|
Стр. 9
5 мл на каждое яичко. Готовят препарат, и под микроскопом
определяют наличие и количество бледных трепонем, чтобы определить
длительность встряхивания. При 5-15 бледных трепонемах в одном
поле зрения рекомендуется встряхивать взвесь 20-30 минут, при
20-40 бледных трепонемах - 10-15 минут, при 60-100 бледных
трепонемах - 5 минут. После встряхивания содержимое колбы выливают
в стерильную центрифужную пробирку и центрифугируют при 1000
об/мин 5 минут для осаждения плотных кусочков тканей яичка и
эритроцитов. После этого надосадочную жидкость сливают в чистую
стеклянную пробирку, готовят препараты для микроскопирования и
определяют количество бледных трепонем в поле зрения (окуляр 10х,
объектив 40х). Антиген для реакции иммобилизации бледных трепонем
представляет собой взвесь бледных трепонем в среде выживания с
количеством микроорганизмов - 10-15 в каждом поле зрения. Это
достигается добавлением в нужный объем среды выживания небольших
порций полученной взвеси бледных трепонем (при 100-150
микроорганизмах в каждом поле зрения примерно 0,1-0,015 мл взвеси
на каждые 10 мл среды выживания). При каждой постановке реакции
следует одновременно производить заражение кролика для обеспечения
следующего опыта ранним орхитом, так как обязательным условием
получения ранних орхитов является регулярная перевивка штамма
кроличьего сифилиса. Для этой цели используют взвесь бледных
трепонем, оставшуюся после приготовления антигена. Зараженных
кроликов содержать в отдельных клетках в светлом, проветриваемом
помещении с температурой 18-20 град. С. Пища их должна быть
полноценной, содержать достаточное количество витаминов, особенно
моркови. Не следует прибегать к пункции яичек для определения в
них бледных трепонем прежде чем взять кролика в опыт, так как эта
процедура нарушает нормальное развитие орхита.
Основной опыт. Каждую испытуемую сыворотку (инактивированную)
исследуют в двух пробирках, предварительно разлив в каждую по 0,05
мл. В обе пробирки приливают по 0,35 мл антигена. Комплемент,
активный, в дозе 0,15 мл приливают в первую пробирку; комплемент,
инактивированный в водяной бане, в дозе 0,15 мл - во вторую
пробирку. После легкого встряхивания пробирки помещают в
микроанаэростат, из которого вакуумным насосом откачивают
атмосферный воздух. Затем микроанаэростат заполняют газовой смесью
из баллона - 95 частей азота и 5 частей углекислого газа. При
заполнении микроанаэростатов не следует заполнять их газом
полностью, до нулевого деления в манометре, так как при помещении
их в термостат с температурой 35 град. С объем газов будет больше,
чем при комнатной температуре.
Ко всему опыту ставят пять контролей. В двух пробирках -
контроль заведомо положительной сыворотки из предыдущего опыта; в
двух пробирках - контроль заведомо отрицательной сыворотки из
предыдущего опыта; в одной пробирке - контроль активного
комплемента; в одной пробирке - контроль инактивированного
комплемента; в одной пробирке - контроль антигена.
Пробирки, пипетки и другая лабораторная посуда, используемая
для постановки реакции иммобилизации бледных трепонем, должна быть
вымыта без применения дезинфицирующих средств последовательно
холодной, горячей и дистиллированной водой, высушена,
замонтирована и простерилизована автоклавированием. Разлив
ингредиентов производят в боксе, предварительно облученном
кварцевой лампой в течение 45-60 минут. Микроанаэростат с
пробирками помещают в термостат на 18-20 часов (см. табл. 16).
Таблица 16
СХЕМА РЕАКЦИИ ИММОБИЛИЗАЦИИ БЛЕДНЫХ ТРЕПОНЕМ
(МИКРОАНАЭРОСТАТНАЯ МЕТОДИКА)
---------------------T----------------------------------------¬
¦ ¦ NN пробирок ¦
¦ +-------------T--------------------------+
¦ Ингредиенты (в мл) ¦ опыт ¦ контроли ингредиентов ¦
¦ +-----T-------+-----T----T-----T----T----+
¦ ¦ 1 ¦ 2 ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦
¦ ¦ ¦ контр.¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+--------------------+-----+-------+-----+----+-----+----+----+
¦Испытуемая инактиви-¦0,05 ¦ 0,05 ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦
¦рованная сыворотка ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Комплемент активный ¦0,15 ¦ - ¦0,15 ¦ - ¦0,15 ¦ - ¦ - ¦
¦Комплемент инактиви-¦ - ¦ 0,15 ¦ - ¦0,15¦ - ¦0,15¦ - ¦
¦рованный ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Антиген ¦0,35 ¦ 0,35 ¦0,35 ¦0,35¦0,35 ¦0,35¦0,35¦
¦Положительная инак- ¦ - ¦ - ¦0,05 ¦0,05¦ - ¦ - ¦ - ¦
¦тивированная сыво- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ротка ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Отрицательная инак- ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦0,05 ¦0,05¦ - ¦
¦тивированная сыво- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ротка ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+--------------------+-----+-------+-----+----+-----+----+----+
¦ Встряхнуть, поставить в термостат на 18-20 часов ¦
L--------------------------------------------------------------
Оценка результатов. Через 18-20 часов пробирки вынимают из
микроанаэростата попарно - опытную и контрольную - и производят
подсчет подвижных и неподвижных бледных трепонем. Для этого
пастеровской пипеткой наносят каплю жидкости из опытной пробирки
на левую сторону предметного стекла, а на правую сторону наносят
каплю жидкости из контрольной пробирки одной и той же испытуемой
сыворотки. Предварительно посредине стекла ставят номер сыворотки.
