|
Стр. 13
желтый цвет (хризофон).
Количественное определение антраценовых производных
(в пересчете на истизин)
К экстракту, полученному по п. 2, прибавляют 100 куб. см
щелочно-аммиачного раствора и осторожно встряхивают в течение 5-7
мин., охлаждая воронку под струей воды. После полного расслоения
прозрачный красный нижний слой сливают в мерную колбу на 250 куб.
см. Из эфирного слоя экстракцию продолжают аммиачно-щелочным
раствором до прекращения окрашивания раствора, объединенные
экстракты доводят до метки аммиачно-щелочным раствором. 25 куб. см
этого раствора помещают в коническую колбу на 100 куб. см,
нагревают 15 мин. на кипящей водяной бане при периодическом
перемешивании. После охлаждения раствор переносят в мерную колбу
на 25 куб. см и доводят объем водой до метки. Измеряют оптическую
плотность раствора при 530 нм, в качестве калибровочных используют
растворы хлорида кобальта 10-50 мг/куб. см. Концентрация 2,5
мг/куб. см хлорида кобальта соответствует концентрации истизина
0,0009 мг/куб. см.
20.3. В БАД, содержащих крушину ольховидную
(Frangula alnus mill)
Приборы и реактивы
Спектрофотометр или ФЭК.
Щелочно-аммиачный раствор: 50 г едкого натра растворяют в 870
куб. см воды, добавляют 80 куб. см концентрированного раствора
аммиака.
Подготовка образца
1. 1,0 г измельченного образца помещают в плоскодонную колбу,
добавляют 10 куб. см 10%-ного спиртового раствора едкого натра,
смесь кипятят в течение 3-5 мин. Раствор фильтруют, охлаждают,
подкисляют разбавленной соляной кислотой до слабокислой реакции по
индикаторной бумаге, прибавляют 10 куб. см эфира, встряхивают в
течение 2-3 мин., эфирный слой окрашивается в желтый цвет.
2. 0,05 г образца экстрагируют 7,5 куб. см ледяной уксусной
кислоты при нагревании с обратным холодильником на кипящей водяной
бане в течение 15 мин. После охлаждения в колбу через обратный
холодильник добавляют 30 куб. см эфира и кипятят 15 мин., экстракт
охлаждают, фильтруют или центрифугируют, промывают осадок на
фильтре или центрифугат эфиром. Эфирные экстракты объединяют,
фильтруют или центрифугируют. Осадок экстрагируют еще трижды по 10
куб. см воды, объединенный экстракт фильтруют, охлаждают, фильтрат
подкисляют разбавленной соляной кислотой до слабокислой реакции по
индикаторной бумаге, прибавляют 10 куб. см эфира, встряхивают в
течение 2-3 мин.
Идентификация тестовых соединений
5 куб. см эфирного экстракта, полученного по п. 1, смешивают с
5 куб. см раствора аммиака. Аммиачный слой приобретает вишнево-
красное окрашивание (эмодины), эфирный слой остается окрашенным в
желтый цвет (хризофановая кислота).
Количественное определение антраценовых производных
(в пересчете на истизин)
К экстракту, полученному по п. 2, прибавляют 100 куб. см
щелочно-аммиачного раствора и осторожно взбалтывают в течение 5-7
мин., перемешивают, охлаждая воронку под струей воды. После
полного расслоения прозрачный красный нижний слой сливают в мерную
колбу на 250 куб. см, из эфирного слоя экстрагируют аммиачно-
щелочным раствором до прекращения окрашивания раствора,
объединенные экстракты доводят до метки аммиачно-щелочным
раствором. 25 куб. см этого раствора помещают в коническую колбу
на 100 куб. см, нагревают 15 мин. на кипящей водяной бане при
периодическом перемешивании, после охлаждения раствор переносят в
мерную колбу на 25 куб. см и доводят объем водой до метки.
Измеряют оптическую плотность раствора при 530 нм, в качестве
калибровочных используют растворы хлорида кобальта 10-50 мг/куб.
см. Концентрация 2,5 мг/куб. см хлорида кобальта соответствует
концентрации истизина 0,0009 мг/куб. см.
20.4. В БАД, содержащих сенну
(Salvia officinalis L)
Приборы и реактивы
Спектрофотометр или ФЭК.
Щелочно-аммиачный раствор: 50 г едкого натра растворяют в 870
куб. см воды, добавляют 80 куб. см концентрированного раствора
аммиака.
Подготовка образца
1. 0,5 г измельченного образца помещают в плоскодонную колбу,
добавляют 10 куб. см 10%-ного спиртового раствора едкого натра,
смесь кипятят в течение 3-5 мин. Раствор фильтруют, охлаждают,
подкисляют разбавленной соляной кислотой до слабокислой реакции по
индикаторной бумаге, прибавляют 10 куб. см эфира, взбалтывают в
течение 2-3 мин. Эфирный слой окрашивается в желтый цвет.
