|
Стр. 3
Рассчитывают площади пиков каждого компонента (S ) по формуле:
i
S = K x D x H ,
i i i i
где:
D - ширина i-го пика на половине его высоты, мм;
i
Н - высота i-го пика, мм;
i
K - поправочный коэффициент.
i
Для получения поправочных коэффициентов составляют 3-4
стандартные смеси стеролов, входящих в исследуемые образцы, и
холестерола. По хроматограммам стандартных смесей, полученных в
идентичных условиях, определяют поправочные коэффициенты по
отношению к холестеролу, коэффициент которого принят за единицу,
по формуле:
M S
i ст
К = --- x ---,
i M S
ст i
где:
M и М - масса i-го компонента и стандарта (холестерина);
i ст
S и S - площади их пиков соответственно.
i ст
Молярную долю каждого стерина (С ) рассчитывают методом
i
нормализации по формуле, принимая сумму площадей всех типов за
100%:
S х 100
i
--------,
SUM S
i
где:
S - площадь пика i-го компонента;
i
SUM S - сумма площадей пиков стеринов.
i
За окончательный результат испытания принимают среднее
арифметическое (X) результатов двух параллельных определений.
Метрологические характеристики
Относительное допустимое расхождение между результатами двух
параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, по
отношению к среднему арифметическому значению (Rr) и относительное
допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в
двух разных лабораториях, по отношению к среднему арифметическому
значению (RR) приведены в табл. 7
Таблица 7
ОТНОСИТЕЛЬНЫЕ ДОПУСТИМЫЕ ВНУТРИЛАБОРАТОРНЫЕ (Rr)
И МЕЖЛАБОРАТОРНЫЕ (RR) РАСХОЖДЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
--------------------------T------------------T-------------------¬
¦ Содержание, % ¦ Rr, % ¦ RR, % ¦
+-------------------------+------------------+-------------------+
¦Менее 0,5 ¦ 20 ¦ 40 ¦
+-------------------------+------------------+-------------------+
¦0,5-1,0 ¦ 15 ¦ 30 ¦
+-------------------------+------------------+-------------------+
¦Более 1,0 ¦ 10 ¦ 20 ¦
L-------------------------+------------------+--------------------
3.3. Метод хромато-масс-спектрометрии
в анализе стеринов
Метод основан на прямом хромато-масс-спектрометрическом анализе
стеринов, выделенных из липидов путем тонкослойной хроматографии
фракции неомыляемых веществ.
Условия проведения анализа
Выделение липидов проводят одним из унифицированных методов,
предложенных для данного БАД и исключающих разрушение стеринов.
Экстракцию неомыляемых веществ следует проводить по возможности
быстро, предохраняя пробы от попадания на них прямого солнечного
света, отгонку растворителя следует проводить под вакуумом на
ротационном испарителе при комнатной температуре.
Подготовку к проведению анализа и выделение стеринов из липидов
проводят по п. "Колориметрический метод определения содержания
стеринов".
Условия анализа: хромато-масс-спектрометр с автоматической
системой обработки данных, энергия ионизирующих электронов 70 eV;
диапазон массовых чисел 39-500 а.е.м.; температура источника ионов
120 град. C; хроматографическое разделение на капиллярной колонке
47 м х 0,3 мм с химически связанной фазой SE-30, начальная
температура колонки 50 град. C - 2 мин., 240 град. C - 8 мин. с
последующим программированием со скоростью 4 град. C/мин. до 300
град. C и изотермой (30 мин.), температура испарителя 280 град. C,
переходных линий 275 град. C. Скорость газа-носителя гелия 1,3
куб. см/мин., в момент ввода пробы сброс перекрыт на 30 с, далее
деление потока 1:60.
Структуру компонентов определяют путем сравнения полученных
масс-спектров с имеющейся базой данных, а также по молекулярным и
характеристическим осколочным ионам, выбор которых определяется
эмпирическими корреляциями между масс-спектром и структурой
изучаемых стеринов.
