|
Стр. 5
2. Фермент сыворотки термолабилен. Чтобы избежать потери
активности фермента, сыворотку рекомендуется хранить при
температуре от -8 град. С до -20 град. С.
Литература.
1. Sevela M., Tovarek Y. - Vnitrni lek., 1961, 7, 1392.
2. Громашевская Л.Л. - Инструкция к набору реактивов для
определения активности сорбитолдегидрогеназы в сыворотке крови.
3.5.4. Определение активности трипсина в биологических
жидкостях с субстратом N, альфа-бензоил-Д,
l-аргинин-р-нитроанилид (БАПН) (метод Эрлангера в
модификации Шатерникова)
Принцип. При действии трипсина на синтетический субстрат N,
альфа-бензоил-Д, l-аргинин-р-нитроанилид - образуются
бензоил-Д,альфа-аргинин и пара-нитроанилин, окрашенный в желтый
цвет. Об активности фермента судят по интенсивности окраски
раствора.
Реактивы.
1. 0,2М раствор веронала натрия (мединала). 41,2 веронала
натрия (мединала) растворяют в небольшом количестве
дистиллированной воды в мерной колбе на 1 л и доводят объем
дистиллированной водой до метки. Хранят в холодильнике. Годен в
течение месяца.
2. 0,2н раствор соляной кислоты.
3. Вероналовый буфер, рН-8,2. К 50 мл 0,2М раствора веронала
натрия добавляют 12,7 мл 0,2н раствора соляной кислоты, проверяют
рН и доводят объем дистиллированной водой до 200 мл. Хранят в
холодильнике. Годен в течение месяца.
4. N, N-диметилформамид.
5. 20 мг% раствор N, альфа-бензоил-Д, l-аргинин-р-нитроанилида
в вероналовом буфере. 2 мг БАПН растворяют в 0,1 мл
N,N-диметилформамида при нагревании на водяной бане и доводят
вероналовым буфером до 10 мл. Готовят непосредственно перед
употреблением.
6. 0,5н раствор соляной кислоты.
7. 0,85% раствор хлористого натрия.
8. Калибровочный раствор пара - нитроанилина. 13,8 мг пара -
нитроанилина растворяют в небольшом количестве дистиллированной
воды в мерной колбе на 1 л и доводят водой объем до метки. 1 мл
раствора содержит 100 мкМ пара - нитроанилина.
Специальное оборудование.
Спектрофотометр.
Термостат.
Колбы мерные.
Ход определения. Сыворотку крови разводят физиологическим
раствором 1:1. Дуоденальное содержимое разводят физиологическим
раствором 1:10. Используют порции дуоденального содержимого только
щелочной реакции. Если имеются хлопья, то дуоденальное содержимое
предварительно фильтруют.
Опытная проба. К 0,5 мл соответствующим образом разведенной
биологической жидкости прибавляют 4 мл рабочего раствора БАПН.
Инкубируют 30 мин. при 37 град. С. После инкубации добавляют 0,5
мл 0,5н раствора соляной кислоты. Измеряют оптическую плотность на
спектрофотометре против дистиллированной воды при длине волны 410
нм.
Холостую пробу ставят как опытную, но раствор соляной кислоты
добавляют до инкубации. Из экстинкции опытной пробы вычитают
экстинкцию холостой пробы.
Расчет активности трипсина проводят по калибровочному графику.
Активность трипсина выражают в микромолях пара - нитроанилина,
образовавшегося в результате расщепления субстрата 1 миллилитром
не разведенного биологического материала за 1 минуту при 37 град.
С.
Построение калибровочного графика. Из калибровочного раствора
пара - нитроанилина готовят ряд разведений, как указано в таблице:
---------T----------------T-----------------------T--------------¬
¦ NN ¦ Калибровочный ¦ Дистиллированная ¦ Содержание ¦
¦ п/п ¦ раствор ¦ вода ¦ р-НА в ¦
¦ ¦ (мл) ¦ (мл) ¦калибровочной ¦
¦ ¦ ¦ ¦ пробе ¦
¦ ¦ ¦ ¦ (мкмоль) ¦
+--------+----------------+-----------------------+--------------+
¦ 1 ¦ 0,5 ¦ 4,5 ¦ 50 ¦
¦ 2 ¦ 1,0 ¦ 4,0 ¦ 100 ¦
¦ 3 ¦ 2,0 ¦ 3,0 ¦ 200 ¦
¦ 4 ¦ 3,0 ¦ 2,0 ¦ 300 ¦
¦ 5 ¦ 4,0 ¦ 1,0 ¦ 400 ¦
¦ 6 ¦ 5,0 ¦ - ¦ 500 ¦
L--------+----------------+-----------------------+---------------
Измерение оптической плотности растворов пара - нитроанилина
проводят на спектрофотометре при длине волны 410 нм против
дистиллированной воды. Строят калибровочный график, откладывая на
оси ординат значения оптической плотности, а на оси абсцисс -
концентрацию пара - нитроанилина в микромолях. По разности
экстинкций опытной и холостой проб находят по калибровочному
графику микромоли пара - нитроанилина. Пересчет активности
трипсина на 1 мл неразведенной биологической жидкости в 1 минуту
производят по формуле:
С х К
Активность трипсина = ----- ,
в мкМ/мл/мин t
где: С - микромоли пара - нитроанилина, найденные по
калибровочному графику,
К - коэффициент пересчета на 1 мл биологической жидкости
(для сыворотки крови - 4, для дуоденального содержимого - 20),
t - коэффициент пересчета на 1 минуту инкубации (время
инкубации - 30 минут).
