|
Стр. 18
ст
введенного для калибровки хроматографа;
V - общий объем анализируемой пробы, мл;
общ
V - объем экстракта, взятый для анализа, мл;
э
V - объем, в котором растворен сухой экстракт, мкл;
обр
V - объем экстракта, введенный в хроматограф, мл;
a
Р - навеска пробы, г.
Вычисления проводят до первого десятичного знака. За результат
принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных
измерений и выражают целым числом с одним десятичным знаком.
Метрологические характеристики
Допустимое расхождение между результатами параллельных
определений не должно превышать 10% по отношению к
среднеарифметическому значению.
Относительное стандартное отклонение при определении аминов
составляет 0,06-0,1. Степень извлечения - 85,3-93,4%.
Предел обнаружения метода 0,03 мг/кг для тирамина и 0,1 мг/кг
для гистамина.
V. Метод определения полициклических ароматических
углеводородов (ПАУ)
Сущность метода заключается в экстракции углеводородов из
неомыляемой фракции липидов гексаном с последующей
хроматографической очисткой, идентификацией и количественным
определением ПАУ с помощью ВЭЖХ и спектрофлуориметрии, а также
хромато-масс-спектрометрии.
Область применения метода распространяется в основном на БАД на
основе рыбопродуктов, рыбьего жира и на основе растительных масел.
Рекомендуемая масса пробы для анализа - 25-50 г.
Приведенные в методике варианты хроматографического разделения
экстракта неомыляемой фракции липидов позволяют в зависимости от
поставленной задачи реализовать имеющиеся в распоряжении аналитика
приборы и реактивы.
В методику также включен как арбитражный метод хромато-масс-
спектрометрии.
Схема выделения полициклических ароматических углеводородов
(ПАУ) включает переэкстракцию ПАУ из гексанового раствора
неомыляемой фракции липидов комплексообразователем -
диметилформамидом и хроматографическую очистку экстракта на
колонке с сефадексом LH-20. Анализ ПАУ проводят с помощью ВЭЖХ или
низкотемпературной спектрофлуориметрии. Ввиду того, что
бенз(а)пирен рассматривают в качестве индикатора загрязнения ПАУ,
в методику включены прописи его выделения и определения. Первый
способ позволяет определить бенз(а)пирен в сумме ПАУ методом
низкотемпературной спектрофлуориметрии, второй предполагает его
выделение из суммы ПАУ в тонком слое ацетилированной целлюлозы и
определение методом спектрофлуориметрии при комнатной температуре.
1. Специфические аппаратура, материалы и реактивы
Жидкостной хроматограф со спектрофотометрическим
(фотометрическим) и флуориметрическим детекторами и колонкой с
обращеннофазовым сорбентом (силикагель ОDS или С18).
Хромато-масс-спектрометр с автоматической системой обработки
данных, энергией ионизирующих электронов 70 eV, диапазоном
массовых чисел 40-420 а.е.м., с капиллярной колонкой с неполярной
или слабополярной жидкой фазой.
Спектрофотометр флуоресцентный с монохроматорами на линиях
возбуждения и эмиссии.
Спектрофотометр флуоресцентный с приставкой для анализа
флуоресценции и фосфоресценции при температуре жидкого азота (типа
Hitachi-850, MPF-44B).
Спектрометр ДФС-12 или ДФС-24.
Облучатель с переменной длиной волны на 250 и 360 нм типа ОЛД,
ТУ 64-1-2242-77.
Пластины стеклянные 20х20 см для тонкослойной хроматографии.
Колонки стеклянные длиной 250-500 мм и внутренним диаметром 10-
15 мм со стеклянным пористым фильтром ПОР 160 и шлифом 14.
Целлюлоза микрокристаллическая для хроматографии.
Силикагель для хроматографии 40-100 мкм.
Алюминия окись 5/40 мкм.
Сефадекс LH-20, "Фармация", Швеция.
Стандарты: флуорантен, пирен, бенз(а)антрацен, хризен,
бенз(b)флуорантен, бенз(k)флуорантен, бенз(а)пирен, бенз(е)пирен,
дибенз(а,h)антрацен, бенз(b)хризен, бенз(g,h,i)перилен, коронен,
дибенз(а,е)пирен ("Serva", Германия).
2. Подготовка к испытанию
2.1. Приготовление растворителей
Все используемые органические растворители перегоняют
общепринятым способом.
Диметилформамид перегоняют, добавив к 250 куб. см растворителя
12 куб. см воды и 30 куб. см бензола.
Отбирают фракцию, выкипающую выше 153 град. C.
