|
Стр. 2
обесцвечивании раствор не пригоден для употребления.
2. Калибровочный раствор гемиглобинцианида. В качестве
калибровочного раствора могут применяться стандартные растворы
гемиглобинцианида производства фирм "ИМУНА" (ЧССР) и "РЕАНАЛ"
(ВНР). Концентрация гемиглобинцианида в стандартном растворе
производства фирмы "РЕАНАЛ" - 59,75 мк%, фирмы "ИМУНА" - 61,28
мг%. Это соответствует концентрации гемоглобина в крови - 15 г% и
15,? г% при разведении крови в 251 раз. Указанные стандартные
растворы соответствуют международному эталонному раствору
гемиглобинцианида. Стандартные растворы хранят в холодильнике при
+4 град. С в защищенном от света месте (предостерегать от
замерзания). Применяют в нет разбавленном виде.
Специальное оборудование.
Фотоэлектроколориметр или
Гемоглобинометр.
Пипетка на 0,02 мл
Колба мерная на 1,0 л
Ход определения. Опытная проба. 0,02 мл крови приливают к 5,0
мл трансформирующего раствора (разведение в 251 раз), хорошо
перемешивают, оставляют стоять 10 минут, после чего измеряют на
фотоэлектроколориметре при длине волны 500-560 нм (зеленый
светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см против холостой пробы.
Холостая проба - трансформирующий раствор или вода.
Стандартный раствор измеряют при тех же условиях, что и
опытную пробу.
Расчет содержания гемоглобина производят по калибровочному
графику, построенному по стандартному раствору гемиглобинцианида,
или по формуле:
Еоп
Нb в г% - ---- х С х К х 0,001,
Ест
где: Еоп - экстинкция опытной пробы,
Ест - экстинкция стандартного раствора,
С - концентрация геминглобинцианида в стандартном
растворе в мг%,
К - коэффициент разведения крови,
0,001 - коэффициент для пересчета мг% в г%.
Построение калибровочного графика. Из стандартного раствора
готовят разведения, как указано в таблице:
---------T----------------T-------------------T------------------¬
¦ NN ¦ Стандартный ¦ Трансформирующий ¦ Концентрация ¦
¦ п/п ¦ раствор ¦ раствор ¦ гемоглобина крови¦
¦ ¦ (мл) ¦ (мл) ¦ (г%) ¦
+--------+----------------+-------------------+------------------+
¦ 1 ¦ - ¦ 6 ¦ "холостая" проба ¦
¦ 2 ¦ 2 ¦ 4 ¦ 5 ¦
¦ 3 ¦ 4 ¦ 2 ¦ 10 ¦
¦ 4 ¦ 6 ¦ - ¦ 15 ¦
L--------+----------------+-------------------+-------------------
Измеряют против холостой пробы.
Нормальные величины гемоглобина крови:
у женщин - 12,0 - 14,0 г%.
у мужчин - 13,0 - 16,0 г%.
Примечания.
1. Международным комитетом по стандартизации в гематологии
предложен в качестве стандартного гемиглобинцианидный метод
определения гемоглобина с использованием трансформирующего
раствора, содержащего цианистый калий. Результаты, полученные при
определении гемоглобина унифицированным методом и методом,
принятым Международным комитетом, совпадают (коэффициент
корреляции - 0,96).
2. Измерение можно проводить на спектрофотометре при длине
волны 540 нм или на гемоглобинометре.
Литература.
1. Кушековский М.С. - Клинические формы повреждения
гемоглобина. Л., 1968.
2. Пименова Л.М., Дервиз Г.В. - В кн. "Унифицированные методы
клинических лабораторных исследований", под ред. В.В.Меньшикова,
вып. 6, 1975.
2.1.2. Определение осмотической резистентности эритроцитов
Принцип. Измерение степени гемолиза эритроцитов в забуференных
гипотонических растворах хлористого натрия определенной
концентрации.
Реактивы.
Основной раствор (по своей осмотической концентрации
соответствует 10% раствору хлористого натрия):
двузамещенный фосфорнокислый натрий (Na2HPO4) - 27,31 г (или
Na2HPO4 х 2H2O - 34,23 г)
однозамещенный фосфорнокислый натрий (NaH2PO4 х 2H20) - 4,86 г
хлористый натрий - 180 г
дистиллированная вода - до 2 л. рН раствора - 7,4.
Основной раствор разводят в 10 раз, получают раствор,
соответствующий по осмотической концентрации 1% раствору
хлористого натрия, из которого затем готовят следующие разведения:
0,85%, 0,75%, 0,70%, 0,65%, 0,60%, 0,55%, 0,50%, 0,45%, 0,40%,
0,35%, 0,30%, 0,20% 0,1% хлористого натрия. Можно готовить сразу
по 100 мл рабочих растворов разных концентраций и хранить их в
течение 2 недель в холодильнике.
Специальное оборудование.
Фотоэлектроколориметр.
Термостат на 37 град. С.
Пипетка на 0,02 мл.
Ход определения. В две стерильные пробирки, содержащие по 2
капли гепарина, берут по 1,5 мл крови. Одну пробирку помещают на
сутки в термостат; вторую - используют в день взятия крови.
