|
Стр. 8
Ход определения. Постановке основного опыта предшествует
подготовительная работа, состоящая из следующих этапов.
1. Обработка испытуемой сыворотки производится согласно
методике, принятой для серологических исследований на сифилис.
2. Приготовление солевого раствора. В 1 л дистиллированной
воды растворяют 0,85 г хлористого натрия и 0,1 г сернокислого
магния. Свежеприготовленный солевой раствор фильтруют через
складчатый бумажный фильтр и используют только в день постановки
реакции. Солевой раствор хранению не подлежит.
3. Приготовление разведения антигенов. Антигены разводят
соответственно способу и титру, указанным на этикетке. Титр - это
количество антигена на 1 мл солевого раствора.
4. Приготовление раствора гемолизина. Гемолитическую сыворотку
консервируют химически чистым нейтральным глицерином в соотношении
1:1 и хранят в холодильнике. Активность такой основной
гемолитической сыворотки сохраняется в течение 3-4 лет. Из
основного консервированного гемолизина готовят рабочий раствор
1:100, который и применяется для постановки основного опыта. Для
приготовления рабочего раствора гемолизина в колбу отмеряют 94 мл
солевого раствора и 4 мл 5% фенола. Взбалтыванием раствор фенола
хорошо перемешивается с солевым раствором, затем туда добавляют 2
мл основного консервированного гемолизина. Содержимое колбы вновь
перемешивают. Полученный рабочий раствор сохраняют в холодильнике,
срок годности 1 год.
Определение титра гемолизина в рабочем растворе 1:100. Для
определения титра гемолизина в рабочем растворе 1:100 используют
10 пробирок, в которых готовят ряд возрастающих разведений от
1:1000 до 1:16000 в объеме 0,5 мл. Во все 10 пробирок к каждому
разведению рабочего раствора гемолизина добавляют по 0,3 мл
комплемента, разведенного 1:30 , и по 0,5 мл 2% взвеси бараньих
эритроцитов (см. табл. 8). Пробирки встряхивают и помещают в
термостат на 1 час при периодическом встряхивании. После
одночасовой инкубации определяют единицу или титр рабочего
раствора гемолизина, т.е. наивысшее разведение, которое в
присутствии комплемента в течение 1 часа пребывания в термостате
дает полный гемолиз 0,5 мл 2% взвеси бараньих эритроцитов.
Для титрования комплемента и проведения опыта применяется
гемолизин по удвоенному титру (2 единицы гемолизина) (см. табл.
9). Например, титр гемолизина в рабочем растворе - 1:6000 (1
единица гемолизина), удвоенный титр - 1:3000 (2 единицы
гемолизина). Так как рабочий раствор гемолизина приготовлен 1:100,
то для основного опыта его нужно развести 1:30 (1 мл рабочего
раствора гемолизина + 29 мл солевого раствора). Титруют каждую
новую серию гемолизина.
Таблица 8
Схема определения титра гемолизина в рабочем растворе
(в мл)
---------------T-------------T-----------T--------T--------------¬
¦ Разведения ¦ Количество ¦Комплемент ¦Солевой ¦ 2% взвесь ¦
¦ гемолизина ¦разведенного ¦в разведе- ¦раствор ¦ эритроцитов ¦
¦ ¦ гемолизина ¦нии 1:30 ¦ ¦ барана ¦
+--------------+-------------+-----------+--------+--------------+
¦ 1:1000 ¦ 0,5 ¦ 0,3 ¦ 1,7 ¦ 0,5 ¦
¦ 1:2000 ¦ 0,5 ¦ 0,3 ¦ 1,7 ¦ 0,5 ¦
¦ 1:3000 ¦ 0,5 ¦ 0,3 ¦ 1,7 ¦ 0,5 ¦
¦ 1:4000 ¦ 0,5 ¦ 0,3 ¦ 1,7 ¦ 0,5 ¦
¦ 1:5000 ¦ 0,5 ¦ 0,3 ¦ 1,7 ¦ 0,5 ¦
¦ 1:6000 ¦ 0,5 ¦ 0,3 ¦ 1,7 ¦ 0,5 ¦
¦ 100 ¦ 0,5 ¦ 0,3 ¦ 1,7 ¦ 0,5 ¦
¦ 1:10000 ¦ 0,5 ¦ 0,3 ¦ 1,7 ¦ 0,5 ¦
¦ 1:12000 ¦ 0,5 ¦ 0,3 ¦ 1,7 ¦ 0,5 ¦
¦ 1:16000 ¦ 0,5 ¦ 0,3 ¦ 1,7 ¦ 0,5 ¦
L--------------+-------------+-----------+--------+---------------
Таблица 9
Схема разведения гемолизина
-------------------T------------------T--------------------------¬
¦ Титр гемолизина ¦ Гемолизин по ¦ Приготовление раствора ¦
¦ (1 единица ¦ удвоенному ¦ гемолизина для опыта ¦
¦ гемолизина) ¦ титру (2 еди- +-------------T------------+
¦ ¦ ницы гемолизина) ¦ рабочий ¦ солевой ¦
¦ ¦ ¦ раствор ¦ раствор ¦
¦ ¦ ¦ гемолизина ¦ ¦
¦ ¦ ¦ 1:100 ¦ ¦
+------------------+------------------+-------------+------------+
¦ 1:4000 ¦ 1:2000 ¦ 0,3 ¦ 5,7 ¦
¦ 1:5000 ¦ 1:2500 ¦ 0,2 ¦ 4,8 ¦
¦ 1:6000 ¦ 1:3000 ¦ 0,2 ¦ 5,8 ¦
¦ 100 ¦ 1:4000 ¦ 0,15 ¦ 5,85 ¦
¦ 1:10000 ¦ 1:5000 ¦ 0,1 ¦ 4,9 ¦
¦ 1:12000 ¦ 1:6000 ¦ 0,1 ¦ 5,9 ¦
¦ 1:16000 ¦ 100 ¦ 0,1 ¦ 7,9 ¦
L------------------+------------------+-------------+-------------
Разведения гемолизина по удвоенному титру готовят в объеме,
необходимом для данного рабочего дня.