Таблица 8
СОСТАВ ФРАКЦИЙ СТЕРИНОВ, % ОТН.,
ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ РЯДА БАД НА РАСТИТЕЛЬНОЙ ОСНОВЕ
И НА ОСНОВЕ МОРЕПРОДУКТОВ, ПОЛУЧЕННЫЙ С ПОМОЩЬЮ МЕТОДА
ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ
----------------------T----T----T----T------T----T----T----T-----¬
¦ Стерины ¦М.м.¦Соя ¦Аво-¦Апель-¦Ко- ¦Ама-¦Рапс¦Каль-¦
¦ ¦ ¦ ¦кадо¦син ¦кос ¦рант¦ ¦мар ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦(ши-¦ ¦ ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ри- ¦ ¦ ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ца) ¦ ¦ ¦
+---------------------+----+----+----+------+----+----+----+-----+
¦ДЕЛЬТА-5,7,22,24- ¦394 ¦0,7 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦эргостатетраенол ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+---------------------+----+----+----+------+----+----+----+-----+
¦4альфа-метил-холеста-¦396 ¦0,4 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦5,7,22-триенол ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+---------------------+----+----+----+------+----+----+----+-----+
¦холестерин ¦386 ¦0,1 ¦0,4 ¦0,8 ¦0,7 ¦2,3 ¦0,7 ¦96,8 ¦
+---------------------+----+----+----+------+----+----+----+-----+
¦десмостерин ¦384 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦1,6 ¦
+---------------------+----+----+----+------+----+----+----+-----+
¦брассикастерин ¦398 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦10,3¦ ¦
+---------------------+----+----+----+------+----+----+----+-----+
¦эргостерин ¦396 ¦ ¦ ¦0,3 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+---------------------+----+----+----+------+----+----+----+-----+
¦24-метиленхолестерин ¦398 ¦ ¦ ¦0,7 ¦ ¦ ¦ ¦1,0 ¦
+---------------------+----+----+----+------+----+----+----+-----+
¦кампестерин ¦400 ¦17,4¦4,0 ¦4,0 ¦5,8 ¦- ¦29,4¦ ¦
+---------------------+----+----+----+------+----+----+----+-----+
¦дигидрокампестерин ¦402 ¦1,0 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦2,0 ¦ ¦
+---------------------+----+----+----+------+----+----+----+-----+
¦лофенол ¦400 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦0,4 ¦
+---------------------+----+----+----+------+----+----+----+-----+
¦стигмастерин ¦412 ¦16,1¦0,7 ¦6,4 ¦9,5 ¦ ¦ ¦ ¦
+---------------------+----+----+----+------+----+----+----+-----+
¦ДЕЛЬТА-7-кампестерин ¦400 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦4,3 ¦ ¦ ¦
+---------------------+----+----+----+------+----+----+----+-----+
¦обтусифолиол ¦426 ¦ ¦ ¦ ¦0,6 ¦ ¦ ¦ ¦
+---------------------+----+----+----+------+----+----+----+-----+
¦клионастерин ¦414 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦0,2 ¦
+---------------------+----+----+----+------+----+----+----+-----+
¦циклоартанол ¦428 ¦ ¦ ¦ ¦0,7 ¦ ¦ ¦ ¦
+---------------------+----+----+----+------+----+----+----+-----+
¦бета-ситостерин ¦414 ¦47,5¦89,9¦83,5 ¦44,2¦- ¦52,9¦ ¦
+---------------------+----+----+----+------+----+----+----+-----+
¦дигидроситостерин ¦416 ¦3,0 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+---------------------+----+----+----+------+----+----+----+-----+
¦бета-амирин ¦426 ¦1,4 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+---------------------+----+----+----+------+----+----+----+-----+
¦ДЕЛЬТА-5-авенастерин ¦412 ¦2,4 ¦3,8 ¦2,2 ¦10,2¦ ¦4,7 ¦ ¦
+---------------------+----+----+----+------+----+----+----+-----+
¦альфа-амирин ¦426 ¦1,4 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+---------------------+----+----+----+------+----+----+----+-----+
¦циклоэфкаленол ¦426 ¦1,1 ¦ ¦ ¦2,3 ¦ ¦ ¦ ¦
+---------------------+----+----+----+------+----+----+----+-----+
¦циклоартенол ¦426 ¦2,4 ¦0,1 ¦ ¦16,2¦1,0 ¦ ¦ ¦
+---------------------+----+----+----+------+----+----+----+-----+
¦ДЕЛЬТА-7-стигмастерин¦412 ¦2,6 ¦0,4 ¦0,6 ¦4,4 ¦60,6¦ ¦ ¦
+---------------------+----+----+----+------+----+----+----+-----+
¦ДЕЛЬТА-7-авенастерин ¦412 ¦1,4 ¦0,6 ¦1,0 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+---------------------+----+----+----+------+----+----+----+-----+
¦24-метиленцикло- ¦440 ¦ ¦0,1 ¦ ¦4,1 ¦ ¦ ¦ ¦
¦артанол ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+---------------------+----+----+----+------+----+----+----+-----+
¦ДЕЛЬТА-7-ситостерин ¦414 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦31,8¦ ¦ ¦
+---------------------+----+----+----+------+----+----+----+-----+
¦цитростадиенол ¦426 ¦2,4 ¦ ¦0,5 ¦1,3 ¦ ¦ ¦ ¦
L---------------------+----+----+----+------+----+----+----+------
4. Метод определения фосфолипидов
(определение суммарного фосфора)
Метод основан на способности фосфора, соединяясь с молибденом
аммония, образовывать фосфорно-молибденовую кислоту, которая
восстанавливается амидоловым реагентом и дает голубое окрашивание.
