|
Стр. 5
+------------------+--------+------------------+-------+---------+
¦Ликопин ¦ гексан ¦ 474 ¦ 3470 ¦ [3] ¦
+------------------+--------+------------------+-------+---------+
¦бета-криптоксантин¦ гексан ¦ 451 ¦ 2460 ¦ [3] ¦
+------------------+--------+------------------+-------+---------+
¦Зеаксантин ¦ этанол ¦ 452 ¦ 2480 ¦ [3] ¦
+------------------+--------+------------------+-------+---------+
¦Лютеин ¦ этанол ¦ 447 ¦ 2560 ¦ [3] ¦
L------------------+--------+------------------+-------+----------
Градуировка прибора
Градуировка хроматографической системы проводится с целью
убедиться, что область определяемых концентраций лежит в пределах
линейного участка градуировочного графика, построенного по
площадям (высотам) пиков. Она проводится в следующих случаях:
- на этапе освоения методики;
- при смене колонки и/или предколонки;
- при замене стандартного образца;
- в других случаях, когда есть основания полагать, что
изменилась эффективность хроматографической системы или
чувствительность детектора.
Градуировку хроматографа проводят строя градуировочный график
по серии градуировочных растворов. Аналитический сигнал (площадь,
кв. мм, или высота пика, мм) фиксируют на интеграторе или
самописце, соблюдая условия и продолжительность
хроматографического разделения и детектирования (табл. 12).
Таблица 12
УСЛОВИЯ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ ВИТАМИНОВ А, Е И КАРОТИНОИДОВ
-------------T---------------------------------------------------¬
¦ Детектор ¦ Условия детектирования ¦
¦ +-------------T-------------------------T-----------+
¦ ¦ витамины ¦ длина волны ¦продолжи- ¦
¦ ¦(каротиноиды)¦ детектирования ¦тельность, ¦
¦ ¦ ¦ ¦мин. ¦
+------------+-------------+-------------------------+-----------+
¦Флуориметри-¦Витамин А ¦лямбда = 325 нм ¦ 0-6 ¦
¦ческий ¦ ¦ возб. ¦ ¦
¦ ¦ ¦лямбда = 480 нм ¦ ¦
¦ ¦ ¦ эмисс. ¦ ¦
¦ +-------------+-------------------------+-----------+
¦ ¦Витамин Е ¦лямбда = 295 нм ¦ 6,1-16 ¦
¦ ¦ ¦ возб. ¦ ¦
¦ ¦ ¦лямбда = 330 нм ¦ ¦
¦ ¦ ¦ эмисс. ¦ ¦
+------------+-------------+-------------------------+-----------+
¦Спектро- ¦Каротиноиды ¦лямбда = 450 нм ¦ 0-30 ¦
¦фотометри- ¦ ¦ ¦ ¦
¦ческий ¦ ¦ ¦ ¦
L------------+-------------+-------------------------+------------
Ориентировочные времена удерживания и последовательность выхода
витаминов из хроматографической колонки: ретинол - 4,0-4,5 мин.,
альфа-токоферол - 10,5-11,0 мин. (флуориметрическое
детектирование), бета-каротин > альфа-каротин > ликопин > бета-
криптоксантин > лютеин > зеаксантин (спектрофотометрическое
детектирование).
Градуировочный график строят в координатах "аналитический
сигнал" - "концентрация витамина в градуировочном растворе,
мкг/куб. см". Для каждого анализируемого раствора проводят два
параллельных измерения и находят среднее арифметическое. Различие
между измеренными значениями аналитических сигналов и времен
удерживания не должно превышать 5% от средних значений. Линейные
участки градуировочного графика должны соответствовать всему
диапазону определяемых концентраций микронутриентов. Коэффициент
градуировочного графика (k ) определяют как среднее
гр
арифметическое значение коэффициентов k , вычисляемых по формуле:
i
С
i
k = --,
i S
i
где:
С - массовая концентрация микронутриентов в градуировочном
i
растворе, мкг/куб. см;
S - площадь (высота) аналитического сигнала.
i
Описание хроматографической системы
Подготовку к работе хроматографической системы, состоящей из
последовательно соединенных насоса высокого давления,
спектрофотометрического и флуориметрического детекторов и
интеграторов, проводят в соответствии с руководством по
эксплуатации.