Капли накрывают покровным стеклом 20х20 мм. Капли не должны быть
большими, иначе "трепонемы текут", и тогда суждение об их
подвижности и подсчет затруднительны. Учет результатов реакции
состоит в определении процента подвижных и неподвижных бледных
трепонем сначала в препарате из контрольной, затем из опытной
пробирки. Для этого подсчитывают 25-50 бледных трепонем и
отмечают, какое количество из них подвижные, и какое -
неподвижные. Если в контроле содержится меньше 17 подвижных
бледных трепонем из 25 подсчитанных, то такой опыт непригоден, и
исследование данной сыворотки следует повторить. В контрольных
пробирках с инактивированным комплементом отсутствие подвижных
бледных трепонем объясняется не присутствием специфических
иммобилизинов, а токсичностью испытуемой сыворотки крови или
недостаточно высоким качеством среды выживания (загрязнение
бактериями, примесь медикаментов и т.д.). При определении
подвижности бледных трепонем нужно быть весьма внимательным, так
как движение бледных трепонем по интенсивности бывает различным.
Они могут обладать активной подвижностью с отчетливыми
сгибательными движениями, иногда же отмечаются только
винтообразные движения. Подсчет производят медленно, так как у
видимо неподвижных бледных трепонем могут появиться активные
движения. Следует также отличать активные движения бледных
трепонем от движения с током жидкости.
Расчет специфической иммобилизации бледных трепонем
производят по следующей формуле:
подвижные бледные подвижные бледные
трепонемы в контроле - трепонемы в опыте
Х = ----------------------------------------- х 100
подвижные бледные трепонемы в контроле
Пример:
24 - 21
Х = --------- х 100 = 12%
24
При практической работе процент специфической иммобилизации
можно определять по специальной, высчитанной заранее, таблице (см.
табл. 17).
Реакция иммобилизации бледных трепонем считается
положительной, когда процент иммобилизированных бледных трепонем
бывает 50 и выше; слабо положительной - от 31 до 50%; сомнительной
- от 21 до 30%; отрицательной - от 20% и ниже. Сыворотки крови с
сомнительными или слабо положительными результатами необходимо
исследовать повторно для получения более четких и достоверных
результатов. Целесообразно также подвергать повторному
исследованию все сыворотки крови, показавшие полное расхождение
результатов реакции иммобилизации бледных трепонем и стандартных
серологических реакций. Эти сыворотки заслуживают особого
внимания, так как в этих случаях результаты реакции иммобилизации
бледных трепонем дают возможность судить о наличии или отсутствии
сифилиса у обследуемого лица.
Определение остаточного комплемента. После регистрации
результатов иммобилизации бледных трепонем в содержимом пробирок
определяют остаточный комплемент добавлением в каждую пробирку
гемолитической системы в объеме 0,1 мл. Гемолитическая система
состоит из равных частей (объемов) 1% взвеси эритроцитов барана с
плотного осадка и гемолитической сыворотки по утроенному титру.
При правильно прошедшем опыте в контрольных пробирках с
инактивированным комплементом гемолиз должен отсутствовать. В
опытных пробирках с активным комплементом гемолиз должен быть
полным, или его задержка не должна превышать один плюс.
Определение остаточного комплемента необходимо для суждения о том,
достаточным ли было количество комплемента, не была ли подвижность
бледных трепонем обусловлена тем, что количество его было
недостаточным, и специфические иммобилизины не могли проявить свою
иммобилизирующую активность.
Источники ошибок.
1. Токсичность испытуемой сыворотки.
2. Бактериальное загрязнение испытуемой сыворотки.
3. Недостаточное количество комплемента в опыте.
4. Нарушение герметичности микроанаэростата с последующим
проникновением в него кислорода атмосферного воздуха.
5. Повышение температуры в термостате (выше 35 град. С) в
течение реакции.
6. Кислотность или щелочность лабораторной посуды, применяемой
для постановки реакции.
Таблица 17
Определение процента иммобилизации бледных трепонем
--------------------------T--------------------------------------------------------------------------¬
¦ Количество подвижных ¦ Количество подвижных бледных трепонем в опытных пробирках ¦
¦ бледных трепонем +--------------------------------------------------------------------------+
¦ в контрольных пробирках¦25 24 23 22 21 20 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 ¦
+-------------------------+--------------------------------------------------------------------------+
¦ 25 ¦ 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 76 80 84 88 92 96¦
¦ 24 ¦ 0 0 4 8 12 17 21 25 29 33 37 42 46 50 54 58 62 67 71 75 79 83 87 92 96¦
¦ 23 ¦ 0 0 0 4 9 13 17 22 26 30 35 39 43 48 52 56 61 65 69 74 78 83 87 91 96¦
¦ 22 ¦ 0 0 0 0 5 9 14 18 23 27 32 36 41 45 50 54 59 63 68 73 77 82 86 91 95¦
¦ 21 ¦ 0 0 0 0 0 5 10 14 19 24 29 33 38 43 48 52 57 62 67 71 76 81 86 90 95¦
¦ 20 ¦ 0 0 0 0 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95¦
¦ 19 ¦ 0 0 0 0 0 0 0 5 11 16 21 26 32 37 42 47 53 58 63 68 74 79 84 89 95¦
¦ 18 ¦ 0 0 0 0 0 0 0 0 6 11 17 22 28 33 39 44 50 56 61 67 72 78 83 89 94¦
¦ 17 ¦ 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 12 18 24 29 35 41 47 53 59 65 71 76 82 88 94¦
L-------------------------+---------------------------------------------------------------------------
Цифра, находящаяся в точке пересечения горизонтальной линии,
соответствующей количеству подвижных бледных трепонем в
контрольной пробирке, и вертикальной линии, соответствующей
количеству подвижных бледных трепонем в опытной пробирке,
обозначает процент иммобилизации бледных трепонем.