Специфические приборы и реактивы
Спектрофотометр.
Молибдат аммония, 8,4%-ный.
Амидоловый реагент, 1%-ный, свежеприготовленный.
Спиртовой раствор фосфора, 1,097 г КН2РО4 растворяют в 250 куб.
см воды, этот запасной раствор разбавляют водой и получают рабочий
раствор, содержащий 10 мкг фосфора в 1 куб. см.
Подготовка проб
Пипеткой отбирают аликвотную часть раствора липидов (содержащую
10-100 мкг фосфора, но не более 2 мг липидов) и переносят ее в
толстостенную пирексовую пробирку с делениями, соответствующими
12,5 и 25 куб. см. Растворитель упаривают досуха в токе воздуха
при 350 град. C, к остатку прибавляют 2,0 куб. см хлорной кислоты,
немного стеклянных шариков и нагревают пробирку на электрической
плитке или газовой горелке до тех пор, пока раствор не станет
прозрачным и бесцветным. Охлажденный раствор разбавляют водой по
12,5 куб. см, тщательно перемешивают, добавляют 1,0 куб. см
раствора молибдата аммония, перемешивают и оставляют на 20 мин. до
появления голубой окраски.
Проведение испытания
Окрашенный раствор разбавляют водой по 25 куб. см,
перемешивают. На спектрофотометре типа СФ-46 в парных кюветах 1 см
определяют поглощение при 680 нм полученного раствора и р-ра
холостого опыта.
Обработка результатов
Расчет производят по калибровочной кривой, построенной по
стандартному раствору КН2РО4. Используют аликвотные пробы
стандартного раствора, содержащие от 30 до 60 мкг фосфора. Закон
Бера соблюдается в интервале 10-100 мкг фосфора.
III. Методы определения углеводов
1. Определение содержания крахмала
с помощью поляриметрического метода
Метод определения массовой доли крахмала в БАД на зерновой
основе распространяется на продукты с массовой долей крахмала выше
10%. Содержание крахмала определяют поляриметрическим методом
путем его гидролиза раствором соляной кислоты.
Специфические аппаратура, материалы и реактивы
Сахариметр или поляриметр.
Мельница лабораторная, обеспечивающая требуемую крупность
размола.
Сито из проволочной сетки N 08 по ТУ 14-4-1374-86.
Соляная кислота по ГОСТу 3118-77, раствор массовой
концентрацией 11,24 г/куб. дм, для анализа картофеля - 3,77 г/куб.
дм.
Калий железистосинеродистый по ГОСТу 4207-75, раствор массовой
концентрацией 150 г/куб. дм.
Цинка сульфат по ГОСТу 3765-78, раствор массовой концентрацией
150 г/куб. дм.
Аммония молибдат по ГОСТу 3765-78, раствор массовой
концентрацией 100 г/куб. дм.
Натрия молибдат по ГОСТу 10931-74, раствор массовой
концентрацией 150 г/куб. дм.
Фосфорно-вольфрамовая кислота, раствор массовой концентрацией
40 г/куб. дм.
Подготовка к испытанию
Пробы, влажность которых превышает 17%, предварительно
подсушивают на воздухе или в одном из следующих устройств:
сушильном шкафу, термостате, лабораторном сушильном аппарате при
температуре воздуха не более 50 град. C. Пробу тщательно
перемешивают, измельчают до такой степени, чтобы весь размолотый
материал прошел при просеивании через сито из проволочной сетки N
8.
Одновременно со взятием навесок для анализа берут навески для
определения влажности. Определение влажности осуществляется по
ГОСТам, принятым в соответствующей отрасли.
Проведение испытания
Из аналитической пробы берут навеску массой 5 г с погрешностью
не более 0,01 г, помещают в 100 куб. см центрифужный стакан,
доливают 18 куб. см 10% раствора этанола (при определении массовой
доли крахмала в отрубях - 28 куб. см раствора этанола) и
перемешивают стеклянной палочкой. Стеклянную палочку ополаскивают
2 куб. см раствора этанола. Закрывают центрифужный стакан
резиновой пробкой и вручную сильно встряхивают в течение 2 мин.
После встряхивания стенки центрифужного стакана и резиновую
пробку ополаскивают 25 куб. см этанола. Затем в течение 20 мин.
пробу центрифугируют при 4000 об./мин., после чего прозрачный
центрифугат сливают. К остатку постепенно добавляют 20 куб. см
соляной кислоты, перемешивают стеклянной палочкой до образования
суспензии и переносят в мерную колбу на 100 куб. см. Прилипшие к
стенкам центрифужного стакана и к стеклянной палочке остатки пробы
многократно ополаскивают раствором соляной кислоты массовой
концентрацией 11,24 г/куб. дм в мерную колбу; общее количество
раствора соляной кислоты составляет 50 куб. см.
