|
Стр. 10
инактивирование удлиняют до 30 минут.
2. Приготовление антигена. Антиген разводят солевым раствором
согласно способу и титру, указанным на этикетке. Титр - это
количество антигена на 1 мл солевого раствора.
3. Приготовление солевого раствора.: Производится так же,
4. Приготовление разведения : как для качественной
гемолитической сыворотки. : методики реакции
5. Приготовление взвеси : Колмера в 1/5 объема
эритроцитов барана. :
6. Титрование комплемента :
Основной опыт. Каждая испытуемая положительная сыворотка,
разведенная 1:5, исследуется в восьми пробирках. Ко всему опыту
ставят контроли ингредиентов (антигена, гемолитической сыворотки и
эритроцитов барана). Во второй, третьей, четвертой, пятой, шестой
и седьмой пробирки отмеривают по 0,2 мл солевого раствора, а в
восьмую - 0,1 мл. В пробирку для контроля антигена вносят 0,2 мл
солевого раствора, в пробирку для контроля гемолитической
сыворотки - 0,3 мл, для контроля эритроцитов барана - 0,6 мл
солевого раствора. В первую, вторую и восьмую пробирки приливают
0,2 мл испытуемой инактивированной сыворотки, разведенной 1:5.
Затем перемешивают содержимое второй пробирки и переносят 0,2 мл в
третью, из третьей, после перемешивания, - в четвертую, из
четвертой - в пятую, из пятой - в шестую, из шестой - в седьмую,
из седьмой, после перемешивания, 0,2 мл удаляют. Таким образом,
содержание сыворотки соответственно в семи опытных пробирках будет
следующим: 0,05, 0,025, 0,012, 0,006, 0,003, 0,0015, 0,00075 мл. В
первые семь пробирок с испытуемой сывороткой и в пробирку для
контроля антигена приливают по 0,1 мл антигена, разведенного по
титру. Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и оставляют
при комнатной температуре на 10 минут. По истечении 10 минут во
все восемь пробирок с испытуемой сывороткой и в две пробирки с
контролями антигена и гемолитической сыворотки приливают по 0,2 мл
комплемента, разведенного по рабочей дозе (2 единицы). После
встряхивания штативы с пробирками помещают в холодильник на 18-20
часов с последующей инкубацией в термостате в течение 10 минут.
После 10-минутного пребывания в термостате во все пробирки с
испытуемой сывороткой и в пробирки для контроля антигена и
гемолитической сыворотки приливают по 0,1 мл гемолитической
сыворотки, разведенной по удвоенному титру. Одновременно во все
пробирки с испытуемой сывороткой и в три пробирки для контроля
ингредиентов приливают по 0,1 мл 2% взвеси эритроцитов барана.
Перемешав содержимое пробирок встряхиванием, их помещают в
термостат на 45-60 минут до наступления полного гемолиза в
контрольных пробирках испытуемых сывороток.
Если испытуемая сыворотка 1:64 дала полную задержку гемолиза
(4+), рекомендуется исследовать ее в разведении 1:128, 1:256,
1:512, пользуясь вышеизложенной методикой (см. табл. 25).
Оценка результатов. Титром реагинов испытуемой сыворотки
считается наибольшее ее разведение, давшее полную задержку
гемолиза (4+) или значительную задержку гемолиза (3+).
Источники ошибок.
1. Неправильно выбранная доза комплемента (избыток или
недостаток комплемента в опыте).
2. Неправильное хранение испытуемой сыворотки.
3. Длительное хранение испытуемой сыворотки.
Таблица 25
СХЕМА ПОСТАНОВКИ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ МЕТОДИКИ РЕАКЦИИ КОЛМЕРА
В 1/5 ОБЪЕМА
------------T-----------------------------------------------------¬
¦Ингредиенты¦ NN пробирок ¦
¦ (в мл) +----------------------------------T------------------+
¦ ¦ ¦ Контроли ¦
¦ ¦ Разведения сыворотки ¦ ингредиентов ¦
¦ ¦ +-----T-----T------+
¦ ¦ ¦Анти-¦Гемо-¦Эрит- ¦
¦ ¦ ¦ген ¦лизин¦роциты¦
¦ +---T---T---T---T---T---T---T------+-----+-----+------+
¦ ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦ 7 ¦ 8 ¦ 9 ¦ 10 ¦ 11 ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦контр.¦ ¦ ¦ ¦
+-----------+---+---+---+---+---+---+---+------+-----+-----+------+
¦Солевой ¦ - ¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦ 0,1 ¦ 0,2 ¦ 0,3 ¦ 0,6 ¦
¦раствор ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Испытуемая ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦инактивиро-¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ванная сы- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦воротка ¦0,2¦0,2¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ 0,2 ¦ - ¦ - ¦ - ¦
+-----------+---+---+---+---+---+---+---+------+-----+-----+------+
¦ Из второй пробирки после перемешивания переносят по ¦
¦ 0,2 мл последовательно из пробирки в пробирку (из второй в ¦
¦ третью, из третьей в четвертую и т.д.) до 7-й пробирки, ¦
¦ из которой 0,2 мл удаляют ¦
¦ ¦
¦ Получаются титры реогеитов ¦
¦ 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 <*> ¦
¦ ¦
¦ ¦
+-----------T---T---T---T---T---T---T---T------T-----T-----T------+
¦Антиген по ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦титру ¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦ - ¦ 0,1 ¦ - ¦ - ¦
+-----------+---+---+---+---+---+---+---+------+-----+-----+------+
¦ Встряхнуть, оставить при комнатной температуре ¦
¦ на 10 минут ¦
+-----------T---T---T---T---T---T---T---T------T-----T-----T------+
¦Комплемент ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦2 единицы ¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ - ¦
+-----------+---+---+---+---+---+---+---+------+-----+-----+------+
¦ Встряхнуть, поставить в холодильник на 18-20 часов ¦
¦ с последующей инкубацией в термостате в течение ¦
¦ 10 минут ¦
+-----------T---T---T---T---T---T---T---T------T-----T-----T------+
¦Гемолити- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ческая сы- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦воротка по ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦удвоенному ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦титру ¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ - ¦
¦2% взвесь ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦эритроцитов¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦барана ¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦
+-----------+---+---+---+---+---+---+---+------+-----+-----+------+
¦ Встряхнуть, поставить на 45-60 минут в термостат ¦
¦ до полного гемолиза в контрольных пробирках с испытуе- ¦
¦ мой сывороткой ¦
L------------------------------------------------------------------
-------------------------------
<*> Титры реагинов по отноению к первоначальному разведению
испытуемой сыворотки 1:5.