2. 0,4 г продукта экстрагируют 100 куб. см воды при нагревании
с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 20 мин.
После охлаждения в колбу через обратный холодильник добавляют
эфир, экстрагируют 2 раза по 30 куб. см, эфирные экстракты
отбрасывают, водную фазу подогревают до исчезновения запаха эфира,
добавляют 0,1 г натрия гидрокарбоната, 10 куб. см 10%-ного
раствора хлорида окисного железа, нагревают на кипящей водяной
бане при перемешивании в течение 20 мин., добавляют 5 куб. см 50%-
ной серной кислоты и нагревают еще 20 мин. После охлаждения
раствор переносят в делительную воронку, колбу ополаскивают 20
куб. см воды и 75 куб. см эфира, экстрагируют из объединенной
водной фазы эфиром еще дважды по 20-30 куб. см, объединенные
эфирные экстракты фильтруют, промывают водой. К эфирному экстракту
добавляют 100 куб. см щелочно-аммиачного раствора, перемешивают 5
мин., водную фазу переносят в колбу на 300 куб. см, к эфирному
экстракту добавляют 20 куб. см воды и 3 куб. см концентрированной
соляной кислоты, воронку охлаждают под струей воды и перемешивают
слои, водную фазу переносят в колбу с водно-щелочной вытяжкой.
Объединенные щелочно-аммиачные экстракты доводят до метки щелочно-
аммиачным раствором.
Идентификация тестовых соединений
5 куб. см эфирного экстракта, полученного по п. 1, встряхивают
с 5 куб. см раствора аммиака. Аммиачный слой приобретает вишнево-
красное окрашивание (эмодины), эфирный слой остается окрашенным в
желтый цвет (хризофановая кислота).
Количественное определение антраценовых производных
(в пересчете на хризофановую кислоту)
Измеряют оптическую плотность раствора, полученного по п. 2,
при 530 нм, в качестве калибровочных используют растворы хлорида
кобальта 1 - 5%; 1%-ный раствор хлорида кобальта соответствует
концентрации хризофановой кислоты 4,3 мг/куб. дм щелочно-
аммиачного раствора.
21. Определение гидрохинона и его производных в БАД,
содержащих толокнянку (Uvae ursi folium)
Арбутин (бета-глюкозид гидрохинона) является полифенольным
индикаторным компонентом толокнянки Uva Ursi. Метод анализа
арбутина включает стадии кислотного гидролиза с последующим
определением гидрохинона с помощью обращеннофазовой ВЭЖХ с
спектрофотометрическим детектором при длине волны 280 нм.
Приборы и реактивы
Система ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектором.
Гидрохинон, Sigma.
Приготовление рабочего стандартного раствора
Точную навеску 1 мг стандартного образца гидрохинона переносят
в мерную колбу вместимостью 100 куб. см, до половины содержащую
метанол, встряхивают до полного растворения вещества, доводят
объем метанолом до метки и тщательно перемешивают.
Подготовка образца
Содержимое капсул или растертых таблеток, содержащих около 1,0
г порошка листьев или экстракта толокнянки, помещают в
круглодонную колбу объемом 250 куб. см, добавляют 90 куб. см смеси
метанол - вода - концентрированная соляная кислота (70:30:2) и
экстрагируют на кипящей водяной бане с обратным холодильником в
течение 1 часа. Экстракт охлаждают до комнатной температуры,
фильтруют через целлюлозный или тефлоновый фильтр с размером пор
до 0,45 мкм в мерную колбу вместимостью 100 куб. см. Объем
экстракта доводят дистиллированной водой до метки.
Проведение анализа
Колонка: Kromosil C18 или аналогичная, 5 мкм, 250х4,6 мм ID.
Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,1 М ортофосфорная кислота, pH
2,6 (20), скорость потока 1,0 куб. см/мин.
Детектирование: УФ, 280 нм.
Объем вводимой пробы 5-20 мкл.
Примерное время удерживания гидрохинона 4,5-5 мин.
Идентификацию гидрохинона проводят сравнением времени
удерживания со стандартным образцом. При количественном
определении используют метод внешней калибровки, сравнивая площади
пиков гидрохинона в образце и стандарте.
Концентрацию арбутина определяют умножением найденной
концентрации гидрохинона на коэффициент пересчета 2,473.
22. Определение производных кумарина
22.1. В БАД, содержащих крапиву (Urtica dioica L)
Скополетин (6-метокси-7-оксикумарин-гельзелиновая кислота)
Приборы и реактивы
Пластины для ТСХ "Silufol".
Облучатель ультрафиолетовый.
10%-ный водный раствор серной кислоты.
20%-ный раствор аммиака.
Стандартный раствор: 0,05%-ный раствор скополетина в метаноле
(раствор 1).