5. Приготовление взвеси эритроцитов барана. Дефибринированную
кровь барана в объеме, необходимом для работы на данный день,
центрифугируют, плазму осторожно отсасывают и осадок трижды
отмывают 5-6 объемами солевого раствора. При последнем промывании
надосадочная жидкость должна быть бесцветной. Из плотного осадка
готовят 2% взвесь в солевом растворе в объеме, необходимом для
данного рабочего дня.
Раствор гемолизина и взвесь эритроцитов барана при титровании
комплемента при постановке основного опыта разливают раздельно.
6. Титрование комплемента. Комплемент морской свинки разводят
солевым раствором 1:30. Титрование проводят в восьми пробирках. В
первые семь пробирок разливают разведенный комплемент в дозах 0,2;
0,25; 0,3; 0,35; 0,4; 0,45; 0,5 мл и добавляют во все семь
пробирок по 0,5 мл антигена, разведенного по титру. После этого в
восемь пробирок разливают солевой раствор в следующих дозах: 1,3;
1,25; 1,2; 1,15; 1,1; 1,05; 1,0; 2,5 мл. Штатив с пробирками
встряхивают и помещают в термостат на 45 минут. После инкубации в
первые семь пробирок приливают раствор гемолизина по удвоенному
титру по 0,5 мл и 2% взвесь эритроцитов барана по 0,5 мл во все
восемь пробирок. Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и
помещают в термостат на 45 минут при периодическом встряхивании
(см. табл. 10).
Таблица 10
Схема титрования комплемента для реакции Колмера
--------------------------T--------------------------------------¬
¦ Ингредиенты (в мл) ¦ NN пробирок ¦
¦ +-----T-----T----T----T---T----T---T---+
¦ ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦ 7 ¦ 8 ¦
+-------------------------+-----+-----+----+----+---+----+---+---+
¦ Комплемент 1:30 ¦ 0,2 ¦0,25 ¦0,3 ¦0,35¦0,4¦0,45¦0,5¦ - ¦
¦ Антиген по титру ¦ 0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5¦0,5 ¦0,5¦ - ¦
¦ Солевой раствор ¦ 1,3 ¦1,25 ¦1,2 ¦1,15¦1,1¦1,05¦1,0¦2,5¦
+-------------------------+-----+-----+----+----+---+----+---+---+
¦ Встряхнуть, поставить в термостат на 45 минут ¦
+-------------------------T-----T-----T----T----T---T----T---T---+
¦ Гемолитическая сыворотка¦ 0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5¦ 0,5¦0,5¦ - ¦
¦ по удвоенному титру ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ 2% взвесь эритроцитов ¦ 0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5¦ 0,5¦0,5¦0,5¦
¦ барана ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-------------------------+-----+-----+----+----+---+----+---+---+
¦ Встряхнуть, поставить в термостат на 45 минут ¦
L-----------------------------------------------------------------
По истечении 45 минут определяют рабочую дозу комплемента.
Минимальное количество комплемента, которое способствовало полному
гемолизу 0,5 мл 2% взвеси эритроцитов барана, является титром
комплемента. Рабочая доза комплемента должна быть на 0,05 мл
больше титра комплемента (1 единица). Для реакции Колмера
используют разведение комплемента, содержащее 2 единицы в 1 мл.
Например, титр комплемента 0,3 мл; рабочая доза 0,3 + 0,05 = 0,35
мл (1 единица). Две точных единицы, или общая рабочая доза, будут
равны 0,7 мл. Для того чтобы подсчитать необходимое разведение
комплемента для проводимой реакции, нужно основное разведение 1:30
30
разделить на две единицы, т.е. на 0,7 : ---- = 43. Следовательно,
0,7
в 42 объемах солевого раствора необходимо развести 1 мл
комплемента морской свинки.
Для подсчета необходимых разведений комплемента используется
специальная таблица (см. табл. 11).
Таблица 11
Схема разведения комплемента (в мл)
---------------T------------T-----T------------T-----------------¬
¦ Титр ¦Рабочая доза¦Две ¦Разведения ¦ Приготовление ¦
¦ комплемента ¦комплемента ¦еди- ¦комплемента ¦ разведений ¦
¦ ¦(1 единица) ¦ницы ¦ ¦ комплемента ¦
¦ ¦ ¦ ¦ +--------T--------+
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ Компле-¦Солевой ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ мент ¦раствор ¦
+--------------+------------+-----+------------+--------+--------+
¦ 0,3 ¦ 0,35 ¦0,7 ¦ 1:43 ¦ 1 ¦ 42 ¦
¦ 0,35 ¦ 0,4 ¦0,8 ¦ 1:37 ¦ 1 ¦ 36 ¦
¦ 0,4 ¦ 0,45 ¦0,9 ¦ 1:33 ¦ 1 ¦ 32 ¦
¦ 0,45 ¦ 0,5 ¦1,0 ¦ 1:30 ¦ 1 ¦ 29 ¦
¦ 0,5 ¦ 0,55 ¦1,1 ¦ 1:27 ¦ 1 ¦ 26 ¦
L--------------+------------+-----+------------+--------+---------
Основной опыт. При постановке реакции Колмера с двумя
антигенами - неспецифическим и кардиолипиновым - каждая сыворотка
исследуется в трех пробирках. Кроме того, ко всему опыту ставят
контроль ингредиентов в четырех пробирках. Каждую исследуемую
инактивированную сыворотку разливают в три пробирки по 0,2 мл; в
первую пробирку приливают 0,5 мл антигена I по по титру, во вторую
- 0,5 мл антигена II по титру; в третью - 0,5 мл солевого
раствора. В первую пробирку для контроля ингредиентов наливают 0,5
мл антигена I по титру, во вторую - 0,5 мл антигена II по титру.
