|
Стр. 11
Колориметрический метод с 2,4-динитрофенилгидразином
(суммарное определение флаванонов)
По 1,0 куб. см каждого разбавленного стандартного раствора (+/-
)-нарингенина смешивают с 2,0 куб. см 1%-ного раствора 2,4-Д и 2,0
куб. см метанола. Смесь выдерживают при 50 град. C в течение 50
мин. После охлаждения до комнатной температуры к смеси добавляют 5
куб. см 1%-ного раствора едкого натра в 70%-ном метаноле и
инкубируют при комнатной температуре в течение 2-х минут. Затем к
1 куб. см смеси добавляют 5 куб. см метанола и центрифугируют при
1000 об./мин. в течение 10 мин. Отделяют супернатант и в мерной
колбе доводят до объема 25 куб. см. Измеряют оптическую плотность
раствора при 495 нм против раствора сравнения - метанола.
Проведение испытаний
Отбирают по 0,5 куб. см гидролизата (раствор А) и проводят
колориметрические реакции с хлоридом алюминия и 2,4-Д, как описано
выше. Определяют содержание флавоноидов согласно калибровочным
графикам.
11. Анализ индикаторных показателей некоторых БАД
на растительной основе
11.1. Определение катехинов и галловой кислоты в БАД
на основе зеленого чая и в травяных чаях
Катехины - это флаван-3-олы, структура которых представлена на
рис. 8.
Приборы и реактивы
Жидкостной хроматограф с насосом высокого давления с подачей
растворителя от 0,1 до 5,0 куб. см/мин., обеспечивающий работу в
режиме градиентного элюирования, оборудованный
спектрофотометрическим детектором с переменной длиной волны и
системой для сбора и обработки хроматографических данных
МультиХром, версия 1,5х (Амперсенд, Россия).
Колонка и предколонка хроматографические с силикагелем,
химически связанным с октадецилсиланом (силикагель С18), с
размером частиц 5 мкм; длина колонки - 15 см, предколонки - 4,5
см, внутренний диаметр колонок - 0,46 см.
Микрошприцы МШ-10 и МШ-25 для жидкостной хроматографии.
Колбы мерные наливные 2-50-2, 2-100-2, 2-250-2, 1-1000-2 по
ГОСТ 1770.
Пипетки 4-1-2 или 5-1-2, 4-2-10 или 5-2-10, 4-2-25 или 5-2-25
по ГОСТ 29227.
Ацетонитрил, ч., ТУ 6-09-3534-74.
Спирт этиловый ректификованный.
Кислота о-фосфорная, ч., ГОСТ 6552, раствор 0,1%: 1,2 куб. см
фосфорной кислоты помещают в мерную колбу вместимостью 1 куб. дм,
добавляют около 950 куб. см дистиллированной воды, перемешивают,
охлаждают до комнатной температуры, доводят до метки и
перемешивают.
Метанол - яд, для жидкостной хроматографии, ос.ч. по ТУ 6-09-14-
2192-85.
Спирт этиловый ректификованный, очищенный дистилляцией.
Капроновый фильтр марки 0,45 мкм RC.
Бумажные фильтры обеззоленные марки ФОМ.
(+)-катехин, (+)-эпикатехин, (-)-эпигаллокатехин, (-)-
эпигаллокатехин галлат, галловая кислота - SIGMA Chemical Co.
Приготовление стандартного раствора
5 +/- 0,1 мг (+)-катехина, предварительно высушенного при 105
град. C в течение 1 ч, помещают в мерную колбу вместимостью 100
куб. см, добавляют около 70 куб. см 0,1%-ного раствора фосфорной
кислоты, перемешивают до полного растворения вещества, охлаждают
до комнатной температуры, доводят до метки 0,1%-ным раствором
фосфорной кислоты и перемешивают. Концентрация полученного
стандартного раствора катехина 0,05 мг/куб. см. 5 куб. см
полученного раствора переносят в мерную колбу вместимостью 50 куб.
см, доводят до метки 0,1%-ным раствором фосфорной кислоты и
перемешивают. Концентрация полученного рабочего стандартного
раствора катехина 0,005 мг/куб. см. В хроматограф вводят 10 мкл.
Подготовка образца
1 г порошка экстракта листьев, 2 г измельченных листьев,
таблеток или содержимого капсул помещают в химический стакан
вместимостью 250 куб. см, добавляют 50 куб. см 0,1%-ного раствора
фосфорной кислоты и проводят экстракцию в ультразвуковой бане в
течение 5 мин. Полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр
"синяя лента" в мерную колбу вместимостью 250 куб. см или при
необходимости центрифугируют при 3000 об./мин. 5 мин., а затем
супернатант помещают в мерную колбу на 250 куб. см, доводят до
метки 0,1%-ным раствором фосфорной кислоты и перемешивают (раствор
А). Раствор анализируют с помощью ВЭЖХ.