Подготовка образца
Экстракция стеринов
5,0 г измельченного образца помещают в плоскодонную колбу,
соединенную с обратным холодильником, добавляют 100 куб. см
хлористого метилена, смесь нагревают на водяной бане при
перемешивании в течение 30 мин. Раствор охлаждают, фильтруют,
растворитель упаривают на ротационном испарителе до небольшого
объема, остаток растворителя удаляют в токе воздуха. Вещество
растворяют в 2 куб. см хлористого метилена.
2,0 г измельченного образца помещают в плоскодонную колбу,
соединенную с обратным холодильником, добавляют 100 куб. см
циклогексана, смесь нагревают на водяной бане при перемешивании в
течение 30 мин. Смесь фильтруют, повторяют экстракцию в тех же
условиях. Объединенные экстракты охлаждают, фильтруют,
растворитель упаривают на ротационном испарителе до небольшого
объема, остаток растворителя удаляют током воздуха. Вещество
растворяют в 5 куб. см смеси ацетонитрил - тетрагидрофуран (96:4).
Экстракция скополетина
5,0 г измельченного продукта помещают в плоскодонную колбу,
соединенную с обратным холодильником, добавляют 50 куб. см
метанола, смесь нагревают на водяной бане при перемешивании в
течение 30 мин. Раствор охлаждают, фильтруют, растворитель
упаривают на ротационном испарителе до небольшого объема, остаток
растворителя удаляют в токе воздуха. Вещество растворяют в 2 куб.
см метанола.
Качественный анализ скополетина
с помощью метода ТСХ
На стартовую линию пластины Silufol (20х20 см), отстоящую от
края пластины на 20-25 мм, микрошприцем или стеклянным капилляром
наносят в виде полосы 20х3 мм 10 мкл экстракта и 5 мкл
контрольного раствора 1. Пластинку помещают в хроматографическую
камеру и элюируют в смеси толуол - эфир диэтиловый (40:60)
насыщенным раствором 10%-ной уксусной кислоты. Дают фронту
растворителя подняться на 10 см, затем после высушивания пластинку
опрыскивают 20% раствором аммиака. При рассматривании в УФ-свете
(длина волны 360 нм) обнаруживают синюю флуоресцирующую полосу с
Rf 0,25, соответствующую полосе скополетина в контрольном образце.
22.2. В БАД, содержащих вздутоплодник сибирский
(Pholojodicarpus sibiricus-fisch.ex.sp re ng)
Производные пиранокумаринов: виснадин, дигидросамидин
Приборы и реактивы
Газовый хроматограф с пламенно-ионизационным детектором.
Раствор фловерина (природная смесь дигидросамидина и виснадина)
- 0,5 мг/куб. см в 95%-ном этаноле.
Подготовка образца
1 г измельченного сырья экстрагируют в аппарате Сокслета
хлороформом в течение 1 часа (9-10 сливов). Хлороформ упаривают до
объема 1-2 куб. см. К остатку добавляют 5 куб. см 95% этанола,
содержимое количественно переносят в мерную колбу на 10 куб. см,
объем доводят до метки 95% этанолом.
Идентификация и количественное определение
тестовых соединений
Проводят ГЖХ определение суммарного содержания производных
пиранокумаринов. Условия ГЖХ: стеклянная колонка 1200х2 мм,
заполненная хроматоном N-AW-HMDS с размером частиц 0,16-0,20 мм с
2% лукопрена G1000.
Температура колонки - 200 град. C, испарителя - 240 град. C.
Скорость газа-носителя (азот) - 50 куб. см/мин.
В инжектор вводят 5-6 мкл исследуемого раствора и такое же
количество контрольного раствора фловерина.
Фловерин при данных условиях разделения элюируется одним пиком.
Расчет производят по площадям пиков контрольного образца и пробы.