Например: 22 подвижных бледных трепонемы в контрольной
пробирке и 8 подвижных бледных трепонем в опытной пробирке
соответствуют 63% иммобилизации бледных трепонем.
4.3.10. Реакция иммобилизации бледных трепонем
меланжерным методом Овчинникова
Принцип. Реакция основана на феномене потери подвижности
бледными трепонемами в присутствии иммобилизинов испытуемой
сыворотки и активного комплемента. Анаэробные условия опыта
создаются помещением реагирующей смеси в меланжер (лейкоцитарный
смеситель), оба конца которого закрыты резиновыми кольцами.
Меланжерная методика РИТ позволяет обходиться без сложного
оборудования и аппаратуры. При сравнительном изучении на большом
клиническом материале получены результаты, не уступающие
классической анаэростатной методике.
Реагенты.
1. Едкий натрий х.ч.
2. Двууглекислый натрий х.ч.
3. Хлористый натрий х.ч.
4. Спирт этиловый.
5. Эфир для наркоза.
6. Стрептомицин.
7. Кортизон или гидрокортизон.
8. Альбумин из человеческой сыворотки, лиофилизированный.
9. Желатина пищевая.
10. Гемолизин. : Условия хранения и методика
11. Комплемент. : приготовления такие же, как при
12. Эритроциты барана. : микроанаэростатной методике РИТ.
Специальное оборудование.
Центрифуга.
Термостат с температурой +35 град. С.
Холодильник с температурой в морозильном отделении -10-15
град. С.
Инактиватор (водяная баня) с температурой +56 град. С.
Микроскоп бинокулярный с насадкой темного поля.
Осветитель к микроскопу.
Бактериальные фильтры Л .
3
Кварцевая лампа.
Аппарат для встряхивания (шуттель - аппарат).
Штативы для меланжеров.
Стерилизатор.
Шприцы на 5 и на 10 мл.
Иглы для инъекций.
Пинцеты хирургические.
Ножницы прямые.
Пробирки 15х150 мм.
Пробирки 12х60 мм.
Пробирки центрифужные.
Чашки Петри.
Бюксы стеклянные на 50 мл.
Флаконы стеклянные на 50 и 100 мл.
Банки стеклянные на 100, 200 и 500 мл.
Пипетки мерные на 1, 2, 5 и 10 мл с делениями на 0,01 мл.
Стекла предметные.
Стекла покровные.
Меланжеры (смесители) лейкоцитарные.
Резиновые кольца с диаметром, равным длине меланжера.
Ампулы стеклянные на 5 и 10 мл.
Лабораторные животные.
Кролики - самцы весом 2,5 - 3 кг.
Морские свинки.
Ход определения. Постановке основного опыта предшествует
подготовительная работа, состоящая из следующих этапов.
1. Приготовление солевого раствора. Растворяют 8,3 г
хлористого натрия х.ч. в 1 литре дистиллированной воды. Раствор
фильтруют через складчатый бумажный фильтр.
2. Обработка испытуемой сыворотки. Кровь для меланжерной
методики реакции иммобилизации бледных трепонем берут так же, как
и для микроанаэростатной.
3. Приготовление сред выживания. Меланжерная методика реакции
иммобилизации бледных трепонем может выполняться с теми же средами
выживания, что и микроанаэростатная методика РИТ.
4. Комплемент. Готовится и хранится так же, как при выполнении
микроанаэростатной методики РИТ.
5. Приготовление антигена. Для меланжерной методики РИТ
применяются те же штаммы кроличьего сифилиса и те же методики
приготовления, что и для микроанаэростатной методики.
6. Приготовление смеси комплемента с антигеном. Предварительно
в стерильных флаконах или колбах соединяют комплемент с антигеном
в нужных соотношениях для всех испытуемых сывороток. Антиген, т.е.
взвесь бледных трепонем в среде выживания, разливают равными
частями в два стерильных флакона или в две колбы и добавляют в
один флакон или колбу активный комплемент, а во второй флакон или
колбу - инактивированный комплемент (см. табл. 18).
Основной опыт. Каждую испытуемую сыворотку исследуют в двух
меланжерах. В стерильный меланжер набирают сыворотку до метки "I".
С конца меланжера стерильным ватным тампоном снимают остатки
сыворотки; после этого набирают до метки "II" смесь комплемента с
антигеном из флакона 1. Оба конца смесителя закрывают резиновым
кольцом (как при транспортировке крови). Во второй меланжер
набирают до метки "I" ту же самую сыворотку и до метки "II" смесь
комплемента с антигеном из флакона II. После одевания кольца
содержимое меланжеров перемешивают легким встряхиванием.