Проведение анализа ВЭЖХ
Условия хроматографического анализа: колонка Hypersil ODS,
размер колонки 250х4,6 мм, размер частиц 5 мкм, подвижная фаза:
ацетонитрил - 85%-ная фосфорная кислота (15:85), скорость
подвижной фазы 1,0 куб. см/мин., объем петли инжектора 20 куб. мм.
УФ-детектор, длина волны 280 нм. Времена удерживания: галловая
кислота - 2,9 +/- 0,1 мин., эпигаллокатехин - 4,5 +/- 0,1 мин.,
катехин - 5,8 +/- 0,2 мин., эпикатехин - 6,8 +/- 0,2 мин.,
эпигаллокатехин галлат - 9,8 +/- 0,2 мин., галлокатехин галлат -
12,0 +/- 0,1 мин., эпикатехин галлат - 13,5 +/- 0,1 мин., катехин
галлат - 15,5 +/- 0,1 мин.
Количественный расчет
При количественном анализе используют метод абсолютной
калибровки.
Количественный расчет каждого катехина в пересчете на катехин
проводят по формуле:
S x m x V x K x 100
обр ст 1
X = -------------------------, %,
V x S x M
2 ст обр
где:
S - площадь пика исследуемого компонента;
обр
S - площадь пика стандарта катехина;
ст
V - объем анализируемого раствора пробы, куб. мм;
1
V - объем экстракта, введенного в хроматограф, куб. мм;
2
m - масса стандарта катехина, введенная в хроматограф, мг;
ст
М - навеска образца, взятая для анализа, мг;
обр
К - коэффициент пересчета содержания индивидуального катехина
относительно катехина - согласно нижеприведенной таблице:
-------------------------------------T---------------------------¬
¦ Катехин ¦ К, по катехину ¦
+------------------------------------+---------------------------+
¦(+)-катехин ¦ 1,000 ¦
+------------------------------------+---------------------------+
¦(-)-эпикатехин ¦ 1,020 ¦
+------------------------------------+---------------------------+
¦(-)-катехин галлат ¦ 0,327 ¦
+------------------------------------+---------------------------+
¦(-)-эпикатехин галлат ¦ 0,382 ¦
+------------------------------------+---------------------------+
¦(-)-галлокатехин галлат ¦ 0,482 ¦
+------------------------------------+---------------------------+
¦(-)-эпигаллокатехин галлат ¦ 0,543 ¦
+------------------------------------+---------------------------+
¦(-)-эпигаллокатехин ¦ 3,450 ¦
L------------------------------------+----------------------------
Относительное стандартное отклонение, вычисленное по площадям
пиков не менее двух параллельных измерений катехина, не должно
превышать 0,4%.
11.2. Определение флаванонов в БАД
на фруктовой основе
Гесперидин, нарингенин относятся к разряду флаванглюкозидов,
широко представленных во фруктах, особенно в кожуре зеленых
апельсинов. При отжатии сока под высоким давлением флаваноны
переходят в сок.
Приборы и реактивы
Жидкостной хроматограф с насосом высокого давления с подачей
растворителя от 0,1 до 5,0 куб. см/мин., обеспечивающий работу в
режиме градиентного элюирования, оборудованный
спектрофотометрическим детектором с переменной длиной волны и
системой для сбора и обработки хроматографических данных
МультиХром, версия 1,5х (Амперсенд, Россия).
Колонка и предколонка хроматографические с силикагелем,
химически связанным с октадецилсиланом (силикагель С18), с
размером частиц 5 мкм; длина колонки - 15 см, предколонки - 4,5
см, внутренний диаметр колонок - 0,46 см.
Микрошприцы МШ-10 и МШ-25 для жидкостной хроматографии.
Кислота серная, х.ч.
Ацетонитрил, ч., ТУ 6-09-3534-74.
Спирт этиловый ректификованный.
Бумажные фильтры обеззоленные марки ФОМ.
Гесперидин, раствор в 50%-ном этиловом спирте концентрацией
0,02 мг/куб. см.
Нарингенин, раствор в 50%-ном этиловом спирте концентрацией
0,02 мг/куб. см.
Подготовка образца
1 г измельченных таблеток или содержимого капсул помещают в
плоскодонную колбу, добавляют 40 куб. см 50% этилового спирта,
смесь нагревают на водяной бане при 55-60 град. C в течение 30
мин. Экстракцию повторяют пятикратно. Спиртовые экстракты
охлаждают, фильтруют, доводят объем до 250 куб. см 50%-ным
этиловым спиртом.
Проведение анализа
Условия хроматографического разделения: колонка ODS - Hypersil
(HP 799160D-552), размеры колонки 100х2,1 мм, размер частиц 5 мкм,
объем петли инжектора 20 куб. мм. Подвижная фаза: раствор серной
кислоты, pH 2,5, - ацетонитрил (85:15), скорость потока 0,5 куб.
см/мин., УФ-детектор, длина волны 280 нм. Ориентировочные времена
удерживания нагингенина - 4,8 +/- 0,1 мин., гисперидина - 6,0 +/-
0,1 мин.