23. Определение содержания эфирных масел
и подтверждение состава компонентов
Таблица 43
КОМПОНЕНТНЫЙ СОСТАВ ЭФИРНЫХ МАСЕЛ
(КРАТКИЙ ПЕРЕЧЕНЬ)
-------------------------------T---------------------------------¬
¦ ¦ Состав эфирного масла ¦
+------------------------------+---------------------------------+
¦Анис обыкновенный (Anisum ¦анетол (80%), метилхавикол, ¦
¦vulgare Gaerth), плоды ¦анискетон, ацетальдегид, анисовая¦
¦ ¦кислота ¦
+------------------------------+---------------------------------+
¦Кориандр посевной (Coriandrum ¦d-линалоол (65%), i-пинен, n- ¦
¦sativum L.), плоды ¦цимол, феландрен, дипентен, ¦
¦ ¦терпинолен, терпинен, гераниол, ¦
¦ ¦борнеол, геранилацетат, ¦
¦ ¦борнилацетат ¦
+------------------------------+---------------------------------+
¦Эвкалипт шариковый ¦Цинеол (60%), d-пинен, эвгенол, ¦
¦(Eucaliptus globulus Labill), ¦глобулол, пинакарнеол, ¦
¦листья ¦сесквитерпены, альдегиды ¦
+------------------------------+---------------------------------+
¦Фенхель обыкновенный ¦Анетол (60%), фенон (20%), ¦
¦(Foeniculum vulgare Mill), ¦метилхавикол (10%), пинен, ¦
¦плоды ¦камфен, диптен, фелландрен ¦
+------------------------------+---------------------------------+
¦Лаванда колосовая (Lavandula ¦1-линалилацетат (35%), спирты ¦
¦spica L.), соцветия ¦(10-30%): 1-линалоол, ¦
¦ ¦изоамиловый спирт, гераниол ¦
+------------------------------+---------------------------------+
¦Мята перечная (Mentha piperita¦1-ментол (50%), 1-ментон (10- ¦
¦L.), листья и другие наземные ¦20%), эфиры ментола с уксусной, ¦
¦части ¦валериановой и др. кислотами ¦
¦ ¦(4-9%) ¦
L------------------------------+----------------------------------
Приборы и реактивы
ГХ-МС с энергией ионизирующих электронов 70 эВ, квадрупольный
анализатор, диапазон массовых чисел 39-450 а.е.м., температура
источника ионов и переходных линий 200-250 град. C. Обработка
данных на МС-станции с библиотечным поиском.
ГХ с пламенно-ионизационным детектором (ГХ-ПИД).
Подготовка образца
Эфирные масла извлекают общепринятыми методами: перегонкой с
водяным паром, экстракцией органическими растворителями (ГФ IX, с.
328, ГФ XI, т. 1, с. 287). Суммарное количественное определение
содержания эфирных масел проводят гравиметрическим методом.
Идентификация и количественное определение состава
Анализ выделенных эфирных масел проводят с помощью методов ГХ-
ПИД и ГХ-МС с использованием двух колонок разной полярности. В
случае ГХ-ПИД идентификацию проводят с использованием индексов
Ковача (http://www.nysaes.cornell.edu/-
fst/faculty/acree/flavornet/OV101.html) при одинаковых условиях
хроматографического разделения. Количественный анализ проводят с
использованием метода внутреннего стандарта.
Условия хроматографического разделения (примеры)
1. ГХ-МС/ПИД: кварцевая капиллярная колонка длиной 30-50 м,
внутренним диаметром 0,2-0,25 мм с неподвижной
полиметилсилоксановой фазой толщиной пленки 0,2-0,3 мкм типа SE30
или SE54. Анализ проводят при программировании температуры: 60
град. C (5 мин.) -> 280 град. C, 5 град./мин. Газ-носитель -
гелий, давление на входе колонки 1-1,5 атм. Температура инжектора
- 200-250 град. C, температура интерфейсной линии ГХ-МС - 200
град. C.
2. ГХ-МС/ПИД: кварцевая капиллярная колонка длиной 30-50 м,
внутренним диаметром 0,2-0,32 мм с неподвижной
полиэтиленгликолевой фазой типа ПЭГ-20М или ФФАП толщиной пленки
0,2-0,3 мкм. Анализ проводят при программировании температуры: 50
град. C (5 мин.) -> 220 град. C, 5 град./мин. Газ-носитель -
гелий, давление на входе колонки 0,5-10 атм. Температура инжектора
- 200-220 град. C, температура интерфейсной линии ГХ-МС - 200
град. C.
Примечание. Из БАД на основе плодов и ягод эфирные масла
предпочтительно анализировать на полярных колонках, т.к.
достигается лучшее разделение основных компонентов - смешанных
сложных эфиров. Эфирные масла, выделенные из БАД на основе
цитрусовых и хвойных растений, содержащие терпеновые компоненты,
предпочтительнее разделять на колонках SE30 и SE54.
24. Определение содержания инулина в БАД
Метод основан на определении инулина с помощью
высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Приборы и реактивы
Жидкостной хроматограф с рефрактометрическим детектором.
Смола Дауэкс 50x4, 200-400 меш., и Дауэкс 1х8, 200-400 меш.
Стандартный раствор инулина 10 мг/куб. см: предварительно
высушивают в сушильном шкафу при 105 град. C до постоянного веса в
стеклянных бюксах.
Подготовка смол
Смолу Дауэкс 50х4, 200-400 меш., последовательно промывают на
бюхнеровской воронке большими объемами 2Н NaOH, дистиллированной
водой, 3Н HCl и опять водой. Избыток воды удаляют путем
длительного отсасывания насосом. Готовят суспензию смолы в
дистиллированной воде (1:1) и используют ее для заполнения
колонки.
Ионообменная способность для Дауэкса 50х4 в сухом виде
составляет 5,1 мэкв/куб. см и во влажном 1,7 мэкв/куб. см
соответственно.