2.2. Подготовка сернокислого натрия безводного
1 кг сульфата натрия безводного заливают 2 куб. дм перегнанного
хлороформа или смеси хлороформа и метанола (1:1), оставляют на 3-4
ч или встряхивают в течение 1 ч на качалке в герметично закрытой
колбе, суспензию отфильтровывают на воронке Бюхнера, промывая
осадок на фильтре 1 куб. дм растворителя, высушивают осадок на
воздухе до полного удаления растворителя, после чего прокаливают
при температуре 400 град. C в течение 6 ч, хранят в колбе с
притертой пробкой.
2.3. Приготовление адсорбентов для хроматографии
2.3.1. Приготовление ацетилированной целлюлозы для ТСХ
К 50 г микрокристаллической целлюлозы добавляют смесь 150 куб.
см бензола или толуола, 70 куб. см уксусного ангидрида и 0,3 куб.
см концентрированной серной кислоты. Реакционную смесь
перемешивают на магнитной мешалке в течение 6-8 ч, оставляют еще
на 18 ч, после чего осадок отфильтровывают на воронке Бюхнера и
заливают 300 куб. см этанола, оставляют на 24 ч. Отфильтровывают
осадок, промывают его на фильтре 100 куб. см этанола,
дистиллированной водой до нейтральной реакции (5х300 куб. см) и
сушат на воздухе. Для приготовления пластинки 5 г ацетилированной
целлюлозы суспендируют в 15-20 куб. см этанола и наносят ровным
слоем на стеклянную пластинку 20х20 см. После полного испарения
растворителя проверяют хроматографическую подвижность
бенз(а)пирена в системе этанол - ацетон - вода, взятых в объемном
соотношении 60:25:15. Rf бенз(а)пирена и бенз(k)флуорантена
составляет 0,1 и 0,2 соответственно.
2.3.2. 10 г сефадекса заливают 50 куб. см этанола и оставляют
для набухания на 3-4 ч, после чего переносят на колонку. Над
сорбентом до начала работы должен быть слой растворителя 0,5-1,0
см.
2.4. Приготовление растворов сравнения,
внутренних стандартов
Для приготовления исходных растворов берут навески не менее 5
мг, растворяют в бензоле в мерных колбах объемом 50-100 куб. см и
хранят в холодильнике. Рабочие растворы готовят из исходных
разведением в соответствующем растворителе. Концентрации рабочих
растворов внутренних стандартов и растворов сравнения следующие.
Внутренние стандарты для хромато-масс-спектрометрического
анализа:
- растворы сравнения и внутреннего стандарта для анализа ПАУ
(ВЭЖХ) - 100 мкг/куб. см.
Растворы сравнения для анализа ПАУ низкотемпературной
спектрофлуориметрией:
- бенз(а)пирен - 1,0..., 10..., 100 нг/куб. см, перилен - 1...,
10 нг/куб. см, пирен, флуорантен, хризен, бенз(а)антрацен,
бенз(b)флуорантен, бенз(k)флуорантен, дибенз(а,h)антрацен,
дибенз(а,с)антрацен, бенз(е)пирен, бенз(g,h,i)перилен,
дибенз(а,с)пирен, коронен - 1..., 10..., 100..., 1000 нг/куб. см
(в бензоле).
Концентрация раствора сравнения для определения бенз(а)пирена
спектрофлуориметрией при комнатной температуре: бенз(а)пирен -
20..., 100..., 1000 нг/куб. см.
3. Проведение испытания
3.1. Щелочной гидролиз и экстракция неомыляемой
фракции липидов
50 г измельченного образца помещают в плоскодонную колбу
вместимостью 1000 куб. см, добавляют раствор 19,5 г гидроокиси
калия в 250 куб. см 92%-ного этилового спирта, туда же помещают
стеклянную трубочку-мешалку со впаянной стальной проволокой для
перемешивания на магнитной мешалке. К реакционной смеси добавляют
необходимые внутренние стандарты. Колбу присоединяют к обратному
холодильнику и нагревают при кипении реакционной массы и
перемешивании на магнитной мешалке в течение 3 ч. Полученный
раствор охлаждают до комнатной температуры и через холодильник
добавляют 350 куб. см воды. Полученный раствор переносят в
делительную воронку на 1000 куб. см и экстрагируют трижды по 150
куб. см гексана. Объединенные гексановые экстракты промывают в
делительной воронке водой трижды по 50 куб. см, переносят в
плоскодонную колбу, добавляют 30-40 г сульфата натрия и сушат
экстракт в течение 24 ч. Полученный экстракт (экстракт А) -
раствор неомыляемой фракции липидов используют далее для выделения
ПАУ.