Используется система для ВЭЖХ следующей конфигурации:
- аналитическая хроматографическая колонка (типа картридж
"Элсикарт" фирмы "Элсико", Россия) из нержавеющей стали длиной 150
мм, внутренним диаметром 4 мм, с обращеннофазным сорбентом,
например Нуклеосил 100 С18, зернением 5 мкм или другим,
аналогичным по свойствам, с эффективностью по бета-каротину не
ниже 5000 теоретических тарелок;
- предколонка из нержавеющей стали длиной 50 мм, внутренним
диаметром 4 мм, с сорбентом типа "Нуклеосил" 100 С18, 7 мкм или
аналогичным по свойствам;
- петлевой кран-дозатор (инжектор ввода пробы типа "Реодайн
7125", США) с рабочим объемом петли 50 куб. мм;
- объемная скорость подачи подвижной фазы - 0,6 куб. см/мин.
Подготовка пробы к анализу
Подготовка проб к анализу производится непосредственно перед
анализом. Взвешивают не менее 10 таблеток (драже, порошкообразное
содержимое капсул) и определяют вес одной штуки, затем материал
тщательно растирают и перемешивают в фарфоровой ступке. Точную
навеску анализируемого материала m, г (0,05-0,20 г), помещают в
плоскодонную колбу вместимостью 100 куб. см, добавляют 15 куб. см
воды и нагревают на водяной бане при температуре от 60 град. C до
70 град. C при перемешивании в течение 5 мин. Затем прибавляют
30 куб. см этилового спирта, 0,1 г аскорбиновой кислоты, 3 куб.
см 50%-ного раствора гидроокиси калия и нагревают в течение 30
мин. на водяной бане с обратным холодильником при температуре
кипения смеси. Содержимое колбы быстро охлаждают до комнатной
температуры, количественно переносят в делительную воронку и
экстрагируют неомыляемые вещества 150 куб. см гексана (3 раза по
50 куб. см) в течение двух минут. Объединенные гексановые
экстракты промывают водой по 50 куб. см до исчезновения щелочной
реакции промывных вод (по универсальной индикаторной бумаге).
Промытые гексановые экстракты количественно переносят в колбу
объемом V (200 куб. см) и доводят объем раствора до метки тем же
1
растворителем. Аликвоту V (2 куб. см) полученного раствора
2
переносят в мерную пробирку на 10 куб. см, упаривают в токе
азота, сухой остаток растворяют в точно измеренном объеме V
3
(1 куб. см) подвижной фазы.
Измерение концентрации витаминов и каротиноидов
в экстракте пробы
Полученный раствор анализируют дважды с помощью
хроматографической системы.
Идентификацию пиков проводят сопоставляя времена удерживания и
спектральные отношения с временами удерживания и спектральными
отношениями растворов соответствующих стандартов (табл. 13).
Таблица 13
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПИКОВ ВИТАМИНОВ И КАРОТИНОИДОВ
--------------T-------T---------------T----------------T---------¬
¦ Витамин ¦Время ¦Условия детек- ¦Условия детек- ¦Соотноше-¦
¦ ¦удержи-¦тирования - 1 ¦тирования - 2 ¦ния ана- ¦
¦ ¦вания, ¦ ¦ ¦литичес- ¦
¦ ¦мин. ¦ ¦ ¦ких сиг- ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦налов ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦(1:2) ¦
+-------------+-------+---------------+----------------+---------+
¦Ретинол ¦4,0-4,5¦лямбда = ¦лямбда = ¦ 1,2-1,3 ¦
¦ ¦ ¦ возб. ¦ возб. ¦ ¦
¦ ¦ ¦325 нм ¦340 нм ¦ ¦
¦ ¦ ¦лямбда = ¦лямбда = ¦ ¦
¦ ¦ ¦ эмисс. ¦ эмисс. ¦ ¦
¦ ¦ ¦480 нм ¦95 нм ¦ ¦
+-------------+-------+---------------+----------------+---------+
¦альфа- ¦10,5- ¦лямбда = ¦лямбда = ¦ 1,9-2,0 ¦
¦токоферол ¦11,0 ¦ возб. ¦ возб. ¦ ¦
¦ ¦ ¦295 нм ¦305 нм ¦ ¦
¦ ¦ ¦лямбда = ¦лямбда = ¦ ¦
¦ ¦ ¦ эмисс. ¦ эмисс. ¦ ¦
¦ ¦ ¦330 нм ¦340 нм ¦ ¦
+-------------+-------+---------------+----------------+---------+
¦бета-каротин ¦ 28-30 ¦450 нм ¦470 нм ¦ 1,1-1,2 ¦
+-------------+-------+---------------+----------------+---------+
¦альфа-каротин¦ 24-26 ¦450 нм ¦470 нм ¦ 1,2-1,3 ¦