Для работы нужна формиатная форма смолы. Последнюю готовят из
_
смолы Дауэкс 1 x 8 (Cl -форма), пропуская через смолу на
бюхнеровской воронке 3Н формиат натрия до тех пор, пока проба на
_
Cl не станет отрицательной (проба с азотнокислым серебром). После
этого смолу промывают большими объемами дистиллированной воды и
заполняют колонку.
Ионообменная способность для Дауэкс 1 x 8 в сухом виде
составляет 3,2 мэкв/куб. см и во влажном виде - 1,4 мэкв/куб. см.
Проведение испытания
Подготовка пробы
Моно- и дисахара экстрагируют 80% этиловым спиртом с учетом
естественной влаги. Навеску образца заливают в колбе в соотношении
1:4 по сухим веществам 96%-ным этанолом и необходимым количеством
воды с расчетом, чтобы общая концентрация спирта была в пределах
80-82%. Колбу нагревают с обратным холодильником на водяной бане
при 70-80 град. C в течение 15 мин. Затем спиртовую вытяжку
отфильтровывают. Экстракцию повторяют в тех же условиях еще 3-4
раза. Спиртовые экстракты объединяют, спирт отгоняют на
ротационном испарителе при температуре не выше 40 град. C.
Предназначенные для определения экстракты нейтральных сахаров
содержат также вещества, имеющие заряд (аминокислоты, пептиды и
др.). Чтобы освободить нейтральные сахара от этих примесей,
экстракты пропускают через колонку со смолой Дауэкс 50х4,
непосредственно соединенную с колонкой, содержащей Дауэкс 1х8. С
двух колонок собирают элюат и, если необходимо, его концентрируют
на роторном испарителе. Чтобы в бане не поднимать высоко
температуру, воду упаривают азеотропной отгонкой с этанолом.
Сконцентрированный образец количественно переносят в мерную
емкость, замеряют объем и хроматографируют.
Навеску исходного образца гидролизуют 2%-ным раствором
щавелевой кислоты в течение часа при 100 град. C. В качестве
контроля на полноту гидролиза параллельно гидролизуют раствор
инулина. Полученный после гидролиза продукт пропускают через
колонки вышеописанным способом, после чего хроматографически
определяют суммарное количество фруктозы с помощью ВЭЖХ.
Условия ВЭЖХ
Перед работой новую хроматографическую колонку с сепароном
переводят на обратнофазный режим работы. Для этого колонку
промывают 40 куб. см изопропанола, затем 80 куб. см
деионизированной воды, после чего уравновешивают колонку подвижной
фазой до стабильной нулевой линии. Подвижная фаза: ацетонитрил -
вода (77:23). Смесь дегазируют на роторном испарителе.
Детектирование - рефрактометрическое. Скорость потока 2,5 куб.
см/мин.
Обработка результатов
От общего количества фруктозы вычитают фруктозу моно- и
дисахаров и получают количество инулина и полифруктозидов. При
расчете используют коэффициент 0,9, который учитывает
присоединение воды при гидролизе. Стандартный образец и
испытываемую пробу хроматографируют не менее трех раз.
Ошибка метода +/- 2%.
Качественный тест на инулин
Пробу обрабатывают 1-2 каплями 20% спиртового раствора нафтола
и 1 каплей концентрированной серной кислоты. Наблюдают красно-
фиолетовое окрашивание. При замене нафтола резорцином и тимолом
соответственно красное и розово-малиновое окрашивание.
25. Определение содержания аралозидов А, В, С в БАД,
содержащих аралию маньчжурскую (Araliae elatae (Mig) Seem)
Приборы и реактивы
Приготовление пластин для ТСХ
6 г силикагеля КСК, предварительно промытого соляной кислотой и
водой и высушенного, и 0,6 г сульфата кальция растирают в ступке,
добавляют 17 куб. см воды и выливают на пластинку 20х20 см. Сушат
в течение суток на воздухе, активируют при 120-140 град. C 30-40
мин.
Стандартный раствор - 0,6% раствор сапарала в метиловом спирте.
Подготовка образца
1. 1 г измельченного образца кипятят с 20 куб. см метилового
спирта на водяной бане при 80-85 град. C с обратным холодильником
в течение 1 ч, дают раствору отстояться.
2. 5 г измельченного образца помещают в аппарат Сокслета с
рабочим объемом 150-200 мл. В колбу-приемник наливают 250 мл
метанола, 70 мл 50%-ного раствора серной кислоты и проводят
экстракцию на кипящей водяной бане в течение 7 ч. Полученную в
приемнике смесь разбавляют водой 1:1 и колбу охлаждают под струей
холодной воды в течение 10 мин. Выпавший осадок отфильтровывают,
промывают на фильтре водой, подсушивают на фильтре под вакуумом.
Осадок количественно переносят 50 куб. см горячей смеси метилового
и изобутилового спиртов (1:1,5).