Таблица 18
РАСЧЕТ КОЛИЧЕСТВА ИНГРЕДИЕНТОВ ДЛЯ ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ
ИММОБИЛИЗАЦИИ БЛЕДНЫХ ТРЕПОНЕМ МЕЛАНЖЕРНЫМ МЕТОДОМ
------------------------T----------------------------------------¬
¦ Ингредиенты (в мл) ¦ Количество испытуемых сывороток ¦
¦ +----T----T----T------T------T-----T-----+
¦ ¦ 1 ¦ 5 ¦ 10 ¦ 15 ¦ 20 ¦ 25 ¦ 30 ¦
+-----------------------+----+----+----+------+------+-----+-----+
¦ Флакон I (опыт) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ Антиген ¦0,13¦0,65¦1,3 ¦ 1,95 ¦ 2,6 ¦ 3,25¦ 3,9 ¦
¦ Комплемент активный ¦0,13¦0,65¦1,3 ¦ 1,95 ¦ 2,6 ¦ 3,25¦ 3,9 ¦
¦ Флакон II (контроль) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ Антиген ¦0,13¦0,65¦1,3 ¦ 1,95 ¦ 2,6 ¦ 3,25¦ 3,9 ¦
¦ Комплемент инактив. ¦0,13¦0,65¦1,3 ¦ 1,95 ¦ 2,6 ¦ 3,25¦ 3,9 ¦
L-----------------------+----+----+----+------+------+-----+------
Ко всему опыту ставят следующие контроли: а) контроль
положительной сыворотки из предыдущего опыта; б) контроль
отрицательной сыворотки из предыдущего опыта; в) контроль
активного комплемента - в меланжер до метки "II" набирают смесь
комлемента с антигеном из флакона I; г) контроль инактивированного
комплемента - в меланжер до метки "II" набирают смесь комплемента
с антигеном из флакона II; д) контроль антигена - в меланжер до
отметки "II" набирают антиген (взвесь бледных трепонем в среде
выживания). Наполненные и закрытые кольцами меланжеры помещают в
штатив, предварительно надев на каждый пронумерованные кольца.
Штативы помещают в термостат на 18-20 часов.
Меланжеры, пробирки и другая лабораторная посуда, используемая
для постановки реакции иммобилизации бледных трепонем меланжерной
методикой, должна быть вымыта без применения дезинфицирующих
средств последовательно холодной, горячей и дистиллированной
водой, высушена, замонтирована и простерилизована
автоклавированием. Разлив ингредиентов производят в боксе,
предварительно облученном кварцевой лампой в течение 45-60 минут.
Оценка результатов. Через 18-20 часов меланжеры вынимают из
термостата попарно - опытный и контрольный - и производят подсчет
подвижных и неподвижных бледных трепонем. Для этого,
соответственно количеству меланжеров, в штатив расставляют попарно
и нумеруют пробирки (12х60 мм). После снятия кольца меланжер
опускают в соответствующую пробирку. Содержимое меланжера либо
свободно стекает на дно пробирки, либо выталкивается из него при
помощи резиновой пипетки, надетой на верхний конец меланжера. При
помощи этой же пипетки перемешивают находящуюся в пробирке
жидкость и, не снимая пипетки с верхнего конца меланжера, нижним
его концом переносят каплю жидкости из опытного меланжера на левую
сторону предметного стекла, а на правую сторону - каплю жидкости
из контрольного меланжера одной и той же испытуемой сыворотки.
Предварительно посередине стекла ставят номер меланжера. Капли
накрывают покровным стеклом 20х20 мм. Дальнейшая регистрация
результатов реакции производится аналогично регистрации
результатов, полученных при исследовании сывороток крови
микроанаэростатной методикой реакции иммобилизации бледных
трепонем.
Определение остаточного комплемента. После регистрации
результатов реакции иммобилизации бледных трепонем в содержимом
меланжеров, вылитом в пробирки, определяют остаточный комплемент
добавлением в каждую пробирку гемолитической системы в объеме 0,1
мл. Гемолитическая система состоит из равных объемов 1% взвеси
эритроцитов барана с плотного осадка и гемолитической сыворотки по
утроенному титру. При правильно прошедшем опыте в содержимом
контрольного меланжера с инактивированным комплементом гемолиз
должен отсутствовать. В содержимом опытных меланжеров с активным
комплементом гемолиз должен быть полным, или его задержка не
должна превышать один плюс. Определение остаточного комплемента
необходимо для суждения о том, достаточным ли было количество
комплемента, не была ли подвижность бледных трепонем обусловлена
тем, что количество его было недостаточным, и специфические
иммобилизины не могли проявить свою иммобилизирующую активность.
Источники ошибок.
Те же, что и при постановке микроанаэростатной методики РИТ.
4.3.11. Микрометод реакции связывания комплемента
комплексом антигена патогенных бледных трепонем и
противотрепонемных антител
Принцип. Реакция основана на феномене связывания комплемента
комплексом специфическое противотрепонемное антитело +
специфический антиген, приготовленный из патогенных бледных
трепонем. Индикация образовавшегося комплемента достигается
добавлением гемолитической системы (гемолитическая сыворотка +
эритроциты барана). Общий объем реагирующей смеси равен 0,5 мл.
Реагенты.
1. 0,85% раствор хлористого натрия х.ч. (физиологический
раствор).
2. Антигены: специфические - протеиновая фракция или
ультраозвученный антиген из патогенных бледных трепонем.
Сохраняются в холодильнике.
3. Комплемент. Применяется смесь сывороток крови здоровых
морских свинок.
4. Гемолизин - кроличья гемолитическая сыворотка с разными
титрами. Сохраняется в холодильнике.
5. Эритроциты барана.
Специальное оборудование.
Центрифуга.