При количественном анализе используют метод абсолютной
калибровки. Относительное стандартное отклонение, вычисленное по
площадям пиков не менее двух параллельных измерений стандартов
гесперидина и нарингенина, не должно превышать 0,4%.
11.3. Определение флаванонолов в БАД
из экстрактов лиственницы
К флаванонолам относятся дигидрокверцетин, дигидрокемпферол,
эриодиктиол.
Приборы и реактивы
Жидкостной хроматограф с насосом высокого давления с подачей
растворителя от 0,1 до 5,0 куб. см/мин., обеспечивающий работу в
режиме градиентного элюирования, оборудованный
спектрофотометрическим детектором с переменной длиной волны и
системой для сбора и обработки хроматографических данных
МультиХром, версия 1,5х (Амперсенд, Россия).
Колонка и предколонка хроматографические с силикагелем,
химически связанным с октадецилсиланом (силикагель С18), с
размером частиц 5 мкм; длина колонки - 15 см, предколонки - 4,5
см, внутренний диаметр колонок - 0,46 см.
Микрошприцы МШ-10 и МШ-25 для жидкостной хроматографии.
ГСО дигидрокверцетина ВФС 42-2399-94.
Колбы мерные наливные 2-50-2, 2-100-2, 2-250-2, 1-1000-2 по
ГОСТ 1770.
Пипетки 4-1-2 или 5-1-2, 4-2-10 или 5-2-10, 4-2-25 или 5-2-25
по ГОСТ 29227.
Ацетонитрил, ч., ТУ 6-09-3534-74.
Спирт этиловый ректификованный.
Кислота уксусная ледяная, х.ч., ГОСТ 6709-72, раствор 2%.
Кислота соляная, х.ч., ГОСТ 3118.
Капроновый фильтр марки 0,45 мкм RC.
Бумажные фильтры обеззоленные марки ФОМ.
Цинк гранулированный, ч.
Приготовление стандартного раствора
0,05 +/- 0,0001 г дигидрокверцетина, предварительно высушенного
при 105 град. C в течение 1 ч, помещают в мерную колбу
вместимостью 100 куб. см, заполненную до половины ацетонитрилом,
перемешивают до полного растворения образца, доводят до метки
ацетонитрилом и тщательно перемешивают. 1 куб. см полученного
раствора концентрацией 0,5 мг/куб. см переносят в мерную колбу
вместимостью 25 куб. см, доводят ацетонитрилом до метки и
тщательно перемешивают. Концентрация рабочего стандартного
раствора дигидрокверцетина 0,02 мг/куб. см. В хроматограф вводят
10 мкл.
Подготовка образца
1 г измельченных таблеток или содержимого капсул помещают в
мерную колбу вместимостью 250 куб. см, добавляют 50 куб. см
подвижной фазы ацетонитрил - 2%-ная уксусная кислота (30:70),
встряхивают 30 мин., доводят подвижной фазой до метки и тщательно
перемешивают. Полученный раствор фильтруют через капроновый фильтр
или центрифугируют при 3000 об./мин. 5 мин. Раствор используют для
проведения качественной реакции на флаванонолы (дигидрокверцетин)
или анализируют с помощью ВЭЖХ.
Проведение качественной реакции
1 г измельченного образца встряхивают с 50 куб. см спирта 96%-
ного, раствор фильтруют через бумажный фильтр "синяя лента", к 1
куб. см фильтрата добавляют 0,5 куб. см концентрированной соляной
кислоты и 0,05 г цинка гранулированного. О наличии в растворе
флаванонолов свидетельствует малиновое окрашивание.
Проведение анализа ВЭЖХ
Условия хроматографического анализа: колонка Hypersil ODS,
размер колонки 250х4,6 мм, размер частиц 5 мкм, подвижная фаза
ацетонитрил - 2%-ная уксусная кислота (30:70), скорость подвижной
фазы 1,0 куб. см/мин., объем петли инжектора 20 куб. мм. УФ-
детектор, длина волны 287 нм. Времена удерживания флаванонолов:
дигидрокверцетин - 5,0 +/- 0,1 мин., дигидрокемпферол - 6,5 +/-
0,1 мин., эриодиктиол - 7,5 +/- 0,1 мин.
При количественном анализе используют метод абсолютной
калибровки. Относительное стандартное отклонение, вычисленное по
площадям пиков не менее двух параллельных измерений
дигидрокверцетина, не должно превышать 0,4%.
11.4. Определение изофлавонов в БАД
Принцип метода
Метод определения массовой концентрации изофлавонов в
соесодержащих продуктах и БАД основан на применении
высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). К изофлавонам
относятся даидзеин, генистеин и глицитеин и их гликозиды даидзин,
генистин, глицитин, структура которых указана на рис. 13.