В серию центрифужных пробирок (14) разливают по 5,0 мл рабочих
растворов с концентрациями от 1,0% до 0,1%. В каждую пробирку
прибавляют по 0,02 мл хорошо перемешанной гепаринизированной
крови, перемешивают и оставляют стоять не менее 30 мин. при
комнатной температуре (20 град. С). Центрифугируют при 2.000
об/мин. в течение 5 минут. Сливают надосадочную жидкость из каждой
пробирки и измеряют на фотоэлектроколориметре при длине волны
500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10 мм
против холостой пробы.
Холостая проба - надосадочная жидкость в пробирке, содержащей
1% раствор хлористого натрия.
Расчет. За 100%-й гемолиз принимают гемолиз в пробирке,
содержащей 0,1% раствор хлористого натрия. Сравнивая величины
экстинкции надосадочной жидкости остальных пробирок с экстинкцией,
принятой за 100%, вычисляют процент гемолиза в каждой пробирке:
Ех х 100
--------- ,
Е1
где: Е1 - экстинкция надосадочной жидкости в пробирке с 0,1%
раствором хлористого натрия,
Ех - экстинкция исследуемой пробы,
100 - процент гемолиза в пробирке с 0,1% раствором
хлористого натрия.
На следующий день повторяют исследование с кровью,
инкубированной 24 часа в термостате при 37 град. С.
Нормальные величины.
-----------------------T-----------------------------------------¬
¦ Концентрация ¦ %% гемолиза ¦
¦ хлористого натрия +------------------T----------------------+
¦ (в %) ¦ В свежей крови ¦В крови инкубированной¦
¦ ¦ ¦ в течение суток ¦
+----------------------+------------------+----------------------+
¦ 0,20 ¦ 98-100 ¦ 95-100 ¦
¦ 0,30 ¦ 97-100 ¦ 85-100 ¦
¦ 0,35 ¦ 90-100 ¦ 75-100 ¦
¦ 0,40 ¦ 50-100 ¦ 65-100 ¦
¦ 0,45 ¦ 5-45 ¦ 55-100 ¦
¦ 0,50 ¦ 0-6 ¦ 40-85 ¦
¦ 0,55 ¦ 0 ¦ 15-70 ¦
¦ 0,60 ¦ 0 ¦ 0-40 ¦
¦ 0,65 ¦ 0 ¦ 0-10 ¦
¦ 0,70 ¦ 0 ¦ 0-5 ¦
¦ 0,75 ¦ 0 ¦ 0 ¦
¦ 0,85 ¦ 0 ¦ 0 ¦
L----------------------+------------------+-----------------------
Примечание. Исследуют осмотическую резистентность не только
свежей крови, но и инкубированной в течение 24 часов при 37 град.
С, так как в ряде случаев при микросфероцитарной гемолитической
анемии понижение осмотической резистентности выявляется только в
инкубированной крови.
Литература.
1. Идельсон Л.И. - В кн.: Справочник по функциональной
диагностике. Под ред. И.А.Кассирского. М., 1970, 401.
2. Dacie Y.V. - The Haemolytic Anamias. London, 1954.
2.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СИСТЕМЫ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ И
ФИБРИНОЛИЗА
2.2.1. Определение времени свертывания крови
Принцип. Определение времени образования сгустка венозной
крови.
Реактивы. Не требуются.
Специальное оборудование.
Водяная баня.
Пробирки, высотой 10 см с внутренним диаметром 1 см.
Секундомер.
Ход определения. Сухой иглой, без шприца, из локтевой вены,
выпустив первые капли на ватный тампон, берут кровь в 2 сухие
стеклянные пробирки по 1 мл в каждую. Секундомер включают сразу же
при соприкосновении крови с пробирками. Пробирки с кровью ставят в
водяную баню при 37 град. С. Через 2 минуты после взятия крови, а
затем через каждые 30 сек. пробирки наклоняют на 45-60 град. При
этом, если кровь не свернулась, то она растекается по стенке
пробирки.
Свертывание считается законченным, когда кровь не выливается
при переворачивании пробирок вверх дном. В этот момент секундомер
выключается.
Время свертывания выражается в минутах (среднее значение из
двух определений).
Нормальные величины. Пределы колебаний времени свертывания
крови в стеклянных пробирках, у здоровых людей - 5-10 минут.
Литература.
Lee P.Y., White P.D. - Amer. Y.Med.Sci.,1913, 145, 495.
2.2.2. Определение времени рекальцификации плазмы
Принцип. Определение времени свертывания плазмы при добавлении
к ней оптимального количества хлористого кальция.
Реактивы.
1. 1,34% раствор щавелевокислого натрия (оксалата натрия).
2. 0,025М раствор хлористого кальция.
3. 0,85% раствор хлористого натрия.
Специальное оборудование.
Водяная баня.
Секундомер.
Ход определения. Исследование проводят с плазмой, содержащей
тромбоциты. Кровь у больного или донора берут в центрифужные
пробирки с 1,34% раствором оксалата натрия в соотношении 9:1.
Пробирки с кровью сразу же помещают в баню со льдом, затем
центрифугируют 10 минут при 1.200-1.500 об/мин.
В пробирку, установленную на водяной бане при 37 град. С,
наливают 0,2 мл раствора хлористого кальция и 0,1 мл 0,85%
раствора хлористого натрия. Через 60 сек. в пробирку вводят 0,1 мл
плазмы и включают секундомер. Определяют время свертывания плазмы.
Определение повторяют 2-3 раза.
Нормальные величины. Плазма здорового человека при добавлении
к ней оптимального количества раствора хлористого кальция
свертывается в течение 60-120 секунд.