Прямолинейная зависимость между концентрацией пара -
нитроанилина и оптической плотностью сохраняется до 100 мкМ пара -
нитроанилина на 1 мл.
Нормальные величины. Активность трипсина:
сыворотки крови - 1-4 микромоля/мл/мин
(60-240 микромолей/мл/час)
дуоденального содержимого - 50-500 микромолей/мл/мин
(3.000-30.000 микромолей/мл/час)
Литература.
1. Erlander B.F., Kokovski N., Cohen N. - Arch. Biochem.
Biophys., 1961, 95, 271.
2. Шатерников В.А. - Вопросы мед. химии, 1966, 12, 1.
3.5.5. Определение активности холинэстеразы
в сыворотке крови колориметрическим методом
по гидролизу ацетилхолинхлорида
Принцип. Под действием холинэстеразы происходит гидролиз
ацетилхолинхлорида с образованием уксусной кислоты и холина.
Уксусная кислота сдвигает рН раствора, что устанавливается с
помощью индикатора.
Реактивы.
1. 0,9М раствор ацетилхолинхлорида - 1,67 г ацетилхолинхлорида
растворяют в 10 мл дистиллированной воды. Удобно использовать
фармакопейный ампулированный препарат ацетилхолинхлорида.
Содержимое одной ампулы (0,2 г) растворяют в 1,2 мл
дистиллированной воды.
2. 0,0075М вероналовый буфер, рН-8,4. 1,5450 г натриевой соли
веронала растворяют в 500 мл дистиллированной воды, добавляют 9,0
мл 0,1н раствора соляной кислоты и 150 мл 0,01% раствора
индикатора - фенолового красного. Измеряют рН. Доливают
дистиллированной водой до 1 литра. Хранят в холодильнике в посуде
из темного стекла. Годен в течение месяца.
3. Индикатор - феноловый красный. Область действия - 6,8-8,4
рН. Изменение окраски от желтой к красной. 0,1 г сухого индикатора
растирают в фарфоровой ступке с 5,7 мл 0,05н раствора едкого
натра, количественно переносят в мерный цилиндр и доводят до 25 мл
дистиллированной водой. Из полученного 0,4% раствора перед
употреблением готовят 0,01% раствор разведением дистиллированной
водой в 40 раз.
4. 0,1н раствор соляной кислоты.
5. 0,05н раствор едкого натра.
6. 0,7% раствор прозерина. 0,7 г прозерина растворяют в 100 мл
дистиллированной воды. Хранят в посуде из темного стекла.
7. 0,1н калибровочный раствор уксусной кислоты. 0,57 мл
ледяной уксусной кислоты (хч) разбавляют дистиллированной водой до
100 мл в мерной колбе. Для проверки нормальности приготовленный
раствор уксусной кислоты титруют 0,1н раствором щелочи по
фенолфталеину до появления слабо розовой окраски. Нормальность
раствора едкого натра определяют по точному 0,1н раствору
щавелевой кислоты.
Специальное оборудование.
Фотоэлектроколориметр.
Термостат.
Колбы мерные.
Ход определения. Опытная проба. Смешивают 5,0 мл вероналового
буфера, 0,2 мл дистиллированной воды и 0,1 мл сыворотки. Смесь
прогревают при 37 град. С в течение 5 минут. Затем добавляют 0,2
мл раствора ацетилхолинхлорида и инкубируют в течение 30 минут при
37 град. С. После инкубации добавляют 0,2 мл раствора прозерина.
Охлаждают и измеряют на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 0,5 см при
длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) против воды. Окраска
устойчива в течение одного часа.
Холостую пробу ставят как опыт, но раствор прозерина добавляют
до инкубации. Из экстинкции холостой пробы вычитают экстинкцию
опытной пробы.
Расчет ведут по калибровочному графику. Активность
холинэстеразы выражают в микромолях уксусной кислоты,
образовавшейся при инкубации 1 мл сыворотки в течение часа при 37
град. С.
Построение калибровочного графика. Из 0,1н раствора уксусной
кислоты готовят разведения, как указано в таблице:
-----T-------------T----------------T---------------T------------¬
¦ NN ¦ 0,1н раствор¦Дистиллированная¦ Содержание ¦Активность в¦
¦ п/п¦ уксусной ¦ вода (мл) ¦уксусн. кислоты¦ микромолях/¦
¦ ¦ кислоты (мл)¦ ¦в калибровочной¦ час/мл ¦
¦ ¦ ¦ ¦ пробе ¦ сыворотки ¦
¦ ¦ ¦ ¦ (микромоль) ¦ ¦
+----+-------------+----------------+---------------+------------+
¦ 1 ¦ 2,0 ¦ 8,0 ¦ 4 ¦ 80 ¦
¦ 2 ¦ 4,0 ¦ 6,0 ¦ 8 ¦ 160 ¦
¦ 3 ¦ 6,0 ¦ 4,0 ¦ 12 ¦ 240 ¦
¦ 4 ¦ 8,0 ¦ 2,0 ¦ 16 ¦ 320 ¦
¦ 5 ¦ 9,0 ¦ 1,0 ¦ 18 ¦ 360 ¦
L----+-------------+----------------+---------------+-------------
Из каждого разведенного раствора берут по 0,2 мл, смешивают с
5,0 мл вероналового буфера, 0,1 мл сыворотки, прогревают 5 мин при
37 град. С, затем добавляют 0,2 мл прозерина, 0,2 мл
ацетилхолинхлорида, инкубируют 30 минут при 37 град. С и
охлаждают. Измерение проводят при тех же условиях, что и опытные
пробы.