Солевой раствор добавляют в пробирки для контроля ингредиентов в
следующих объемах: в первую пробирку - 0,2 мл, во вторую - 0,2 мл,
в третью - 0,7 мл и в четвертую - 2,2 мл. После встряхивания все
пробирки оставляют при комнатной температуре на 10 минут (первая
фаза реакции). Затем во все пробирки с исследуемыми сыворотками и
в первую, вторую и третью пробирки для контроля ингредиентов
приливают по 1,0 мл комплемента, разведенного по общей рабочей
дозе (2 единицы). После встряхивания все пробирки помещают в
холодильник при температуре +6-8 град. С на 18-20 часов (вторая
фаза реакции). После чего пробирки помещают в термостат, а затем
добавляют по 0,5 мл гемолитической сыворотки, разведенной по
удвоенному титру, во все пробирки с исследуемыми сыворотками и в
первую, вторую и третью пробирки для контроля ингредиентов и по
0,5 мл 2% взвеси эритроцитов барана во все пробирки. После
встряхивания пробирки помещают в термостат на 45-60 минут до
полного гемолиза в контрольных пробирках исследуемых сывороток
(третья фаза реакции) (см. табл. 12).
Таблица 12
СХЕМА ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ КОЛМЕРА
----------------------T------------------------------------------¬
¦ ¦ NN пробирок ¦
¦ +--------------T--------T------------------+
¦ Ингредиенты ¦ исследуемая ¦ ¦ контроль ¦
¦ (в мл) ¦ сыворотка ¦ ¦ ингредиентов ¦
¦ +-------T------+ +---T----T----T----+
¦ ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦
¦ ¦ ¦ ¦(контр.)¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+---------------------+-------+------+--------+---+----+----+----+
¦ Испытуемая ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ инактивированная ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ сыворотка, ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ разведенная 1:5 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦- ¦- ¦ - ¦ - ¦
+---------------------+-------+------+--------+---+----+----+----+
¦ Антиген I ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ по титру ¦ 0,5 ¦ - ¦ - ¦0,5¦- ¦ - ¦ - ¦
+---------------------+-------+------+--------+---+----+----+----+
¦ Антиген II ¦ - ¦ 0,5 ¦ - ¦ - ¦0,5 ¦ - ¦ - ¦
¦ по титру ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+---------------------+-------+------+--------+---+----+----+----+
¦ Солевой раствор ¦ - ¦ - ¦ 0,5 ¦0,2¦0,2 ¦0,7 ¦2,2 ¦
+---------------------+-------+------+--------+---+----+----+----+
¦ Встряхнуть, оставить при комнатной температуре на 10 минут ¦
+---------------------T-------T------T--------T---T----T----T----+
¦ Комплемент ¦ 1,0 ¦ 1,0 ¦ 1,0 ¦1,0¦ 1,0¦ 1,0¦ - ¦
¦ (2 единицы) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+---------------------+-------+------+--------+---+----+----+----+
¦ Встряхнуть, поставить в холодильник на 18-20 часов, ¦
¦ затем в термостат на 10 минут ¦
+---------------------T-------T------T--------T---T----T----T----+
¦ Гемолитическая ¦ 0,5 ¦ 0,5 ¦ 0,5 ¦0,5¦ 0,5¦ 0,5¦ - ¦
¦ сыворотка по ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ удвоенному титру ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+---------------------+-------+------+--------+---+----+----+----+
¦ 2% взвесь ¦ 0,5 ¦ 0,5 ¦ 0,5 ¦0,5¦ 0,5¦ 0,5¦ 0,5¦
¦ эритроцитов барана ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+---------------------+-------+------+--------+---+----+----+----+
¦ Встряхнуть, поставить в термостат на 45-60 минут до ¦
¦ наступления полного гемолиза в контрольных пробирках ¦
¦ исследуемых сывороток ¦
L-----------------------------------------------------------------
Оценка результатов. Для обозначения позитивности реакции Колмера
пользуются системой четырех плюсов. После наступления гемолиза в
контрольных пробирках регистрируют результаты реакции по наличию
или отсутствию гемолиза в опытных пробирках. Полный гемолиз в
опытных пробирках расценивается как отрицательная реакция. Полная
задержка гемолиза в опытных пробирках - резко положительная
реакция (4+); значительная задержка гемолиза - положительная
реакция (3+); частичная задержка гемолиза - слабо положительная
реакция(2+); незначительная задержка гемолиза - сомнительная
реакция (1+ или +/-).
Источники ошибок.
1. Избыток комплемента в опыте.
2. Неправильное хранение испытуемой сыворотки.
3. Длительное хранение испытуемой сыворотки.
4.3.6. Реакция трехфазного связывания комплемента
комплексом липоидного антигена и реагина исследуемой
сыворотки (реакция Колмера, количественный метод)
Принцип. Определение титра реагинов в положительных сыворотках
путем исследования в реакции уменьшающихся объемов при разведении
сыворотки солевым раствором. Особенностью данной реакции является
трехфазность температурных режимов, при которых протекает
связывание комплемента.
Реагенты.
Солевой раствор, антигены, гемолитическая система. Готовятся
таким же способом, как и для качественной реакции Колмера.
Специальное оборудование.
Центрифуга.
Термостат с температурой +37 град. С.