Средства измерений, материалы и реактивы
Жидкостной хроматограф с насосом высокого давления с подачей
растворителя от 0,1 до 5,0 куб. см/мин., обеспечивающий работу в
режиме градиентного элюирования, оборудованный
спектрофотометрическим детектором с переменной длиной волны и
системой для сбора и обработки хроматографических данных
МультиХром, версия 1,5х (Амперсенд, Россия).
Колонка и предколонка хроматографические с силикагелем,
химически связанным с октадецилсиланом (силикагель С18), с
размером частиц 5 мкм; длина колонки - 15 см, предколонки - 4,5
см, внутренний диаметр колонок - 0,46 см.
Микрошприцы МШ-10 и МШ-25 для жидкостной хроматографии.
Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С, ТУ 64-1-2451-78.
Ультразвуковая баня.
Колбы мерные наливные 2-50-2, 2-100-2, 2-250-2, 1-1000-2 по
ГОСТ 1770.
Пипетки 4-1-2 или 5-1-2, 4-2-10 или 5-2-10, 4-2-25 или 5-2-25
по ГОСТ 29227.
Ацетонитрил, ч., ТУ 6-09-3534-74.
Метанол - яд, для жидкостной хроматографии, ос.ч. по ТУ 6-09-14-
2192-85.
Бумага фильтровальная "красная лента" и "синяя лента" по ТУ 6-
09-1678-95.
Фильтры капроновые марки 0,45 мкм RC или целлюлозные.
Баллон с сжатым азотом марки ПНГ.
Вода деионизированная.
Кислота о-фосфорная, ч., ГОСТ 6552.
Подготовка к проведению измерений
Приготовление рабочих растворов изофлавонов
Навеску изофлавона (генистеин) массой 10,0 +/- 0,1 мг помещают
в мерную колбу вместимостью 25 куб. см, до половины заполненную
70%-ным метанолом, перемешивают до полного растворения вещества,
доводят 70%-ным метанолом до метки и тщательно перемешивают.
Получают раствор с массовой концентрацией генистеина 0,4 мг/куб.
см.
Подготовка образца
Содержимое капсул или растертых таблеток БАД или 1,0 г
измельченного образца помещают в круглодонную колбу вместимостью
100 куб. см, прибавляют около 50 куб. см 70%-ного метанола,
экстрагируют с помощью ультразвука в течение 10 минут и
встряхивают 20 минут на аппарате для встряхивания. Экстракт
охлаждают до комнатной температуры, надосадочную жидкость
фильтруют через целлюлозный или капроновый фильтр с размером пор
до 0,45 мкм в мерную колбу вместимостью 100 куб. см. Объем
экстракта доводят 70%-ным метанолом до метки и тщательно
перемешивают.
Проведение анализа
Условия ВЭЖХ. Колонка с сорбентом Kromasil 100 С18 или
аналогичная, размер частиц 5 мкм. Подвижная фаза: градиент 0,1%
фосфорной кислоты - ацетонитрил от (90:10) до (65:35) за 40 мин.,
скорость потока 0,8 куб. см/мин., температура колонки 25 град. C.
Детектор спектрофотометрический, длина волны УФ 255 нм, шкала 0,01
AUFS. Параметры разделения изофлавонов: даидзин - 9,5 +/- 0,5,
глицитин - 10,5 +/-0,5, генистин - 14,5 +/- 0,5, даидзеин 23,5 -
+/-0,5 мин., глицитеин - 24,5 +/- 0,5 и генистеин - 31,5 +/- 0,5
мин.
Расчет концентраций изофлавонов
Массовую концентрацию каждого изофлавона относительно стандарта
генистеина рассчитывают по формуле:
S x m x V x K x 100
обр ст 1
X = -------------------------, %,
V x S x M
2 ст обр
где:
S - площадь пика исследуемого компонента;
обр
S - площадь пика стандарта генистеина;
ст
V - объем анализируемого раствора пробы, куб. мм;
1
V - объем экстракта, введенного в хроматограф, куб. мм;
2
m - масса стандарта генистеина, введенная в хроматограф, мг;
ст
М - навеска образца, взятая для анализа, мг;
обр
К - коэффициент пересчета содержания индивидуального
изофлавона относительно генистеина - согласно нижеприведенной
таблице:
--------------------------------T--------------------------------¬
¦ Изофлавон ¦ К ¦
+-------------------------------+--------------------------------+
¦Генистеин ¦ 1,000 ¦
+-------------------------------+--------------------------------+
¦Генистин ¦ 1,458 ¦
+-------------------------------+--------------------------------+
¦Даидзеин ¦ 1,203 ¦
+-------------------------------+--------------------------------+
¦Даидзин ¦ 1,931 ¦
+-------------------------------+--------------------------------+
¦Глицитеин ¦ 1,630 ¦
+-------------------------------+--------------------------------+
¦Глицитин ¦ 2,118 ¦
L-------------------------------+---------------------------------
Вычисления проводят до второго десятичного знака. За результат
принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных
измерений и выражают целым числом с одним десятичным знаком.
Относительное допустимое расхождение между результатами двух
параллельных определений при доверительной вероятности Р = 0,95 не
должно превышать 10%.