3.2. Выделение ПАУ из неомыляемой фракции
липидов (экстракта А)
3.2.1. Переэкстракция водным диметилформамидом
Экстракт А упаривают до объема 100 куб. см, переносят в
делительную воронку емкостью 1000 куб. см и добавляют 100 куб. см
смеси диметилформамида и воды, взятых в объемном соотношении 9:1.
Содержимое воронки интенсивно встряхивают в течение 1 мин.,
отделяют нижний слой, а из верхнего гексанового экстрагируют ПАУ
повторно, добавив в воронку новую порцию водного диметилформамида
объемом 100 куб. см. Гексановый (верхний) слой отбрасывают, а
объединенный диметилформамидный экстракт разбавляют 200 куб. см
воды и экстрагируют ПАУ из слоя разбавленного водой
диметилформамида гексаном - трижды по 75 куб. см. Гексановые
экстракты объединяют и промывают водой (4 раза по 50 куб. см),
отделяют и сушат с 30 г безводного сульфата натрия в течение 1 ч.
Обезвоженный экстракт упаривают до объема 1-1,5 куб. см, остаток
растворителя удаляют в токе азота. Вещество в колбе (экстракт В)
растворяют в 1-1,5 куб. см этанола и очищают на колонке с
сефадексом LH-20.
3.2.2. Хроматография на колонке с сефадексом LH-20
10 г сефадекса заливают 50 куб. см этанола и оставляют для
набухания на 3-4 ч, после чего гель переносят на стеклянную
хроматографическую колонку, дают растворителю стечь и переносят на
колонку раствор экстракта В, смывая его из колбы 2-3 раза
небольшим количеством этанола, каждый раз давая растворителю
полностью впитаться в слой геля. Элюируют вещество с колонки
этанолом со скоростью 0,5 куб. см/мин., обеспечивая такой поток
небольшим избыточным давлением тока воздуха или азота, подаваемого
на колонку через насадку со шлифом, заполненную силикагелем и
слоем ваты. Первую фракцию - 50 куб. см этанола отбрасывают,
вторую фракцию - 100 куб. см этанола, содержащую ПАУ с числом
циклов 4-7, собирают, упаривают растворитель и далее анализируют с
помощью ВЭЖХ, низкотемпературной спектрофлуориметрии или
используют для выделения бенз(а)пирена.
3.2.3. Выделение бенз(а)пирена из фракции ПАУ ТСХ на
ацетилированной целлюлозе
Фракцию ПАУ растворяют в 1-1,5 куб. см бензола и наносят
вещество сплошной полосой на пластинку с ацетилированной
целлюлозой размером 20х20 см, подготовленную, как указано в п.
2.3.1., оставляя снизу и с боков пластинки поля шириной 1,5-2,0
см. На стартовую линию бокового поля, отделенного от основного с
помощью скальпеля, наносят в точку 1-2 мкл раствора бенз(а)пирена
с концентрацией 1 мкг/куб. см. Пластинку помещают в
хроматографическую камеру и проводят элюирование в смеси этанол -
ацетон - вода (60:25:15). Камеру предварительно насыщают парами
растворителя в течение 2-3 ч. Когда фронт растворителя достигнет 2
см от верхнего края пластинки, ее вынимают и отмечают зону
бенз(а)пирена в УФ-свете с длиной волны 360 нм. Сорбент из зоны
бенз(а)пирена (которая ниже зоны бенз(k)флуорантрена) собирают с
помощью скальпеля на воронку Шотта и элюируют вещество бензолом
(5х10 куб. см) в круглодонную колбу. Растворитель упаривают до
небольшого объема, остаток отдувают в токе азота, затем добавляют
1 куб. см бензола и анализируют с помощью спектрофлуориметрии при
комнатной температуре.
3.3. Определение ПАУ с помощью ВЭЖХ
Рекомендуемые условия хроматографического разделения и
детектирования ПАУ:
1) колонка Zorbax ODS, 250х4 мм, подвижная фаза ацетонитрил -
вода (84:16), скорость потока 1 куб. см/мин., детектор
флуориметрический, длина волны возбуждающего света 280 нм,
эмиссионного - 405 нм;
2) колонка та же, подвижная фаза метанол - вода (90:10),
скорость потока 1,2 куб. см/мин., детектор спектрофотометрический
при 254 или 290 нм;
3) колонка Supelcosil LC РАН, 150х4,6 мм, подвижная фаза
ацетонитрил - вода (80:20 или 85:15), скорость потока 1 куб.
см/мин., детектор флуориметрический, длина волны возбуждающего
света 300 нм, эмиссионного > 418 нм.