4.3.14. Реакция иммунофлуоресценции (РИФ)
Принцип. Принцип метода заключается в использовании
люминесцентного варианта реакции антиген - антитело для
серодиагностики сифилиса. Антиген из патогенных бледных трепонем
соединяется с соответствующими антителами сыворотки крови больного
сифилисом, которые, в свою очередь, соединяются с антителами
кроличьей люминесцирующей сыворотки против глобулинов человека. В
результате образовавшихся комплексов при исследовании в
люминесцентном микроскопе в положительных случаях наблюдается
желто - зеленое свечение трепонем; в отрицательных - трепонемы не
светятся.
Реагенты.
1. Антиген - взвесь бледных трепонем штамма Никольса из
семисуточного орхита кролика в физиологическом растворе хлористого
натрия. Хранится в холодильнике при +4 град. С, при соблюдении
условий стерильности. Одна взвесь может быть использована в
течение нескольких месяцев (до 4-х). Из нескольких взвесей
выбирают ту, в которой не наблюдается агглютинации трепонем, их
достаточное количество и они обеспечивают чувствительность и
специфичность реакции.
2. Люминесцирующая сыворотка против глобулинов человека.
Готовится лабораторией люминесцирующих сывороток Института
эпидемиологии и микробиологии им. Гамалеи АМН СССР.
3. Физиологический раствор хлористого натрия - 8,5 г
хлористого натрия на 1 литр дистиллированной воды.
4. Фосфатный буфер, рН 7,2 (1 литр дистиллированной воды, 6,8
г хлористого натрия, 1,48 г двузамещенного фосфорнокислого натрия,
0,43 г однозамещенного фосфорнокислого калия).
5. Фосфатный буфер, pH 7,4 (первый раствор - 100 мл
дистиллированной воды, 2,84 г двузамещенного фосфорнокислого
натрия; второй раствор - 100 мл дистиллированной воды, 2,78 г
лимонной кислоты; для получения фосфатного буфера 18,17 мл первого
раствора смешивают с 1,83 мл второго раствора).
6. Глицерин.
7. Ацетон х.ч.
8. Забуференный глицерин (9 частей глицерина и 1 часть
фосфатного буфера рН 7,4).
9. Иммерсионное масло, нелюминесцирующее, или диметилфталат.
10. Сорбенты: а) ультраозвученные трепонемы штамма Рейтера или
концентрированный фильтрат бульонной культуры трепонем штамма
Рейтера.
Специальное оборудование.
Пробирки бактериологические.
Пипетки градуированные (1 мл) и пастеровские.
Колбы на 2 литра.
Цилиндры на 1 литр.
Капельницы.
Стекла тонкие, предметные и покровные.
Люминесцентный микроскоп типа МЛ или люминесцентный осветитель
ОСЛ-1.
Термостат.
Инактиватор.
Холодильник с температурой во внутренней камере +4 град. С.
Вентилятор.
Часы лабораторные.
Весы лабораторные.
Штативы для пробирок и для предметных стекол.
Влажные камеры для предметных стекол.
Ход определения. Постановке основного опыта предшествует
подготовительная работа, состоящая из следующих этапов.
1. Подготовка испытуемых сывороток крови. Сыворотку крови,
освобожденную от сгустка и форменных элементов, инактивируют 30
минут при 56 град. С. Хранят в холодильнике при +4 град. С или -20
град. С. В день постановки сыворотки разводят фосфатным буфером с
рН 7,2 в 10 (РИФ-10) или в 200 раз (РИФ-200) или сорбентом в 5 раз
при постановке РИФ с абсорбцией.
2. Приготовление антигена. Взвесь бледных трепонем штамма
Никольса, густотой 40-60 трепонем в темном поле зрения, в виде
капель наносят на обезжиренные предметные стекла и делают из них
мазки, высушивают и фиксируют в химически чистом ацетоне 15 минут.
3. Титрование люминесцирующей сыворотки против глобулинов
человека. Титрованию подлежит каждая серия люминесцирующей
сыворотки. Титрование проводят на сыворотках крови больных
сифилисом и здоровых людей. Титром считается то разведение, при
использовании которого в реакции с сыворотками крови больных
сифилисом получено хорошее свечение антигена, а с сыворотками
крови здоровых людей свечение антигена не получено.
4. Подготовка люминесцирующей сыворотки для постановки реакции
заключается в ее разведении в день постановки реакции по титру
физиологическим раствором хлористого натрия.