+-------------+-------+---------------+----------------+---------+
¦Ликопин ¦ 17-18 ¦450 нм ¦470 нм ¦ 0,7-0,8 ¦
+-------------+-------+---------------+----------------+---------+
¦бета- ¦ 11-12 ¦450 нм ¦480 нм ¦ 1,0-1,1 ¦
¦криптоксантин¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-------------+-------+---------------+----------------+---------+
¦Лютеин ¦5,0-5,5¦450 нм ¦480 нм ¦ 1,2-1,3 ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-------------+-------+---------------+----------------+---------+
¦Зеаксантин ¦5,6-6,5¦450 нм ¦480 нм ¦ 1,2-1,3 ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
L-------------+-------+---------------+----------------+----------
Концентрацию витаминов и бета-каротина в растворе пробы (С ,
пр
мкг/куб. см) определяют по формуле:
C = k x S ,
пр гр пр
где:
S - площадь (высота) пика витамина или каротиноида в
пр
растворе пробы;
k - коэффициент градуировочного графика.
гр
За окончательный результат определения концентрации
микронутриентов в растворе пробы принимают среднее арифметическое
результатов параллельных измерений, допускаемое относительное
расхождение между которыми не должно превышать 5% от среднего
значения.
Представление результатов
Содержание микронутриентов (X), выраженное в мг на 1 г пищевой
добавки, рассчитывают по формуле:
0,001 x С x V x V
пр 1 3
Х = ---------------------,
V x m
2
где С - концентрация витамина или каротиноида в
пр
анализируемом растворе (мкг/куб. см); коэффициент 0,001 учитывает
пересчет содержания витаминов и бета-каротина в мг.
Минимально детектируемое количество ретинола и альфа-токоферола
- 0,1 мкг/мл, каротиноидов - 0,05 мкг/мл.
Погрешность измерения вычисляется по формуле:
дельта x X
ДЕЛЬТА = ----------,
100
где дельта - характеристика погрешности измерений (п. 2), %.
Контроль погрешности результатов измерений
Для контроля погрешности результатов измерений массовой
концентрации витаминов А, Е и бета-каротина с помощью ВЭЖХ
используют метод добавок.
Производят измерение концентрации витаминов и бета-каротина в
экстракте пробы в соответствии с п. 5.7.(С , мкг/куб. см), а
пр
затем с введенной в него добавкой (С , мкг/куб. см), который также
д
анализируют (С', мкг/куб. см). Величину добавки выбирают таким
образом, чтобы концентрация микронутриентов в экстракте
увеличилась на 50-150%. Для добавки используют градуировочные
растворы микронутриентов.
Результаты контроля считают удовлетворительными, если
выполняется условие:
|С' - С - С | <= 0,01 x C x К ,
пр д д д
где:
К - норматив оперативного контроля погрешности, составляющий
д
15%;
С - расчетное значение величины добавки, мкг/куб. см.
д
При превышении норматива оперативного контроля погрешности
эксперимент повторяют, выясняют причины, приводящие к
неудовлетворительным результатам контроля, и устраняют их.
2. Определение витамина В-6 (пиридоксина) в БАД
Сущность метода
В биологически активных добавках витамин В-6 содержится в
основном в виде пиридоксина гидрохлорида, действующим началом
которого выступает пиридоксин (витамин В-6). Пиридоксин определяют
методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в
обращеннофазовом ион-парном варианте в изократическом режиме со
спектрофлуориметрическим детектированием. Массовую концентрацию
пиридоксина определяют по площади (высоте) пика при
соответствующих пиридоксину длинах волн флуориметрического
детектирования после введения в хроматографическую систему
анализируемых проб и градуировочных растворов.
Характеристика погрешности измерений
Настоящая методика измерений массовой концентрации пиридоксина
в биологически активных добавках с вероятностью 0,95 обеспечивает
выполнение анализа с погрешностями +/- 15% во всем диапазоне
измерений.