Холодильник с температурой +4 град. С.
Инактиватор (водяная баня) с температурой +56 град. С.
Пробирки - 15х100 мм, 15х150 мм.
Банки стеклянные емкостью 200 и 500 мл.
Пипетки градуированные на 1, 2, 5 и 10 мл с делениями 0,01 мл.
Цилиндры градуированные на 100 и 500 мл.
Ход определения. Постановке основного опыта предшествует
подготовительная работа, состоящая из следующих этапов.
1. Подготовка испытуемой сыворотки. Сыворотку, обнаружившую
резко положительный результат в качественной методике Колмера,
повторно инактивируют 15 минут в водяной бане. Если исследуют
новую порцию той же самой сыворотки, инактивирование удлиняют до
30 минут.
2. Приготовление антигена. Антиген разводят солевым раствором
согласно способу и титру, указанным на этикетке. Титр - это
количество антигена на 1 мл солевого раствора.
3. Приготовление разведения гемолитической сыворотки. 4.
Приготовление взвеси эритроцитов барана и 5. Титрование
комплемента - производят так же, как и для качественной методики
реакции Колмера.
Основной опыт. Каждую испытуемую сыворотку исследуют в восьми
пробирках. Ко всему опыту ставят контроли ингредиентов (антигена,
гемолизина и эритроцитов барана), а также заведомо положительной и
заведомо отрицательной сыворотки из предыдущего опыта. В первую
пробирку отмеряют 0,9 мл солевого раствора, в остальные семь - по
0,5 мл в каждую. В пробирку для контроля антигена вносят 0,5 мл
солевого раствора, в пробирку для контроля гемолизина - 1,0 мл,
для контроля эритроцитов барана - 2,5 мл солевого раствора. В
первую пробирку приливают 0,6 мл испытуемой инактивированной
сыворотки и, перемешав, переносят по 0,5 мл во вторую и в восьмую
(контрольную) пробирки. Затем перемешивают содержимое второй
пробирки и переносят 0,5 мл в третью пробирку, из третьей после
перемешивания в четвертую, из четвертой - в пятую, из пятой - в
шестую, из шестой - в седьмую, а из седьмой после перемешивания
0,5 мл удаляют. Таким образом, содержание сыворотки в семи опытных
пробирках будет следующим: 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,012, 0,006,
0,003 мл.
В первые семь пробирок с испытуемой сывороткой и в пробирку
для контроля антигена приливают по 0,5 мл антигена, разведенного
по титру. Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и
оставляют при комнатной температуре на 10 минут. По истечение 10
минут во все восемь пробирок с испытуемой сывороткой и в три
пробирки с контролями ингредиентов приливают комплемент,
разведенный согласно титрованию данного дня, в объеме 1,0 мл в
каждую пробирку. После встряхивания штативы с пробирками помещают
в холодильник при температуре +6-8 град. С на 18-20 часов с
последующей инкубацией в термостате в течение 10 минут. После
10-минутного пребывания в термостате во все пробирки с испытуемыми
сыворотками, а также в пробирку с контролем антигена и в пробирку
с контролем гемолитической сыворотки приливают по 0,5 мл
гемолитической сыворотки, разведенной по удвоенному титру.
Одновременно во все пробирки с испытуемыми сыворотками и во все
пробирки для контроля ингредиентов приливают по 0,5 мл 2% взвеси
эритроцитов барана. Перемешав содержимое пробирок встряхиванием,
их помещают в термостат на 45-60 минут до наступления полного
гемолиза в контрольных пробирках (см. табл. 13).
Если испытуемая сыворотка в разведении 1:96 (седьмая пробирка)
дала полную задержку гемолиза, рекомендуется исследовать ее в
разведениях 1:192 и 1:768, пользуясь вышеизложенной методикой.
Оценка результатов. Титром реагинов исследуемой сыворотки
является ее наибольшее разведение, давшее полную задержку гемолиза
- 4+ или значительную задержку гемолиза - 3+.
Источники ошибок.
1. Неправильный выбор дозы комплемента (избыток или недостаток
в опыте).
2. Неправильное хранение испытуемой сыворотки.
3. Длительное хранение испытуемой сыворотки.
4.3.7. Осадочная реакция с образованием комплекса антигена
Кана и реагина исследуемой сыворотки
(реакция Кана)
Принцип. Реакция основана на образовании комплекса антиген
Кана + реагины испытуемой сыворотки, проявляющегося образованием
макрофлокулята.
Реагенты.
1. Физиологический раствор - хлористого натрия х.ч. 8,5 г на 1
литр дистиллированной воды.
2. Антиген Кана. Сохраняется в темноте при комнатной
температуре во флаконах или пробирках, плотно закрытых корковыми
пробками. Антиген разводят по титру согласно способу, указанному
на этикетке.