Качественный тест на аралозиды
20 мкл экстракта, полученного по п. 1, и 10 мкл стандартного
раствора сапарала наносят на стартовую линию пластинки с
силикагелем, хроматографируют в системе хлороформ - метиловый
спирт - вода (61:32:7). Дают фронту растворителя подняться на 16-
18 см, затем после высушивания пластинку опрыскивают 20% раствором
серной кислоты и нагревают в сушильном шкафу при 105 град. C 10
мин. На пластинке должны проявиться три основных пятна вишневого
цвета аралозидов, соответствующих по Rf аралозидам в сапарале.
Количественное суммарное определение аралозидов
Полученный по п. 2 раствор титруют потенциометрически 0,1 М
раствором едкого натра в смеси метилового спирта и бензола. При
титровании отмечают количество титранта, израсходованного на
доведение pH испытуемого раствора до 7,0.
Расчет суммарного содержания аралозидов в пересчете на
аммонийную соль аралозидов А, В, С с усредненной молекулярной
массой не менее 5% в % на сухое вещество рассчитывают по формуле:
0,10422 х (V - V - V ) х 100 х 100
1 2
X = -----------------------------------,
M x (100 - W)
где:
0,10422 - количество аммонийных солей аралозидов,
соответствующих 1 куб. см раствора едкого натра 0,1 М;
V - объем титранта, израсходованный на титрование пробы;
V - объем титранта, израсходованный на доведение pH до 7,0;
1
V - объем титранта, израсходованный на холостой опыт;
2
W - потеря при высушивании, %;
0,2020 - коэффициент пересчета бихромата калия на гнафалозид
А;
1,03 - поправочный коэффициент на неполное элюирование
гнафалозида А с сорбента;
W - потеря массы при высушивании, %.
26. Определение содержания экдистена в БАД, содержащих
левзею сафлоровидную (Leuzea carthamoides (Willd.DC))
Приборы и реактивы
Приготовление пластин для ТСХ: сорбент состоит из смеси Аl2О3
нейтральной и силикагеля, промытого последовательно 5Н соляной
кислотой (15-20 ч) и водой и высушенного при 120 град. C 12 час.
Для приготовления пластинок 9 г силикагеля и 3 г оксида алюминия
растирают в ступке с 0,4 г сульфата кальция, постепенно прибавляя
25 куб. см воды, массу перемешивают и выливают на пластинку 20х20
см, высушивают и активируют при 120 град. C 1 ч.
Спектрофотометр.
Раствор ГСО экдистена: 0,15 г ГСО экдистена (ВФС42-1713-87)
помещают в мерную колбу на 25 куб. см и доводят раствор до метки
95%-ным этанолом. 7 куб. см полученного раствора переносят в
мерную колбу на 25 куб. см и объем доводят до метки 95% этанолом
(раствор А).
Раствор ванилина в концентрированной серной кислоте.
Подготовка образца
15 г измельченного образца экстрагируют 180-200 куб. см
метилового спирта в аппарате Сокслета с рабочим объемом 150 куб.
см в течение 7 час. (25-30 сливов). Экстракт концентрируют на
ротационном испарителе при температуре 40 град. C до объема 5 куб.
см, количественно переносят в мерную колбу на 25 куб. см, доводят
объем метанолом до метки (раствор Б). На пластинку, разделенную на
5 зон, с помощью микрошприца или стеклянного капилляра наносят в
виде полос 20х3 мм 150 мкл раствора Б и 150 мкл стандартного
раствора экдистена (раствор А) - на 4 зоны, пятая зона остается
пустой (для раствора сравнения). Пластинку помещают в
хроматографическую камеру и элюируют в смеси метанол - хлороформ -
ацетон (2:6:1). Дают фронту растворителя подняться на 16-18 см.
После высушивания пластинки две зоны опрыскивают раствором
ванилина, отмечают полосу стандарта и собирают сорбент из
необработанных зон стандарта и образца. Вещества смывают с
силикагеля 15 мл метанола в течение 4 час.
Проведение анализа
Спектрофотометричекое количественное определение экдистена
Измеряют оптическую плотность растворов стандарта и образца
относительно раствора "холостого опыта" при длине волны 242 нм в
кюветах 10 мм. Содержание экдистена в сырье должно быть не менее
0,1%.
Качественный тест на инулин
Сухой порошок обрабатывают 1-2 каплями 20% спиртового раствора
нафтола и 1 каплей концентрированной серной кислоты. Наблюдают
красно-фиолетовое окрашивание. При замене нафтола резорцином и
тимолом наблюдают соответственно красное и розово-малиновое
окрашивание.
27. Определение содержания четвертичных
аммонийных оснований (глицинбетаин) в БАД, содержащих
солянку холмовую (Salsola collina PALL)
Приборы и реактивы
Спектрофотометр.
ВЭЖХ с УФ-детектором.
5% раствор соли Рейнеке (1,25 г соли Рейнеке,
перекристаллизованной из воды и высушенной при 60 град. C,
растворяют при перемешивании в 25 куб. см дистиллированной воды,
нагретой до 60 град. C).