Мерную колбу при постоянном встряхивании погружают в кипящую
водяную баню. Из-за погружения мерной колбы не должен нарушаться
процесс кипения водяной бани: с помощью специальных уплотнительных
колец ее следует держать по возможности закрытой. По секундомеру
встряхивают мерную колбу в течение 3 мин., при этом колбу из
водяной бани не поднимают. После этого выдерживают колбу без
встряхивания для всех крахмалосодержащих БАД 12 мин.
По истечении в общей сложности 15 мин. для всех
крахмалосодержащих БАД колбу вынимают из бани и быстро приливают
столько холодной воды, чтобы до мерной черты оставался объем не
более 10-15 куб. см. Содержимое колбы охлаждают в проточной воде
до температуры 20 град. C.
Белковые вещества в растворе осаждают добавлением 2 куб. см
раствора калия железистосинеродистого (150 г/куб. дм) и после
перемешивания 2 куб. см раствора цинка сульфата (150 г/куб. дм).
Затем мерную колбу в течение 10-15 мин. выдерживают при комнатной
температуре, доводят дистиллированной водой до метки, перемешивают
и в течение 5 мин. дают отстояться. Взамен обоих указанных
реактивов в случае их отсутствия для осаждения белков и осветления
раствора в колбу приливают 5 куб. см раствора аммония молибдата
(100 г/куб. дм), или 5 куб. см раствора фосфорно-вольфрамовой
кислоты (40 г/куб. дм), или 3 куб. см раствора натрия молибдата
(165 г/куб. дм). При использовании молибдатов в качестве
осадителей белков рекомендуется избегать попадания солнечных лучей
на реактивы. Содержимое колбы через сухой складчатый фильтр
фильтруют в сухую коническую колбу, первые несколько капель
фильтрата отбрасывают. Прозрачным фильтром заполняют трубку
поляриметра и в поляриметре измеряют оптическое вращение. Угол
вращения испытуемого раствора в трубке поляриметра измеряют 5 раз.
До начала и после каждого второго измерения производят контроль
установки поляриметра на нуль. Средняя величина 5 измерений служит
исходной величиной для дальнейших вычислений массовой доли
крахмала.
Обработка результатов
Массовую долю крахмала (X) в процентах вычисляют по следующим
формулам.
При использовании сахариметра с нормальной шкалой:
Х = К х а
или при использовании поляриметра с круговой шкалой:
K x a
X = ------,
0,3468
где:
К - переводной коэффициент, который при длине трубки 2 дм равен
1,9;
а - показатель сахариметра или поляриметра в градусах шкалы
(переводные коэффициенты К для длины трубки 1 дм умножают на 2).
Метрологические характеристики
Допустимые расхождения между результатами двух параллельных
определений (r) не должны превышать значений:
r = 0,03 + 0,04 x Х ,
1
но не более 0,5% абсолютного содержания крахмала в БАД, где X
1
- среднее арифметическое двух параллельных определений.
Допустимое расхождение между результатами измерений,
выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать
значений:
R = 0,05 + 0,06 x Х ,
2
но не более 1,2% абсолютного содержания крахмала в продукте,
где Х - среднее значение результатов измерений, выполненных в
2
двух разных лабораториях.
2. Определение содержания и состава углеводов
2.1. Определение состава углеводов
с помощью метода ГЖХ
Метод основан на переводе углеводов типа глюкозы, фруктозы,
арабинозы, ксилозы, галактозы, сахарозы, мальтозы, лактозы,
рафинозы, сорбита и инозита в БАД в триметилсилильные производные
с последующим их газохроматографическим анализом.
Специфические реактивы, материалы и аппаратура
Гексан х.ч.
Гексаметилдисилазан.
Трифторуксусная кислота или триметилхлорсилан.
Пиридин х.ч., безводный.
Ксилит х.ч. или инозит.
Свинец уксуснокислый х.ч.
Неподвижные фазы для ГЖХ SE-30, OV-17, ХЕ-60, СКТФТ-50.
Инертный носитель для ГЖХ: хромосорб-W DMCS, хроматон-N DMCS.
Газовый хроматограф с пламенно-ионизационным детектором и
устройством для программирования температуры.
Стеклянная насадочная колонка длиной 2-3 м и диаметром 3-4 мм
или капиллярная колонка длиной 25-30 м с нанесенной фазой.
Микрошприц емкостью 1,0-10 мкл.
Роторный испаритель.