Укорочение времени рекальцификации плазмы указывает на
повышение свертываемости крови, увеличение - на замедление.
Литература.
Berqerhof H.D., Roka L. - Z. Vitamin, Hormon u. Fermentforsch,
1954, 6, 1, 25.
2.2.3. Определение толерантности плазмы к гепарину
Принцип. Толерантность - это устойчивость крови к действию
гепарина, понятие, обратное чувствительности. При внесении в
плазму определенной концентрации гепарина время ее рекальцификации
изменяется в зависимости от коагуляционной и антикоагуляционной
активности крови. Если введение гепарина резко увеличивает время
образования сгустка, это говорит о понижении толерантности плазмы
к гепарину. Наоборот, когда внесение в исследуемую плазму гепарина
не замедляет свертывания (или изменяет мало), говорят о повышенной
толерантности плазмы к гепарину.
Определение толерантности плазмы к гепарину можно проводить
цитратной плазмой и оксалатной плазмой.
Метод 1. Определение толерантности к гепарину цитратной
плазмы.
Реактивы.
1. 3,8% раствор лимоннокислого натрия (цитрата натрия).
2. Раствор гепарина "Гедеон Рихтер" (ВНР), 5.000МЕ в 1 мл.
3. 0,025 М раствор хлористого кальция.
Приготовление гепарин - кальциевой смеси. 0,05 мл раствора
гепарина добавляют к 250 мл 0,025 М раствора хлористого кальция.
Активность смеси меняется первые сутки, а затем в течение 14 дней
остается устойчивой. Раствор готовят каждые 14 дней, хранят в
холодильнике. При данной концентрации гепарина нормальное время
свертывания плазмы составляет 11-16 минут.
Специальное оборудование.
Водяная баня.
Пробирки, высотой 12 см с внутренним диаметром 8 мм.
Секундомер.
Ход определения. Кровь у больного или у донора берут в
центрифужные пробирки с 3,8% раствором цитрата натрия в
соотношении 9:1. Пробирки с кровью сразу же помещают в баню со
льдом, затем центрифугируют в течение 3 минут при комнатной
температуре при 1.200-1.500 об/мин. 0,2 мл цитратной плазмы
наливают в пробирку и помещают в водяную баню при температуре 37
град. С. Через 1 минуту инкубации добавляют 0,2 мл гепарин -
кальциевой смеси, предварительно подогретой до той же температуры,
и перемешивают встряхиванием. Через каждые 2-3 минуты, а в конце
реакции и чаще, пробирки медленно наклоняют и отмечают время,
когда смесь больше не стекает при наклоне пробирки. Обычно через
5-6 минут прозрачность плазмы изменяется, что вызывает начало
свертывания пробы. Момент образования сгустка фиксируют
секундомером.
Результаты выражают в минутах времени образования сгустка
фибрина.
Нормальные величины для здорового человека составляют 10-16
минут (у 75% людей - 11-14 мин., у 90% - 10-16 минут).
Метод II. Определение толерантности к гепарину оксалатной
плазмы.
Реактивы.
1. 1,34% раствор щавелевокислого натрия (оксалата натрия).
2. Раствор гепарина "Гедеон Рихтер" (ВНР) 5000 МЕ в 1 мл.
3. 0,025 М раствор хлористого кальция.
Приготовление гепарин - кальциевой смеси. К 0,1 мл исходного
раствора гепарина добавляют 9,9 мл 0,025 М раствора хлористого
кальция. Затем к 2,5 мл этой смеси добавляют раствор хлористого
кальция до 100 мл. Рабочий раствор гепарина готовят смешиванием
равных объемов гепарин - кальциевой смеси и 0,025 М раствора
хлористого кальция. Полученный раствор хранят при 4 град. С.
Специальное оборудование.
Водяная баня.
Секундомер.
Ход определения. Кровь у больного или у донора берут в
центрифужные пробирки с 1,34% раствором оксалата натрия в
соотношении 9:1. Пробирки с кровью сразу же помещают в баню со
льдом, затем центрифугируют 10-15 минут при 1.500 об/мин.
В пробирку с 0,2 мл исследуемой плазмы, которая установлена на
водяной бане при 37 град. С, добавляют 0,2 мл гепарин - кальциевой
смеси и одновременно включают секундомер. Через 2 минуты, а затем
через каждые 30 секунд, пробирку осторожно наклоняют, не
встряхивая ее, приблизительно на 50-60 град. и отмечают время
появления сгустка фибрина.
Результаты выражают в минутах времени образования сгустка
фибрина.
Нормальные величины для здорового человека составляют от 7 до
13 минут.
Примечания.
1. Реакцию на толерантность плазмы к гепарину одновременно с
кровью донора и больного производят для сравнения не реже 1 раза в
неделю, а также при смене раствора гепарина.
2. Соблюдают однородность техники взятия крови.
3. Центрифугирование проб крови, взятых от больного и от
донора, производят одновременно при одном и том же числе оборотов.
4. Плазму не отсасывают, а используют для реакции из пробирки
с осажденными форменными элементами.
5. Определение толерантности плазмы к гепарину производят не
позднее, чем через 4-6 часов после взятия крови, по методу, и 2-3
часов по методу, так как в противном случае получаются повышенные
показатели толерантности плазмы к гепарину.
Литература.
