеценовых микотоксинов
группы А в пищевых продуктах и БАД на зерновой основе
с помощью газожидкостной хроматографии
(арбитражный метод)
В основу положен метод групповой индикации трихотеценовых
микотоксинов группы А, в т.ч. наиболее токсичного среди них Т-2-
токсина, с помощью газожидкостной хроматографии по внутреннему
стандарту - 3-О-метил-Т-2-тетраолу.
5.1. Экстракция
Навеску измельченной пробы зерна массой 20 г помещают в
плоскодонную коническую колбу вместимостью 250 куб. см, добавляют
10 куб. см 4%-ного раствора хлорида калия и 90 куб. см
ацетонитрила. Встряхивают на аппарате для встряхивания 30 мин.
Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр в
мерный цилиндр, отбирают 70 куб. см фильтрата (соответствует 14 г
исходного образца).
5.2. Очистка экстракта
В делительную воронку на 250 куб. см помещают 70 куб. см
фильтрата, добавляют 50 куб. см гексана, после встряхивания и
разделения слоев верхний гексановый слой отбрасывают. Нижний
ацетонитрильный слой еще дважды встряхивают с 40 куб. см гексана,
каждый раз отбрасывая верхний гексановый слой. Если слои плохо
разделяются, добавляют сульфат аммония. К ацетонитрильному слою
добавляют 2-3 куб. см бензола и сульфат аммония на кончике
шпателя, встряхивают и отбрасывают нижний водный слой.
Ацетонитрильный слой помещают в круглодонную колбу и упаривают
досуха с добавлением изопропанола до объема 1 куб. см.
5.3. Омыление пробы
К пробе добавляют 1 куб. см 4%-ного раствора едкого натра в 30%-
ном изопропиловом спирте. Смесь выдерживают 2 ч при комнатной
температуре.
5.4. Экстракция продуктов омыления
Щелочь нейтрализуют добавлением 2%-ного раствора уксусной
кислоты (около 2 куб. см) до pH среды 5-7 (контроль по
универсальной индикаторной бумаге). Смесь помещают в делительную
воронку или в пробирку вместимостью 10 куб. см, добавляют 3,5 куб.
см смеси ацетонитрил - бензол (3:0,5), на кончике шпателя -
сульфат аммония, встряхивают и отделяют в чистую сухую колбу
верхний ацетонитрильный слой (при использовании пробирки экстракт
отделяют с помощью пипетки). Экстракцию повторяют дважды.
Объединенные экстракты высушивают добавлением 1 г безводного
сульфата натрия, фильтруют через ватный тампон в грушевидную
колбу, куда предварительно помещают около 200 мг силикагеля для
колоночной хроматографии, и упаривают досуха на ротационном
испарителе при температуре 40-45 град. C (до получения сыпучего
силикагеля).
|