Холостую пробу ставят как калибровочную, но вместо растворов
уксусной кислоты добавляют дистиллированную воду. Из экстинкции
холостой пробы вычитают экстинкцию калибровочной пробы. На оси
ординат откладывают полученную разницу экстинкций, на оси абсцисс
- микромоли уксусной кислоты.
Пересчет активности холинэстеразы в микромоли уксусной кислоты
на 1 мл сыворотки за 1 час инкубации при 37 град. С производят по
формуле:
Активность холинэстеразы
в микромолях/мл/час = С х 10 х 2
где: С - микромоли уксусной кислоты в калибровочной пробе,
10 - коэффициент пересчета на 1 мл сыворотки,
2 - коэффициент пересчета на 1 час инкубации.
Прямолинейная зависимость калибровочного графика сохраняется в
пределах от 0 до 400 микромолей/мл/час.
Нормальные величины - 160-340 микромолей уксусной кислоты на 1
мл сыворотки за 1 час инкубации.
Примечания.
1. Сыворотка должна быть свободной от гемолиза.
2. Нормальные величины активности фермента в сыворотке крови
желательно проверять на донорах в каждой лаборатории.
3. Лимоннокислую и щавелевоуксусную плазму употреблять нельзя,
так как соли лимонной и щавелевой кислот ингибируют активность
фермента.
Литература.
1. Schafer C.W., Dopke K.H., Goll und Gothe W. - Arzn.
standard, 1967, 3, 84.
2. Molander D., Friedman M., La Due Y. - Ann. Int. Med., 1954,
41, 6, 1139-1151.
3. Делекторская Л.Н., Добрянская Л.Д., В кн: Унифицированные
методы клинических лабораторных исследований. Под ред.
В.В.Меньшикова. Вып. VI, М., 1974.
3.5.6. Определение активности холинэстеразы
в сыворотке крови экспресс - методом
с применением индикаторной бумаги
(Метод Герцфельда и Штрумпфа в модификации
Децика и Туркевича)
Определение проводят строго по инструкции.
Холинэстеразная индикаторная бумага представляет собой полоску
хроматографической бумаги, размером 65х10 мм с линией перфорации,
отделяющей конец индикаторной бумаги - 20х10 мм, пропитанной
ацетилхолином и индикатором, меняющим цвет в зависимости от рН
среды. После контакта исследуемой сыворотки с индикаторной
бумагой, под влиянием холинэстеразы наступает гидролиз
ацетилхолина и освобождается уксусная кислота, которая влияет на
рН и меняет цвет индикатора. Реакция должна продолжаться до тех
пор, пока рН достигнет определенного уровня, а соответствующий
этому цвет индикаторной бумаги не сравняется с цветом эталона.
Мерой активности холинэстеразы является время (в минутах), на
протяжении которого под влиянием исследуемой сыворотки происходит
изменение цвета индикаторной бумаги вплоть до совпадения с цветом
эталона.
Ход определения. Микропипеткой наносят 0,05 мл сыворотки крови
на поверхность химически чистого предметного стекла. Стекло должно
лежать на белой бумаге (белый фон).
На каплю сыворотки, находящуюся на предметном стекле, помещают
пропитанный конец индикаторной бумаги до границы с линией
перфорации. Затем быстро накладывают второе предметное стекло,
слегка прижимая его с целью равномерного распределения сыворотки в
полоске индикаторной бумаги. Верхнее стекло не следует снимать,
чтобы не вызвать высыхания бумаги.
Рядом кладут эталон, представляющий собой полоску бумаги с
желто - зеленым цветом.
Определение должно проводиться при комнатной температуре -
18-22 град. С.
Индикаторная бумага в сухом виде имеет желтый цвет; после
контакта с сывороткой цвет ее становится темно - зеленым или сине
- зеленым, на протяжении реакции меняется в пределах различных
оттенков зеленого цвета и в конце определения сравнивается с желто
- зеленым цветом бумаги - эталона.
Отсчет времени ведется с момента контакта индикаторной бумаги
с сывороткой до момента, когда цвет этой бумаги сравняется с
цветом эталона.
Время от 7 до 21 минуты соответствует нормальной активности
холинэстеразы; время меньше 6 минут - повышенной активности, и
наконец, время от 41 до 60 и больше минут свидетельствует о резком
снижении активности фермента.
Расхождение результатов в параллельных определениях - не
больше 21 минуты.
Литература.
Инструкция по определению активности сывороточной
холинэстеразы микроэкспресс - методом Герцфельда и Штрумпфе в
модификации Ю.И.Децика и Н.Н.Туркевича. Инструкция разработана
Львовским государственным медицинским институтом совместно с
Рижским заводом "Реагент" и согласована с Всесоюзным научно -
методическим центром по лабораторному делу.
3.5.7. Обнаружение активности
глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы эритроцитов
(проба Бернштейна)
Принцип. Глюкозо-6-фосфат в присутствии
глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы эритроцитов и НАДФ окисляется с
образованием НАДФ-Н. НАДФ-Н восстанавливает феназин метосульфат,
который, в свою очередь, восстанавливает 2,6-дихлорфенолиндофенол.
Феназин метосульфат действует в этой реакции как активный
переносчик электронов от НАДФ к краске, что значительно убыстряет
ход реакции.
Реактивы.