5. Приготовление фосфатного буфера, рН 7,2, в день постановки
реакции.
6. Приготовление сорбента заключается в разведении его по
титру фосфатным буферным раствором, рН 7,2.
Основной опыт. Препараты, пронумерованные соответственно
номерам испытуемых сывороток крови, помещают во влажную камеру и
наносят на них разведенные в 10 (РИФ-10) или в 200 раз (РИФ-200)
испытуемые сыворотки крови. При постановке РИФ-10 влажную камеру
выдерживают при комнатной температуре 30 минут, при постановке
РИФ-200 ее помещают на то же время в термостат при 37 град. С
(первая фаза реакции), после чего препараты промывают 10 минут, в
двух порциях фосфатного буфера с рН 7,2, высушивают и помещают во
влажную камеру. Наносят разведенную по титру люминесцирующую
сыворотку и оставляют на 30 минут при комнатной температуре
(вторая фаза реакции), после чего промывают в двух порциях
фосфатного буфера 10 минут, высушивают, монтируют с помощью
забуференного глицерина и исследуют в люминесцентном микроскопе с
иммерсионной системой.
Основной опыт РИФ с абсорбцией. Препараты, пронумерованные
соответственно номерам исследуемых сывороток, помещают во влажную
камеру и наносят на них разведенные сорбентом в 5 раз испытуемые
сыворотки. Влажную камеру помещают в термостат с температурой 37
град. С (первая фаза). После этого препараты промывают 10 минут в
двух порциях фосфатного буфера с рН 7,2, высушивают и помещают
во влажную камеру. Наносят разведенную по титру люминесцирующую
сыворотку и оставляют на 30 минут при комнатной температуре
(вторая фаза реакции), затем препараты промывают в двух порциях
фосфатного буфера 10 минут, высушивают, монтируют с помощью
забуференного глицерина и исследуют в люминесцентном микроскопе с
иммерсионной системой.
Оценка результатов. Свечение антигена 4+, 3+ и 2+ указывает на
положительный результат реакции, свечение трепонем 1+ и
невыявление их в препарате считается отрицательным результатом
реакции.
Источники ошибок.
1. Исследование сывороток крови больных во время лечения
пенициллином.
2. Неправильное и длительное хранение сывороток крови.
3. Некачественный антиген.
4. Некачественная люминесцирующая сыворотка.
5. Неправильное определение титра люминесцирующей сыворотки.
6. Нанесение испытуемой сыворотки крови или люминесцирующей
сыворотки при постановке реакции не на препарат, а на другую
сторону стекла.
7. Неправильная установка освещения в люминесцентном
микроскопе.
4.4. ЛИКВОРОДИАГНОСТИКА СИФИЛИСА
Исследование спинномозговой жидкости имеет очень важное
значение для диагностики сифилиса нервной системы, а также при
решении вопроса об излеченности больного сифилисом. Изменения в
спинномозговой жидкости в большем или меньшем проценте случаев
имеются при всех формах сифилиса. По мере давности заболевания
частота и степень изменений нарастают. Примечательно, что
патологическую спинномозговую жидкость при сифилисе можно
обнаружить и в тех случаях, когда в сыворотке реакция Вассермана
бывает отрицательной. При прогрессивном параличе и табо - параличе
специфические изменения в ликворе, обнаруживаемые лабораторно,
предшествуют на 1-2 года проявлению клинических симптомов
(А.П.Фридман).
Спинномозговую жидкость берут методом поясничного прокола при
помощи особой пункционной или обыкновенной рекордовской или
люэровской иглы, длиной 10-12 см - для взрослых и 5-6 см - для
детей, предварительно простерилизованной кипячением. Пункцию
производят между остистыми отростками III и IV или IV и V
поясничных позвонков. Место предстоящего прокола тщательно
обрабатывают спиртом и йодной настойкой. Иглу вкалывают в
намеченное место и медленно продвигают вперед до тех пор, пока из
канюли не появится спинномозговая жидкость; в норме она прозрачна
и вытекает каплями. При появлении ликвора из канюли иглы под нее
подставляют чистую пробирку, куда и собирают спинномозговую
жидкость в общем объеме не более 10-12 миллилитров. После этого
винтообразным движением извлекают иглу, место прокола зажимают
ватой, смоченной спиртом, и затем накладывают коллодийную повязку.
При нормальном состоянии спинномозговая жидкость - бесцветна -
прозрачна, при хранении не свертывается и не дает осадка. Удельный
вес ее - 1006-1007, рН - 7,35-7,4, содержание белка - 10-25 мг%,
форменных элементов - от 0 до 3 в 1 куб. мм.
Исследование спинномозговой жидкости должно включать в себя
определенный минимум реакций: счет форменных элементов,
определение общего содержания белка, глобулиновые реакции Нонне -
Апельта и Панди, реакцию Вассермана в трех разведениях и
коллоидную реакцию с хлорным золотом.
4.4.1. Подсчет количества форменных элементов
Принцип. В нормальной спинномозговой жидкости содержится
незначительное количество форменных элементов, как правило, -
лимфоцитов. Увеличение количества клеток является одним из ранних
признаков инфекции мозговых оболочек.
Реактивы.
10% раствор уксусной кислоты, подкрашенный метилвиолетом.
Дистиллированной воды - 50 мл, ледяной уксусной кислоты - 5 мл,
метилвиолета - 0,1 мл.
Специальное оборудование.
Микроскоп светооптический.
Камера Фукс - Розенталя.
Меланжеры (смесители для подсчета лейкоцитов).