Объем анализируемой пробы определяют экспериментально. Он
составляет не менее 200 мкл, объем вводимой пробы 10-20 мкл.
Расчет содержания компонентов суммы ПАУ (X) в образце проводят
по следующим формулам:
а) по методу абсолютной калибровки:
M x (S - S ) x 1000 x V
ст x xo 1
X = ----------------------------,
S x 0,8 x G x V
ст 2
где:
М - количество компонента, введенного в хроматограф со
ст
стандартным раствором, мкг;
S - площадь пика компонента, введенного со стандартным
ст
раствором;
S - площадь компонента на хроматограмме "холостого опыта";
xo
V - объем раствора пробы, мкл;
1
V - объем раствора пробы, введенной в хроматограф, мкл;
2
S - площадь пика компонента на хроматограмме пробы;
x
G - масса образца, г;
б) по методу внутреннего стандарта (добавка бенз(b)хризена)
M x (S - S ) x 1000 x V
ст x xo 1
X = ----------------------------,
S x G x V
ст 2
где:
М - количество введенного в образец внутреннего стандарта,
ст
мкг;
К - коэффициент пересчета, определяемый экспериментально в
зависимости от выбранных условий детектирования по хроматограмме
стандартной смеси ПАУ, включающей бенз(b)хризен. При длине волны
возбуждающего света 360 нм и эмиссионного > 418 нм этот
коэффициент равен для:
- бенз(b)хризена - 1,00;
- пирена - 42,40;
- бенз(е)пирена - 26,10;
- бенз(b)флуорантена - 0,99;
- бенз(k)флуорантена - 0,30;
- бенз(а)пирена - 3,00;
- бенз(а)антрацена - 19,20.
3.4. Определение ПАУ методом низкотемпературной
спектрофлуориметрии
3.4.1. Определение бенз(а)пирена в сумме ПАУ методом добавки
Фракцию ПАУ, полученную по п. 3.2.2., растворяют в 5-10 куб. см
бензола, из этого раствора в пробирку емкостью 10 куб. см отбирают
1 куб. см и добавляют к нему 2 куб. см н-октана, получая таким
образом раствор с нулевой добавкой бенз(а)пирена.
Спектры люминесценции получают на спектрометре дифракционном
ДФС-12 или ДФС-24, а также на любом спектрофлуориметре с
разрешением не менее 0,3 нм в области 380-450 нм.
При перекрытом потоке УФ-излучения закрепляют пробирку,
опущенную в прозрачный сосуд Дьюара, перед щелью спектрометра;
спустя 2 мин. открывают доступ УФ-излучению к замерзшему раствору.
Регулируя щели спектрометра, добиваются, чтобы интенсивность
сигнала, создаваемого люминесценцией фона при длине волны 401,5
нм, не превышала 20% шкалы. Записывают на спектрометре
спектрограмму люминесценции в области 401,5-410 нм. Наличие в
квазилинейчатом спектре люминесценции раствора фракции ПАУ полос с
максимумом 403,0 нм (более интенсивная) и 408,5 нм (менее
интенсивная) свидетельствует о присутствии бенз(а)пирена в этой
фракции. Запись повторяют не менее двух раз при воспроизводимости
не ниже чем 10% интенсивности сигнала при 403 нм. По интенсивности
в максимуме люминесценции с длиной волны 403 нм в сравнении с
интенсивностью этой линии в спектрах стандартных растворов
бенз(а)пирена, записанных при тех же условиях возбуждения и
регистрации, определяют концентрацию стандартного раствора
бенз(а)пирена для анализа методом добавки. Если интенсивность
линии 403 нм в спектре исследуемого раствора с нулевой добавкой
несравнимо ниже, чем интенсивность этой линии в спектре
стандартного раствора концентрации 1 нг/куб. см, исходный раствор
фракции ПАУ концентрируют до меньшего объема и готовят новый
раствор с нулевой добавкой, а затем повторно регистрируют его
спектр и сравнивают высоту пика на спектрограмме с высотой пика
той же линии в спектре стандарта. Если интенсивность линии 403 нм
в спектре исследуемого раствора выше, чем в спектре стандартного
раствора концентрации 100 нг/куб. см, то исследуемый раствор
разбавляют в таком разведении, чтобы интенсивность линии 403 нм в
получаемом растворе с нулевой добавкой не превышала интенсивности
этой линии, даваемой указанным выше стандартным раствором.
Для определения концентрации исследуемого раствора далее
готовят пробу с добавкой, соответствующей концентрации нулевого
раствора. Для этого в пробирку на 10 куб. см вносят 1 куб. см
исследуемого раствора в том же разведении, что и раствора с
нулевой добавкой, а также 1 куб. см н-октана и 1 куб. см
стандартного раствора с концентрацией, выбранной по результатам
предварительной оценки, в диапазоне 0,1-100 нг/куб. см. Записывают
спектрограмму исследуемого раствора с добавкой, как описано выше.