Подготовка образцов
БАД с низким содержанием лимонной кислоты (менее 1,5%)
Содержание лимонной кислоты устанавливается по "Таблицам
химического состава". Навеску гомогенизированной пробы БАД с
высоким содержанием сухих веществ (более 60%) наносят на
полиэтиленовую пластинку в количестве 50-150 мг и взвешивают на
аналитических весах с точностью до 0,0001 г. На этой же пластинке
взвешивают 5-10 мг ксилита. Пластинку помещают в круглодонную
колбу емкостью 10-25 куб. см и силилируют без обезвоживания с
использованием трифторуксусной кислоты. При использовании
триметилхлорсилана содержимое колбы упаривают досуха на роторном
испарителе при 60 град. C под вакуумом. В случае медленного
упаривания в колбу добавляют 1 куб. см бензола. После упаривания
проводят силилирование.
Жидкие БАД отмеряют пипеткой в количестве 0,5-1,0 куб. см и
помещают в круглодонную колбу емкостью 10-25 куб. см, снабженную
шлифом. Туда же на полиэтиленовой пластинке вносят навеску 5-10 мг
ксилита, взвешенного с точностью до 0,0001 г. Содержимое колбы
упаривают досуха на роторном испарителе.
БАД с содержанием лимонной кислоты более 1,5%
Для исключения наложения пика ТМС-производного лимонной кислоты
на ТМС-производное бета-глюкозы лимонную кислоту осаждают
уксуснокислым свинцом. Навеску средней гомогенизированной пробы
БАД (содержащие лимонную кислоту как пищевую или консервирующую
добавку) в количестве 1-15 г взвешивают с точностью до 0,001 г в
конической колбе емкостью 100 куб. см, приливают 30 куб. см 75-80%
раствора этанола и экстрагируют 30 мин. при температуре 60-70
град. C. Используют водяную баню и обратный холодильник.
Экстракцию повторяют трижды, экстракты объединяют.
Колбу доводят до метки дистиллированной водой. В центрифужную
пробирку на 10 куб. см вносят пипеткой 5 куб. см отфильтрованного
экстракта, 0,5 куб. см насыщенного раствора уксуснокислого свинца.
Осадок центрифугируется. 1 куб. см надосадочной жидкости переносят
в шлифную круглодонную колбу емкостью 10-25 куб. см. Туда же на
полиэтиленовой пластинке вносят навеску ксилита 5-10 мг.
Содержимое колбы упаривается на роторном испарителе при 60 град. C
под вакуумом.
Получение триметилсилильных (ТМС) производных
Способ с использованием трифторуксусной кислоты
В подготовленную навеску образца приливают точно 1,0 куб. см
пиридина, 0,9 куб. см гексаметилдисилазана, 0,1 куб. см
трифторуксусной кислоты, плотно закрывают и энергично встряхивают
в течение 30 с. Вначале наблюдают расслоение жидкости на 2 фазы,
при этом нижний слой незначителен. По мере стояния раствора в
течение 20-30 мин. это расслоение исчезает и начинает выделяться
аммиак, что указывает на успешное протекание реакции
силилирования. После прекращения выделения аммиака раствор
выдерживают 12 ч при комнатной температуре или 1 ч при 60 град. C.
Длительно сохраняющееся расслоение, исчезающее только при
нагревании, говорит о том, что реакция силилирования прошла не
полностью из-за высокого содержания влаги (более 40%) или
повышенного содержания углеводов. В этом случае подготовку пробы
повторяют, уменьшив при этом навеску или увеличив время
высушивания на роторном испарителе.
Способ с использованием триметилхлорсилана
В подготовленную навеску образца приливают точно 1,0 куб. см
пиридина, 0,2 куб. см гексаметилдисилазана и 0,1 куб. см
триметилхлорсилана, встряхивают в течение 1 мин. и нагревают в
термостате 45 мин. при 60 град. C, затем хроматографируют.
Для упрощения идентификации и количественных расчетов (если не
требуется знания аномерного состава сахаров) определение сахаров
производят в виде ТМС-производных сахаров. В подготовленную пробу
образца добавляют 100 г гидроксиламина солянокислого, приливают 10
куб. см пиридина и выдерживают в термостате при 80 град. C в
течение 2 ч. Охлаждают и далее приливают силилирующие реагенты.
Газохроматографический анализ
Подготовка хроматографической колонки
Условия: стеклянная колонка, наполненная сорбентом, с 3-5%
неподвижной жидкой фазы, длиной 2 м и внутренним диаметром 3 мм.
Температуру колонки программируют от 125 до 270 град. C со
скоростью 4 град. C в 1 мин., температура испарителя 250 град. C,
расход газа-носителя 40 куб. см/мин., температура пламенно-
ионизационного детектора 250 град. C.