1. Раствор никотинамид - аденин - динуклеотидфосфата (НАДФ).
5,75 мг НАДФ растворяют в 2,5 мл дистиллированной воды. Хранят в
холодильнике. Стабилен в течение 4 недель.
2. Раствор глюкозо-6-фосфата. 38 мг
глюкозо-6-фосфатдинатриевой соли растворяют в 2,5 мл
дистиллированной воды.
Так как в продаже чаще имеется бариевая соль
глюкозо-6-фосфата, то перевод ее в динатриевую соль осуществляется
следующим способом: 60,0 мг бариевой соли глюкозо-6-фосфата
растворяют в 1 мл дистиллированной воды, добавляют 0,2 мл
насыщенного раствора сернокислого натрия, центрифугируют. Отбирают
весь надосадочный слой и прибавляют к нему 1,3 мл дистиллированной
воды. Раствор используют для определения активности фермента.
Хранят в холодильнике.
3. 2 мг% водный раствор феназин метосульфата. Раствор - не
стабилен, готовят перед употреблением.
4. 1н раствор соляной кислоты.
5. 0,74М трис - буфер, рН-8,0. 44,8 г триса
(гидроксиметиламинометана) растворяют в 200 мл дистиллированной
воды, прибавляют 1н раствор соляной кислоты до получения рН-8,0 и
доводят дистиллированной водой до 500 мл. Хранят в холодильнике.
6. Раствор 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия в трис - буфере.
К 5,8 мг 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия прибавляют 40 мл 0,74М
трис - буфера, рН-8,0. Хранят в холодильнике.
7. Для реакции используют смесь реактивов, состоящую из: одной
части раствора НАДФ, одной части раствора глюкозо-6-фосфата, двух
частей раствора феназин метосульфата, 16-ти частей раствора
2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия. Смесь реактивов - не
стабильна, готовят перед употреблением.
Специальное оборудование. Не требуется.
Ход определения. Опытная проба. В пробирку наливают 1 мл
дистиллированной воды, добавляют 0,02 мл крови и после наступления
полного гемолиза (через 5-10 минут) прибавляют 0,5 мл смеси
реактивов. При проведении массовых исследований прибавление смеси
может быть проведено одновременно в 35-40 пробах. Время от момента
взятия крови до прибавления реактива не должно превышать 45 минут.
Через 30 минут производят оценку результатов.
Контрольная проба ставится как опытная, для исследования
берется кровь практически здорового человека.
Оценка результатов.
Отрицательная реакция (в норме) - происходит полное
обесцвечивание краски.
Сомнительная (+/-) - происходит явное обесцвечивание, но по
сравнению с контрольной пробой остается зеленоватый оттенок.
Положительная реакция - обесцвечивания краски не происходит
или происходит очень незначительно.
Примечания.
1. При работе в экспедиционных условиях заранее приготовляются
навески реактивов в зависимости от количества исследований,
запланированных на 1 раз.
2. Сомнительные (+/-) реакции не должны приниматься в расчет
при массовом обследовании населения; плохо вымытая пробирка может
симулировать сомнительную (+/-) реакцию. При массовых
исследованиях имеют значение резко положительные и положительные
реакции.
3. Сомнительные (+/-) реакции следует принимать во внимание и
проверять активность фермента количественным методом у женщин с
подозрением на гемолитическую анемию, обусловленную дефицитом
активности фермента, особенно после приема лекарств, вызывающих
гемолитические кризы у этих больных.
Литература.
Bernstein R.E. - Nature, 1962, 194, 192. Идельсон Л.И., Котоян
Э.Р. - Лабор. дело, 1970, 7, 428.
4. ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
4.1. ИЗОИММУНОЛОГИЯ (ИЗОСЕРОЛОГИЯ)
4.1.1. Определение групп крови системы АВО
при помощи стандартных сывороток
Принцип. Реакцией агглютинации с помощью стандартных сывороток
определяют групповые агглютиногены в эритроцитах исследуемой
крови, что дает возможность судить о групповой принадлежности
исследуемой крови.
Реагенты.
1. Стандартная сыворотка группы 0 альфа-бета (I) двух
различных серий.
2. Стандартная сыворотка группы А-бета (II) двух различных
серий.
3. Стандартная сыворотка группы В-альфа (III) двух различных
серий.
4. Стандартная сыворотка группы АВ (IV).
Сыворотки можно применять не окрашенными или окрашенными:
группы А-бета(II) - в синий цвет, группы В-альфа (III) - в красный
цвет и группы АВ(IV) - в желтый цвет.
Хранят сыворотки в холодильнике. Срок годности указан на
этикетках.
5. 0,85% раствор хлористого натрия (физиологический раствор).
Специальное оборудование.
Белые пластинки со смачиваемой поверхностью.
Стаканы химические.
Штативы для ампул или флаконов со стандартными сыворотками.
Ход определения. Определение группы крови производят в
помещении с хорошим освещением при температуре 15-25 град. С.
Ампулы или флаконы со стандартными сыворотками двух различных
серий каждой группы ставят в два штатива с тремя гнездами каждый
или в один штатив с двумя рядами гнезд. В левые гнезда ставят
сыворотку группы 0-альфа-бета(I), в средние - сыворотку группы
А-бета(II) и в правые - сыворотку группы В-альфа(III). Отдельно
ставят сыворотку группы АВ(IV), употребляемую в качестве
дополнительного контроля. Сухие пипетки опускают во все ампулы со
стандартными сыворотками и в пробирку с физиологическим раствором.