При правильном выборе концентрации раствора-добавки высоты пиков
полосы 403 нм исследуемого раствора и раствора с нулевой добавкой
должны быть сравнимыми, при этом высота пика раствора с нулевой
добавкой должна быть достоверно ниже. Если высота пика на
спектрограмме раствора с добавкой на порядок выше, чем у раствора
с нулевой добавкой, приготавливают новый раствор с добавкой
меньшей концентрации. Если высоты пиков сравнимы для обоих
растворов, в качестве добавки используется стандартный раствор
большей концентрации (но не выше 100 нг/куб. см). Если высота пика
на спектрограмме раствора с добавкой неизмеримо ниже высоты той же
линии в спектре стандартного раствора той же концентрации, то это
может быть связано с гашением люминесценции примесями. В этом
случае раствор разбавляют н-октаном в 10-100 раз и повторяют
запись спектров растворов с нулевой добавкой и с добавкой
стандартного раствора соответствующей концентрации.
Измеряют на спектрограмме высоту спектральной линии в
максимуме при 403 нм над уровнем фона, создаваемого люминесценцией
примесей при 401,5 нм в растворе с нулевой добавкой (Y
0
абсолютная) и высоту фона при той же длине волны над уровнем
темнового тока (Y абсолютная) и вычисляют отношение:
0 фона
Y абсолютная
0
Y' = ------------------,
0 Y абсолютная
0 фона
где Y' - относительная интенсивность аналитической линии в
0
растворе с 0-добавкой.
Аналогично вычисляют Y" для повторной спектрограммы раствора
0
с нулевой добавкой и находят:
Y' + Y"
0 0
Y = -------.
0 2
Измеряют на спектрограмме высоту спектральной линии в
максимуме при 403 нм над уровнем фона при 401,5 нм в растворе с
концентрацией С0 (Y абсолютная) и высоту фона при 401,5 нм над
1
уровнем темнового тока (Y абсолютная) и вычисляют отношение
1 фона
этих величин:
Y абсолютная
1
Y' = ------------------,
0 Y абсолютная
1 фона
где Y - относительная интенсивность аналитической линии
1
раствора с добавкой С концентрацией C .
0
Аналогично вычисляют Y" для повторной спектрограммы этого
1
раствора и находят среднее значение:
Y' + Y"
1 1
Y = -------.
1 2
Вычисляют концентрацию бенз(а)пирена в исследуемой фракции по
формуле:
Y x C
0 0
C = ------- (г/куб. см).
x Y - Y
1 0
Вычисляют содержание бенз(а)пирена (X) в образце по формуле:
6
С х V х 1000 х n х 10
x 1
X = ------------------------, мкг/кг,
G x 0,8
где:
V - объем раствора фракции в бензоле, куб. см;
1
n - степень разбавления раствора (n = 1, если фракцию не
разбавляют и не концентрируют для окончательного анализа);
0,8 - поправка на полноту извлечения;
G - масса образца, г.
3.4.2. Определение компонентов фракции ПАУ
Для количественного определения во фракции ПАУ 17 наиболее
часто исследуемых соединений последовательно записывают спектры
люминесценции раствора ПАУ при селективных для каждого из этих ПАУ
длинах волн возбуждающего и эмиссионного света, приведенных в
табл. 57.
Таблица 57
СПЕКТРЫ ЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ ПАУ
-----------------T------T------T-------------------T------T------¬
¦ Соединение ¦лямбда¦лямбда¦ Соединение ¦лямбда¦лямбда¦
¦ ¦в ¦эм ¦ ¦в ¦эм ¦
+----------------+------+------+-------------------+------+------+
¦Пирен ¦ 338 ¦ 372 ¦бенз(k)флуорантен ¦ 310 ¦ 403 ¦
+----------------+------+------+-------------------+------+------+
¦бенз(а)пирен ¦ 298 ¦ 403 ¦дибенз(а,h)пирен ¦ 313 ¦ 448 ¦
+----------------+------+------+-------------------+------+------+
¦Коронен ¦ 307 ¦ 444 ¦бенз(е)пирен ¦ 334 ¦ 388 ¦
+----------------+------+------+-------------------+------+------+
¦Фенантрен ¦ 255 ¦ 347 ¦бенз(g,h,i)перилен ¦ 303 ¦ 420 ¦
+----------------+------+------+-------------------+------+------+
¦Перилен ¦ 414 ¦ 444 ¦флоурантен ¦ 362 ¦ 436 ¦
+----------------+------+------+-------------------+------+------+
¦дибенз(а,h)ан- ¦ 301 ¦ 394 ¦бенз(b)флуорантен ¦ 304 ¦ 392 ¦
¦трацен ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+----------------+------+------+-------------------+------+------+
¦Хризен ¦ 272 ¦ 361 ¦дибенз(а,с)антрацен¦ 291 ¦ 375 ¦
+----------------+------+------+-------------------+------+------+
¦Инденопирен ¦ 362 ¦ 463 ¦дибенз(а,i)пирен ¦ 398 ¦ 431 ¦
+----------------+------+------+-------------------+------+------+
¦бенз(а)антрацен ¦ 292 ¦ 384 ¦ ¦ ¦ ¦
L----------------+------+------+-------------------+------+-------
При этом для каждого из 17 ПАУ готовят из исходного раствора
фракции ПАУ серию из трех рабочих растворов, содержащих по 0,1
куб. см исходного раствора, соответственно 0,1, 0,05 и 0,00 куб.