Таблица 13
СХЕМА ПОСТАНОВКИ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ МЕТОДИКИ РЕАКЦИИ КОЛМЕРА
-------------T-----------------------------------------------------¬
¦ ¦ NN пробирок ¦
¦ +-----------------------------------T-----------------+
¦ ¦ ¦Контроли ингреди-¦
¦ ¦ ¦ ентов ¦
¦Ингредиенты ¦ Разведение сыворотки +-----T-----T-----+
¦ (в мл) ¦ ¦Анти-¦Гемо-¦Эрит-¦
¦ ¦ ¦ген ¦лизин¦роци-¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ты ¦
¦ +---T---T---T---T---T----T---T------+-----+-----+-----+
¦ ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦ 7 ¦ 8 ¦ 9 ¦ 10 ¦ 11 ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦Контр.¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦сывор.¦ ¦ ¦ ¦
+------------+---+---+---+---+---+----+---+------+-----+-----+-----+
¦Солевой ¦0,9¦0,5¦0,5¦0,5¦0,5¦ 0,5¦0,5¦ 0,5 ¦ 0,5 ¦ 1,0 ¦ 2,5 ¦
¦раствор +---+---+---+---+---+----+---+------+-----+-----+-----+
¦Испытуемая ¦0,6 перемешивают, переносят по 0,5 мл во вторую и¦
¦инактивиро- ¦ восьмую пробирки. Из второй пробирки после пере-¦
¦ванная сы- ¦ мешивания переносят последовательно из пробирки в¦
¦воротка ¦ пробирку (из второй в третью, из третьей в чет-¦
¦ ¦ вертую и т.д.) по 0,5 мл до 7-й пробирки, из ¦
¦ ¦ которой 0,5 мл удаляют. ¦
+------------+-----------------------------------------------------+
¦ Получается разведение сыворотки: ¦
¦ 1:1,5 1:3 1:6 1:12 1:24 1:48 1:96 1:1,5 ¦
+------------------------------------------------------------------+
¦ Контрольные, заведомо положительную и заведомо отрицательную ¦
¦ сыворотки, разливают так же, как испытуемую сыворотку ¦
+------------T---T---T---T---T----T---T---T------T------T----T-----+
¦Антиген ¦0,5¦0,5¦0,5¦0,5¦0,5 ¦0,5¦0,5¦ - ¦ 0,5 ¦ - ¦ - ¦
¦по титру ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+------------+---+---+---+---+----+---+---+------+------+----+-----+
¦ Встряхнуть, оставить при комнатной температуре на 10 минут ¦
+------------T---T---T---T---T----T---T---T------T------T----T-----+
¦Комплемент, ¦1,0¦1,0¦1,0¦1,0¦1,0 ¦1,0¦1,0¦ 1,0 ¦ 1,0 ¦1,0 ¦1,0 ¦
¦разведен- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ный из ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦расчета 2 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦единицы ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+------------+---+---+---+---+----+---+---+------+------+----+-----+
¦ Встряхнуть, поставить в холодильник на 18-20 часов ¦
¦ с последующей инкубацией в термостате в течение 10 минут ¦
+------------T---T---T---T---T----T---T---T------T------T----T-----+
¦Гемолити- ¦0,5¦0,5¦0,5¦0,5¦0,5 ¦0,5¦0,5¦ 0,5 ¦ 0,5 ¦0,5 ¦ - ¦
¦ческая сы- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦воротка по ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦удвоенному ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦титру ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦2% взвесь ¦0,5¦0,5¦0,5¦0,5¦ 0,5¦0,5¦0,5¦ 0,5 ¦ 0,5 ¦ 0,5¦0,5 ¦
¦эритроцитов ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦барана ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+------------+---+---+---+---+----+---+---+------+------+----+-----+
¦ Встряхнуть, поставить в термостат на 45-60 минут ¦
¦ до полного гемолиза в контрольных пробирках ¦
L-------------------------------------------------------------------
Специальное оборудование.
Инактиватор (водяная баня) с температурой +56 град. С.
Термостат с температурой +37 град. С.
Аппарат для встряхивания (шуттель - аппарат).
Пробирки размером 11х75 мм.
Пипетки градуированные на 0,1, 1, 2 и 5 мл с делениями на 0,01
мл.
Стеклянные стаканчики на 20 и 40 мл.
Банки стеклянные на 200 и 500 мл.
Ход определения. Постановке основного опыта предшествует
подготовительная работа, состоящая из следующих этапов.
1. Приготовление физиологического раствора. В 1 литре
дистиллированной воды растворяют 8,5 г хлористого натрия. Раствор
фильтруют через складчатый бумажный фильтр.
2. Обработка испытуемой сыворотки. Производится так же, как
для реакции Вассермана.
3. Приготовление разведения антигена. Антиген разводят по
титру, который, как правило, бывает 1 +1 или 1 +1,2, т.е. на
каждый 1 мл антигена добавляют 1 мл или 1,2 мл физиологического
раствора. Для приготовления разведения антигена в низкий
стеклянный стаканчик отмеривают необходимый для данного
рабочего дня объем физиологического раствора, во второй стаканчик
- необходимое количество антигена Кана. Для отмеривания антигена
Кана обязательно пользоваться сухой пипеткой. Затем
физиологический раствор быстро вливают в антиген и смесь
переливают из стаканчика в стаканчик 6-7 раз (не встряхивать!).
Разведение антигена оставляют на 10 минут при комнатной
температуре. Приготовленное разведение антигена Кана пригодно для
постановки реакции только в течение 30 минут. Поэтому при большом
количестве испытуемых сывороток рекомендуется готовить разведения
антигена отдельными порциями.
Основной опыт. Каждую сыворотку исследуют в одной пробирке, в
которую при помощи микропипетки вносят 0,025 мл разведенного
антигена, стараясь попасть на дно. Приливают 0,15 мл исследуемой
сыворотки и встряхивают на шуттель - аппарате 3 минуты. После
этого в пробирку приливают 0,5 мл физиологического раствора и
встряхивают до смешивания содержимого пробирок. Для всего опыта
ставят три контроля: антигена, заведомо положительной и заведомо
отрицательной сыворотки (см. табл. 14).