Для промывания стеклянных палочек и пипеток подготавливают
химические стаканы с водой и физиологическим раствором. На
пластинке делают надпись: на левой стороне 0-альфа-бета, в
середине - А-бета, справа В-альфа и на верхнем крае - фамилию и
инициалы лица, у которого определяют группу крови. Под
соответствующей надписью наносят по 0,1 мл (1 большая капля)
каждой стандартной сыворотки. Всего получается 6 капель - два ряда
по три капли в каждом, в следующем порядке слева направо:
0-альфа-бета(I), А-бета(II) и В-альфа(III). Пипетку, которой берут
сыворотку из ампулы, тотчас же после того, как из нее выпущена
сыворотка, опускают в ту же ампулу, из которой она взята. Кровь
для исследования берут из пальца или из мочки уха. 0,01 мл (1
маленькая капля) крови сухой стеклянной палочкой наносят рядом с
каждой каплей стандартной сыворотки. Стеклянными палочками
перемешивают капли стандартной сыворотки с находящимися рядом с
ними каплями исследуемой крови - каждую отдельной палочкой. Можно
перемешивать кровь с сыворотками одной стеклянной палочкой, но в
этом случае необходимо после перемешивания каждой капли промывать
палочку в воде и насухо ее вытирать. После размешивания капель
пластину покачивают, затем на 1-2 минуты оставляют в покое и снова
периодически ее покачивают. Наблюдение за ходом реакции проводят
не менее 5 минут, хотя агглютинация начинается в течение первых
10-30 секунд, так как возможна поздняя агглютинация, например, с
эритроцитами группы А2(II). По мере наступления агглютинации, но
не ранее чем через 3 минуты, в те капли, в которых наступила
агглютинация, добавляют по 0,05 мл (1 капля) физиологического
раствора и продолжают наблюдение при покачивании пластинки до
истечения 5 минут, после чего оценивают результат.
Оценка результатов. Реакция в каждой капле может быть
положительной или отрицательной. При положительной реакции в смеси
появляются видимые невооруженным глазом мелкие красные зернышки
(агглютинаты), состоящие из склеенных эритроцитов, которые
постепенно сливаются в более крупные зерна или хлопья неправильной
формы. При этом сыворотка полностью или частично обесцвечивается.
При отрицательной реакции на протяжении всего времени наблюдения
(5 минут) жидкость остается равномерно окрашенной в красный цвет и
в ней не обнаруживают никаких агглютинатов. Результаты реакции в
каплях с сыворотками одной группы должны быть одинаковыми для
обеих серий. Всего может получиться четыре различных комбинации
положительных и отрицательных реакций (см. рис. 1).<*>
--------------------------------
<*> Рисунок не приводится.
1. Если сыворотки всех трех групп дали отрицательную реакцию,
т.е. все смеси остались равномерно окрашенными в красный цвет без
признаков агглютинации, испытуемая кровь принадлежит к группе
0(I).
2. Если сыворотки групп 0-альфа-бета(I) и В-альфа(III) дали
положительную реакцию, а сыворотка группы А-бета(II) -
отрицательную, испытуемая кровь принадлежит к группе А(II).
3. Если сыворотки групп 0-альфа-бета(I) и А-бета(II) дали
положительную реакцию, а сыворотка группы В-альфа(III) -
отрицательную, испытуемая кровь принадлежит к группе В(III).
4. Если сыворотки всех трех групп дали положительную реакцию,
то в этих случаях для исключения неспецифической
агглютинабельности исследуемых эритроцитов проводится
дополнительное контрольное исследование со стандартной сывороткой
группы АВ0(IV).
Для этого на пластинку наносят 0,1 мл (1 большая капля)
стандартной сыворотки группы АВ0(IV), добавляют 0,01 мл (1
маленькая капля, величиной с булавочную головку) исследуемой
крови, перемешивают и наблюдают за результатом при периодическом
покачивании пластинки в течение 5 минут. Отсутствие агглютинации в
этой капле при наличии ее во всех остальных позволяет считать
реакцию специфической и отнести исследуемую кровь к группе АВ(IV).
Наличие агглютинации с сывороткой группы АВ0(IV) говорить о
неспецифической агглютинабельности эритроцитов (аутоагглютинация),
панагглютинация). В этих случаях исследование следует повторить с
отмытыми эритроцитами.
Примечание. При получении сомнительного или нечеткого
результата исследуют кровь данного лица повторно стандартными
сыворотками других серий. Если результаты остаются неясными, то
следует определить группу крови перекрестным способом при помощи
стандартных сывороток и стандартных эритроцитов.
4.1.2. Определение групп крови системы АВО
перекрестным способом при помощи стандартных
сывороток и стандартных эритроцитов
Принцип. Определение реакцией агглютинации одновременно
групповых агглютиногенов в эритроцитах исследуемой крови при
помощи стандартных сывороток и групповых агглютининов в сыворотке
исследуемой крови при помощи стандартных эритроцитов позволяет с
достоверностью установить групповую принадлежность исследуемой
крови.
Реагенты.
1. Стандартная сыворотка группы 0-альфа-бета(I) двух различных
серий.
2. Стандартная сыворотка группы А-бета(II) двух различных
серий.
3. Стандартная сыворотка группы В-альфа(III) двух различных
серий.
4. Стандартная сыворотка группы АВ(IV).
Сыворотки можно применять не окрашенными или окрашенными:
группы А(II) - в синий цвет, группы В(III) - в красный цвет и
группы АВ(IV) - в желтый цвет.