см н-октана и 0,00, 0,05 и 0,1 куб. см эталонного раствора
определяемого соединения с концентрацией, выбранной в зависимости
от ориентировочно найденной его концентрации в исследуемом
растворе. Для бенз(а)пирена диапазон концентраций эталонного
раствора составляет 1-100 нг/куб. см, для перилена - 1-10 нг/куб.
см, для остальных ПАУ - 1-1000 нг/куб. см. На полученных
спектрограммах замеряют высоты спектральных линий в максимумах
аналитических длин волн, приведенных в табл. 57, и определяют
относительную интенсивность аналитических линий (аналогично п.
3.4.1.). Расчет содержания компонентов фракции ПАУ в образце
проводят по формуле, приведенной в разделе 3.4.1.
3.5. Определение бенз(а)пирена методом спектрофлуориметрии
при комнатной температуре
Фракцию бенз(а)пирена, выделенную согласно п. 3.2.3.,
растворяют в 1 куб. см бензола. В качестве раствора сравнения
используют раствор, получаемый при добавлении 50-200 нг
бенз(а)пирена к "холостому опыту" и разведенный в 1 куб. см
бензола. Записывают спектры флуоресценции этих растворов при длине
волны возбуждающего света 388 нм в области 400-450 нм так, чтобы
интенсивность в максимуме пика при 403-406 нм была не менее 25% и
не более 90% шкалы. При необходимости изменяют разведение
растворов и чувствительность прибора и снова записывают спектры в
одном и том же режиме и при одинаковом разведении растворов.
Содержание бенз(а)пирена (X) в образце (мкг/кг) рассчитывают по
следующей формуле:
Y х С х 1000 х V
x
Х = -----------------,
Y x G x 0,75
ст
где:
С - концентрация раствора стандарта, мкг/куб. см;
Y - интенсивность флуоресценции раствора пробы;
x
Y - интенсивность флуоресценции раствора сравнения;
ст
V - объем пробы, куб. см;
G - масса образца, г;
0,75 - поправка на полноту извлечения.
4. Метрологические характеристики
Относительное допустимое расхождение между результатами двух
параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, по
отношению к среднему арифметическому значению (Rr) и относительное
допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в
двух разных лабораториях, по отношению к среднему арифметическому
значению (RR), а также предел определения, по данным авторов
методики, приведены в табл. 58.
Таблица 58
ОТНОСИТЕЛЬНЫЕ ДОПУСТИМЫЕ ВНУТРИЛАБОРАТОРНЫЕ (Rr)
И МЕЖЛАБОРАТОРНЫЕ (RR) РАСХОЖДЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
И ВЕЛИЧИНА ПРЕДЕЛА ОПРЕДЕЛЕНИЯ
------------------T------------------T-------------T------T------¬
¦ Определяемый ¦ Метод анализа ¦ Предел ¦Rr, % ¦RR, % ¦
¦ показатель ¦ ¦определения, ¦ ¦ ¦
¦ ¦ ¦ мкг/кг ¦ ¦ ¦
+-----------------+------------------+-------------+------+------+
¦ ¦ ¦ 1 ¦ ¦ ¦
¦Полициклические ¦ВЭЖХ с ¦ 0,2 - 2 ¦ 60 ¦ 100 ¦
¦ароматические ¦флуоресцентным ¦ ¦ ¦ ¦
¦углеводороды ¦детектором ¦ ¦ ¦ ¦
¦(индивидуальные ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦соединения) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-----------------+------------------+-------------+------+------+
¦ ¦ ¦ 1 ¦ ¦ ¦
¦ ¦Низкотемпературный¦ 0,1 - 1 ¦ 45 ¦ 90 ¦
¦ ¦люминесцентный ¦ ¦ ¦ ¦
+-----------------+------------------+-------------+------+------+
¦Бенз(а)пирен ¦Спектрофлуори- ¦ 0,1 ¦ 45 ¦ 90 ¦
¦ ¦метрический ¦ ¦ ¦ ¦
L-----------------+------------------+-------------+------+-------
VI. Показатели окислительной порчи масел
1. Перекисное число
Метод основан на реакции взаимодействия продуктов окисления
растительных масел и животных жиров (перекисей и гидроперекисей) с
йодистым калием в растворе уксусной кислоты и хлороформа с
последующим количественным определением выделившегося йода
раствором тиосульфата натрия титрометрическим методом по ГОСТ Р
(ИСО 3960-1998).