11.5. Определение гиперозида и рутина в БАД,
содержащих боярышник (Crataegus Monoguna)
Приборы и реактивы
Высокоэффективный жидкостной хроматограф с колонкой ODS
(Nucleosil) 250х4,6 мм, предколонкой ODS 20х4,6 мм, размер частиц
5 мкм, объем петли инжектора 20 мкл, фотометрический детектор,
длина волны 590 нм.
Пластины для ТСХ "Silufol".
Облучатель ультрафиолетовый.
Спектрофотометр.
Реактив Neu: а) смесь аминоэтанол дифенилбората, 1%-ный раствор
в метаноле, и полиэтиленгликоль 400R, 5%-ный раствор в метаноле;
б) алюминий хлористый, 5%-ный раствор в спирте.
Кислота уксусная ледяная.
Кислота муравьиная безводная.
Этилацетат.
Стандартные растворы
Гиперозид, раствор в метаноле концентрацией 0,5 мг/куб. см.
Гиперозид, раствор в 96%-ном этиловом спирте концентрацией 1
мг/куб. см.
Витексин-2-рамнозид, раствор в метаноле концентрацией 0,02
мг/куб. см.
Рутин, раствор 0,05%-ный в метаноле.
Подготовка образца
1) 1,0 г измельченного продукта помещают в плоскодонную колбу,
добавляют 10 куб. см метанола, смесь перемешивают в течение 15
мин. Раствор фильтруют.
2) 0,5 г измельченного продукта кипятят в течение 15 мин. в 5
куб. см 95%-ного этилового спирта, экстракт фильтруют (для
качественного анализа).
3) 2 г измельченного продукта нагревают с обратным
холодильником на кипящей водяной бане в течение 1 ч в 100 куб. см
95%-ного этилового спирта, после охлаждения доводят объем до
первоначального, экстракт фильтруют, 50 куб. см фильтрата
упаривают до 2-3 куб. см, переносят в мерную колбу на 10 куб. см,
доводят объем до 10 куб. см 96%-ным этиловым спиртом, перемешивают
и дают осесть образовавшемуся аморфному осадку.
4) На стартовую линию пластины Silufol (20х20 см), отстоящую от
края пластины на 20-25 мм, микрошприцем или стеклянным капилляром
наносят в виде полосы 80 мкл экстракта и 80 мкл контрольного
раствора ГСО гиперозида. Пластинку помещают в хроматографическую
камеру и проводят разделение в системе хлороформ - метиловый спирт
(8:2). Когда фронт растворителя дойдет до края пластинки, ее
высушивают в течение 2 мин. и вторично хроматографируют в той же
системе. Высушивают и просматривают в УФ-свете при 360 нм.
Отмечают пятна гиперозида в образце и стандарте. Элюируют вещество
со слоя сорбента 10 куб. см смеси диоксан - вода (1:1) (раствор
А).
Идентификация тестового соединения
На стартовую линию пластины Silufol (20х20 см), отстоящую от
края пластины на 20-25 мм, с помощью микрошприца или стеклянного
капилляра наносят в виде полосы 20х3 мм 20 мкл анализируемого
экстракта и 5 мкл контрольного раствора. Пластинку помещают в
хроматографическую камеру и элюируют в системе ледяная уксусная
кислота - муравьиная кислота безводная - метилэтилкетон -
этилацетат (10:10:30:50). Дают фронту растворителя подняться на 10-
15 см, затем пластину высушивают, после испарения растворителя
помещают на 2 мин. под струю горячего воздуха и опрыскивают
реактивом Neu. В длинноволновом УФ-свете (длина волны 365 нм)
гиперозид обнаруживают по полосе с желтой флуоресценцией и Rf 0,5,
2,2-рамнозил витексина - по зеленоватой и Rf 0,25, хлорогеновую
кислоту - по белой и Rf 0,4 и изохлорогеновую кислоту - по голубой
флуоресценции и Rf 0,7.
В системе хлороформ - метанол (8:2) на уровне гиперозида в УФ-
свете 360 нм наблюдают пятно темно-коричневого цвета. При
обработке пластинки 5% спиртовым раствором АlСl3 и последующем
нагревании при 100-105 град. C 2-3 мин. пятно приобретает ярко-
желтую окраску при дневном свете и желто-зеленую флуоресценцию в
УФ-свете 360 нм.
Количественное определение тестовых соединений
Содержание гиперозида
Измеряют оптическую плотность исследуемого раствора А при 365
нм, против раствора сравнения - контрольный опыт (экстракт полосы
сорбента). Калибровку проводят по раствору стандарта ГСО
гиперозида.
Содержание витексин-2-рамнозида и гиперозида
0,5 г измельченного продукта помещают в плоскодонную колбу,
соединенную с обратным холодильником, добавляют 50 куб. см
метанола, смесь нагревают на водяной бане при перемешивании в
течение 30 мин. Раствор охлаждают, фильтруют, растворитель
упаривают на ротационном испарителе до небольшого объема. Остаток
растворяют в 25 куб. см метанола, а затем разбавляют подвижной
фазой в соотношении 1:5 и анализируют с помощью ВЭЖХ.