Описание хроматографической системы
Система для ВЭЖХ с спектрофлуориметрическим детектором с
монохроматорами на линии возбуждения и эмиссии (или набором
соответствующих фильтров в интервале длин волн от 220-650 нм) и
аналитической хроматографической колонкой из нержавеющей стали
длиной 150 мм и 250 мм, внутренним диаметром 4 мм и 4,6 мм, с
обращеннофазовым сорбентом типа Нуклеосил 100 С18, зернением 5 мкм
или другим сорбентом, аналогичным по свойствам, с эффективностью
по пиридоксину не ниже 8000 теоретических тарелок. (США) Р7949.
Подготовка к выполнению измерений
Условие выполнения измерений и подготовки проб
Для предотвращения разрушения пиридоксина под действием света
подготовку проб и приготовление стандартных растворов пиридоксина
проводят в посуде темного стекла либо обернув колбочки темной
бумагой.
Приготовление растворов
Приготовление раствора соляной кислоты с молярной концентрацией
0,1 М.
К дистиллированной воде добавляют 4 куб. см концентрированной
соляной кислоты (ро = 1,19 г/куб. см), объем доводят до 500 куб.
см.
Раствор фосфорной кислоты с массовой долей 30%.
41,3 г 85%-ной фосфорной кислоты (ро = 1,698 г/куб. см)
растворяют в дистиллированной воде, доводят объем до 100 куб. см.
Приготовление 0,03 М калий фосфатного буфера, pH 3,0.
4,08 г дигидроортофосфата калия растворяют в 500 куб. см
дистиллированной воды, доводят pH потенциометрически с помощью
раствора фосфорной кислоты с массовой долей 30% до значения 3,0 и
объем доводят до 1000 куб. см.
Экстрагирующая смесь для гидролиза капсул с содержимым на
жировой основе.
40 г винной кислоты растворяют в 800 куб. см дистиллированной
воды, добавляют 1 г Твина-80, объем доводят до 1000 куб. см.
Подвижная фаза для ВЭЖХ.
В мерную колбу вместимостью 500 куб. см добавляют 100-150 куб.
см 0,03 М калий фосфатного буфера, 20 куб. см ацетонитрила, 326 мг
гептилсульфоната натрия и доводят объем до метки фосфатным
буфером. Раствор тщательно перемешивают и дегазируют на УЗ-бане в
течение 10 мин.
Количественное определение пиридоксина (витамина В-6)
Количественное определение пиридоксина проводят методом
абсолютной калибровки, определяя градуировочный коэффициент. Для
определения градуировочного коэффициента готовят серию
калибровочных растворов (не менее 5) с концентрациями пиридоксина
в интервале от 0,01 до 0,200 мкг/куб. см.
Приготовление градуировочных растворов пиридоксина
Приготовление стандартного раствора пиридоксина гидрохлорида с
концентрацией пиридоксина 500 мкг/куб. см
Точную навеску 61 мг пиридоксина гидрохлорида количественно
переносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см, растворяют в
0,1 М растворе соляной кислоты и доводят объем этим же раствором
до метки. Содержимое колбы тщательно перемешивают. Концентрацию
пиридоксина уточняют спектрофотометрически по коэффициенту
-1 -1
молярной экстинкции, равному 7000 М х см в 0,1 М растворе
едкого натра при длине волны 308 нм [2]. Данный раствор можно
хранить в холодильнике в течение 3 мес.
Градуировочные растворы пиридоксина готовят непосредственно
перед определением. После введения в колбу вместимостью 100 куб.
см аликвоты 1 куб. см приготовленного стандартного раствора объем
доводят дистиллированной водой в мерной колбе до 100 куб. см и
получают раствор с концентрацией 5 мкг/куб. см. Для приготовления
градуировочных растворов в мерные колбы вместимостью 100 куб. см
помещают аликвоты раствора пиридоксина с концентрацией 5 мкг/куб.
см (0,2; 0,6; 1,0; 4,0 куб. см) и доводят объемы до метки
дистиллированной водой.
Градуировка прибора
Градуировку хроматографа проводят путем построения
градуировочных графиков по серии градуировочных растворов
стандартных растворов пиридоксина, приготовленных по п. 5.1.
Аналитический сигнал (площадь в кв. мм или высота пика в мм)
фиксируют на интеграторе или самописце при длине волны возбуждения
290 нм, эмиссии 395 нм. Ориентировочное время удерживания на
хроматографической колонке 15,0-15,6 мин.