Специфические приборы и реактивы
Весы лабораторные по ГОСТ 24104 2-го класса точности с
наибольшим пределом взвешивания 200 г.
Колбы Кн-I-250-29/32 ТСХ по ГОСТ 25336.
Колба I (2)-1000-2 по ГОСТ 1770.
Стаканчики стеклянные цилиндрические для испытуемой пробы.
Бюретки 1-1(2,3), 3-1(2)-5-0,02; 1-1(2,3)-1(2)-10-0,05 по ГОСТ
29251.
Пипетки 2-2-1(2)-1 по ГОСТ 29297.
Цилиндры 1(3)-25, 1(3)-100 по ГОСТ 1770.
Кислота уксусная по ГОСТ 61, х.ч., ледяная, не содержащая
кислорода.
Хлороформ по ГОСТ 20015 свежеперегнанный, не содержащий
кислорода.
Калий йодистый.
Натрий серноватистокислый (тиосульфат натрия).
Стандарт-титры тиосульфата натрия 0,1 г-моль.
Крахмал растворимый.
Вода дистиллированная.
Проведение испытания
Готовят раствор крахмала: 5 г растворимого крахмала смешивают с
30 куб. см воды, добавляют 1000 куб. см кипящей воды и кипятят в
течение 3 мин.
Готовят раствор тиосульфата натрия из стандарт-титров (1 ампула
на 1 куб. дм дистиллированной воды). Для получения раствора
тиосульфата натрия необходимых молярных концентраций 0,002
моль/куб. дм и 0,01 моль/куб. дм раствор разбавляют в 50 и 10 раз
соответственно. Разбавление проводят непосредственно перед
использованием.
Раствор йодистого калия хранят в темном сосуде. Для
приготовления 50%-ного раствора KJ нужно 12,5 г поместить в колбу
на 25 куб. см и долить до метки дистиллированной водой.
В колбу со взвешенной пробой приливают 10 куб. см хлороформа,
быстро растворяют пробу, приливают 15 куб. см уксусной кислоты и 1
куб. см 50%-ного раствора йодистого калия, после чего колбу
закрывают, перемешивают содержимое в течение 1 мин. и оставляют на
20 мин. в темном месте. Приливают в колбу 75 куб. см воды,
перемешивают и добавляют раствор крахмала до появления слабой
однородной фиолетово-синей окраски. Выделившийся йод титруют
раствором тиосульфата натрия до молочно-белой окраски, устойчивой
в течение 5 сек.
Выполняют контрольное определение параллельно с основным
определением.
Обработка результатов
Перекисное число вычисляют по формуле:
c
X = 1000 х (V - V ) х -, ммоль акт. кислорода/кг,
0 m
где:
V - объем раствора тиосульфата натрия, использованный при
определении, куб. см;
V - объем раствора тиосульфата натрия, использованный при
0
контрольном определении;
С - действительная концентрация использованного раствора
тиосульфата натрия, вычисленная с учетом поправки к номинальной
концентрации;
m - масса испытуемой пробы, г.
За определение принимают среднее арифметическое значение
результатов двух параллельных определений.
Расхождение между результатами двух независимых единичных
определений, выполненных при использовании одного метода, не
должно превышать 10% от среднего значения перекисного числа для
перекисных чисел менее 3 ммоль акт. кислорода/кг.
2. Кислотное число
Метод основан на реакции нейтрализации свободных жирных кислот,
содержащихся в маслах (ГОСТ 5476-64).
Специфические приборы и реактивы
Колбы конические вместимостью 250 мл по ГОСТ 10394-63.
Бюретки вместимостью 25 и 50 мл с делениями 0,1 мл по ГОСТ 1770-
64.
Микробюретки вместимостью 2 мл с делениями 0,01 мм.