Подготовка образца
1. 2-3 г измельченного продукта экстрагируют в аппарате
Сокслета 200 куб. см 70% этилового спирта в течение 2-2,5 ч.
Экстракт фильтруют и упаривают досуха, остаток растворяют в 10
куб. см 1 М НСl, фильтруют через бумажный фильтр, промывают 1 М
НСl.
Получение производного глицинбетаина для ВЭЖХ:
р-бромфенациловый эфир глицинбетаина
2. Экстракт переносят в мерную колбу на 200 куб. см и доводят
объем 70% этанолом. 1,25 куб. см этого экстракта переносят в
реакционную пробирку с пробкой на 10 куб. см и растворитель
упаривают досуха в токе воздуха при нагревании 80-90 град. C. В
пробирку добавляют 0,25 куб. см 40% раствора ацетонитрила,
содержащего 10 мМ КН2РО4, 10 мМ КНСО3, 5мМ 18-краун-6 эфира, и
после встряхивания добавляют 1,0 куб. см раствора р-
бромфенацилбромида (15 мг/куб. см) в ацетонитриле. После инкубации
30 мин. при 80 град. C пробирку охлаждают и добавляют по 2,5 куб.
см 0,1Н раствора серной кислоты и хлороформа. Пробирку встряхивают
и центрифугируют 3 мин. Отбирают водную фазу.
Количественное определение четвертичных оснований
с помощью метода спектрофотометрии
К фильтрату, полученному по п. 1, добавляют при перемешивании 5
куб. см горячего 5% раствора соли Рейнеке. Через 1 ч выпавший
осадок отфильтровывают, промывают на фильтре 20 куб. см эфира,
переносят в стаканчик и растворяют в 15 куб. см ацетона. Раствор
фильтруют в мерную колбу на 25 куб. см, добавляют 7,5 куб. см
воды, доводят до метки ацетоном. Определяют оптическую плотность
раствора при 520 нм. Раствор сравнения ацетон - вода (7:3).
Расчет содержания четвертичных оснований в пересчете на
глицинбетаин, %, проводят по формуле:
D x 153 x V
X = ------------,
10 x 118 x a
где:
D - оптическая плотность раствора;
153 - молекулярная масса глицинбетаинхлорида;
118 - коэффициент молярного поглощения рейнеката глицинбетаина
при 520 нм;
а - навеска травы;
V - объем пробы.
Количественное определение четвертичных оснований
с помощью метода ВЭЖХ
Условия хроматографии: сорбент: а) катионообменный (Nucleosil-
50, SA) или б) ионно-парный (Silasorb-5, C18), размеры колонки
2х64 мм, подвижная фаза - раствор додецилсульфоната натрия,
скорость потока 0,1 мл/мин. Детектор УФ 210 нм.
В хроматограф вводят 5 мл водной фазы (п. 2). Расчет - по
производному глицинбетаина. Время выхода р-бромфенацилового эфира
глицинбетаина - 6 мин.
28. Определение содержания гексозаминов
Для определения гексозаминов используют колориметрический метод
Элсона и Моргана (Biochem. J., 27, 1824 (1933)). Метод основан на
конденсации аминосахара с щелочным ацетилацетоном с образованием 2-
метил-3-ацетилпиррола и 2-метилпиррола; в присутствии реактива
Эрлиха (4-диметиламинобензальдегида) 2-метилпиррол является
основным хромогеном. Образование этих хромогенов сопровождается
появлением красновато-розоватой окраски. В реакции этого типа
глюкозамин и галактозамин дают одинаковую окраску с одинаковой
величиной молярной экстинкции. Взаимодействие между сахарами и
аминокислотами мешает определению, поэтому гексозамины отделяют от
аминокислот на ионообменной колонке.
Если гексозамины находятся в связанном виде, то их отделяют
путем гидролиза в 4Н соляной кислоте при 100 град. C в течение 4
часов в запаянных ампулах под азотом.
Выделение фракции гексозаминов и отделение их от нейтральных
сахаров, аминокислот и пептидов осуществляют хроматографией на
+
смоле Дауэкс 50х4 (200-400 меш., Н -форма). Смолу
последовательно промывают на бюхнеровской воронке большими
объемами 2Н NaOH, дистиллированной водой, 3Н HCl и опять водой.
Избыток влаги удаляют путем длительного отсасывания насосом.
Готовят суспензию промытой смолы в дистиллированной воде (1:1) и
используют ее для заполнения хроматографических колонок.
Перед нанесением на колонку образец освобождают от соляной
кислоты. Для этого его помещают в вакуумный эксикатор с NaOH. Для
защиты от кислоты насос снабжают ловушкой с негашеной известью.