Условия хроматографического разделения: колонка ODS
(Nucleosil), 250х4,6 мм, предколонка ODS, 20х4,6 мм, размер частиц
5 мкм, объем петли инжектора 20 мкл, УФ-детектор, длина волны 590
нм, подвижная фаза:
А: вода - тетрагидрофуран - этанол - фосфорная кислота
(90:10:5:1);
В: вода - тетрагидрофуран - пропанол-2 - фосфорная кислота
(20:5:1).
Градиент элюирования: А -> В 0:100 за 45 мин., скорость потока
1 куб. см/мин.
Ориентировочные времена удерживания:
витексин-2-рамнозида - 22,59 мин., гиперозида - 31,90 мин.
Записывают хроматограммы стандартного образца и экстракта.
Отмечают пик, совпадающий по времени удерживания с соответствующим
стандартом, и по площадям пиков рассчитывают содержание в
продукте.
11.6. Определение флавонолгликозидов в БАД
на основе экстракта Ginkgo biloba
Согласно фармакопее США экстракт листьев Ginkgo biloba должен
содержать не менее чем 22,0% и не более чем 27,0% флавоноловых
гликозидов (рис. 14). В стандартизованных экстрактах Ginkgo biloba
содержание кверцетина, кемпферола и изорамнетина колеблется около
9,5%, 10,5% и 2,0% соответственно. Такое качественное и
количественное соотношение флавонолгликозидов уникально для высших
растений и может служить специфическим индикаторным показателем
качества препаратов гинкго.
В качестве метода анализа используется высокоэффективная
обращеннофазная жидкостная хроматография.
Подготовка проб для анализа
Содержимое капсул или растертые таблетки, содержащие около 0,3
г сухого экстракта или 1,0 г порошка листьев гинкго, помещают в
круглодонную колбу объемом 250 куб. см, прибавляют 80 куб. см
смеси метанол - вода - соляная кислота (60:20:8). Экстракцию
проводят на кипящей водяной бане с обратным холодильником в
течение 1-1,5 ч. Экстракт охлаждают до комнатной температуры,
надосадочную жидкость фильтруют через целлюлозный или тефлоновый
фильтр с размером пор до 0,45 мкм в мерную колбу объемом 100 куб.
см. Объем экстракта доводят дистиллированной водой до 100 куб. см.
Приготовление рабочих стандартных растворов
Точные навески 1 мг стандартных образцов кверцетина, кемпферола
и изорамнетина переносят в мерные колбы, встряхивают с метанолом
до полного растворения, доводят объем растворителя до метки и
тщательно перемешивают.
Проведение анализа
Колонка: Kromosil С18, 5 мкм, 250 мм x 4,6 мм ID.
Подвижная фаза: метанол - ортофосфорная кислота, pH 2,6
(53:47), скорость потока 1,2 куб. см/мин.
Детектирование: UV, 370 нм.
Объем вводимой пробы 5 - 20 мкл.
Параметры разделения кверцетина, кемпферола и изорамнетина в
табл. 37.
Таблица 37
-----------------------T-------------------T---------------------¬
¦ Флавоноид ¦ tR, мин. ¦ К - коэффициент ¦
¦ ¦ ¦ емкости колонки ¦
+----------------------+-------------------+---------------------+
¦Кверцетин ¦ 13,3 ¦ 5,4 ¦
+----------------------+-------------------+---------------------+
¦Кемпферол ¦ 24,0 ¦ 10,6 ¦
+----------------------+-------------------+---------------------+
¦Изорамнетин ¦ 27,9 ¦ 12,5 ¦
L----------------------+-------------------+----------------------
Таблица 38
МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕТОДА
ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЛАВОНОЛГЛИКОЗИДОВ
------------------------------------------------------T----------¬
¦ Статистический параметр ¦Кверцетин ¦
+-----------------------------------------------------+----------+
¦Предел обнаружения, % ¦ 0,01 ¦
+-----------------------------------------------------+----------+
¦Интервал определяемых концентраций, мг/кг ¦ 0,01-15 ¦
+-----------------------------------------------------+----------+
¦Среднее значение открываемости (показатель ¦ 90-95 ¦
¦правильности), % ¦ ¦
+-----------------------------------------------------+----------+
¦Максимально допустимое расхождение между результатами¦ 7,0 ¦
¦двух параллельных внутрилабораторных определений ¦ ¦
¦(сходимость) при р = 0,95, % ¦ ¦
+-----------------------------------------------------+----------+
¦Максимально допустимое расхождение между результатами¦ 10,0 ¦
¦двух параллельных межлабораторных определений ¦ ¦
¦(воспроизводимость) при р = 0,95, % ¦ ¦
L-----------------------------------------------------+-----------
Для определения содержания флавонолгликозидов найденные
концентрации кверцетина умножают на коэффициент 2,5, кемпферола -
на 2,05, изорамнетина - на 2,4.