Газохроматографическое определение
1,0 мкл пиридинового раствора триметилсилильных производных
углеводов вводят в испаритель хроматографа и элюируют из колонки
газом-носителем. Идентификацию индивидуальных триметилсилильных
производных проводят по времени удерживания триметилсилильных
производных сахаров-метчиков и методом добавки.
Приготовление калибровочных растворов
Сахара, имеющие альфа- и бета-аномеры
Навеску ксилита и навеску определяемого сахара, взятую с
точностью до 0,0001 г, помещают в коническую колбу и заливают
дистиллированной водой до полного растворения углеводов. Раствор
выдерживают в течение суток. Аликвотную часть раствора отбирают
пипеткой, помещают в круглодонную колбу и упаривают досуха, после
чего проводят силилирование.
Сахара, не имеющие аномеров
Сахара, не имеющие аномеров, силилируют без предварительного
растворения.
Обработка результатов
Массовую долю отдельных сахаров (в %) в навеске БАД определяют
по формуле:
A x K x C x 100
1 1
C = -----------------,
1 A x Q
c
где:
С - содержание отдельного сахара в навеске, %;
1
К - поправочный коэффициент данного сахара;
1
С - масса навески стандарта, мг;
Q - навеска образца;
А - площадь пика стандарта в относительных единицах;
с
А - площадь пика данного сахара в относительных единицах.
1
Расчет площадей хроматографических
пиков сахарозы и альфа-лактозы при их совместном
присутствии в пробе
Ввиду того, что альфа-лактоза и сахароза выходят на
хроматограмме одним пиком, площадь пика альфа-лактозы определяют
исходя из соотношения площадей альфа- и бета-лактозы в модельном
соединении лактозы. За основу берется площадь пика бета-лактозы.
Площадь пика сахарозы определяют вычитанием от суммарного пика
сахарозы пика альфа-лактозы, рассчитанного из пика бета-лактозы.
За окончательный результат принимают среднеарифметическое (X)
результатов двух параллельных определений.
Окончательный результат округляют до трехзначной цифры.
Метрологические характеристики
Относительное допустимое расхождение между результатами двух
параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, по
отношению к среднему арифметическому значению (Rr) и относительное
допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в
двух разных лабораториях, по отношению к среднему арифметическому
значению (RR) зависят от содержания сахаров в продукте.
При содержании отдельных сахаров типа глюкозы, фруктозы,
арабинозы, ксилозы, галактозы, сахарозы, лактозы, мальтозы,
рафинозы, инозита и сорбита в продукте в пределах от 1 до 5%:
- значения Rr = 20%, RR = 40% для каждого сахара; при
содержании отдельного сахара в продукте свыше 5%;
- значения Rr = 10%, RR = 25% для каждого сахара.
2.2. Определение состава углеводов
с помощью метода ВЭЖХ
Настоящий метод основан на выделении, разделении и
количественном определении с помощью высокоэффективной жидкостной
хроматографии моно-, ди-, олигосахаров, а также сахарных спиртов.
Он распространяется на определение глюкозы, фруктозы, арабинозы,
фукозы, галактозы, ксилозы, лактозы, лактулозы, мальтозы,
мальтотриозы, маннозы, сахарозы, раффинозы, стахиозы, сорбита,
инозита, мальтита, ксилита, изомальта, лактитола, добавленных в
БАД.
Приборы и реактивы
Прибор для проведения хроматографии методом ВЭЖХ, состоящий из
насоса, детектора-рефрактометра, колонки 250 мм х 4 мм Сепарон SGX
NH2 или аналогичной.
Компьютер с программным обеспечением по приему и обработке
хроматографических данных.
Ротационный испаритель, водяная баня, обратный холодильник, две
стеклянные колонки 7-10 см (внутренний диаметр 10 мм).
Ацетонитрил CH3CN для хроматографии.
Этиловый спирт 80%.
+
Ионообменная смола Дауэкс 50х4, 200-400 меш. (Н -форма).
Ионообменная смола Дауэкс 1 x 8, 200-400 меш. (формиатная
форма).
2Н NaOH, 3Н HCl, 3Н формиат натрия, бидистиллированная вода.
0,1%-ный раствор азотнокислого серебра.
Изопропиловый спирт.
Экстракция
Углеводы извлекают из БАД 80% этиловым спиртом с учетом
естественной влаги. Навеску БАД заливают в колбе в соотношении 1:4
по сухим веществам 96% этанолом и необходимым количеством воды с
расчетом, чтобы общая концентрация спирта была в пределах 80-82%.
Колбу нагревают с обратным холодильником на водяной бане при 70-80
град. C в течение 15 мин. Затем спиртовую вытяжку отфильтровывают.
К остатку приливают опять раствор 80%-ного спирта и экстракцию
повторяют в тех же условиях. Всего углеводы экстрагируют из
продукта 3-4 раза.