Таблица 14
СХЕМА ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ КАНА
-----------------------------------T-----------------------------¬
¦ Ингредиенты (в мл) ¦ NN пробирок ¦
¦ +------T----------------------+
¦ ¦ 1 ¦ контроли ¦
¦ ¦ +--------T------T------+
¦ ¦ ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦
+----------------------------------+------+--------+------+------+
¦Антиген, разведенный по титру ¦0,025 ¦ 0,025 ¦0,025 ¦0,025 ¦
¦Сыворотка испытуемая ¦0,15 ¦ - ¦ - ¦ - ¦
¦Сыворотка заведомо положительная ¦ - ¦ 0,15 ¦ - ¦ - ¦
¦Сыворотка заведомо отрицательная ¦ - ¦ - ¦0,15 ¦ - ¦
¦Физиологический раствор ¦ - ¦ - ¦ - ¦0,15 ¦
+----------------------------------+------+--------+------+------+
¦ Встряхивание в течение 3 минут ¦
+----------------------------------T------T--------T------T------+
¦Физиологический раствор ¦0,5 ¦ 0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦
+----------------------------------+------+--------+------+------+
¦ Встряхивание до смешивания содержимого пробирок ¦
L-----------------------------------------------------------------
Оценка результатов. Определение результатов реакции Кана
производят непосредственно после добавления физиологического
раствора невооруженным глазом, при помощи лупы или при помощи
агглютиноскопа. Пользоваться следует каким-либо одним методом. Для
обозначения позитивности реакции Кана пользуются системой четырех
плюсов: выпадение крупных хлопьев, жидкость прозрачная - резко
положительная реакция (4+); образование ясного преципитата со
значительным просветлением жидкости - положительная реакция (3+);
образование преципитата со взвешенными мелкими частицами в
мутноватой жидкости - слабо положительная реакция (2+); мелкие
частицы, взвешенные в мутной жидкости - сомнительная реакция (1+).
Отсутствие осадка и взвешенных частиц в прозрачной опалесцирующей
жидкости в опытных пробирках и в пробирке с контролем антигена
регистрируют как отрицательный результат реакции Кана.
Источники ошибок.
1. Избыток антигена в реакции.
2. Длительное хранение разведенного антигена.
3. Загрязнение испытуемой сыворотки или лабораторной посуды.
4.3.8. Осадочная реакция с образованием комплекса
цитохолевого антигена и реагина исследуемой сыворотки
(реакция Закс - Витебского)
Принцип. Реакция основана на образовании комплекса антиген
цитохолевый + реагины испытуемой сыворотки, проявляющегося
образованием макрофлокулята.
Реагенты.
1. Физиологический раствор - хлористый натрий х.ч. 8,5 г на 1
литр дистиллированной воды.
2. Антиген Закс - Витебского (цитохолевый). Сохраняется в
темноте при комнатной температуре во флаконах или пробирках,
плотно закрытых корковыми пробками. Антиген разводят по титру,
согласно способу, указанному на этикетке.
Специальное оборудование.
Термостат с температурой +37 град. С.
Инактиватор (водяная баня) с температурой +56 град. С.
Аппарат для встряхивания (шуттель - аппарат).
Пробирки размером 11х75 мм.
Пипетки градуированные на 0,1, 1, 2 и 5 мл с делениями на 0,01
мл.
Пробирки размером 15х150 мм.
Банки стеклянные на 200 и 500 мл.
Ход определения. Постановке основного опыта предшествует
подготовительная работа, состоящая из следующих этапов.
1. Приготовление физиологического раствора. В 1 литре
дистиллированной воды растворяют 8,5 г хлористого натрия. Раствор
фильтруют через складчатый бумажный фильтр.
2. Обработка испытуемой сыворотки. Производится так же, как
для реакции Вассермана.
3. Приготовление резведения антигена. Антиген Закс -
Витебского (цитохолевый) разводят по титру, который бывает 1:2 или
1:3, т.е. в 2 мл или в 3 мл физиологического раствора добавляют 1
мл антигена. Заранее отмеривают необходимое для данного рабочего
дня количество физиологического раствора. Нужный объем антигена,
набранный сухой пипеткой, вдувают в физиологический раствор,
перемешивают и оставляют для созревания при комнатной температуре
на 10 минут.
Основной опыт. Каждую сыворотку исследуют в одной пробирке в
объеме 0,1 мл. После добавления 0,05 мл разведенного антигена
смесь встряхивают три минуты и оставляют при комнатной температуре
на 30 минут. После этого добавляют 0,5 мл физиологического
раствора и повторно встряхивают 5-10 секунд. Для всего опыта
ставят три контроля: антигена, заведомо положительной и заведомо
отрицательной сыворотки из предыдущего опыта (см. табл. 15)
Таблица 15
СХЕМА ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ ЗАКС - ВИТЕБСКОГО (цитохолевой)
-----------------------------------T-----------------------------¬
¦ ¦ NN пробирок ¦
¦ +------T----------------------+
¦ Ингредиенты (в мл) ¦ 1 ¦ контроли ¦
¦ ¦ +--------T------T------+
¦ ¦ ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦
+----------------------------------+------+--------+------+------+
¦Сыворотка испытуемая ¦0,1 ¦ - ¦ - ¦ - ¦
¦Сыворотка заведомо положительная ¦ - ¦ 0,1 ¦ - ¦ - ¦
¦Сыворотка заведомо отрицательная ¦ - ¦ - ¦0,1 ¦ - ¦
¦Физиологический раствор ¦ - ¦ - ¦ - ¦0,1 ¦
¦Антиген, разведенный по титру ¦0,05 ¦ 0,05 ¦0,05 ¦0,05 ¦
+----------------------------------+------+--------+------+------+
¦ Встряхивать 3 минуты, оставить при ¦
¦ комнатной температуре на 30 минут ¦
+----------------------------------T------T--------T------T------+
¦Физиологический раствор ¦0,5 ¦ 0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦
+----------------------------------+------+--------+------+------+
¦ Встряхивать 5-10 секунд ¦
L-----------------------------------------------------------------
Оценка результатов. Учет результатов реакции Закс -
Витебского (цитохолевой) производят тут же после добавления
физиологического раствора и встряхивания невооруженным глазом или
при помощи лупы, или при помощи агглютиноскопа. Необходимо
пользоваться каким - либо одним методом. Для обозначения
позитивности реакции Закс - Витебского (цитохолевой) пользуются
системой четырех плюсов: выпадение крупных хлопьев, жидкость
прозрачная - резко положительная реакция (4+); образование ясного
преципитата со значительным просветлением жидкости - положительная
реакция (3+); образование преципитата со взвешенными мелкими
частицами в мутноватой жидкости - слабо положительная реакция
(2+); мелкие частицы, взвешенные в мутной жидкости, - сомнительная
реакция (1+). Отсутствие осадка и взвешенных частиц в прозрачной
опалесцирующей жидкости в опытных пробирках и в пробирке с
контролем антигена регистрируют как отрицательный результат
реакции Закс - Витебского (цитохолевой).