11.7. Определение флавоноидов в БАД,
содержащих солодку (Radix Glicyrrisae)
Солодка содержит тритерпеноидные сапонины (4-24%), главным
образом глицирризин, смесь натриевой и кальциевой солей
глицирризиновой кислоты; флавоноиды (1%), в основном флаваноны,
ликвиритин и ликвиритигенин, халконы - изоликвиритин,
изоликвиритигенин и изофлавоноиды (формононетин).
Анализ основан на определении глицерризиновой кислоты и
тестовых соединений с помощью ТСХ и ВЭЖХ.
Приборы и реактивы
Спектрофотометр СФ-26, СФ-46 или подобный (Shimadzu UV-160A,
Япония), позволяющий проводить измерения при длинах волн 190-900
нм, с допустимой абсолютной погрешностью измерений коэффициента
пропускания не более 1%.
Пластины "Silufol".
Жидкостной хроматограф с насосом высокого давления с подачей
растворителя от 0,1 до 5,0 куб. см/мин., обеспечивающий работу в
режиме градиентного элюирования, оборудованный
спектрофотометрическим детектором с переменной длиной волны и
системой для сбора и обработки хроматографических данных
МультиХром, версия 1,5х (Амперсенд, Россия).
Колонка и предколонка хроматографические с силикагелем,
химически связанным с октадецилсиланом (силикагель С18), с
размером частиц 5 мкм; длина колонки - 15 см, предколонки - 4,5
см, внутренний диаметр колонок - 0,46 см.
Микрошприцы МШ-10 и МШ-25 для жидкостной хроматографии.
Спирт этиловый ректификованный.
Метанол - яд, для жидкостной хроматографии, ос.ч. по ТУ 6-09-14-
2192-85.
Бумага фильтровальная "красная лента" и "синяя лента" по ТУ 6-
09-1678-95.
Ликуразид, раствор в 50%-ном этиловом спирте концентрацией 1
мг/куб. см.
Глицирризиновая кислота, аммониевая или натриевая соль: раствор
в 50%-ном этиловом спирте концентрацией 1 мг/куб. см.
Подготовка образца
1 г измельченного продукта помещают в плоскодонную колбу,
добавляют 50 куб. см 50%-ного этилового спирта, смесь нагревают на
водяной бане при 55-60 град. C в течение 30 мин. Экстракцию
повторяют пятикратно. Спиртовые экстракты охлаждают, фильтруют,
доводят объем до 250 куб. см 50%-ным этиловым спиртом.
Идентификация тестовых соединений ТСХ
На стартовую линию пластины Silufol, УФ 254 (20х20 мм),
отстоящую от края пластины на 20-25 мм, с помощью микрошприца или
стеклянного капилляра наносят в виде полосы 20х3 мм 10 мкл
экстракта и по 5 мкл растворов стандартов: ГСО ликуразида,
глицирризиновой кислоты. Пластинку помещают в хроматографическую
камеру и элюируют в смеси хлороформ - метанол - вода, взятых в
объемном соотношении 61:32:7. Дают фронту растворителя подняться
на 10 см, затем после высушивания пластинку рассматривают в
видимом и УФ-свете при длинах волн 254 и 360 нм: наблюдают желтые
(видимый свет) или темно-фиолетовые (УФ-свет) пятна с Rf 0,9 -
изоликвиритигенин, Rf 0,5 - изоликвиритин, Rf 0,4 - ликуразид.
Только в УФ-свете проявляются синим цветом пятна: глицирризиновой
кислоты - Rf 0,1, ликвиритигенин - Rf 0,8, ононин - Rf 0,6,
ликвиритин - Rf 0,5. При опрыскивании пластины диазореагентом все
вещества, кроме ононина, проявляются в виде желтых или оранжевых
пятен.
Количественное определение ВЭЖХ
Условия хроматографического разделения: колонка Zorbax ODS, 5
мкм, 250х4,6 мм, предколонка ODS, 5 мкм, 20х4,6 мм, объем петли
инжектора 20 мкл. Подвижная фаза: градиент метанол - 1,5% уксусная
кислота от (20) до (40:60) за 60 мин., скорость потока 1 куб.
см/мин., температура колонки 45 град. C. УФ-детектор, длины волн:
275 нм для обнаружения ликвиритина и 375 нм для обнаружения
ликуразида. Время выхода 10 и 25 мин. соответственно.
11.8. Определение флавоновых гликозидов в БАД,
содержащих страстоцвет (Passiflora incarnata L)
Приборы и реактивы
Пластины для ТСХ с силикагелем ("Silufol", "Sorbfil").
Реактив Neu: а) смесь 1%-ного раствора дифенилбората
аминоэтанола в метаноле и 5%-ного раствора полиэтиленгликоля -
400R (PEG-400R) в метаноле; б) 2%-ный раствор хлорида алюминия в
метаноле.