Используют хроматографическую колонку с внутренним диаметром 10 мм
(можно использовать в качестве колонки пластмассовый шприц). На
дно колонки помещают маленький фильтр из стеклянной ваты, сверху
наливают 5 куб. см суспензии и дают ей осесть. После того как
образец проникнет в смолу, колонку промывают четырьмя порциями по
5 куб. см дистиллированной воды. Гексозамины элюируют 5-10 куб. см
2Н HCl. Элюат освобождают от кислоты указанным выше способом и в
остатке сразу определяют количество гексозаминов колориметрическим
методом.
Реактивы
Приготовление щелочного раствора ацетилацетона
2,4-пентандион (ацетилацетон) должен быть бесцветным. Его
накануне перегоняют и хранят в темной посуде при 4 град. C.
Непосредственно перед использованием 2 мл ацетилацетона растворяют
в 98 куб. см 1 М Na2CO3.
Реактив Эрлиха 2,7%-ный (вес/объем) раствор 4-
диметиламинобензальдегида в смеси этанол - концентрированная HCl
(1:1, по объему). Этот реактив следует готовить в день
определения.
Проведение анализа
В пробирках со стеклянными пробками смешивают 1 куб. см
раствора гексозамина (5-30 мкг) с 1 куб. см раствора щелочного
ацетилацетона. Пробы нагревают в течение 45 мин. при 100 град. C и
затем охлаждают водопроводной водой. Добавляют 4 куб. см 95%-ного
этанола и тщательно перемешивают, а затем добавляют 1 куб. см
реактива Эрлиха и опять интенсивно перемешивают. На последнем
этапе следует периодически выпускать образующийся СO2, приоткрывая
пробку несколько раз во время перемешивания. Пробирки оставляют на
1 ч при комнатной температуре и затем определяют оптическую
плотность раствора при 530 нм. Параллельно проводят обработку
стандартных и слепых проб.
29. Определение содержания гуминовых кислот
и глицина в мумие
Методика основана на гравиметрическом определении содержания
гуминовых кислот, экстрагированных из продукта щелочным раствором.
Глицин идентифицируют в кислотном гидролизате методом ТСХ при
обнаружении пятен аминокислот обработкой нингидроновым реагентом.
Приборы и реактивы
Спектрофотометр.
1% раствор NaOH.
6Н, 0,5Н растворы НСl.
0,3% раствор нингидрина в н-бутаноле.
Уксусная кислота концентрированная.
25% раствор аммиака.
Раствор глицина в 0,5 н НСl - 2 мг/куб. см.
Подготовка образца
К 2 г образца добавляют 25 куб. см 1% раствора NaOH и нагревают
в колбе с обратным холодильником в течение 2-2,5 ч на кипящей
водяной бане. Экстракт фильтруют или центрифугируют при 3000
об./мин., остаток снова обрабатывают 10 куб. см раствора щелочи.
Объединенные экстракты фильтруют или центрифугируют, фильтрат
подкисляют 5% НСl до pH 3-4, колбу с выпавшим осадком помещают на
30-60 мин. в холодильник, далее взвесь переносят в ц/ф пробирку с
известным весом, центрифугируют, осадок промывают водой, снова
центрифугируют, супернатант отделяют, а осадок высушивают при
температуре 105 град. C до постоянного веса. В образце определяют
содержание золы, прокалив его при температуре 350 град. C в
течение 5-6 ч. Содержание беззольных гуминовых кислот рассчитывают
по разнице массы гуминовых кислот и золы. Записывают спектры
раствора гуминовых кислот с концентрацией 2 мг/куб. см в 0,1Н NaOH
в области длин волн 465-730 нм. Раствор гуминовых кислот мумие
характеризуется максимумами с убывающей интенсивностью при 726,
665, 620, 575, 530, 500, 465 нм.
200 мг образца помещают в запаянную стеклянную ампулу,
добавляют 10 куб. см 6Н НСl и проводят гидролиз при 100-105 град.
C в течение 24 ч; далее кислоту упаривают досуха. Остаток
растворяют в 0,5Н НСl.
Идентификация глицина
На стартовую линию пластины "Силуфол" наносят по 2-3 мкл
растворов образца и глицина и помещают в хроматографическую
камеру, содержащую смесь бутанола, уксусной кислоты и воды, взятых
в объемном соотношении 4:1:1. Дают растворителю подняться на 10
см, пластинку вынимают, сушат от растворителя и опрыскивают 0,3%
раствором нингидрина. Помещают пластину на 5-10 мин. в термостат
при 105 град. C. Глицин обнаруживают в виде красного пятна с Rf
0,5.
Глава 4. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПИЩЕВЫХ ДОБАВОК
В СОСТАВЕ БАД
I. Метод определения консервантов (бензойная
и сорбиновая кислоты) с помощью ВЭЖХ
Сущность метода
Метод основан на извлечении бензойной кислоты (БК) и сорбиновой
кислоты (СК) из БАД перегонкой с паром и/или экстракцией
органическим растворителем с последующим хроматографическим
разделением их в тонком слое сорбента, элюции и измерении
оптической плотности полученных элюатов.
|