Источники ошибок.
1. Избыток антигена в реакции.
2. Длительное хранение разведенного антигена.
3. Загрязнение испытуемой сыворотки или лабораторной посуды.
4.3.9. Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИТ)
Принцип. Реакция основана на феномене потери подвижности
бледными трепонемами в присутствии иммобилизинов испытуемой
сыворотки и активного комплемента в условиях анаэробиоза.
Реагенты.
1. Едкий натрий, х.ч.
2. Двууглекислый натрий, х.ч.
3. Хлористый натрий, х.ч.
4. Спирт этиловый.
5. Эфир для наркоза.
6. Стрептомицин.
7. Кортизон или гидрокортизон.
8. Альбумин из человеческой сыворотки, лиофилизированный.
9. Желатина пищевая.
10. Азот газообразный.
11. Углекислый газ.
12. Гемолизин - кроличья гемолитическая сыворотка. Сохраняется
в холодильнике.
13. Комплемент - свежая смесь стерильной сыворотки крови
морских свинок. Хранится в холодильнике замороженным.
Консервированный комплемент для постановки реакции непригоден.
Высушенный из замороженного состояния комплемент - хуже, но может
быть использован при условии, что перед высушиванием в него не
добавляли консервант.
14. Эритроциты барана. Кровь получают у барана пункцией
яремной вены. Кровь собирают в сухую чистую стеклянную банку
со стеклянными бусами, которую встряхивают 10-15 минут.
Фильтрованием через 2-3 слоя марли отделяют образовавшиеся сгустки
фибрина. Дефибринированная кровь барана может храниться в
холодильнике в течение 3-5 дней.
15. Говяжье мясо.
Специальное оборудование.
Центрифуга.
Термостат с температурой +35 град. С.
Холодильник с температурой в морозильном отделении -10-15
град. С.
Инактиватор (водяная баня) с температурой +56 град. С.
Микроскоп бинокулярный с конденсором темного поля (окуляр 10х,
объектив 40х).
Осветитель к микроскопу.
Бактериальные фильтры Л3.
Микроанаэростат.
Вакуумный насос.
Баллон со сжатым азотом.
Кварцевая лампа.
Аппарат для встряхивания (шуттель - аппарат).
Стерилизатор.
Шприцы на 5 и 10 мл.
Иглы для инъекций.
Пинцеты хирургические.
Ножницы прямые.
Пробирки 15х150 мм.
Пробирки 11х75 мм.
Пробирки центрифужные.
Чашки Петри.
Бюксы стеклянные на 50 мл.
Флаконы стеклянные на 50 и 100 мл.
Ампулы стеклянные на 5 и 10 мл.
Банки стеклянные на 100, 200 и 500 мл.
Пипетки пастеровские.
Пипетки градуированные на 1, 2, 5 и 10 мл.
Стекла предметные.
Стекла покровные.
Лабораторные животные.
Кролики - самцы весом 2,5 - 3 кг.
Морские свинки.
Ход определения. Постановке основного опыта предшествует
подготовительная работа, состоящая из следующих этапов.
1. Приготовление солевого раствора. Растворяют 8,3 г
хлористого натрия в 1 литре дистиллированной воды. Раствор
фильтруют через складчатый бумажный фильтр.
2. Обработка испытуемой сыворотки. Кровь для реакции
иммобилизации бледных трепонем берут из вены стерильно в сухую,
чистую, специально вымытую для этой цели и простерилизованную
пробирку. Кожу в месте прокола протирают эфиром. Больной перед
взятием крови не должен принимать медикаменты, которые могут
оказать вредное влияние на подвижность бледных трепонем.
Необходимо прекратить введение дюрантных и водорастворимых
препаратов пенициллина на срок возможной их задержки в организме.
Взятую кровь обрабатывают как для реакции Вассермана, но с
соблюдением стерильности. В реакции применяют сыворотку крови,
инактивированную в течение 30 минут в водяной бане. В случае
повторного исследования инактивирование проводят вновь в течение
15 минут. Консерванты в сыворотку добавлять нельзя.
При необходимости сыворотку можно хранить длительно (10-15
дней) при температуре -10-15 град. С; при обычной температуре
холодильника +4-6 град. С только 3-4 дня, так как в дальнейшем
отмечается снижение позитивности сывороток крови больных
сифилисом. Сыворотки крови, высушенные на вощанке с добавлением
свежеприготовленного 40% раствора пищевого сахара по 3 капли на
0,5 мл сыворотки, можно в отдельных случаях применять для
исследования в реакции иммобилизации бледных трепонем. Следует
учитывать при этом, что титр иммобилизинов может снижаться. В
сыворотках крови с невысоким титром иммобилизинов снижение может
быть настолько значительным, что они станут отрицательными в
реакции иммобилизации бледных трепонем; поэтому срок годности
высушенных сывороток должен быть 5 дней с момента приготовления -
в южных районах СССР или в жаркое время года и 10 дней - в
остальной части СССР.