1. Gormaen I. - Brit. Y.Hematot., 1959, 3, 257.
2. Sigg B. - Klin. Wsehr., 1952, 9/10, 205.
2.2.4. Определение протромбинового (тромбопластинового)
времени
Принцип. При избытке тромбопластина и оптимальном содержании
кальция время образования сгустка в плазме зависит от активности
факторов протромбинового комплекса, II, VII, IX, X.
На этом основании в реакционную смесь вводят тканевый
тромбопластин и хлористый кальций. Источником фактора
протромбинового комплекса является исследуемая плазма. Если в ней
снижена активность одного или нескольких факторов протромбинового
комплекса, то время образования сгустка в плазме будет замедлено.
При достаточном содержании факторов протромбинового комплекса
переходу протромбина в тромбин и действию последнего на фибриноген
могут препятствовать антикоагулянты (антитромбины), в основном -
гепарин, и очень низкое содержание фибриногена в плазме (ниже, чем
100 мг%). Это определяется дополнительными тестами.
Метод 1. Определение протромбинового времени плазмы.
Реактивы.
1. 3,8% раствор лимоннокислого натрия или 1,34% раствор
щавелевокислого натрия.
2. 0,025 М раствор хлористого кальция.
3. 1% раствор тромбопластина. При недостаточно активном
тромбопластине (удлиненное протромбиновое время плазмы крови
донора) используют 2% суспензию.
Специальное оборудование.
Водяная баня.
Секундомер.
Ход определения. Кровь у больного или донора берут в
центрифужные пробирки с 1,34% раствором щавелевокислого натрия или
с 3,8% раствором лимоннокислого натрия в соотношении 9:1. Пробирки
с кровью сразу же помещают в баню со льдом, затем центрифугируют
10 минут при 1.200-1.500 об/мин. В пробирку с 0,1 мл цитратной или
оксалатной плазмы добавляют 0,1 мл раствора тромбопластина и
инкубируют 1 мин на водяной бане при 37 град. С. Затем добавляют
0,1 мл 0,025 М раствора хлористого кальция в тотчас же включают
секундомер. Время от момента добавления раствора хлористого
кальция до образования плотного сгустка фибрина соответствует
протромбиновому времени и выражается в секундах.
Метод II. Определение протромбинового времени разведенной
(1:1) плазмы.
Реактивы.
1. 1,34% раствор щавелевокислого натрия.
2. 0,025 М раствор хлористого кальция.
3. 1% раствор тромбопластина.
4. 0,85% раствор хлористого натрия.
Специальное оборудование.
Водяная баня.
Секундомер.
Ход определения. Оксалатную плазму разводят 0,85% раствором
хлористого натрия 1:1. В тонкостенные пробирки наливают 0,2 мл
раствора хлористого кальция и 0,1 мл суспензии тромбопластина.
Смесь инкубируют 30 сек. на водяной бане при 37 град. С, затем в
тромбопластин - кальциевую смесь вводят 0,1 мл исследуемой плазмы,
разведенной 1:1. При введении плазмы включают секундомер. Пробирку
с реагентами через каждые 12-15 секунд наклоняют на 45 град. и
отмечают на секундомере время появления нитей или сгустка фибрина.
Определение повторяют не менее двух раз. Разница времени в
параллельных исследованиях не должна превышать 1 секунды.
Результат выражают в виде протромбиновой активности (индекса).
Протромбиновую активность плазмы (ПАП) по методам I и II
определяют по формуле:
А
ПАП (в %) = --- х 100, где:
В
А - протромбиновое время плазмы здорового человека,
В - протромбиновое время исследуемой плазмы.
Нормальные величины. Протромбиновая активность (индекс) плазмы
здорового человека в среднем равна 100+/-5%. (Протромбиновое время
здорового человека определяют каждый раз при работе с новой серией
тромбопластина).
Метод III. Определение протромбинового времени в капиллярной
крови.
Реактивы.
1. 3,8% раствор лимоннокислого натрия (цитрата натрия).
2. 0,5% раствор хлористого кальция.
3. Раствор тромбопластина.
Специальное оборудование.
Водяная баня.
Пробирки высотой 10 см, с внутренним диаметром 1 см.
Ход определения. В микропипетку, емкостью 0,1 мл, набирают
0,02 мл раствора цитрата натрия. Мякоть пальца протирают спиртом,
после высыхания спирта стерильным скарификатором делают прокол. В
микропипетку набирают 0,08 мл свободно выступающей крови и
немедленно выдувают в пробирки и перемешивают. Точно так же
набирают цитратную кровь еще в две пробирки.
Пробирки с кровью устанавливают на водяной бане при
температуре 37 град. С; через 60 сек. в пробирки добавляют по 0,1
мл раствора хлористого кальция и 0,1 мл тромбопластина. Определяют
время свертывания крови.
Протромбиновую активность крови (ПАК) определяют по формуле:
А
ПАК (в %) = --- х 100, где:
В
А - протромбиновое время крови здорового человека,
В - протромбиновое время исследуемой крови.
Протромбиновое время крови здорового человека определяют
каждый раз при работе с новой серией тромбопластина.
Нормальные величины. Протромбиновая активность крови здоровых
людей равна 93-107%.
Литература.
1. Quick A.T. - Amer Y.Physiol., 1943, 2, 140, 212.
2. Туголуков В.Н. - О способах определения протромбина крови и
применения их в клинике. Автореферат дисс. канд., Л., 1952.
3. Балуда В.П. и др. - Лабораторные методы исследования
свертывающей системы крови. М., 1962, 93.