Градуировочный график строят в координатах "аналитический
сигнал" - "концентрация пиридоксина в градуировочном растворе,
мкг/куб. см". Для каждого анализируемого раствора проводят два
параллельных измерения и находят среднее арифметическое. Различие
между измеренными значениями аналитических сигналов и времени
удержания не должно превышать 5% от средних значений. Линейные
участки градуировочного графика должны соответствовать всему
диапазону определяемых концентраций пиридоксина. Коэффициент
градуировочного графика (k ) определяют как среднее
гр
арифметическое значение коэффициентов k , вычисляемых по формуле:
i
C
i
k = --,
i S
i
где:
С - массовая концентрация пиридоксина в градуировочном
i
растворе, мкг/куб. см;
S - площадь (высота) аналитического сигнала.
i
Подготовка проб к анализу
Подготовка проб проводится непосредственно перед анализом.
Таблетки или драже
Взвешивают не менее 10 таблеток (драже) и определяют вес одной
(одного) таблетки (драже), затем материал тщательно растирают в
фарфоровой ступке. Точную навеску анализируемого материала m, г
(0,2-1,5 г), помещают в плоскодонную колбу вместимостью 100 куб.
см, добавляют 50 куб. см 0,1 М соляной кислоты, тщательно
перемешивают и кипятят на водяной бане в течение 20 мин.
Капсулы с порошкообразным содержимым
3-5 желатиновых капсул с порошкообразным содержимым помещают в
кислоты и кипятят на водяной бане в течение 20 мин., периодически
помешивая.
Капсулы с содержимым на жировой основе
3-5 капсул с содержимым на жировой основе помещают в
плоскодонную колбу вместимостью 100 куб. см, добавляют 50 куб. см
экстрагирующей смеси и кипятят на водяной бане 30 минут,
перемешивая через каждые 5 мин. Затем пробы охлаждают до комнатной
температуры, помещают на УЗ-баню на 5 мин., доводят экстрагирующей
смесью объем до 50 куб. см и фильтруют через бумажный фильтр.
При необходимости гидролизаты фильтруют через бумажный фильтр.
Измерение концентрации пиридоксина
в экстракте пробы
Перед определением гидролизаты разводят дистиллированной водой
в мерных колбах до концентрации, сопоставимой с концентрацией
пиридоксина в растворах для построения градуировочного графика
(0,03-0,05 мкг/куб. см).
Полученные из экстрактов растворы анализируют дважды с помощью
хроматографической системы, вводя на колонку с помощью крана-
дозатора (петля 0,1 куб. см).
Идентификацию пиков проводят сопоставляя времена удерживания и
спектральное отношение с временами удерживания и спектральными
отношениями стандартного раствора пиридоксина (табл. 14).
Таблица 14
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПИКОВ ПИРИДОКСИНА
---------T-------T------------------T------------------T---------¬
¦Витамин ¦Время ¦ Условия ¦ Условия ¦Соотноше-¦
¦ ¦удержи-¦детектирования - 1¦детектирования - 2¦ние ана- ¦
¦ ¦вания, ¦ ¦ ¦литичес- ¦
¦ ¦мин. ¦ ¦ ¦ких сиг- ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦налов ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦(1:2) ¦
+--------+-------+------------------+------------------+---------+
¦Пиридок-¦15,0- ¦лямбда = ¦лямбда = ¦ 1,11 ¦
¦син ¦15,6 ¦ возб. ¦ возб. ¦ ¦
¦ ¦ ¦290 нм ¦305 нм ¦ ¦
¦ ¦ ¦лямбда = ¦лямбда = ¦ ¦
¦ ¦ ¦ эмисс. ¦ эмисс. ¦ ¦
¦ ¦ ¦395 нм ¦410 нм ¦ ¦
L--------+-------+------------------+------------------+----------
Концентрацию пиридоксина в растворе пробы (С , мкг/куб. см)
пр
определяют по формуле:
C = k х S ,
пр гр пр
где:
S - площадь (высота) пика пиридоксина в растворе пробы;
пр
k - коэффициент градуировочного графика.
гр
За окончательный результат определения концентрации
пиридоксина в растворе пробы принимают среднее арифметическое
результатов параллельных измерений, допускаемое относительное
расхождение между которыми не должно превышать 5% от среднего
значения.