Хранят сыворотки в холодильнике. Срок годности указан на
этикетках.
5. 0,85% раствор хлористого натрия (физиологический раствор).
6. Стандартные эритроциты групп 0(I), А(II) и В(III).
В центрифужную пробирку, содержащую 0,25-0,5 мл изотонического
раствора лимоннокислого натрия, добавляют 2-4 мл крови доноров,
затем пробирку на 3/4 заполняют физиологическим раствором,
содержимое ее перемешивают и центрифугируют или оставляют стоять
до оседания эритроцитов. Стандартные эритроциты хранят в
холодильнике. Срок годности - 2-3 дня.
Специальное оборудование.
Белые пластинки со смачиваемой поверхностью.
Стаканы химические.
Штативы для пробирок, ампул и флаконов со стандартными
сыворотками.
Ход определения. Определение группы крови производят в
помещении с хорошим освещением при температуре 15-25 град. С.
Ампулы со стандартными сыворотками двух различных серий каждой
группы ставят в два штатива с тремя гнездами каждый или в один
штатив с двумя рядами гнезд. В левые гнезда ставят сыворотку
группы 0-альфа-бета(I), в средние - сыворотку группы А-бета(II) и
в правые - сыворотку группы В-альфа(III). Отдельно ставят
сыворотку группы АВ0(IV), употребляемую в качестве дополнительного
контроля. Пробирки со стандартными эритроцитами устанавливают в
отдельный штатив с 3 гнездами в следующем порядке: слева - группы
0(I), в середине - группы А(II) и справа - группы В(III). Сухие
пипетки опускают во все ампулы (флаконы) со стандартными
сыворотками, в пробирку с физиологическим раствором и в пробирки
со стандартными эритроцитами. Для промывания стеклянных палочек и
пипеток подготавливают стаканы с водой и с физиологическим
раствором.
На пластинке делают надписи слева направо: 0-альфа-бета,
А-бета и В-альфа для стандартных сывороток и 0, А и В - для
стандартных эритроцитов. На верхнем крае пластинки надписывают
фамилию и инициалы лица, у которого определяют группу крови.
Под соответствующими обозначениями наносят по 0,1 мл (1
большая капля) всех стандартных сывороток. Получается 6 капель,
которые образуют два ряда по три капли в следующем порядке (слева
направо): 0-альфа-бета(I), А-бета(II), В-альфа(III). На нижнюю
часть пластинки, также у соответствующих обозначений, наносят по
0,01 мл (1 маленькая капля, величиной с булавочную головку)
стандартных эритроцитов. Исследуемую кровь берут из вены, пальца
или из мочки уха в сухую пробирку. Для отделения сыворотки кровь
центрифугируют или оставляют стоять на 20-30 минут.
Из пробирки, содержащей исследуемую кровь, пипеткой извлекают
сыворотку так, чтобы не взболтать эритроциты, и капают по 0,1 мл
(1 большая капля) на подготовленные стандартные эритроциты. После
этого той же пипеткой набирают со дна пробирки эритроциты
исследуемой крови и наносят их по 0,01 мл (1 маленькая капля)
рядом с каждой каплей подготовленной стандартной сыворотки. Во
всех каплях сыворотку тщательно перемешивают с эритроцитами сухой
стеклянной палочкой, пластинку слегка покачивают, затем на 1-2
минуты оставляют в покое и снова периодически покачивают.
Наблюдение за ходом реакции продолжается не менее 5 минут.
Агглютинация в каплях со стандартной сывороткой обычно начинается
через 10-30 секунд, агглютинация же в каплях со стандартными
эритроцитами может наступить позже, даже к концу 5 минуты, в связи
с возможностью низкого титра содержащихся в исследуемой сыворотке
агглютининов. По мере наступления агглютинации, но не ранее чем
через 3 минуты, в те капли, в которых наступила агглютинация,
добавляют по одной капле физиологического раствора и продолжают
наблюдение при покачивании пластинки до истечения 5 минут.
Оценка результатов. Результаты реакций, полученных при помощи
стандартных сывороток и стандартных эритроцитов, должны совпадать,
т.е. указывать на содержание агглютиногенов и агглютининов,
соответствующих одной и той же группе крови. Возможны 4 варианта
(рис. 2) (рисунки не приводятся).
1. Реакция со стандартными сыворотками указывает на
принадлежность исследуемой крови к группе 0(I). При этом сыворотка
исследуемой крови дает отрицательную реакцию со стандартными
эритроцитами группы 0(I) и положительную - с эритроцитами групп
А(II) и В(III). Это указывает на наличие в сыворотке агглютининов
альфа и бета, т.е. подтверждает принадлежность исследуемой крови к
группе 0-альфа-бета(I).
2. Реакция со стандартными сыворотками указывает на
принадлежность исследуемой крови к группе А(II). При этом
сыворотка исследуемой крови дает отрицательную реакцию со
стандартными эритроцитами групп 0(I) и А(II), но положительную - с
эритроцитами группы В(III). Это указывает на наличие в сыворотке
агглютининов бета, т.е. подтверждает принадлежность исследуемой
крови к группе А-бета(II).
3. Реакция со стандартными сыворотками указывает на
принадлежность исследуемой крови к группе В(III). При этом
сыворотка исследуемой крови дает отрицательную реакцию со
стандартными эритроцитами групп 0(I) и В(III), но положительную -
с эритроцитами группы А(II). Это указывает на наличие в сыворотке
агглютининов альфа, т.е. подтверждает принадлежность исследуемой
крови к группе В-альфа(III).