Пробирки 15х150 мм.
Стекла покровные.
Ход определения. В меланжер для подсчета лейкоцитов набирают
до метки "I" 10% раствор уксусной кислоты, подкрашенный
метилвиолетом; затем до метки "II" набирают спинномозговую
жидкость. Раствор уксусной кислоты растворяет возможно
присутствующие эритроциты и подкрашивает в синий цвет лейкоциты,
что в дальнейшем облегчает их подсчет. После энергичного
встряхивания наполняют содержимым смесителя камеру Фукс -
Розенталя, которая состоит из 16-ти больших квадратов, каждый из
которых, в свою очередь, состоит из 16-ти малых квадратов. Глубина
камеры - 0,2 мм, общий объем равен 3,2 куб.мм. При отсутствии
смесителя допускается смешивание спинномозговой жидкости с 10%
раствором уксусной кислоты следующим образом: на часовое стекло
пастеровской пипеткой отсчитывают 10 капель спинномозговой
жидкости и добавляют 1 каплю 10% раствора уксусной кислоты,
подкрашенной метилвиолетом. После перемешивания наполняют
полученной смесью счетную камеру. Лейкоциты сосчитывают во всех
256 квадратах камеры и полученное число делят на 3,2 (объем
камеры). Результат деления будет соответствовать количеству
форменных элементов в 1 куб. мм спинномозговой жидкости,
разведенной уксусной кислотой. Чтобы узнать количество форменных
элементов в 1 куб. мм спинномозговой жидкости, необходимо
сосчитанное во всех квадратах камеры число "А" разделить на 3,2 и
на 10/11 (степень разведения ликвора):
А х 11 А х 11 А
--------- = ------ = ---
3,2 х 10 32 3
Чаще не производят арифметического вычисления, а приводят
число в дроби, где числитель обозначает количество найденных
форменных элементов, а знаменатель - объем камеры.
Источник ошибок. Длительное хранение спинномозговой жидкости.
4.4.2. Определение общего белка
См. определение общего белка в спинномозговой жидкости в
"Методических указаниях по применению унифицированных клинических
лабораторных методов исследования", М., 1973.
4.4.3. Определение глобулинов высаливанием
(реакция Нонне - Апельта)
Принцип. Реакция основана на свойстве некоторых солей в
определенных концентрациях осаждать избирательно глобулины из
спинномозговой жидкости.
Реактивы.
Насыщенный раствор сернокислого аммония - (NH4)2SO4, химически
чистый - при кипячении в 100 мл дистиллированной воды растворяют
85 г сернокислого аммония. Полученный раствор выдерживают 48 часов
при комнатной температуре и после фильтрования употребляют для
постановки реакции. Реактив должен иметь нейтральную реакцию.
Специальное оборудование.
Пробирки 15х100 мм.
Пипетки градуированные на 1, 2, 5 мл с делениями на 0,01 мл.
Колбы стеклянные на 100 и 200 мл.
Ход определения. В пробирку к 0,5 мл спинномозговой жидкости
приливают равный объем насыщенного раствора сернокислого аммония и
основательно перемешивают. В контрольную пробирку равного диаметра
наливают 1 мл дистиллированной воды.
Оценка полученных результатов. Регистрация результатов реакции
производится в течение трех минут после смешивания спинномозговой
жидкости с реактивом, так как при более поздней регистрации
помутнение может произойти и в нормальной спинномозговой жидкости.
При регистрации результатов рядом с пробиркой с реагирующей смесью
нужно держать для сравнения контрольную пробирку с
дистиллированной водой и рассматривать их на черном фоне. Для
обозначения позитивности реакции Нонне - Апельта пользуются
системой четырех плюсов: значительное помутнение жидкости - 4+;
умеренное помутнение - 3+; заметная опалесценция - 2+ и слабая
опалесценция - 1+.
Источники ошибок. 1. Поздняя регистрация результата реакции.
2. Грязная лабораторная посуда.
3. Кислотность или щелочность реактива.
4.4.4. Определение глобулинов осаждением
насыщенным раствором карболовой кислоты
(реакция Панди)
Принцип. Реакция основана на осаждении глобулинов
спинномозговой жидкости насыщенным раствором карболовой кислоты.
Реактивы.
Насыщенный раствор карболовой кислоты: 100 г карболовой
кислоты (Acidi carbolici liquefacti) смешивают с 1 литром
дистиллированной воды, энергично перемешивают и оставляют в
термостате на 6-10 часов. После пребывания при комнатной
температуре в течение 7 дней надосадочную жидкость сливают и
используют в качестве реактива для реакции.
Специальное оборудование.
Термостат с температурой +37 град. С.
Пипетки пастеровские.
Стекла часовые.
Пробирки 15х100 мм.
Колбы стеклянные на 200 и 500 мл.
Ход определения. На часовое стекло, помещенное на черную
бумагу, наливают 1 мл реактива и по краю стекла или в его центр
наслаивают каплю испытуемой спинномозговой жидкости.
Оценка полученных результатов. В случае положительного
результата в месте соприкосновения реактива и испытуемой
спинномозговой жидкости образуется молочно - белое облачко,
переходящее в муть. Для обозначения позитивности реакции Панди
пользуются системой четырех плюсов: значительное помутнение - 4+;
умеренное помутнение - 3+; заметная опалесценция - 2+; слабая
опалесценция - 1+.