Обработка результатов
Содержание пиридоксина в 1 таблетке (драже) (мг):
k x S x V x k x M
гр пр разв
С = -------------------------,
пр m x 1000
где:
S - площадь (высота) пика пиридоксина в пробе;
пр
k - коэффициент градуировочного графика;
гр
V - первоначальный объем гидролизата, куб. см;
k - конечное разведение гидролизата;
разв
m - навеска таблеток, взятая на анализ;
M - масса таблетки;
1000 - коэффициент пересчета мкг в мг.
Содержание пиридоксина в 1 капсуле (мг):
k x S x V x k
гр пр разв
С = ---------------------,
пр n x 1000
где:
S - площадь (высота) пика пиридоксина в пробе;
пр
k - коэффициент градуировочного графика;
гр
V - первоначальный объем гидролизата, куб. см;
k - конечное разведение гидролизата;
разв
n - количество капсул, взятых на анализ;
1000 - коэффициент пересчета мкг в мг.
Контроль погрешности результатов измерений
Для контроля погрешности результатов измерений массовой
концентрации пиридоксина с помощью ВЭЖХ используют метод добавок в
гидролизат.
Производят измерение концентрации пиридоксина в гидролизате
пробы (С , мкг/куб. см), а затем с введенной в него добавкой (С ,
пр д
мкг/куб. см), который также анализируют (С', мкг/куб. см).
Величину добавки выбирают таким образом, чтобы концентрация
пиридоксина в гидролизате увеличилась на 50-150%. Для добавки
используют калибровочные растворы пиридоксина.
Результаты контроля считают удовлетворительными, если
выполняется условие:
|С' - С - С | <= 0,01 x С x К ,
пр д д д
где:
К - норматив оперативного контроля погрешности (составляет
д
20%);
С - расчетное значение величины добавки, мкг/куб. см.
д
При превышении норматива оперативного контроля погрешности
эксперимент повторяют, выясняют причины, приводящие к
неудовлетворительным результатам контроля, и устраняют их.
Таблица 15
МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕТОДА
-------------------------------T---------------------------------¬
¦Предел обнаружения пиридоксина¦0,005 мкг в 1 куб. см гидролизата¦
+------------------------------+---------------------------------+
¦Воспроизводимость, % ¦ 2,0 ¦
+------------------------------+---------------------------------+
¦Правильность, % ¦ 98,6 ¦
+------------------------------+---------------------------------+
¦Относительная сходимость, % ¦ 5,0 ¦
L------------------------------+----------------------------------
3. Одновременное определение витаминов В-1 и В-2
в БАД методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
Сущность метода
Витамин В-1 (тиамин) под действием красной кровяной соли
превращается в тиохром, который флуоресцирует в щелочной среде. В
данном варианте методики происходит постколоночная дериватизация,
то есть после отделения тиамина от пробы методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в обращеннофазовом ион-парном
варианте в изократическом режиме окисляющий агент смешивается с
выходящим из колонки элюатом и образующийся тиохром детектируется
флуориметрическим методом [1] при соответствующих длинах волн.
Массовую концентрацию рибофлавина определяют по площади (высоте)
пика при соответствующих ему длинах волн, так как это соединение
способно флуоресцировать в нативном состоянии в растворе.
Характеристика погрешности измерений
Настоящая методика измерений массовой концентрации пиридоксина
в биологически активных добавках с вероятностью 0,95 обеспечивает
выполнение анализа с погрешностями +/- 15% во всем диапазоне
измерений.
Описание хроматографической системы
Система для ВЭЖХ со спектрофлуориметрическим детектором с
монохроматорами на линии возбуждения и эмиссии (или набором
соответствующих фильтров в интервале длин волн от 220-650 нм),
двухходовым смесителем, в котором происходит реакция образования
тиохрома из витамина В-1, и аналитической хроматографической
колонкой из нержавеющей стали длиной 150 мм и 250 мм, внутренним
диаметром 4 мм и 4,6 мм, с обращеннофазовым сорбентом типа
Нуклеосил 100 С18, зернением 5 мкм или другим сорбентом,
аналогичным по свойствам, с эффективностью по тиамину и
рибофлавину не ниже 8000 теоретических тарелок.
Подготовка к выполнению измерений
Условие выполнения измерений и подготовки проб
Для предотвращения разрушения рибофлавина и тиамина под
действием света подготовку проб и приготовление их стандартных
растворов, а также растворов гексацианоферрата (III) калия
проводят в посуде темного стекла либо обернув колбочки темной
бумагой.