4. Реакция со стандартными сыворотками указывает на
принадлежность исследуемой крови к группе АВ(IV). При этом
сыворотка исследуемой крови дает отрицательную реакцию со
стандартными эритроцитами всех трех групп, т.е. не содержит
агглютининов, что подтверждает принадлежность исследуемой крови к
группе АВ(IV).
Примечание. Причины ошибок:
1. Ошибочный порядок расположения стандартных сывороток или
стандартных эритроцитов в штативах.
2. Ошибочный порядок нанесения стандартных сывороток или
стандартных эритроцитов на пластинку.
3. Неправильное соотношение количества сыворотки и
эритроцитов (при избытке крови реакция может быть оценена как
отрицательная при фактическом наличии агглютинации).
4. Несоблюдение времени наблюдения (при учете результатов
реакции до истечения 5 минут поздно наступившая агглютинация может
быть пропущена; при слишком долгом наблюдении (более 5 минут)
смесь эритроцитов и сыворотки начинает подсыхать, и агрегация
эритроцитов по периферии капли может быть принята за
агглютинацию).
5. Отсутствие дополнительного контрольного исследования со
стандартной сывороткой группы АВ(IV), в результате чего феномен
ауто- или панагглютинации может быть оценен как положительный
результат реакции.
6. Грязная или мокрая посуда, применяемая в реакции.
7. Использование недоброкачественных стандартных сывороток -
недостаточно активных (с истекшим сроком годности, агглютинирующая
способность которых не проверена), загрязненных или частично
высохших.
8. Несоблюдение температурных условий проведения реакции - при
температуре воздуха выше 25 град. С агглютинация может быть не
замечена, ниже 15 град. С - может появиться неспецифическая
агглютинация.
9. Образование "монетных столбиков" из эритроцитов, которые
невооруженным глазом можно принять за агглютинацию. Прибавление
физиологического раствора с последующим покачиванием разрушает их.
10. Отсутствие покачивания пластинки, на которой проводится
определение, приводящее к оседанию эритроцитов на дно и
образованию отдельных скоплений, могущих симулировать
агглютинацию.
4.1.3. Определение резус - фактора методом
агглютинации в солевой среде и пробирках
Принцип. Исследуемые эритроциты смешивают со стандартной
сывороткой антирезус, содержащей полные резус - антитела. Если
исследуемые эритроциты резус - положительны, происходит их
агглютинация, наличие которой устанавливают по форме осадка
эритроцитов.
Реагенты.
1. Стандартные сыворотки антирезус с полными антителами,
приготовленные для этого метода, двух различных серий. Группа
стандартной сыворотки должна быть совместима с исследуемой:
сыворотка антирезус группы 0(I) пригодна для определения резус -
фактора в эритроцитах группы 0(I); сыворотка антирезус группы
А(II) пригодна для определения резус - фактора в эритроцитах групп
0(I) и А(II); сыворотка антирезус группы В(III) пригодна для
определения резус - фактора в эритроцитах групп 0(I) и В(III);
сыворотка группы АВ(IV) и специально приготовленная
"универсальная" сыворотка пригодна для определения резус - фактора
в эритроцитах группы АВ(IV) и любой другой группы. Хранят
стандартные сыворотки в холодильнике, срок годности указан на
этикетке.
Если в распоряжении лаборатории не имеется второй серии
сыворотки антирезус для данного метода, то можно пользоваться
любой другой стандартной сывороткой, применяя тот метод, в котором
она активна (метод указан в сопроводительной инструкции).
Стандартная сыворотка с полными антителами может быть
использована неоднократно. Для этого после определения резус -
фактора из всех пробирок острожно отсасывают сыворотку, не
захватывая эритроцитов, и собирают ее в ампулу. Такая сыворотка
пригодна для использования до тех пор, пока не потеряет
активность.
2. 3,8% раствор лимоннокислого натрия.
3. 0,85% раствор хлористого натрия (физиологический раствор).
4. Стандартные эритроциты для контроля. Применяют стандартные
резус - положительные эритроциты группы 0(I) или той же группы,
что и исследуемая кровь, и стандартные резус - отрицательные
эритроциты обязательно той же группы, что и исследуемая кровь.
Специальное оборудование.
Термостат на 37 град. С.
Лупа.
Пробирки высотой 2-2,5 см и диаметром 0,5-0,6 см с гладким
дном сферической формы.
Штативы для пробирок.
Подготовка к определению. Обработка исследуемой крови и крови
для получения стандартных эритроцитов. Кровь для исследования
берут в количестве 0,5-1,0 мл в центрифужные пробирки, содержащие
0,25 мл (5 капель) изотонического раствора лимоннокислого натрия.
На пробирке надписывают фамилию, инициалы и группу крови лица, от
которого взята кровь. Пробирки на 3/4 заполняют физиологическим
раствором, перемешивают и центрифугируют. Надосадочную жидкость
сливают, из отмытых эритроцитов готовят 2% взвесь. Для этого в
других, соответственно обозначенных, пробирках смешивают 2,45 мл
(49 капель) физиологического раствора и 0,05 мл (1 капля) осадка
отмытых эритроцитов.
Можно пользоваться также эритроцитами, оставшимися свободными
после свертывания крови. Пробирку со свернувшейся кровью
энергично встряхивают для отделения большего количества
эритроцитов, отмывают их от сыворотки физиологическим раствором и
готовят из них 2% взвесь, как это описано выше.