Термостат с температурой +37 град. С.
Холодильник с температурой +4-6 град. С.
Инактиватор (водяная баня) с температурой +56 град. С.
Пробирки 15х100 мм.
Пробирки 15х150 мм.
Пробирки 11х75 мм.
Пипетки градуированные на 1, 2, 5 и 10 мл с делениями на 0,01
мл.
Банки стеклянные на 50, 100, 200 и 500 мл.
Ход определения. Постановке основного опыта предшествует
подготовительная работа, состоящая из следующих этапов.
1. Приготовление физиологического : Производят так же,
раствора. : как при постановке
2. Обработка испытуемой сыворотки. : реакции Вассермана.
3. Приготовление разведений антигенов. :
4. Приготовление гемолитической системы :
5. Титрование комплемента. Комплемент морской свинки разводят
1:10 физиологическим раствором. При работе с сухим комплементом
необходимо предварительно растворить содержимое ампулы в
физиологическом растворе в объеме, равном объему высушенного
комплемента.
Нормальную инактивированную сыворотку человека, отрицательную
в реакции Вассермана и в осадочных реакциях, разводят
физиологическим раствором 1:5. Титрование комплемента производят в
20 пробирках, поставленных по 10 двумя рядами: первый ряд - для
титрования комплемента в присутствии антигена, второй - для
титрования комплемента в присутствии физиологического раствора.
Четыре контрольных пробирки - одна для контроля антигена и по
одной для контроля комплемента, гемолитической сыворотки и
физиологического раствора - заполняют до объединения
гемолитической сыворотки и взвеси эритроцитов барана (см. табл.
19).
Таблица 19
----------------------------------T------------------------------¬
¦ Ингредиенты (в мл) ¦ пробирки ¦
¦ +------T--------T--------T-----+
¦ ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦
+---------------------------------+------+--------+--------+-----+
¦3% взвесь эритроцитов барана ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1¦
+---------------------------------+------+--------+--------+-----+
¦Антиген, разведенный по титру ¦ - ¦ 0,2 ¦ - ¦ - ¦
+---------------------------------+------+--------+--------+-----+
¦Комплемент, разведенный 1:10 ¦ - ¦ - ¦ 0,1 ¦ - ¦
+---------------------------------+------+--------+--------+-----+
¦Гемолитическая сыворотка, раз- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦веденная по утроенному титру ¦ - ¦ - ¦ - ¦ 0,1¦
+---------------------------------+------+--------+--------+-----+
¦Физиологический раствор ¦ 0,4 ¦ 0,2 ¦ 0,3 ¦ 0,3¦
L---------------------------------+------+--------+--------+------
После 45 минут пребывания в термостате во всех пробирках с
контролями ингредиентов должен отсутствовать гемолиз.
Комплемент, разведенный 1:10, разливают в 10 пробирок второго
ряда в объемах: 0,1, 0,2, 0,24, 0,3, 0,36, 0,4, 0,44, 0,5, 0,56,
0,6 мл. Общий объем содержимого пробирок доводят до 1 мл
соответствующими объемами физиологического раствора: 0,9, 0,8,
0,76, 0,7, 0,64, 0,6, 0,56, 0,5, 0,44 и 0,4. Полученную в каждой
пробирке смесь переносят в объеме 0,1 мл в соответствующие
пробирки первого ряда, а по 0,8 мл из каждой пробирки удаляют.
Нормальную инактивированную человеческую сыворотку, разведенную
1:5 физиологическим раствором, разливают во все 20 пробирок по 0,1
мл. Антиген, разведенный по титру, приливают по 0,1 мл во все 10
пробирок первого ряда, физиологический раствор - по 0,1 мл во все
10 пробирок второго ряда. После 45-минутной инкубации в термостате
во все 20 пробирок приливают по 0,2 мл гемолитической системы.
Повторная инкубация в термостате продолжается 45 минут (см.
табл. 20).
Титром комплемента считают наименьшее его количество,
обеспечившее полный гемолиз 0,1 мл эритроцитов барана в
присутствии антигена и нормальной человеческой сыворотки. Для
основного опыта необходима рабочая доза комплемента, т.е. надбавка
к титру в пределах 20-30% в зависимости от степени гемолиза в
последних пробирках с меньшим количеством комплемента. Например,
полный гемолиз получен в третьей пробирке - рабочая доза
комплемента будет равна 3,6%. Готовят необходимый для данного
рабочего дня объем комплемента, разведенного по рабочей дозе,
исходя из расчета по 0,2 мл на каждую испытуемую сыворотку.