2.2.5. Определение фибриногена в плазме весовым методом
Принцип. Свертывание фибриногена плазмы хлористым кальцием,
быстрое высушивание и взвешивание сгустка фибрина. Для ускорения
процесса свертывания или в тех случаях, когда время
рекальцификации резко изменено, используют раствор тромбина или
смесь тромбопластина с хлористым кальцием.
Реактивы.
1. 3,8% раствор лимоннокислого натрия (цитрата натрия).
2. 5% раствор хлористого кальция. Готовят из высушенного до
постоянного веса хлористого кальция.
3. Раствор тромбопластина.
4. Раствор тромбина (активность 10 сек).
Указанные растворы тромбопластина и тромбина не должны
содержать взвешенных частичек, так как это может привести к
увеличению веса фибрина. Удаление мельчайших примесей из раствора
тромбопластина достигают центрифугированием в течение 5 минут при
2.000 об/мин.
5. 3% раствор хлористого кальция.
Специальное оборудование.
Водяная баня.
Торсионные весы.
Секундомер.
Пробирки, высотой 10 см, с внутренним диаметром 1 см.
Палочки стеклянные.
Фильтры беззольные.
Ход определения. В мерную центрифужную пробирку вносят 0,3-0,5
мл раствора цитрата натрия и проколом вены набирают кровь,
соответственно до 3-5 мл. Центрифугируют при 2.000 об/мин 10 мин.
Плазму отсасывают и переносят в чистую сухую пробирку. Если плазма
содержит даже незначительную примесь форменных элементов, ее
подвергают повторному центрифугированию.
К 1 мл прозрачной плазмы добавляют 0,1 мл 5% раствора
хлористого кальция, смесь перемешивают, тотчас же включают
секундомер и устанавливают время свертывания. Образовавшийся
фибрин наматывают на палочку, которую вынимают из пробирки только
после того, как в ней закончится полностью появление даже
мельчайших сгустков или нитей фибрина. Фибрин снимают с палочки с
помощью беззольного фильтра. Сжатием беззольного фильтра, внутри
которого находится сгусток фибрина, достигается удаление из
последнего сыворотки. Сгусток последовательно перемещают по
фильтру и подвергают сжатию до тех пор, пока на бумаге в
проходящем свете не будет заметно следов влаги. Высушенный таким
образом фибрин тотчас взвешивают на заранее уравновешенных
торсионных весах (точность - до 1 мг).
В том случае, если при свертывании образуется плотный сгусток,
не наматывающийся на палочку, содержимое пробирки переносят в
чашку Петри или в тарелку и затем уже фибрин высушивают на
бумажном фильтре, как указано выше.
Использование беззольного фильтра предотвращает попадание на
фибрин бумажных волокон, что возможно при применении обычной
фильтровальной бумаги.
Время свертывания плазмы 5% хлористым кальцием при комнатной
температуре составляет в среднем 11,0 сек.
В тех случаях, когда требуется ускорить определение
фибриногена, или когда в исследуемой плазме время рекальцификации
резко замедлено, следует вместо 5% хлористого кальция пользоваться
раствором тромбина или смесью тромбопластина с 3% раствором (1:1)
хлористого кальция и помещать пробирку с плазмой в водяную баню
при 37 град. С.
При применении раствора тромбина с активностью 10 сек. время
свертывания плазмы составляет в среднем 9,6 сек.
При применении раствора тромбопластина с активностью 14-15
секунд и 3% раствора хлористого кальция время свертывания плазмы
составляет в среднем 35,5 сек.
Для пересчета концентрации фибриногена в миллиграмм - проценты
по сухому веществу, с учетом разведения плазмы раствором цитрата
натрия, полученный вес фибрина в миллиграммах умножают на
коэффициент 22,2. Коэффициент 22,2 выведен экспериментальным путем
и применим только для плазмы человеческой крови.
Нормальные величины. У здоровых людей концентрация фибриногена
в плазме крови колеблется в пределах 200-400 мг%.
Литература.
Рутберг Р.А. - Лабор. дело, 1961, 6, 6.
2.2.6. Определение фибриногена в плазме колориметрическим
методом
Принцип. Свертывание фибриногена тромбином с последующим
растворением его в щелочи и определением по биуретовой реакции.
Реактивы.
1. 1,34% раствор щавелевокислого натрия.
2. Тромбин, очищенный от плазминогена (активность - 7-10
секунд). НИИ эпидемиологии, микробиологии гигиены (Каунас).
3. Биуретовый реактив. В мерную колбу на 1 л к 1,5 г
сернокислой меди (CuSO4 х 5H2O) добавляют 6 г сегнетовой соли
(KNaC4H4O6 х 4H2O) и 500 мл дистиллированной воды. К этому
раствору добавляют при постоянном помешивании 300 мл 10% раствора
едкого натра и доводят дистиллированной водой до метки. Реактив
хранят в парафинированной посуде при комнатной температуре.
4. Фибриноген для построения калибровочного графика.
Специальное оборудование.
Водяная баня.
Фотоэлектроколориметр.