Допустимо хранить кровь до отмывания эритроцитов в течение 2-3
суток в холодильнике.
Ход определения. В штативе устанавливают два ряда пробирок: в
каждом ряду по числу исследуемых и стандартных образцов
эритроцитов для контроля. Штатив предварительно накрывают листом
бумаги, слегка накалывают на нем отверстия, сквозь которые
устанавливают пробирки. Против каждой пары пробирок на бумаге
надписывают фамилию и инициалы лица, кровь которого будут
исследовать.
Во все пробирки первого ряда вводят по 0,1 мл (2 капли)
сыворотки антирезус одной серии, разведенной равным количеством
физиологического раствора; во все пробирки второго ряда - по 0,1
мл (2 капли) сыворотки антирезус другой серии, также разведенной
равным количеством физиологического раствора. В одинаково
обозначенные пары пробирок добавляют по 0,05 мл (1 капля) 2%
взвеси исследуемых эритроцитов, в одну пару контрольных пробирок -
по 0,05 мл (1 каплю) 2% взвеси стандартных резус - положительных
эритроцитов группы 0(I) или одноименной с исследуемой кровью, а в
другую пару контрольных пробирок - по 0,05 мл (1 каплю) 2% взвеси
стандартных резус - отрицательных эритроцитов той же группы, что и
исследуемая кровь. Содержимое пробирок тщательно перемешивают
встряхиванием и помещают на 1 час в термостат при 37 град. С. Для
оценки полученных результатов следует рассматривать пробирки по
продольной оси над источником света, закрытым матовым стеклом.
Оценка результатов. Результаты могут быть положительными и
отрицательными. При положительном результате - наличии
агглютинации - осадок эритроцитов располагается на дне пробирки
неравномерным слоем. Видна шероховатость или зернистость его
структуры. Края осадка никогда не бывают ровными, они изогнуты,
иногда завернуты внутрь. В некоторых случаях эритроциты
располагаются в виде волнистого венчика вокруг более светлой
центральной части. При отрицательном результате - отсутствии
агглютинации - осадок располагается совершенно равномерным слоем
без шероховатостей и неровностей, иногда - с небольшим
просветлением в центре; границы его представляют собой правильно
очерченный круг. Диаметр осадка при отрицательном результате
всегда меньше, чем при положительном. Результаты считаются
истинными при совпадении их в обеих сериях сыворотки антирезус и
после проверки контрольных образцов (при отсутствии агглютинации
со стандартными резус - отрицательными эритроцитами и наличии
агглютинации со стандартными резус - положительными эритроцитами).
Примечание. Если наблюдается слабая или сомнительная реакция,
то кровь данного лица исследуют повторно этими же и другими
сериями сыворотки антирезус, включая и сыворотки, содержащие
неполные антитела.
4.1.4. Определение резус - фактора методом конглютинации
с применением желатины
Принцип. Исследуемые эритроциты инкубируют со стандартной
сывороткой антирезус, содержащей неполные антитела - резус, в
коллоидной среде - растворе желатины. Если исследуемые эритроциты
резус - положительны, происходит их склеивание - конглютинация,
которая обнаруживается после добавления в инкубационную смесь
физиологического раствора. Резус - отрицательные эритроциты не
склеиваются.
Реагенты.
1. Стандартные сыворотки антирезус с неполными антителами,
приготовленные для этого метода, двух различных серий. Группа
стандартной сыворотки должна быть совместима с исследуемой:
сыворотка антирезус 0(I) пригодна для определения резус - фактора
в эритроцитах группы 0(I); сыворотка антирезус групп (II) пригодна
для определения резус - фактора в эритроцитах групп (I) и А(II);
сыворотка антирезус групп В(III) пригодна для определения резус -
фактора в эритроцитах группы 0(I) и В(III); сыворотка антирезус
группы АВ(IV) и специально приготовленная "универсальная"
сыворотка пригодны для определения резус - фактора в эритроцитах
группы АВ(IV) и любой другой группы крови. Хранят стандартные
сыворотки в холодильнике, срок годности указан на этикетке.
Если в распоряжении лаборатории не имеется второй серии
сыворотки антирезус для данного метода, то можно пользоваться
любой другой стандартной сывороткой, применяя тот метод, в котором
она активна (метод указан в сопроводительной инструкции).
2. 10% раствор желатины, выпускаемый в ампулах заводом им.
Семашко. Вскрытые ампулы хранить в холодильнике не более 2-3 дней.
Раствор желатины мутный, с хлопьями или не застывающий при
комнатной температуре употреблять нельзя.
3. 0,85% раствор хлористого натрия (физиологический раствор).
4. 3,8% раствор лимоннокислого натрия.
5. Стандартные эритроциты для контроля. Применяют стандартные
резус - положительные эритроциты группы 0(I) или той же группы,
что и исследуемая кровь, и стандартные резус - отрицательные
эритроциты обязательно той же группы, что и исследуемая кровь.
Специальное оборудование.
Водяная баня или термостат на 48 град. С.
Пробирки, объемом не менее 10 мл.
Лупа с 2-кратным увеличением.
Подготовка к определению. Обработка исследуемой крови и крови
для получения стандартных эритроцитов. Кровь берут в сухую
пробирку без стабилизатора в количестве 1-3 мл. На пробирке
надписывают фамилию, инициалы и группу крови лица, от которого
взята кровь. Для исследования берут эритроциты, оставшиеся
свободными после свертывания крови. Если их окажется недостаточно,
|