4.4.5. Коллоидная реакция с хлорным золотом
(реакция Ланге)
Принцип. Коллоидные растворы, не изменяющиеся под влиянием
различных разведений нормальной спинномозговой жидкости, в
патологически измененной жидкости дают при тех же условиях
изменение степени дисперсности, в зависимости от разведения
жидкости, изменение цвета коллоидного раствора или образование
осадка.
Реактивы.
1. Хлористый натрий - 4,5 г на 1 литр дистиллированной воды.
2. Хлорное золото (Aurum chloratum fuscum) - 1% раствор в
дистиллированной воде.
3. Лимоннокислый натрий (С6Н5Na3 х 5Н2О) - 1% раствор в
дистиллированной воде.
4. Рабочий раствор хлорного золота. К 9 мл дистиллированной
воды приливают 1 мл 1% раствора хлорного золота, подогревают до
90-95 град. С, добавляют 5 мл 1% раствора лимоннокислого натрия и
кипятят до тех пор, пока раствор не примет вишнево - красный цвет.
Во время кипячения цвет раствора меняется от синего и фиолетового
до красного и вишневого. Приготовленный раствор хлорного золота
хранят в темном месте при комнатной температуре в течение 2
месяцев.
Специальное оборудование.
Пробирки 15х100 мм.
Пипетки градуированные на 1, 2, 5 и 10 мл с делениями на 0,01
мл.
Банки стеклянные на 50, 100 и 500 мл.
Колбы стеклянные на 50, 100 и 200 мл.
Цилиндры градуированные на 500 мл с делениями на 5 мл.
Примечание. Для постановки реакции посуда должна быть
абсолютно чистой, не должна иметь примеси кислот или щелочей.
Ход определения. Спинномозговую жидкость исследуют в 11
пробирках. В первую пробирку наливают 0,9 мл 0,45% раствора
хлористого натрия, в остальные - по 0,5 мл того же раствора. В
первую пробирку приливают 0,1 мл активной спинномозговой жидкости
и после перемешивания 0,5 мл смеси переносят во вторую пробирку,
из второй пробирки - в третью и т.д. до десятой. Из десятой
пробирки после перемешивания 0,5 мл смеси удаляют. Таким образом
получают нисходящие разведения спинномозговой жидкости от 1:10 до
1:5.120. В 11-ю пробирку спинномозговую жидкость не добавляют -
она является холостой пробой. Затем во все 11 пробирок приливают
по 2,5 мл раствора хлорного золота. Пробирки энергично встряхивают
и оставляют на 16-18 часов при комнатной температуре.
Оценка полученных результатов. Практически результаты
регистрируют на следующий день после постановки реакции. В случае
нормальной спинномозговой жидкости смесь во всех 11 пробирках
остается пурпурно - красной или в одной из первых пробирок
становится красно - фиолетовой. При патологическом ликворе на дно
пробирок выпадает более или менее интенсивный осадок, и цвет
жидкости меняется на красно - фиолетовый, красно - синий, голубой,
и, наконец, бесцветный. Результаты отмечают цифрами, указывающими
условное изменение цвета в каждой пробирке. Ноль обозначает
отсутствие изменения окраски, 1 - красно - фиолетовый цвет, 2 -
фиолетовый, 3 - красно - синий, 4 - синий и сине - фиолетовый, 5 -
светло - синий и голубой, 6 - бесцветный. Например, цифровое
выражение отрицательной реакции будет 00000000000, дегенеративная
кривая будет иметь выражение - 66666543210, воспалительная кривая
не сифилитической этиологии может выражаться - 00124566531.
4.4.6. Реакция связывания комплемента
комплексом липоидного антигена и реагина
или трепонемального антигена и антитрепонемных антител
исследуемой спинномозговой жидкости
(реакция Вассермана, количественный метод)
Принцип. В спинномозговой жидкости больного сифилисом могут
находиться антитела и реагины, способные вступать в реакцию
связывания комплемента с соответствующими антигенами.
Реагенты.
1. Физиологический раствор - хлористый натрий х.ч., 8,5 г на 1
литр дистиллированной воды.
2. Антигены - кардиолипиновый и неспецифический. Сохраняются в
темном месте при комнатной температуре.
3. Комплемент. Применяется смесь сывороток крови, полученной
пункцией сердца у 5-10 здоровых морских свинок. При
консервировании 4% сухой борной кислотой и 5% сернокислым натром
сохраняется в холодильнике 1-2 месяца. Может быть использован
лиофильно высушенный комплемент.
4. Гемолизин - кроличья гемолитическая сыворотка с различными
титрами. Сохраняется в холодильнике.
5. Эритроциты барана. Кровь получают у барана пункцией яремной
вены. Кровь собирают в чистую стеклянную банку со стеклянными
бусами, которую встряхивают 10-15 минут. Фильтрованием через 2-3
слоя марли отделяют образовавшиеся сгустки фибрина.
Дефибринированную кровь барана хранят в холодильнике в течение 3-5
дней. При необходимости более длительного хранения кровь
консервируют. Приготовление консерванта: на 100 мл
физиологического раствора добавляют 6 г глюкозы и 4,5 г борной
кислоты, смесь кипятят на водяной бане 3 дня по 20 минут. к 100 мл
дефибринированной крови барана добавляют 15 мл консерванта.
Дефибринированную консервированную кровь хранят в холодильнике.
Специальное оборудование.
Термостат с температурой +37 град. С.
Центрифуга.
Холодильник с температурой +4-6 град. С.
Пробирки 15х100 мм.
Пипетки градуированные на 1, 2, 5 и 10 мл с делениями на 0,01
мл.
Банки стеклянные на 100, 200 и 500 мл.