Ход определения. Кровь для определения берут либо
венепункцией, либо после прокола мякоти пальца. В качестве
стабилизатора используют 1,34% раствор щавелевокислого натрия (I
часть оксалата натрия на 9 частей крови). Кровь центрифугируют в
течение 10 минут при 2.000 об/мин. Плазму отсасывают в чистую
пробирку и разливают по 0,2 мл в две пробирки (для параллельных
исследований). К 0,2 мл плазмы добавляют 0,1 мл раствора тромбина
и инкубируют при 37 град. С в течение часа. Образовавшийся сгусток
трижды промывают охлажденным физиологическим раствором, сушат на
фильтровальной бумаге, помещают в пробирку, где приготовлен 1 мл
1н раствора едкого натра, прогревают для полного растворения в
течение 5 минут в водяной бане при 60 град. С. Пробы охлаждают. К
каждой пробе добавляют 4 мл биуретового реактива. Через 30 минут
пробу колориметрируют в кювете с толщиной слоя 1 см при длине
волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) против дистиллированной
воды.
Расчет ведут по калибровочному графику.
Построение калибровочного графика. Для определения количества
фибриногена в миллиграммпроцентах предварительно строится график
соотношения показателей ФЭКа и концентрации фибриногена в
физиологическом растворе. Для этого используются калибровочные
растворы фибриногена, начиная от 50 и до 1.000 мг%. Растворы
фибриногена обрабатывают как опытные пробы, но вместо плазмы берут
растворы фибриногена.
Полученные в опыте показания ФЭКа сопоставляют с калибровочным
графиком и определяют таким образом содержание фибриногена в
исследуемой плазме в миллиграммпроцентах.
Нормальные величины. У здоровых людей содержание фибриногена
колеблется в пределах от 250 до 300 мг%.
Литература.
Горшкова Т.Н., Ломазова Х.Д. - Лабор. дело, 1965, 3, 167.
2.2.7. Определение фибриногена Б в плазме
Принцип. Тромбин, добавленный к плазме, переводит весь
фибриноген в фибрин (проба 1); если же к плазме добавить
бета - нафтол, то фибриноген Б выпадает хлопьями в осадок, а
оставшийся фибриноген можно перевести в фибрин с помощью тромбина
(проба 2). Разница в содержании фибрина в обеих пробах составит
содержание фибриногена Б.
Реактивы.
1. 1,34% раствор щавелевокислого натрия (оксалата натрия).
2. Раствор тромбина без плазминогена. 25 мг тромбина
растворяют в 1 мл 0,85% раствора хлористого натрия.
3. Раствор бета - нафтола. 2 г нафтола растворяют в 100 мл 50%
этилового спирта.
Специальное оборудование. Не требуется.
Ход определения. 9 частей крови смешивают с 1 частью оксалата
натрия. Центрифугируют 3 минуты при 2.000 об/мин. Оксалатную
плазму разливают в 2 пробирки: в первую - 0,2 мл для определения
содержания общего фибриногена биуретовым методом; во вторую -
помещают 0,5 мл плазмы, к которой добавляют 0,1 мл раствора бета -
нафтола. Через 15 минут, когда выпадают хлопья фибриногена Б,
центрифугируют 1 минуту при 1.000 об/мин. Из надосадочной жидкости
(плазмы) забирают 0,2 мл и помещают в сухую пробирку для
определения содержания фибриногена тем же способом, что и в первой
пробе.
Расчет. Разница в содержании фибриногена в первой и во второй
пробирке соответствует выпавшему в осадок фибриногену Б.
Содержание фибриногена Б можно выразить либо в мг% (по разности
между количеством фибриногена в первой и второй пробирке), либо в
%% по отношению ко всему фибриногену по формуле:
А - В
------- х 100, где
А
А - содержание фибриногена в первой пробе,
В - содержание фибриногена во второй пробе.
В норме фибриноген Б не обнаруживается, появляется при
тромботических состояниях.
Литература.
1. Commine H.,Lyons A. - Brit.Y.Surg., - 1948, 35, 338.
2. Ломазова Х.Д. - Лабор. дело, 1971, 12.
3. Перлик Э. - Антикоагулянты. Л., 1965, 332.
2.2.8. Определение содержания фактора VIII
в плазме и антигемофильных препаратах
Принцип. Предлагаемая модификация количественного определения
содержания фактора VIII основана на одноступенчатом коалин -
кефалиновом методе. В качестве реагентов используют субстрат
плазмы с резким дефицитом антигемофильного глобулина, но с
нормальным содержанием всех остальных факторов свертывания. Для
получения оптимальной среды, в которой определяют количество
антигемофильного глобулина, помимо субстрат - плазмы, вводят
заменитель 3-го фактора пластинок и коалин (активатор фактора
контакта). Расчет концентрации искомого фактора ведут по данным,
полученным при титровании различных разведений стандартной плазмы
с известным содержанием антигемофильного глобулина.
Реагенты.
1. Субстрат - плазма.
2. Стандартная плазма (или исследуемая).
3. Взвесь каолина в эритрофосфатиде (заменитель 3 фактора
пластинок) (С.С.Харамоненко, Минский институт переливания крови).
4. Барбиталово - солевой буфер, рН - 7,5.
5. 0,033 М раствор хлористого кальция.
6. 0,9% раствор хлористого натрия.
7. 2% раствор двузамещенного лимоннокислого натрия
(гидроцитрат натрия).
8. 3,8% раствор трехзамещенного лимоннокислого натрия (цитрат
натрия).
1. Получение субстрат - плазмы из крови больного гемофилией.