Таблица 20
СХЕМА ТИТРОВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА
---------------------T--------------------------------------------¬
¦ Ингредиенты ¦ Пробирки ¦
¦ (в мл) +----T---T----T---T----T---T----T---T----T---+
¦ ¦ 1 ¦2 ¦3 ¦4 ¦5 ¦6 ¦7 ¦8 ¦9 ¦10 ¦
+--------------------+----+---+----+---+----+---+----+---+----+---+
¦ Второй ряд ¦
+--------------------T----T---T----T---T----T---T----T---T----T---+
¦ Комплемент ¦ 0,1¦0,2¦0,24¦0,3¦0,36¦0,4¦0,44¦0,5¦0,56¦0,6¦
¦ Физиологический ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ раствор ¦ 0,9¦0,8¦0,76¦0,7¦0,64¦0,6¦0,56¦0,5¦0,44¦0,4¦
+--------------------+----+---+----+---+----+---+----+---+----+---+
¦ После тщательного перемешивания из каждой пробирки ¦
¦ переносят по 0,1 мл в соответствующие пробирки первого ряда ¦
¦ и по 0,8 мл удаляют из каждой пробирки ¦
+--------------------T----T---T----T---T----T---T----T---T----T---+
¦Физиологический ¦ 0,1¦0,1¦0,1 ¦0,1¦0,1 ¦0,1¦0,1 ¦0,1¦0,1 ¦0,1¦
¦раствор ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+--------------------+----+---+----+---+----+---+----+---+----+---+
¦ Первый ряд ¦
+--------------------T----T---T----T---T----T---T----T---T----T---+
¦Антиген по титру ¦ 0,1¦0,1¦0,1 ¦0,1¦0,1 ¦0,1¦ 0,1¦0,1¦ 0,1¦0,1¦
+--------------------+----+---+----+---+----+---+----+---+----+---+
¦Нормальная инакти- ¦ ¦
¦вированная сыворот- ¦ ¦
¦ка человека (1:5) ¦ Во все 20 пробирок по 0,1 мл. ¦
+--------------------+--------------------------------------------+
¦ Встряхнуть и поставить в термостат на 45 минут. ¦
+--------------------T--------------------------------------------+
¦Гемолитическая ¦ ¦
¦система ¦ Во все 20 пробирок по 0,2 мл. ¦
+--------------------+--------------------------------------------+
¦ Встряхнуть и поставить в термостат на 45 минут. ¦
L------------------------------------------------------------------
Основной опыт. Каждую испытуемую сыворотку, разведенную 1:5
физиологическим раствором, исследуют в двух пробирках, разлив
предварительно в каждую по 0,1 мл. В первую пробирку приливают 0,1
мл антигена, разведенного по титру, во вторую (контрольную) - 0,1
мл физиологического раствора. Комплемент, разведенный по рабочей
дозе, добавляют по 0,1 мл во все опытные и контрольные пробирки.
Легким встряхиванием перемешивают содержимое пробирок и помещают
их в термостат на 45 минут. После добавления во все пробирки
гемолитической системы в объеме 0,2 мл их повторно помещают в
термостат на 45 минут (см. табл. 21).
Таблица 21
СХЕМА РЕАКЦИИ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА
С МАЛЫМИ ОБЪЕМАМИ ИНГРЕДИЕНТОВ
--------------------------------------T--------------------------¬
¦ Ингредиенты (в мл) ¦ Пробирки ¦
¦ +-----------T--------------+
¦ ¦ 1 ¦ 2 (контроль) ¦
+-------------------------------------+-----------+--------------+
¦ Сыворотка испытуемая (1:5) ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦
¦ Антиген по титру ¦ 0,1 ¦ - ¦
¦ Физиологический раствор ¦ - ¦ 0,1 ¦
¦ Комплемент по рабочей дозе ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦
+-------------------------------------+-----------+--------------+
¦ Встряхнуть, поставить в термостат на 45 минут ¦
+-------------------------------------T-----------T--------------+
¦ Гемолитическая система ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦
+-------------------------------------+-----------+--------------+
¦ Встряхнуть, поставить в термостат на 45 минут ¦
¦ (до наступления гемолиза в контрольных пробирках) ¦
L-----------------------------------------------------------------
Оценка результатов. После наступления гемолиза в контрольных
пробирках регистрируют результаты реакции по наличию или
отсутствию гемолиза в опытных пробирках. Для обозначения
позитивности реакции связывания комплемента с малыми объемами
ингредиентов пользуются системой четырех плюсов: полная задержка
гемолиза - резко положительная реакция (4+); значительная задержка
гемолиза - положительная реакция (3+); частичная задержка гемолиза
- слабо положительная реакция (2+); незначительная задержка
гемолиза - сомнительная реакция (1+).
Источники ошибок.
1. Избыток комплемента в опыте.
2. Неправильное хранение испытуемой сыворотки.
3. Длительное хранение испытуемой сыворотки.
4.3.12. Микрометод реакции трехфазного связывания комплемента
(реакция Колмера в 1/5 объема, качественный метод)
Принцип. Антитела, находящиеся в сыворотке крови больных
сифилисом, обладают свойством вступать в соединение с трепонемными
антигенами. Индикация образовавшегося комплекса достигается
введением гемолитической системы (эритроциты барана +
гемолитическая сыворотка). Реакция позволяет с минимальным
количеством антигена пользоваться весьма чувствительным методом,
основанным на трехфазности температурных режимов, при которых
протекает связывание комплемента.
Реагенты.
1. Солевой раствор - хлористый натрий х.ч. - 8,5 г,
сернокислый магний х.ч. - 0,1 г, дистиллированная вода - 1 л.
2. Антигены - протеиновая фракция или ультраозвученный,
приготовленные из бледных трепонем. Сохраняются в холодильнике.
3. Комплемент. Может быть использован лиофильно высушенный или
жидкий.
4. Гемолизин - кроличья гемолитическая сыворотка с разными
титрами. Консервируют нейтральным глицерином 1:1, хранят в
холодильнике.
5. Эритроциты барана.
Специальное оборудование.
Центрифуга.
Термостат с температурой +37 град. С.
Холодильник с температурой +4-6 град. С.
Инактиватор (водяная баня) с температурой +56 град. С.
Пробирки 15х150 мм.
Пробирки 15х100 мм.
Пипетки градуированные на 1, 2, 5 и 10 мл с делениями на 0,01
мл.