Ход определения. Постановке основного опыта предшествует
подготовительная работа, состоящая из следующих этапов.
1. Подготовка спинномозговой жидкости. Мутную или с примесью
крови спинномозговую жидкость центрифугируют и отсасывают с
осадка. Реакцию ставят с активной спинномозговой жидкостью.
2. Приготовление разведения антигенов. Антигены разводят
соответственно способу и титру, указанным на этикетке. Титр - это
количество антигена на 1 мл физиологического раствора.
3. Приготовление гемолитической системы. Дефибринированную
кровь или эритроциты барана в объеме, необходимом для работы в
данный день, центрифугируют, плазму осторожно отсасывают и осадок
трижды отмывают 5-6 объемами физиологического раствора. При
последнем промывании надосадочная жидкость должна быть бесцветной.
Из плотного осадка готовят 3% взвесь эритроцитов барана в
физиологическом растворе. Равный объем гемолитической сыворотки,
разведенной физиологическим раствором по утроенному титру
(например, на этикетке указан титр 1:1.500, для разведения титр
будет 1:500, т.е. 0,1 гемолизина на 50 мл физиологического
раствора), объединяют с 3% взвесью эритроцитов барана. Раствор
гемолитической сыворотки приливают к взвеси эритроцитов барана и
производят быстрое перемешивание. Полученную гемолитическую
систему выдерживают в термостате 30 минут.
4. Титрование комплемента. Комплемент морской свинки разводят
1:10 физиологическим раствором. При работе с сухим комплементом
предварительно необходимо растворить содержимое ампулы в
физиологическом растворе в объеме, равном объему высушенного
комплемента. Нормальную инактивированную сыворотку человека,
отрицательную в реакции Вассермана и в осадочных реакциях,
разводят физиологическим раствором 1:5. Титрование комплемента
производят в 30 пробирках, поставленных по 10 тремя рядами: два
для титрования комплемента в присутствии двух антигенов и третий
ряд - для титрования комплемента в присутствии физиологического
раствора. Пять контрольных пробирок - две для контроля антигенов и
по одной для контроля комплемента, гемолизина и физиологического
раствора на гемотоксичность - заполняют до объединения раствора
гемолитической сыворотки и взвеси эритроцитов барана (см. табл.
27).
Таблица 27
---------------------------------------T-------------------------¬
¦ ¦ NN пробирок ¦
¦ Ингредиенты (в мл) +----T----T----T----T-----+
¦ ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦
+--------------------------------------+----+----+----+----+-----+
¦ 3% взвесь эритроцитов барана ¦0,25¦0,25¦0,25¦0,25¦0,25 ¦
¦ Гемолитическая сыворотка по ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ утроенному титру ¦- ¦0,25¦- ¦- ¦- ¦
¦ Раствор комплемента 1:10 ¦0,25¦- ¦- ¦- ¦- ¦
¦ Антиген I по титру ¦- ¦- ¦- ¦0,5 ¦- ¦
¦ Антиген II по титру ¦- ¦- ¦- ¦- ¦0,5 ¦
¦ Физиологический раствор ¦0,75¦0,75¦1,0 ¦0,5 ¦0,5 ¦
L--------------------------------------+----+----+----+----+------
После 45-минутного пребывания в термостате во всех пробирках
должен отсутствовать гемолиз.
Комплемент, разведенный 1:10, разливают в 10 пробирок
третьего ряда в дозах: 0,1; 0,2; 0,24; 0,3; 0,36; 0,4; 0,44; 0,5;
0,56; 0,6. Общий объем содержимого пробирок доводят до 1 мл
соответствующими объемами физиологического раствора: 0,9; 0,8;
0,76; 0,7; 0,64 0,6; 0,56; 0,5; 0,44; 0,4. Полученную в каждой
пробирке смесь переносят по 0,25 мл в соответствующие пробирки
двух рядов, а 0,25 мл удаляют. Нормальную инактивированную
человеческую сыворотку, разведенную 1:5 физиологическим раствором,
разливают во все 30 пробирок по 0,25 мл. Антиген I, разведенный по
титру, приливают по 0,25 мл в 10 пробирок первого рядя; антиген
II, разведенный по титру, приливают по 0,25 мл в 10 пробирок
второго ряда; физиологический раствор приливают по 0,25 мл в 10
пробирок третьего ряда. После 45-минутной инкубации в термостате
во все 30 пробирок приливают по 0,5 мл гемолитической системы.
Повторная инкубация в термостате продолжается 45 минут (см. табл.
28).