Спиртовые экстракты объединяют, спирт отгоняют на ротационном
испарителе при температуре не выше 40 град. C.
Очистка экстракта
Предназначенные для определения экстракты нейтральных сахаров
содержат также вещества, имеющие заряд (аминокислоты, пептиды и
др.). Чтобы освободить нейтральные сахара от этих примесей,
экстракты пропускают через колонку с дауэксом 50х4,
непосредственно соединенную с колонкой, содержащей дауэкс 1 x 8.
Подготовка дауэкс 50х4, 200-400 меш.
Смолу последовательно промывают на бюхнеровской воронке
большими объемами 2н NaOH, дистиллированной водой, 3н HCl и опять
водой. Избыток воды удаляют путем длительного отсасывания насосом.
Готовят суспензию смолы в дистиллированной воде (1:1) и используют
ее для заполнения колонки.
Ионообменная способность для дауэкса 50х4 в сухом виде
составляет 5,1 мэкв/куб. см и во влажном 1,7 мэкв/куб. см
соответственно.
Подготовка дауэкс 1 x 8, 200-400 меш.
Для работы нужна формиатная форма смолы. Последнюю готовят из
_
дауэкса 1 x 8 (CI -форма), пропуская через смолу на бюхнеровской
_
воронке 3н формиат натрия до тех пор, пока проба на CI не станет
отрицательной (проба с азотнокислым серебром). После этого смолу
промывают большими объемами дистиллированной воды и заполняют
колонку. Ионообменная способность для дауэкса 1х8 в сухом виде
составляет 3,2 мэкв/куб. см и во влажном виде 1,4 мэкв/куб. см.
С двух колонок собирают элюент и, если необходимо, его
концентрируют в роторном испарителе. Чтобы упарить воду и не
поднимать температуру, к образцу добавляют этанол. Упаренный
образец переносят в мерную посуду и замеряют объем и
хроматографируют.
Анализ ВЭЖХ
Подготовка колонки
Для этого колонку промывают 40 куб. см изопропанола, затем 80
куб. см деионизированной воды, после чего уравновешивают колонку
подвижной фазой до стабильной нулевой линии.
Условия ВЭЖХ
Подвижная фаза: ацетонитрил - вода (77:23). Смесь дегазируют на
роторном испарителе. Подвижная фаза для мальтотриозы, стахиозы и
рафинозы: ацетонитрил - вода (60:40).
Детектирование - рефрактометр. Скорость потока 2,5 куб. см
/мин. Стандартный раствор углевода 10 мг/куб. см предварительно
высушивают в сушильном шкафу при 105 град. C до постоянного веса в
стеклянных бюксах. Обработка хроматографических данных по
программе МультиХром для Windows или аналогичной. Стандартный
образец и испытываемую пробу хроматографируют не менее трех раз.
Ошибка метода +/- 5%.колонку.
Определение содержания глюкозы в смеси с сорбитом
При описанных выше условиях хроматографирования время
удерживания глюкозы и сорбита одинаковое и на хроматограмме они
выходят единым пиком. В таких случаях количество глюкозы
определяют глюкозооксидазным методом с использованием
соответствующего ферментативного набора. Проведение анализа
описано в соответствующем наборе. Количество сорбита определяют
расчетным способом как разницу суммарного содержания глюкозы и
сорбита (по хроматограмме) и глюкозы (полученной ферментативным
методом). В связи с разницей рефрактометрического индекса глюкозы
и сорбита в расчетную формулу вводят поправочный коэффициент:
С = (С - С ) х К / К ,
сорбита суммарное глюкозы сорбита глюкозы
где К - коэффициент пропорциональности, взятый из программы
МультиХром.
3. Определение содержания пектина
Образец измельчают, взвешивают около от 1 до 5 г (в зависимости
от того, сколько содержится пектина в образце), переносят в
стеклянную колбу, заливают кипящей водой, в которую добавлена
концентрированная соляная кислота из расчета 0,8 куб. см на 250
куб. см дистиллированной воды. Смесь нагревают при перемешивании в
течение 30 мин. при 95-100 град. C. Охлаждают до температуры ниже
25 град. C, чтобы свести к минимуму тепловое разрушение пектина, и
фильтруют на воронке Бюхнера через капроновую ткань с
отсасыванием. Если смесь плохо фильтруется, ее центрифугируют при
5000 об./мин. в течение 30 мин. Экстракцию проводят дважды,
экстракты и промывную воду объединяют, измеряют количество и к
охлажденному раствору пектина прибавляют 1,5 объема этанола (можно
использовать изопропиловый спирт или ацетон), содержащего 2 куб.