Цилиндры градуированные на 100 и 500 мл.
Банки стеклянные на 50, 100, 200 и 500 мл.
Ход определения. Постановке основного опыта предшествует
подготовительная работа, состоящая из следующих этапов.
1. Приготовление солевого раствора.
2. Обработка испытуемой сыворотки.
3. Приготовление разведения антигена.
4. Приготовление раствора гемолизина и определение его титра.
5. Приготовление взвеси эритроцитов и раствора гемолизина.
Производят так же, как при постановке оригинальной реакции
Колмера.
6. Титрование комплемента. Титрование комплемента проводят в
одном ряду в семи пробирках (седьмая пробирка - контрольная).
Комплемент разведенный 1:50, разливают в шесть пробирок в объемах:
0,3, 0,25, 0,2, 0,15, 0,12, 0,1 мл. В каждую пробирку добавляют
солевой раствор: 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,38, 0,4, а в контрольную
- 0,5 мл. Пробирки инкубируют в термостате 45 минут, затем
доливают по 0,1 мл разведенного по удвоенному титру гемолизина и
по 0,1 мл 2% взвеси бараньих эритроцитов. Перемешав содержимое
пробирок встряхиванием, их помещают в термостат на 45 минут (см.
табл. 22).
Таблица 22
СХЕМА ТИТРОВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА
ДЛЯ РЕАКЦИИ КОЛМЕРА В 1/5 ОБЪЕМА
--------------------T--------------------------------------------¬
¦ Ингредиенты ¦ NN пробирок ¦
¦ (в мл) +----T------T-----T------T-----T----T--------+
¦ ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦ 7 ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦(контр.)¦
+-------------------+----+------+-----+------+-----+----+--------+
¦ Комплемент (1:50) ¦0,3 ¦ 0,25 ¦ 0,2 ¦ 0,15 ¦ 0,12¦ 0,1¦ - ¦
¦ Солевой раствор ¦0,2 ¦ 0,25 ¦ 0,3 ¦ 0,35 ¦ 0,38¦ 0,4¦ 0,5 ¦
+-------------------+----+------+-----+------+-----+----+--------+
¦ Встряхнуть, поставить в термостат на 45 минут ¦
+-------------------T----T------T-----T------T-----T----T--------+
¦ Гемолитическая ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ сыворотка по ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ удвоенному титру ¦0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1¦ 0,1 ¦
¦ 2% взвесь ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ эритроцитов барана¦0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1¦ 0,1 ¦
+-------------------+----+------+-----+------+-----+----+--------+
¦ Встряхнуть, поставить в термостат на 45 минут ¦
L-----------------------------------------------------------------
Титр комплемента (1 единица) - это наименьшее его количество,
способствующее полному гемолизу 0,1 мл 2% взвеси бараньих
эритроцитов гемолитической сывороткой. Для реакции Колмера в 1/5
объема применяют рабочую дозу комплемента, равную 1,5 единицам.
Если титр комплемента - 0,2, то рабочая доза составит 0,3. Для
опыта рабочая доза комплемента определяется по следующей формуле:
50
----- х 0,2 = 33,
0,3
то есть - 1 мл комплемента на 32 мл солевого раствора. 50 -
разведение комплемента, 0,2 - объем разведенного комплемента на
одну пробирку, а 0,3 - 1,5 единицы комплемента.
Для подсчета необходимых разведений комплемента используется
специальная таблица (см. табл. 23).
Таблица 23
(в мл)
----------------T-------------T------------T---------------------¬
¦ Титр ¦ Рабочая ¦Разведения ¦ Приготовление ¦
¦ комплемента ¦ доза ¦комплемента ¦ разведений ¦
¦ (1 единица) ¦ комплемента ¦ +-----------T---------+
¦ ¦(1,5 единицы)¦ ¦ Комплемент¦ Солевой ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ раствор ¦
+---------------+-------------+------------+-----------+---------+
¦ 0,25 ¦ 0,38 ¦ 1:20 ¦ 0,5 ¦ 10,0 ¦
¦ 0,2 ¦ 0,3 ¦ 1:25 ¦ 0,5 ¦ 12,5 ¦
¦ 0,15 ¦ 0,23 ¦ 1:33 ¦ 0,33 ¦ 11,0 ¦
¦ 0,12 ¦ 0,18 ¦ 1:42 ¦ 0,25 ¦ 10,5 ¦
¦ 0,1 ¦ 0,15 ¦ 1:50 ¦ 0,2 ¦ 10,0 ¦
L---------------+-------------+------------+-----------+----------
Основной опыт. Реакция Колмера в 1/5 объема проводится в двух
пробирках для каждой испытуемой сыворотки. В первую и вторую
пробирки разливают испытуемую инактивированную сыворотку по 0,2
мл. В первую пробирку приливают 0,1 мл антигена, разведенного по
титру, во вторую (контрольную) - 0,1 мл солевого раствора. После
10-минутного пребывания при комнатной температуре в обе пробирки
добавляют по 0,2 мл комплемента, разведенного по рабочей дозе (1,5
единицы). Встряхнув, пробирки помещают в холодильник на 18-20
часов с последующей инкубаций в термостате в течение 10 минут.
Затем во все пробирки доливают по 0,1 мл гемолитической сыворотки,
разведенной по удвоенному титру, и по 0,1 мл 2% взвеси эритроцитов
барана, встряхивают и помещают в термостат до полного гемолиза в
контрольных пробирках. Ко всему опыту ставят следующие контроли:
1) контроль заведомо положительной сыворотки из предыдущего опыта;
2) контроль заведомо отрицательной сыворотки из предыдущего опыта;
3) контроль антигена; 4) контроль гемолитической сыворотки; 5)
контроль эритроцитов барана.