Таблица 28
СХЕМА ТИТРОВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА
---------------------T-------------------------------------------¬
¦ ¦ NN пробирок ¦
¦ Ингредиенты (в мл) +---T---T----T---T----T---T----T---T----T---+
¦ ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦ 7 ¦ 8 ¦ 9 ¦10 ¦
+--------------------+---+---+----+---+----+---+----+---+----+---+
¦ Третий ряд ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ Комплемент (1:10) ¦0,1¦0,2¦0,24¦0,3¦0,36¦0,4¦0,44¦0,5¦0,56¦0,6¦
¦ Физиологический ¦0,9¦0,8¦0,76¦0,7¦0,64¦0,6¦0,56¦0,5¦0,44¦0,4¦
¦ раствор ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+--------------------+---+---+----+---+----+---+----+---+----+---+
¦ После тщательного перемешивания из каждой пробирки переносят ¦
¦ по 0,25 мл в соответствующие пробирки второго и первого ряда ¦
¦ и по 0,25 мл удаляют. К оставшимся объемам разведенного ¦
¦ комплемента в 3-й ряд добавляют физиологический раствор ¦
¦ по 0,25 мл во все 10 пробирок ¦
+--------------------T-------------------------------------------+
¦ Второй ряд ¦Антиген I по 0,25 мл во все 10 пробирок ¦
¦ Первый ряд ¦Антиген II по 0,25 мл во все 10 пробирок ¦
+--------------------+-------------------------------------------+
¦ Нормальная ¦ ¦
¦ инактивированная ¦ ¦
¦ человеческая ¦ ¦
¦ сыворотка (1:5) ¦по 0,25 мл во все 30 пробирок ¦
+--------------------+-------------------------------------------+
¦ Встряхнуть, инкубация в термостате 45 минут ¦
+--------------------T-------------------------------------------+
¦ Гемолитическая ¦ ¦
¦ система ¦по 0,5 мл во все 30 пробирок ¦
+--------------------+-------------------------------------------+
¦ Встряхнуть, инкубация в термостате 45 минут ¦
L-----------------------------------------------------------------
Из-за отсутствия антикомплементарных свойств у спинномозговой
жидкости, для ее исследования комплемент вводят в реакцию по
титру, т.е. по его растворяющей дозе, по наименьшему количеству,
способствующему полному гемолизу бараньих эритроцитов, находящихся
в 0,5 мл гемолитической системы.
Основной опыт. Спинномозговую жидкость исследуют параллельно в
трех дозах: а) неразведенную, б) разведенную физиологическим
раствором 1+1 и в) разведенную физиологическим раствором 1+4. В
реакции применяются два антигена - кардиолипиновый и
неспецифический (см. табл. 29).
Таблица 29
СХЕМА ОСНОВНОГО ОПЫТА РЕАКЦИИ ВАССЕРМАНА
СО СПИННОМОЗГОВОЙ ЖИДКОСТЬЮ
------------------------T----------------------------------------¬
¦ ¦ NN пробирок ¦
¦ Ингредиенты (в мл) +-----T-----T-----T----T-----T----T------+
¦ ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦ 7 ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦контр.¦
+-----------------------+-----+-----+-----+----+-----+----+------+
¦Спинномозговая жидкость¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,25¦0,25¦ 0,5 ¦ 0,5¦ 0,5 ¦
¦Физиологический раствор¦ 0,4 ¦ 0,4 ¦ 0,25¦0,25¦ - ¦ - ¦ 0,5 ¦
¦Антиген I ¦ 0,5 ¦ - ¦ 0,5 ¦ - ¦ 0,5 ¦ - ¦ - ¦
¦Антиген II ¦ - ¦ 0,5 ¦ - ¦0,5 ¦ - ¦ 0,5¦ - ¦
¦Комплемент по титру ¦ 0,5 ¦ 0,5 ¦ 0,5 ¦0,5 ¦ 0,5 ¦ 0,5¦ 0,5 ¦
+-----------------------+-----+-----+-----+----+-----+----+------+
¦ Встряхнуть, поставить в термостат на 1 час ¦
+-----------------------T-----T-----T-----T----T-----T----T------+
¦Гемолитическая ¦ 1,0 ¦ 1,0 ¦ 1,0 ¦1,0 ¦ 1,0 ¦ 1,0¦ 1,0 ¦
¦система ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-----------------------+-----+-----+-----+----+-----+----+------+
¦ Встряхнуть и поставить в термостат на ¦
¦ 45-60 минут до полного гемолиза в контрольных пробирках ¦
L-----------------------------------------------------------------
Оценка полученных результатов. Результаты учитываются
раздельно с каждым разведением. Для обозначения позитивности
реакции Вассермана со спинномозговой жидкостью пользуются системой
четырех плюсов: полная задержка гемолиза - резко положительная
реакция (4+); значительная задержка гемолиза - положительная
реакция (3+); частичная задержка гемолиза - слабо положительная
реакция (2+); незначительная задержка гемолиза - сомнительная
реакция (1+).
Источники ошибок. 1. Неправильный выбор дозы комплемента -
недостаток или избыток комплемента в опыте.
2. Неправильное хранение спинномозговой жидкости.
3. Длительное хранение спинномозговой жидкости.
Литература.
Вайнштейн А.Б., Резникова Л.С. - Лабораторная практика, 1938,
3.
Григорьев П.С., Раппопорт М.М. - Упрощенные методы
серодиагностики сифилиса. М. - Л., 1937.
Инструкция по постановке серологических реакций на сифилис МЗ
СССР. М., 1956.
Овчинников Н.М. - Новые серологические реакции на сифилис. М.,
1961.
Овчинников Н.М. - Простая методика реакции иммобилизации
бледных трепонем (методическое письмо) МЗ СССР, 1966.
Овчинников Н.М. - Серологические исследования при сифилисе и
гонорее. М., 1958.
Овчинников Н.М., Беднова В.Н. - Вестн. дермат. и венерол.,
1968, 2, 40.
Овчинников Н.М. - Лабораторная диагностика венерических
заболеваний. М., 1969.
Реакция иммунофлуоресценции (РИФ-200) для специфической
серодиагностики сифилиса. Методическое письмо, утв. МЗ СССР 23
марта 1970 г. N 10-83/14-29. М., 1970.
Фридман А.П. - Основы ликворологии. М., 1971.
Manual of tests for syphilis. Public Health service
Publication 411, Washington, 1969.
Kolmer. The Serodiagnosis of Syphilis u.s. publ. Health
Service, 1938.