Стандартные растворы в метаноле витексина, изовитексина,
сапонарина концентрацией 0,5-1,0 мг/куб. см.
Подготовка образца
К 1 г порошка БАД добавляют 10 куб. см метанола, нагревают с
обратным холодильником и при перемешивании на водяной бане при 60
град. C в течение 10 мин. Экстракт фильтруют через сульфат натрия
и упаривают до 1 куб. см.
К 20 г порошка БАД добавляют 200 куб. см этилового спирта,
кипятят с обратным холодильником на водяной бане в течение 1 ч,
фильтруют и упаривают досуха. Остаток растворяют при перемешивании
в 0,5%-ной серной кислоте в течение 15 мин., раствор фильтруют,
фильтрат подщелачивают 20%-ным KOH до pH 9 и экстрагируют
хлористым метиленом (3х50 куб. см). Экстракт обезвоживают
сульфатом натрия и упаривают досуха. Остаток растворяют в 1 куб.
см метанола.
Идентификация тестового соединения
На стартовую линию пластины Silufol (20х20 см), отстоящую от
края на 20-25 мм, с помощью микрошприца или стеклянного капилляра
наносят в виде полосы 20х3 мм по 20 мкл экстракта и эталонного
раствора витексина, изовитексина или сапонарина. Пластинку
помещают в хроматографическую камеру и элюируют в системе
растворителей безводная муравьиная кислота - вода - этилацетат -
метилэтилкетон (10:20:50:30). Дают фронту растворителя подняться
на 12 см, пластинку высушивают и опрыскивают проявляющим
реагентом. На хроматограмме в УФ-свете (365 нм) флавоновые
гликозиды проявляются в виде зеленых пятен: изовитексин с Rf 0,5,
витексин с Rf 0,65, сапонарин с Rf 0,15.
Количественное определение суммы
флавоновых гликозидов
Количественное определение суммы флавоновых гликозидов проводят
с помощью метода спектрофотометрии согласно разделу 10.
12. Определение содержания гинзенозидов в БАД,
содержащих женьшень
В настоящее время корни культивируемого и дикорастущего
многолетнего травянистого растения женьшеня (Раnах ginseng С.А.
Меу, сем. аралиевых - Araliaceae) и его экстракты используются в
качестве добавок при изготовлении ряда пищевых продуктов, а также
входят в состав биологически активных добавок к пище. Его
биологическая активность связывается, в основном, с соединениями
группы тритерпеновых гликозидов (гинзенозидов). Основными
гинзенозидами женьшеня являются: Re, Rg1, Rf, Rg2, Rb1, Rc, Rb2,
Rd - остальные присутствуют в минорных концентрациях. Для
стандартизации корня женьшеня и его препаратов обычно определяют
содержание шести гинзенозидов - Re, Rg1, Rb1, Rc, Rb2, Rd. В
настоящее время стандартные образцы существуют только для Re, Rb1
и Rc (рис. 17).
В качестве метода анализа используется высокоэффективная
обращеннофазная жидкостная хроматография. Предел обнаружения
содержания гинзенозидов Rb1, Rc, Re составляет 0,001 мг/куб. см.
Отклик детектора линеен в диапазоне концентраций гинзенозидов от
0,001 до 1,00 мг/куб. см.
----------T-----------------------------T------------------------¬
¦Название ¦ R ¦ R1 ¦
+---------+-----------------------------+------------------------+
¦Rb1 ¦D-Glc-бета-(1 -> 2)-D-Glc ¦D-Glc-бета(1 -> 6)-D-Glc¦
+---------+-----------------------------+------------------------+
¦Rb2 ¦D-Glc-бета(1 -> 2)-D-Glc ¦L-Ara(пираноза) (1 -> ¦
¦ ¦ ¦6)-D-Glc ¦
+---------+-----------------------------+------------------------+
¦Rc ¦D-Glc-бета(1 -> 2)-D-Glc ¦L-Ara(фураноза) (1 -> ¦
¦ ¦ ¦6)-D-Glc ¦
+---------+-----------------------------+------------------------+
¦Rd ¦D-Glc-бета(1 -> 2)-D-Glc ¦D-Glc ¦
+---------+-----------------------------+------------------------+
¦Название ¦R ¦R1 ¦
+---------+-----------------------------+------------------------+
¦Re ¦L-Rha(1 -> 2)-D-Glc ¦D-Glc ¦
+---------+-----------------------------+------------------------+
¦Rf ¦D-Glc-бета(1 -> 2)-D-Glc ¦D-Glc ¦
+---------+-----------------------------+------------------------+
¦Rg1 ¦D-Glc ¦D-Glc ¦
+---------+-----------------------------+------------------------+
¦Rg2 ¦L-Rha(1 -> 2)-D-Glc ¦H ¦
L---------+-----------------------------+-------------------------
Подготовка проб для анализа
Напитки и биологически активные добавки к пище в жидком виде
|