Приготовление растворов
Приготовление раствора соляной кислоты с молярной концентрацией
0,1 М
К дистиллированной воде добавляют 4 куб. см концентрированной
соляной кислоты (ро = 1,19 г/куб. см), объем доводят до 500 куб.
см.
Экстрагирующая смесь для гидролиза капсул с содержимым на
жировой основе
40 г винной кислоты растворяют в 800 куб. см дистиллированной
воды, добавляют 1 г Твина-80, объем доводят до 1000 куб. см.
3,75 М раствор гидроксида натрия: к 75 г гидроксида натрия
добавить 500 куб. см дистиллированной воды.
0,04 М раствор гексацианоферрата (III) калия: 1,0 г
гексацианоферрата (III) калия растворить в воде в мерной колбе
вместимостью 100 куб. см и довести дистиллированной водой до
метки.
3
1,6 x 10 М щелочной раствор гексацианоферрата (III) калия.
2,0 куб. см раствора с содержанием гексацианоферрата (III)
калия 10 г/1000 мл смешать в мерной колбе вместимостью 50 куб. см
с 3,75 М раствором гидроксида натрия и довести до метки этим же
раствором.
Подвижная фаза для ВЭЖХ
В мерную колбу вместимостью 500 куб. см добавляют примерно 50
куб. см дистиллированной воды, 60 куб. см метанола, 100 мг
гептилсульфоната натрия, 10 куб. см ледяной уксусной кислоты и
доводят объем до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно
перемешивают и дегазируют на УЗ-бане в течение 10 мин.
Количественное определение витаминов В-1 и В-2
Количественное определение витаминов проводят методом
абсолютной калибровки, определяя градуировочный коэффициент. Для
определения градуировочного коэффициента готовят серию
калибровочных растворов (не менее 5) тиамина с концентрациями в
интервале от 0,01 до 0,200 мкг/куб. см, рибофлавина с
концентрациями от 0,02 до 0,100 мкг/мл.
Приготовление градуировочных растворов тиамина
Приготовление стандартного раствора тиамина гидрохлорида с
концентрацией тиамина 1000 мкг/куб. см.
Точную навеску 62,5 мг тиамина гидрохлорида количественно
переносят в мерную колбу вместимостью 50 куб. см, растворяют в 0,1
М растворе соляной кислоты и доводят объем этим же раствором до
метки. Содержимое колбы тщательно перемешивают. Концентрацию
пиридоксина уточняют спектрофотометрически по коэффициенту
-1 -1
молярной экстинкции, равному 14200 М x см в 0,1 М растворе
едкого натра при длине волны 247 нм [2]. Данный раствор можно
хранить в холодильнике в течение 1 мес.
Градуировочные растворы тиамина готовят непосредственно перед
определением. После введения в колбу вместимостью 100 куб. см
аликвоты 1 куб. см приготовленного стандартного раствора объем
доводят дистиллированной водой в мерной колбе до 100 куб. см и
получают раствор с концентрацией 10 мкг/куб. см. Для приготовления
градуировочных растворов в мерные колбы вместимостью 100 куб. см
помещают аликвоты раствора тиамина с концентрацией 10 мкг/куб. см
(0,1; 0,2; 0,5; 1,0; 2,0 куб. см) и доводят объемы до метки
дистиллированной водой.
Приготовление градуировочных растворов
рибофлавина
Приготовление стандартного раствора рибофлавина с концентрацией
рибофлавина 100 мкг/куб. см.
Точную навеску 10,0 мг рибофлавина количественно переносят в
мерную колбу вместимостью 100 куб. см, добавляют примерно 70 куб.
см воды и нагревают в течение 20 мин. до полного растворения,
после охлаждения доводят объем водой до метки. Содержимое колбы
тщательно перемешивают. Концентрацию рибофлавина уточняют
спектрофотометрически по коэффициенту молярной экстинкции, равному
-1 -1
12500 М x см в 0,1 М фосфатном буфере (pH = 7,0) при длине
волны 255 нм [2]. Данный раствор можно хранить в холодильнике в
течение 1 мес.
Градуировочные растворы рибофлавина готовят непосредственно
перед определением. После введения в колбу вместимостью 100 куб.