Весы технические.
Баня водяная.
Фенолфталеин, 1%-ный спиртовой раствор.
Кали едкое, 0,1Н водный раствор.
Эфир этиловый.
Спирт этиловый технический.
Проведение испытания
В коническую колбу на технических весах отвешивают 3-5 г
испытуемого масла, приливают 50 куб. см нейтрализованной смеси
(спирта с этиловым эфиром) и взбалтывают. Полученный раствор при
взбалтывании быстро титруют 0,1Н раствором едкого кали до
получения слабо-розовой окраски, устойчивой в течение 30 сек.
Обработка результатов
Кислотное число испытуемого масла (X) в мг вычисляют по
формуле:
KV
X = 5,61 х --,
G
где:
V - объем 0,1 н раствора едкого кали или едкого натра,
израсходованного на титрование, в куб. см;
К - поправка к титру 0,1 н раствора едкого кали или едкого
натра;
G - навеска испытуемого масла;
5,611 - постоянный множитель, независимо от применяемой щелочи.
Конечный результат выражается как среднее арифметическое между
двумя параллельными определениями: при испытании масел не более
0,06 мг.
Приложение N 1
РАСЧЕТ
МЕТРОЛОГИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК МЕТОДОВ И ВНУТРЕННИЙ
ОПЕРАТИВНЫЙ КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА РЕЗУЛЬТАТОВ
Воспроизводимость (точность) - разброс относительно среднего
результата, оценивают по отношению среднеквадратичного
(стандартного) отклонения (sr) к среднему значению, выраженному в
процентах. Правильность оценивают по измерению известного
количества вещества в пробе и выражают в процентах. Сходимость -
допустимое расхождение параллельных измерений при Р = 0,95,
вычисляют по формуле 2,8 x sr.
Относительная сходимость - отношение сходимости к среднему
арифметическому значению параллельных измерений, выраженное в
процентах.
Внутренний оперативный контроль качества результатов
контрольного химического анализа (сходимость, воспроизводимость,
точность) осуществляют с целью получения оперативной информации о
качестве анализов и принятия при необходимости оперативных мер по
его повышению (МИ 2335-95). Образцами для оперативного контроля
воспроизводимости являются представительные пробы экстрактов
(гидролизатов). Отбирают две пробы и каждую из них анализируют в
точном соответствии с прописью методики, максимально варьируя
условия проведения анализа, т.е. получают 2 результата анализа,
используя разные наборы мерной посуды, разные партии реактивов.
Результаты контроля признаются удовлетворительными, если
выполняется условие:
_ _ _
|X - X | <= 0,01 х D х Х,
1 2
где:
_
X - результат анализа рабочей пробы, мкг/куб. см;
1
_
X - результат анализа этой же пробы, полученный другим
2
аналитиком с использованием другой мерной посуды и другой партии
реактивов, мкг/куб. см;
_
X - среднее значение результатов двух анализов, мкг/куб. см;
D - допустимые расхождения между результатами анализа одной и
той же пробы, соответствующие относительной сходимости каждого
метода.
Образцами для оперативного контроля точности являются
представительные пробы экстрактов (гидролизатов), к которым
делаются добавки определяемого вещества в виде раствора. Отбирают
две пробы и к одной из них делают добавку в виде раствора таким
образом, чтобы его содержание увеличилось по сравнению с исходным
на 50-150%. Каждую пробу анализируют в точном соответствии с
прописью методики и получают результат анализа исходной рабочей
пробы X и рабочей пробы с добавкой X'. Результаты анализа исходной
рабочей пробы X и рабочей пробы с добавкой X' получают не по
возможности, а в одинаковых условиях, т.е. их получает один
аналитик с использованием одного набора мерной посуды, одной
партии реактивов.
Результаты контроля признаются удовлетворительными, если
выполняется условие:
|Х' - Х - С| < К ,
д
где:
С - добавка к пробе в виде раствора концентрацией, мкг/куб.
см;
К - норматив оперативного контроля погрешности, мкг/куб. см.
д
При внешнем контроле (Р = 0,95) принимают:
_________________
/ 2 2
Kд = \/ДЕЛЬТА + ДЕЛЬТА ,
x' x
где:
2 2
ДЕЛЬТА и ДЕЛЬТА - характеристики погрешностей для исходной
x' х
пробы и пробы с добавкой, мкг/куб. см.
ДЕЛЬТА x' = 0,165 x X' и ДЕЛЬТА x = 0,165 x X.
При внутрилабораторном контроле (Р = 0,90) принимают:
К' = 0,84 x К .
д д
При превышении оперативного контроля погрешности эксперимент
|