3. Приготовление сред выживания. Инкубационный период от
момента постановки реакции иммобилизации бледных трепонем до
регистрации ее результатов длится 18-20 часов. Поэтому, для
сохранения жизнеспособности и хорошей подвижности бледных трепонем
необходима элективная среда выживания. Рекомендуются следующие
среды выживания:
а) Среда выживания с 5% содержанием человеческого альбумина.
Готовят 0,2% раствор пищевой желатины на 0,83% растворе хлористого
натрия и стерилизуют его при 110 град. С в течение 10 минут. После
автоклавирования добавляют стрептомицин из расчета 1:10000 для
предотвращения прорастания среды выживания посторонними микробами.
Раствор сухого человеческого альбумина готовят на 0,83% растворе
хлористого натрия - 5 г сухого альбумина на 100 мл солевого
раствора - и стерилизуют его фильтрованием через бактериальный
фильтр Л3. Каждую новую серию сухого человеческого альбумина перед
употреблением испытывают параллельно с предыдущей апробированной
серией. Инактивированная стерильная сыворотка здорового кролика -
донора входит в среду выживания в соотношении 1:2 с 0,83%
раствором хлористого натрия. Весь запас перечисленных ингредиентов
среды выживания хранят в холодильнике и непосредственно перед
опытом смешивают в определенных соотношениях в общем объеме,
необходимом для данного рабочего дня. При хранении ингредиентов рН
среды, равный обычно 7,2-7,4, может меняться; поэтому в среду
выживания, с целью ее подщелачивания, после объединения всех
компонентов необходимо добавлять 1-2 капли стерильного 1% раствора
двууглекислого натрия.
б) Безальбуминовая среда выживания N 2. 50 г говяжьего мяса
освобождают от жира и сухожилий, измельчают, заливают 100 мл
водопроводной воды и помещают в холодильник для экстрагирования на
24 часа. На другой день измельченное мясо при помешивании доводят
до кипения. После охлаждения мясную воду фильтруют через
многослойный бумажный фильтр, устанавливают рН 7,2-7,4 путем
добавления нескольких капель 20% раствора едкого натра. После
приготовления среду выживания N 2 стерилизуют и ампулируют. При
условии сохранения стерильности среда выживания N 2 пригодная для
использования в реакции в течение 12 месяцев. Ампулы со средой N 2
хранят в холодильнике.
4. Комплемент. Реакция иммобилизации бледных трепонем
протекает только при условии избытка комплемента. При пользовании
одной и той же средой выживания установлено, что чем больше взято
комплемента, тем большее количество иммобилизированных трепонем в
положительных сыворотках; чем меньше его количество, тем больше
бледных трепонем остается подвижными при наличии в испытуемой
сыворотке крови специфических иммобилизинов. Количество
комплемента в значительной степени зависит от среды выживания. При
пользовании средой, содержащей 5% человеческий альбумин,
количество комплемента должно составлять 35% от общего объема
реагирующей смеси. При пользовании средой выживания N 2 комплемент
составляет 40% по отношению к общему объему.
5. Приготовление антигена. В качестве антигена в реакции
иммобилизации бледных трепонем применяют взвесь бледных трепонем
из раннего орхита кролика, зараженного кроличьим сифилисом штамма
Никольса или Будапештского штамма. Для заражения следует брать
здоровых кроликов - самцов весом 2,5 - 3 кг с отрицательными
стандартными серолигическими реакциями на сифилис. Для получения
раннего сифилитического орхита заражение кролика производят
введением внутрь яичек взвеси бледных трепонем в количестве не
менее 50-60 микроорганизмов в каждом поле зрения в объеме 0,5-1,0
мл в каждое яичко. Предварительно на лобке животного и на
внутренних поверхностях бедер выстригают шерсть, а с кожи мошонки
выщипывают пушковые волосы. Введение кортизона зараженным кроликам
не является строго обязательным, так как при хорошо отработанной
методике ранние орхиты у кроликов могут развиваться и без
воздействия кортикостероидных препаратов. Однако при ослаблении
штамма в процессе перевивки (уменьшение количества бледных
трепонем) нужно непосредственно после заражения ввести кролику
внутримышечно 20 мг гидрокортизона и в последующие 5 дней - по 10
мг. Для приготовления антигена пользуются 7-9-дневными орхитами. В
это время клинических проявлений в месте заражения, кроме
небольшой пастозности, не имеется. Для удаления яичек кролика
привязывают к специальному станку, обескровливают пункцией сердца,
затем забивают воздушной эмболией - введением 10-20 мл воздуха в
краевую вену уха или, не вынимая иглы из сердца, непосредственно
после обескровливания кролика, впускают в сердце воздух. Яички
выводят через паховой канал в мошонку поглаживанием по животу
сверху вниз. Далее поверхность кожи мошонки покрывают резиновой
стерильной салфеткой с разрезом, через который выводят яичко
наружу и протирают ее поверхность тампоном, смоченным эфиром.
Яичко оператор фиксирует левой рукой, скальпелем или ножницами
делает небольшой поперечный разрез кожи мошонки над яичком и яичко
вместе с оболочками выводит из мошонки через разрез, отрезает
ножницами и помещает в стерильную чашку Петри. Такого же рода
манипуляцию проделывают и с яичком другой стороны мошонки. Далее,
в условиях бокса ножницами удаляют придаток, освобождают яичко от
оболочек и жира и разрезают его на 10-15 частей. Все кусочки
помещают в небольшой стерильный флакон или колбу (емкостью 50-75
мл), в которую предварительно наливают среду выживания из расчета
5 мл на каждое яичко. Готовят препарат, и под микроскопом
|