Схему постановки реакции Колмера в 1/5 объема (см. табл. 24).
Оценка результатов. Для обозначения позитивности реакции
Колмера в 1/5 объема пользуются системой четырех плюсов. После
наступления гемолиза в контрольных пробирках регистрируют
результаты реакции по наличию или степени задержки гемолиза в
опытных пробирках. Полный гемолиз в опытных пробирках расценивают
как отрицательный результат реакции. Полная задержка гемолиза -
резко положительная реакция (4+); значительная задержка гемолиза -
положительная реакция (3+); частичная задержка гемолиза - слабо
положительная реакция (2+); незначительная задержка гемолиза -
сомнительная реакция (1+).
Источники ошибок.
1. Избыток или недостаток комплемента в опыте.
2. Неправильное хранение испытуемой сыворотки.
3. Длительное хранение испытуемой сыворотки.
Таблица 24
СХЕМА ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ КОЛМЕРА В 1/5 ОБЪЕМА
------------------------T---------------------------------------¬
¦ ¦ Пробирки ¦
¦ +-----------T---------------------------+
¦ Ингредиенты ¦ Опыт ¦ Контроли ¦
¦ (в мл) +----T------+---T---T---T---T---T---T---+
¦ ¦ 1 ¦ 2 ¦ 1¦ 2¦ 3¦ 4¦ 5¦ 6¦ 7 ¦
¦ ¦ ¦контр.¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-----------------------+----+------+---+---+---+---+---+---+---+
¦Испытуемая инактивиро- ¦0,2 ¦ 0,2 ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦- ¦
¦ванная сыворотка (1:5) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Антиген, разведенный ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦по титру ¦0,1 ¦ - ¦0,1¦ - ¦0,1¦ - ¦0,1¦ - ¦- ¦
¦Солевой раствор ¦ - ¦ 0,1 ¦ - ¦0,1¦ - ¦0,1¦0,2¦0,3¦0,6¦
¦Заведомо положительная ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦инактивированная сыво- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ротка (1:5) ¦ - ¦ - ¦0,2¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦- ¦
¦Заведомо отрицательная ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦инактивированная сыво- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ротка (1:5) ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦0,2¦ - ¦ - ¦ - ¦- ¦
+-----------------------+----+------+---+---+---+---+---+---+---+
¦ Встряхнуть, оставить при комнатной температуре на ¦
¦ 10 минут ¦
+-----------------------T----T------T---T---T---T---T---T---T---+
¦Комплемент по рабочей ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦дозе (1,5 единицы) ¦0,2 ¦ 0,2 ¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦ - ¦
+-----------------------+----+------+---+---+---+---+---+---+---+
¦ Встряхнуть, поставить в холодильник на 18-20 часов ¦
¦ с последующей инкубацией в термостате в течение 10 минут ¦
+-----------------------T----T------T---T---T---T---T---T---T---+
¦Гемолитическая сыворот-¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ка по удвоенному титру ¦0,1 ¦ 0,1 ¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦ - ¦
¦2% взвесь эритроцитов ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦барана ¦0,1 ¦ 0,1 ¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦
+-----------------------+----+------+---+---+---+---+---+---+---+
¦ Встряхнуть, поставить в термостат на 45-60 минут ¦
¦ до наступления полного гемолиза в контрольных пробирках ¦
L----------------------------------------------------------------
4.3.13. Микрометод реакции трехфазного связывания комплемента
(реакция Колмера в 1/5 объема, количественный метод)
Принцип. Определение титра реагинов в положительных сыворотках
путем исследования увеличивающихся разведений сыворотки при
использовании уменьшенных количеств ингредиентов. Особенностью
реакции является трехфазность температурных режимов, при которых
происходит связывание комплемента.
Реагенты.
1. Солевой раствор - хлористый натрий х.ч. - 8,5 г,
сернокислый магний х.ч.- 0,1 г, дистиллированная вода - 1 л.
2. Антигены - протеиновая фракция или ультраозвученный
антиген, приготовленный из бледных трепонем. Разводят в солевом
растворе согласно способу и титру, указанным на этикетке. Хранят в
холодильнике.
3. Комплемент. Может быть использован лиофильно высушенный или
жидкий, представляющий смесь сывороток крови морских свинок.
4. Гемолизин - кроличья гемолитическая сыворотка.
Консервируется нейтральным химически чистым глицерином в
соотношении 1:1, хранится в холодильнике.
Специальное оборудование.
Центрифуга.
Термостат с температурой +37 град. С.
Холодильник с температурой +4-6 град. С.
Инактиватор (водяная баня) с температурой +56 град. С.
Пробирки 15х150 мм.
Пробирки 11х75 мм.
Пипетки градуированные на 1, 2, 5 и 10 мл с делениями на 0,01
мл.
Цилиндры градуированные на 100 и 500 мл.
Банки стеклянные на 200 и 500 мл.
Ход определения. Постановке основного опыта предшествует
подготовительная работа, состоящая из следующих этапов.
1. Подготовка испытуемой сыворотки. Сыворотка, обнаружившая
резко положительные результаты в качественной реакции Колмера в
1/5 объема, повторно инактивируется в течение 15 минут в водяной
бане. Если исследуют новую порцию той же самой сыворотки,
инактивирование удлиняют до 30 минут.
|