Nielg., Freiburg - Blane A. - Bull. Wld. Hlth. Oro. 1965, 33,
89.
4.5. ИММУНОДИАГНОСТИКА ГЕЛЬМИНТОЗОВ
4.5.1. Определение титра антител при эхинококкозе и
альвеококкозе реакцией латекс - агглютинации
Метод 1. Реакция латекс - агглютинации с эхинококковым
диагностикумом.
Принцип. Сыворотка крови больного эхинококкозом или
альвеококкозом, содержащая специфические антитела, агглютинирует
частицы полистирольного латекса, сенсибилизированные эхинококковым
антигеном.
Реагенты.
1. Эхинококковый диагностикум для реакции латекс -
агглютинации представляет собой эхинококковый антиген (жидкость из
эхинококковых пузырей человека или овец), адсорбированный на
полистирольном латексе, взвешенном в боратно - солевом буфере, рН
- 8,2. Препарат выпускается Ставропольским научно -
исследовательским институтом вакцин и сывороток в виде комплектов,
каждый из которых содержит 10 ампул по 5 мл (20 диагностических
доз) эхинококкового диагностикума, 1 ампулу 0,5 мл (2
диагностические дозы) контрольной гипериммунной агглютинирующей
сыворотки кролика и 1 ампулу 0,5 мл (2 диагностические дозы)
контрольной нормальной сыворотки. Наставление по применению
препарата, приложенное к комплекту, соответствует настоящим
методическим указаниям. Хранить диагностикум - при 4-10 град. С.
Беречь от замерзания. Срок годности - 1 год с момента выпуска. По
окончании срока годности диагностикум подлежит проверке на
чувствительность и специфичность, после чего срок годности может
быть продлен на 6 месяцев.
Перед использованием ампулу с диагностикумом тщательно
встряхивают и просматривают под лупой с увеличением в 2-3 раза.
При обнаружении в жидкости флоккул или хлопьев, а также трещин в
стекле ампулы с диагностикумом выбраковываются.
2. Боратно - солевой буфер, рН - 8,2. Смешивают 50 мл 0,1М
раствора борной кислоты (6,18 г кристаллической борной кислоты и
дистиллированной воды до 1.000 мл), 5,9 мл 0,1н раствора едкого
натра и доводят до 100 мл дистиллированной водой. На каждые 100 мл
готовой смеси добавляют по 0,85 г хлористого натрия. Хранят в
холодильнике не более недели, перед употреблением необходимо
профильтровать и проверить рН.
Специальное оборудование.
Термостат на 37 град. С.
Лупа с увеличением в 2-3 раза (не больше).
Подготовка к определению. Обработка исследуемой крови. Кровь
берут из вены шприцем в количестве 5-6 мл в стерильную пробирку и
выдерживают 30 минут в термостате при 37 град. С. или 1 час при
комнатной температуре. Образовавшийся за это время сгусток
отделяют над пламенем от стенок пробирки пастеровской пипеткой или
стеклянной палочкой и пробирки помещают в холодильник при 4-8
град. С на 5-20 часов. После отстаивания сыворотку осторожно
отсасывают, переливают в стерильную пробирку и центрифугируют 5-10
минут при 1.500 об/мин. Гемолизированные или проросшие сыворотки
для исследования не пригодны. Исследуемые сыворотки хранят в
запаянных ампулах при 4-8 град. С в течение 2 недель, а в
замороженном состоянии - до 2-х месяцев.
Ход определения. Для каждой исследуемой и контрольной
сыворотки в штатив устанавливают по 5 пробирок и одну пробирку на
всю серию для холостой пробы (контроля на реактивы). Исследуемые и
контрольные сыворотки разводят боратно - солевым буфером (рН-8,2)
в последовательных двойных разведениях, от 1:4 до 1:64. Для этого
в первую из пяти пробирок каждого ряда наливают по 0,75 мл, а в
остальные - по 0,5 мл боратно - солевого буфера. Затем в каждую
первую пробирку к 0,75 мл буфера приливают 0,25 мл сыворотки,
отмеряя каждую сыворотку отдельной стерильной пипеткой на 1-2 мл.
Перемешивают сыворотку с буфером и 0,5 мл смеси переносят во
вторую пробирку с 0,5 мл буфера, снова перемешивают и 0,5 мл новой
смеси переносят в третью пробирку и т.д. Из последней, пятой
пробирки 0,5 мл смеси выливают. К каждому разведению сыворотки
добавляют по 0,5 мл эхинококкового диагностикума, тщательно
встряхивают каждую пробирку и помещают сначала на 3 часа в
термостат при 37 град. С, а затем - на ночь в холодильник при 4-8
град. С. На следующий день пробирки центрифугируют 5 минут при
2.000 об/мин, просматривают под лупой с увеличением в 2-3 раза и
по количеству осадка и цвету надосадочной жидкости оценивают
полученные результаты.
Контроль.
1. Контроль на реагенты - 0,5 мл боратно - солевого буфера и
0,5 мл диагностикума.
2. Реакция с контрольной нормальной сывороткой, которую
разводят и исследуют так же, как исследуемую сыворотку.
3. Реакция с контрольной гипериммунной сывороткой кролика,
которую разводят и исследуют так же, как исследуемую сыворотку.
Показатели реакции достоверны при отрицательном результате
контролей 1 и 2 (холостая проба и реакция с контрольной нормальной
сывороткой). В контроле 3 (реакция с контрольной гипериммунной
сывороткой) должна быть ясно выраженная агглютинация в титре не
менее чем 1:32.
|