см аликвоты 1 куб. см приготовленного стандартного раствора объем
доводят дистиллированной водой в мерной колбе до 50 куб. см и
получают раствор с концентрацией 2 мкг/куб. см. Для приготовления
градуировочных растворов в мерные колбы вместимостью 100 куб. см
помещают аликвоты раствора рибофлавина с концентрацией 10 мкг/куб.
см (1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 куб. см) и доводят объемы до метки
дистиллированной водой.
Градуировка прибора
Градуировку хроматографа проводят путем построения
градуировочных графиков по серии градуировочных растворов
стандартных растворов пиридоксина, приготовленных по п. 5.1.-5.2.
Аналитический сигнал (площадь в кв. мм или высота пика в мм)
фиксируют на интеграторе или самописце при длине волны возбуждения
375 нм, эмиссии 435 нм для тиамина и при длине волны возбуждения
450 нм, эмиссии 521 нм для рибофлавина. Ориентировочное время
удерживания на хроматографической колонке 15,0-15,6 мин.
Градуировочный график строят в координатах "аналитический
сигнал" - "концентрация пиридоксина в градуировочном растворе,
мкг/куб. см". Для каждого анализируемого раствора проводят два
параллельных измерения и находят среднее арифметическое. Различие
между измеренными значениями аналитических сигналов и времени
удержания не должно превышать 5% от средних значений. Линейные
участки градуировочного графика должны соответствовать всему
диапазону определяемых концентраций витаминов. Коэффициент
градуировочного графика (k ) определяют как среднее
гр
арифметическое значение коэффициентов k , вычисляемых по формуле:
i
C
i
k = --,
i S
i
где:
С - массовая концентрация витамина в градуировочном растворе,
i
мкг/куб. см;
S - площадь (высота) аналитического сигнала.
i
Подготовка проб к анализу
Подготовка проб проводится непосредственно перед анализом.
Подготовка проб аналогична таковой при определении пиридоксина,
поэтому можно использовать один и тот же гидролизат.
Таблетки или драже
Взвешивают не менее 10 таблеток (драже) и определяют вес одной
(одного) таблетки (драже), затем материал тщательно растирают в
фарфоровой ступке. Точную навеску анализируемого материала m, г
(0,2-1,5 г), помещают в плоскодонную колбу вместимостью 100 куб.
см, добавляют 50 куб. см 0,1 М соляной кислоты, тщательно
перемешивают и кипятят на водяной бане в течение 20 мин. При
необходимости гидролизаты фильтруют через бумажный фильтр.
Капсулы с порошкообразным содержимым
3-5 желатиновых капсул с порошкообразным содержимым помещают в
кислоты и кипятят на водяной бане в течение 20 минут, периодически
помешивая.
Капсулы с содержимым на жировой основе
3-5 капсул с содержимым на жировой основе помещают в
плоскодонную колбу вместимостью 100 куб. см, добавляют 50 куб. см
экстрагирующей смеси и кипятят на водяной бане 30 минут,
перемешивая через каждые 5 мин. Затем пробы охлаждают до комнатной
температуры, помещают на УЗ-баню на 5 мин., доводят экстрагирующей
смесью объем до 50 куб. см и фильтруют через бумажный фильтр.
Измерение концентраций тиамина и рибофлавина
в экстракте пробы
Перед определением гидролизаты разводят дистиллированной водой
в мерных колбах до концентрации, сопоставимой с концентрациями
витаминов в растворах для построения градуировочного графика.
Аликвоту фильтрата 0,1 куб. см вводили в аналитическую
хроматографическую колонку. Витамин В-1 определяли после окисления
его в тиохром путем послеколоночной дериватизации 0,06%-ным
раствором калия гексацианоферрата (III) в 3 N гидроокиси калия со
скоростью подачи реагента 0,1 куб. см в течение 5 мин. после ввода
пробы. Длина волны возбуждения для тиохрома составляла 375 нм,
длина волны флуоресценции - 435 нм. Время удерживания витамина В-1
- 4,0-4,5 мин. После 6-й минуты длины волн автоматически
переключались для определения витамина В-2. Длина волны
возбуждения для рибофлавина (витамина В-2) составляла 450 нм,
длина волны флуоресценции - 521 нм. Время удерживания витамина В-2
составляло 10,0-10,3 мин. Идентификацию пиков проводили
сопоставляя времена удерживания с временами удерживания растворов
соответствующих стандартов.
Идентификацию пиков проводят сопоставляя времена удерживания и
|