Субстрат - плазму получают из крови больного тяжелой формой
гемофилии А, в которой содержание фактора VIII колеблется в
пределах 1-3%. При подборе субстрат - плазмы показанием ее
пригодности служат данные времени свертывания, полученные в тех же
условиях опыта, которые применяются для определения содержания
фактора VIII, за исключением того, что разведенную плазму заменяют
равным количеством (0,1 мл) барбиталового буфера. Время
свертывания плазмы больного гемофилией в пределах 120-135 секунд
указывает на пригодность ее для использования в качестве субстрат
- плазмы. Кровь стабилизируют 2% раствором гидроцитрата натрия в
разведении 1:4. Центрифугируют при +2 град. С в течение 20 минут
при 2.500 об/мин. Плазму отсасывают и повторно центрифугируют при
тех же условиях для полного удаления клеток крови, затем
отсасывают и разливают по 3-4 мл в пенициллиновые флаконы. Флаконы
закупоривают и сохраняют при -30 град. С.
Для получения больших количеств субстрат - плазмы
целесообразно произвести больному гемофилией с резким дефицитом
АГГ в период ремиссии плазмаферез. При этом методе получают 250 мл
плазмы из 500 мл консервированной крови больного. Изменений в
морфологическом составе крови больного не происходит, так как
форменные элементы возвращаются в кровоток в физиологически
полноценном состоянии спустя 50 минут после взятия крови (400 мл
цельной крови). Если нет необходимости в получении такого большого
количества субстрат - плазмы, плазмаферез может быть осуществлен
при изъятии любого заданного объема крови. Полученную плазму
центрифугируют повторно, как указано выше, разливают по 3-4 мл в
пенициллиновые флаконы, которые после укупорки сохраняют при -30
град. С.
Субстрат - плазма пригодна для определения содержания фактора
VIII при хранении в течение 2-3 месяцев.
2. а) Приготовление стандартной плазмы. Кровь от 5-7 доноров
стабилизируют цитратом натрия (3,8%) в разведении 1:10. От каждого
донора получают по 5 мл крови и центрифугируют ее 20 минут при
2.500 об/мин. при +2 град. С. Плазму, полностью лишенную примеси
клеток, отсасывают, смешивают в равных объемах, разливают по 0,5
мл в пенициллиновые флаконы, которые после укупорки хранят при -30
град. С. Стандартная плазма пригодна для использования в течение
5-7 дней.
б) Приготовление исследуемой плазмы. Кровь донора или
больного с неизвестным содержанием фактора VIII стабилизируют
цитратом (3,8%) в разведении 1:10 и центрифугируют в тех же
условиях, что и стандартную плазму. Если нет возможности сразу
произвести определение фактора VIII в исследуемой плазме, ее
следует поместить в холодильник при -30 град. С.
3. Получение взвеси каолина в эритрофосфатиде. В качестве
активного заменителя бета фактора пластинок применяют
эритрофосфатид, полученный из эритроцитов. Он представляет собой
сиропообразную вязкую эмульсию желтого цвета. Различные серии
препарата содержат примерно 2,5-3,0 г эритрофосфатида в 100 мл
физиологического раствора. Концентрированный препарат хранят в
запаянных ампулах при +4 град. С. Из этого препарата готовят 0,1%
раствор эритрофосфатида в хлористом натрии (0,9%), разливают по 1
мл в пенициллиновые флаконы и после укупорки хранят при +4 град .
С. Препарат сохраняется без потери активности в течение нескольких
месяцев.
Приготовление взвеси каолина в эритрофосфатиде. К 4,5 мл 0,?%
раствора хлористого натрия добавляют 25 мг каолина и 0,5 мл и 0,1%
раствора эритрофосфатида, смесь перемешивают в течение 10 минут на
магнитной мешалке (или вручную) при комнатной температуре. Таким
образом получают равномерную взвесь, содержащую 5 мг/мл каолина и
0,1 мг/мл эритрофосфатида. Во время опыта взвесь сохраняют в бане
с тающим льдом. Реагент пригоден для использования в течение
нескольких часов.
4. Барбиталово - солевой буфер, рН - 7,4-7,5. Хлористый натрий
- 7,3 г. Веронал - 2,76 г. Мединал - 2,06 г. Бидистиллированная
вода - до 1 литра.
5. 0,033М раствор хлористого кальция. 370 мг
безводного хлористого кальция растворяют в 100 мл дистиллированной
воды.
Определение содержания фактора VIII в плазме и в
антигемофильных препаратах. Взвесь каолина в эритрофосфатиде,
стандартную, исследуемую, субстрат - плазму и антигемофильные
препараты сохраняют во время опыта в бане со льдом. Раствор
хлористого кальция, 0,37%, - в бане при +37 град. С.
Подготовка реагентов. Непосредственно перед определением
флаконы с плазмой или препаратами погружают для оттаивания на 1-2
минуты в баню при +37 град. С. После оттаивания они должны быть
абсолютно прозрачными. Затем приступают к разведению стандартной,
исследуемой плазмы и антигемофильных препаратов с помощью
барбиталового раствора.
Ход определения. В центрифужную пробирку вносят
последовательно: 0,1 мл тщательно перемешанной взвеси каолина в
эритрофосфатиде, 0,1 мл субстрат - плазмы и 0,1 мл стандартной
либо исследуемой плазмы, либо антигемофильного препарата
соответствующих разведений. Пробирку помещают в баню при 37 град.