см концентрированной соляной кислоты (уд. вес 1,19) на 1 л. Смесь
перемешивают вручную медленно и тщательно и оставляют стоять на 30
мин. с тем, чтобы пектин всплыл на поверхность. Большую часть не
содержащего пектина раствора можно отделить сифонированием. Осадок
пектина отделяют центрифугированием, промывают спиртом до тех пор,
пока реакция с нитратом серебра на ион-хлорид в промывных
растворах будет отрицательной. Осадок сушат в термостате при 60
град. C до постоянного веса.
Содержание пектина определяют гравиметрически.
Ошибка метода 5%. Метод не пригоден для БАД, содержащих большие
количества (более 30%) сахарозы.
4. Методы определения содержания
редуцирующих веществ, общего сахара и сахарозы
4.1. Колориметрический метод
Метод основан на колориметрировании избытка щелочного раствора
гексацианоферрата (III) калия после реакции с редуцирующими
сахарами объекта исследования. При этом гексацианоферрат (III)
восстанавливается до гексацианоферрата (II), что ведет к
ослаблению окраски, так как K3[Fe(CN)6] окрашен значительно
интенсивнее, чем K4[Fe(CN)6].
Специфические реактивы
Глюкоза кристаллическая гидратная, х.ч. по ГОСТу 975-88.
Гексацианоферрат (III) калия, х.ч. по ГОСТу 4206-75.
Гидроксид калия, ч.д.а. по ГОСТу 24363-80 или гидроксид натрия,
ч.д.а., по ГОСТу 4328-77, раствор с концентрацией NaOH (или KOH)
2,0 М и 1,25 М.
Кислота хлороводородная, х.ч. по ГОСТу 3118-77, раствор с
концентрацией 1 М.
Натрия хлорид, х.ч., по ГОСТу 4233-77.
Метиленовый голубой, индикатор, 1 г растворяют в 100 куб. см
дистиллированной воды и фильтруют.
Сахароза, х.ч. по ГОСТу 5833-75 или сахар-рафинад по ГОСТу 22-
78.
Цинка сульфат, х.ч., по ГОСТу 4174-77, раствор с концентрацией
0,5 М.
Внимание! Перед проведением анализа необходимо в обязательном
порядке проверить вместимость мерной посуды и пипеток по I классу
точности!
Подготовка к анализу
Приготовление раствора гексацианоферрата (III) калия - основной
реактив. Взвешивают 8 г K3[Fe(CN)6] и 20 г NaOH (или 28 г KOH).
Отдельно растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды.
Затем оба раствора сливают в мерную колбу вместимостью 1000 куб.
см и доводят до метки дистиллированной водой. Раствор готов к
использованию через сутки. Раствор можно хранить в склянке из
темного стекла в течение 2 мес.
Приготовление стандартного раствора глюкозы
1,6000 г безводной глюкозы взвешивают с точностью до 0,0002 г и
растворяют в мерной колбе вместимостью 1000 куб. см.
Предварительно глюкозу выдерживают в эксикаторе над
свежепрокаленным хлоридом кальция в течение 3 сут. После
растворения навески раствор в колбе доводят до метки. Если раствор
готовят на месяц, необходимо внести в колбу 150 г хлорида натрия и
хранить в холодильнике.
Построение градуировочного графика
В 6 конических колб вместимостью 100 куб. см вносят пипеткой по
25 куб. см щелочного раствора гексацианоферрата (III) калия и по
7,0; 7,5; 8,0; 8,5; 9,0; 9,5 куб. см стандартного раствора
глюкозы. Из бюретки соответственно приливают 9,0; 8,5; 8,0; 7,5;
7,0 куб. см дистиллированной воды, тем самым доводят объем
жидкости в каждой колбе до 41 куб. см. Содержимое каждой колбы
нагревают до кипения за 3 мин. и кипятят в течение 1 мин., закрыв
часовым стеклом. Затем охлаждают и измеряют оптическую плотность
на ФЭК со светофильтром, имеющим лямбда эф = 440 нм (синий
светофильтр). Раствором сравнения служит дистиллированная вода.
Кювету подбирают такого размера, чтобы оптическая плотность была в
пределах 0,3-0,6 для раствора, содержащего 8,5 куб. см раствора
глюкозы (10, 20 или 30 мм). Оптическую плотность определяют в
каждом растворе не менее 3-х раз и из полученных данных берут
среднее арифметическое значение. Строят график зависимости
величины оптической плотности от концентрации глюкозы в растворе.
Полученный график используют для определения содержания общего
сахара, восстанавливающих сахаров и сахарозы.
Приготовление исследуемого раствора
Объект исследования тщательно измельчают в ступке. Затем
готовят водную вытяжку объекта исследования. Массу навески М в
граммах рассчитывают по формуле:
C x V
|