С для инкубации в течение 6 минут. Точно в конце 6-ой минуты
добавляют 0,1 мл раствора хлористого кальция (находящегося в бане
при 37 град. С), перемешивают, тотчас же включают секундомер и
определяют время образования плотного сгустка. Точно так же
проводят определение еще в двух параллельных пробах. Для
максимального сокращения времени целесообразно добавлять реагенты
в каждую следующую пробу с интервалом в 90 секунд.
Расчет концентрации искомого фактора ведется по таблице,
которая составлена на основании данных, полученных при титровании
различных разведений стандартной плазмы с известным содержанием
фактора VIII.
По условиям, принятым для данной модификации метода, время
свертывания стандартной плазмы в разведении 1:10 должно быть
постоянным и равняться 65 секундам, что достигается за счет
изменения концентрации эритрофосфатида.
При определении стандартной точки (65 сек.) требуется
совпадение значений трех параллельных проб.
Аналогичным образом проводят определение содержания фактора
VIII для всех последующих разведений стандартной плазмы. Для этого
готовят следующий ряд разведений стандартной плазмы с помощью
барбиталового буфера:
---------------T------T------T------T------T------T-------T------¬
¦ NN проб ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦ 7 ¦
+--------------+------+------+------+------+------+-------+------+
¦ Разведение ¦ 1:5 ¦ 1:10 ¦ 1:20 ¦ 1:40 ¦ 1 ¦ 1:160 ¦ 1:320¦
L--------------+------+------+------+------+------+-------+-------
Каждое последующее разведение готовят из предыдущего
непосредственно перед употреблением. При правильном определении
полученные экспериментальные значения для каждого разведения
стандартной плазмы наклеиваются на теоретически рассчитанную
прямую (отклонения в пределах 0-3,8%).
Экстраполируя данные времени свертывания с интервалом в 1 сек.
на прямую, полученную на двойной логарифмической шкале, определяют
соответствующие им концентрации фактора VIII в %%, которые
представлены в таблице:
Зависимость времени свертывания от содержания
фактора VIII в %%
----------T-----------T---------T-----------T---------T-----------¬
¦Время ¦ ¦Время ¦ ¦Время ¦ ¦
¦свертыва-¦Фактор VIII¦свертыва-¦Фактор VIII¦свертыва-¦Фактор VIII¦
¦ния в се-¦ в % ¦ния в се-¦ в % ¦ния в се-¦ в % ¦
¦кундах ¦ ¦кундах ¦ ¦кундах ¦ ¦
+---------+-----------+---------+-----------+---------+-----------+
¦ 55 ¦ 255 ¦ 83 ¦ 27 ¦ 111 ¦ 3,9 ¦
¦ 56 ¦ 235 ¦ 84 ¦ 25 ¦ 112 ¦ 3,67 ¦
¦ 57 ¦ 215 ¦ 85 ¦ 23 ¦ 113 ¦ 3,47 ¦
¦ 58 ¦ 200 ¦ 86 ¦ 22 ¦ 114 ¦ 3,28 ¦
¦ 59 ¦ 177 ¦ 87 ¦ 21 ¦ 115 ¦ 3,11 ¦
¦ 60 ¦ 160 ¦ 88 ¦ 19 ¦ 116 ¦ 2,94 ¦
¦ 61 ¦ 146 ¦ 89 ¦ 17,5 ¦ 117 ¦ 2,8 ¦
¦ 62 ¦ 136 ¦ 90 ¦ 16 ¦ 118 ¦ 2,64 ¦
¦ 63 ¦ 124 ¦ 91 ¦ 15 ¦ 119 ¦ 2,5 ¦
¦ 64 ¦ 115 ¦ 92 ¦ 14 ¦ 120 ¦ 2,38 ¦
¦ 65 ¦ 100 ¦ 93 ¦ 12,5 ¦ 121 ¦ 2,25 ¦
¦ 66 ¦ 96 ¦ 94 ¦ 11,5 ¦ 122 ¦ 2,14 ¦
¦ 67 ¦ 90 ¦ 95 ¦ 10,5 ¦ 123 ¦ 2,04 ¦
¦ 68 ¦ 81 ¦ 96 ¦ 10 ¦ 124 ¦ 1,98 ¦
¦ 69 ¦ 74 ¦ 97 ¦ 9 ¦ 125 ¦ 1,84 ¦
¦ 70 ¦ 68 ¦ 98 ¦ 8,25 ¦ 126 ¦ 1,75 ¦
¦ 71 ¦ 64 ¦ 99 ¦ 7,75 ¦ 127 ¦ 1,66 ¦
¦ 72 ¦ 59 ¦ 100 ¦ 7,5 ¦ 128 ¦ 1,58 ¦
¦ 73 ¦ 55 ¦ 101 ¦ 6,75 ¦ 129 ¦ 1,5 ¦
¦ 74 ¦ 52 ¦ 102 ¦ 6,5 ¦ 130 ¦ 1,44 ¦
¦ 75 ¦ 50 ¦ 103 ¦ 6,25 ¦ 131 ¦ 1,37 ¦
¦ 76 ¦ 44 ¦ 104 ¦ 5,86 ¦ 132 ¦ 1,3 ¦
¦ 77 ¦ 42 ¦ 105 ¦ 5,5 ¦ 133 ¦ 1,24 ¦
¦ 78 ¦ 38 ¦ 106 ¦ 5,2 ¦ 134 ¦ 1,19 ¦
¦ 79 ¦ 35 ¦ 107 ¦ 4,9 ¦ 135 ¦ 1,13 ¦
|
