|
Стр. 3
¦ 79 ¦ 35 ¦ 107 ¦ 4,9 ¦ 135 ¦ 1,13 ¦
¦ 80 ¦ 33 ¦ 108 ¦ 4,62 ¦ 136 ¦ 1,08 ¦
¦ 81 ¦ 30 ¦ 109 ¦ 4,35 ¦ 137 ¦ 1,03 ¦
¦ 82 ¦ 29 ¦ 110 ¦ 4,1 ¦ 137,7 ¦ 1,0 ¦
L---------+-----------+---------+-----------+---------+------------
Контроль реагентов. Контроль реагентов необходим для создания
стандартных условий при определении концентрации фактора VIII и,
как показал опыт, чрезвычайно важен для получения правильного
значения этого фактора в исследуемых пробах и для использования
данных таблицы при вычислении процентного содержания в них
антигемофильного глобулина.
Ежедневно, перед началом титрования фактора VIII, необходимо
проверять соответствие реагентов требованиям метода. Для этого
определяют время свертывания стандартной плазмы в разведении 1:10.
Если оно равно 65 сек., готовят еще одно разведение стандартной
плазмы (1:60 или 1). В том случае, когда для разведения
стандартной плазмы 1:10 полученные значения несколько больше или
меньше 65 сек., подбирают необходимую концентрацию
эритрофосфатида, изменяя его содержание во взвеси с каолином, в
пределах 0,2-0,075 мг/мл. Совпадение полученных значений для двух
разведений стандартной плазмы (1:10 и 1 или 1:60) позволяет
приступить к определению содержания фактора VIII в исследуемой
плазме или в антигемофильных препаратах.
Для титрования плазмы крови доноров или при определении
содержания фактора VIII больных гемофилией пользуются разведением
1:10 и по времени свертывания определяют по таблице
соответствующее им содержание фактора VIII в %. Концентраты АГГ
(криопреципитат и др.) обычно разводят 1:100 или 1:200. Поэтому
полученные по таблице значения умножают соответственно на 10 или
на 20 и определяют таким образом содержание в них фактора VIII в
%.
Содержание АГГ в плазме и ее препаратах можно рассчитать не
только в %, но и в единицах активности по следующей формуле:
Содержание Объем исследуемой
Содержание фактора VIII в % х плазмы или препарата
фактора VIII в = -------------------------------------------
един. активности 100
За 1 ед активности АГГ принимают количество фактора VIII в
плазме 100% активности.
Нормальные величины составляют 50-200%, в среднем - 100%.
Литература.
1. Breckenridge R.T., Rathoff O.D. - Blood, 1962, 15, 637.
2. Рутберг Р.А. - Лабор. дело, 1972, 11, 658.
3. Инструкция по применению плазмафереза, 1972.
2.2.9. Определение активности фактора XIII в плазме
ускоренным методом
Принцип. Фактор XIII в процессе свертывания крови превращает
растворимый фибрин (S) в окончательный нерастворимый фибрин (i).
Принцип основан на определении времени растворения сгустка фибрина
в растворе кислой щавелевокислой мочевины при добавлении к
реагирующей смеси монойодуксусной кислоты, которая блокирует
активность фактора XIII. Время растворения сгустка зависит от
активности фактора XIII исследуемой плазмы. Применение в качестве
растворителя кислой щавелевокислой мочевины позволяет в течение
короткого времени (30-40 мин. с момента взятия крови) определить
активность фактора XIII.
Реактивы.
1. 1,34% раствор щавелевокислого натрия.
2. 0,5% раствор монойодуксусной кислоты.
3. 0,025М раствор хлористого кальция.
4. 0,12% раствор кислой щавелевокислой мочевины.
Специальное оборудование. Не требуется.
Ход определения. К 0,2 мл оксалатной плазмы добавляют 0,1 мл
раствора монойодуксусной кислоты и 0,4 мл раствора хлористого
кальция. Перемешивают встряхиванием и оставляют на 20 минут при
комнатной температуре. К образовавшемуся сгустку добавляют 2,0 мл
раствора кислой щавелевокислой мочевины. Определяют время полного
растворения фибринового сгустка при постоянном встряхивании.
Определение проводят параллельно в двух пробирках для каждой пробы
и вычисляют среднее время.
Расчет. Активность фактора XIII исследуемой плазмы определяют
по формуле
А
АФ = --- х 100, где:
В
А - время лизиса фибрина исследуемой плазмы,
В - время лизиса фибрина здоровых людей.
Нормальные величины. Лизис сгустка происходит в течение
70,6+/-15 секунд, что равно 100%.
Примечание. При резком нарушении первой фазы процесса
свертывания крови (гемофилии) для образования сгустка необходимо
добавить кроме хлористого кальция 0,1 мл тромбина (активность - 20
сек).
Литература.
Балуда В.П., Жукова Н.А., Руказенкова Ж.Н. - Лабор. дело,
1965, 7, 417.
2.2.10. Определение фибринолитической активности
методом лизиса эуглобулинов плазмы
Принцип. Время лизиса сгустка, полученного из эуглобулиновой
фракции плазмы, характеризует фибринолитическую активность плазмы,
освобожденную от ингибиторов.
Реактивы.
1. 1,42% раствор щавелевокислого аммония или 1,34% раствор
щавелевокислого натрия.
2. 1% раствор уксусной кислоты.
3. Боратный раствор. 9 г хлористого натрия и 1 г бората натрия
растворяют в 100 мл дистиллированной воды.
4. 0,025М раствор хлористого кальция.
Специальное оборудование.
Водяная баня.
Ход определения. Кровь, взятую из вены (без жгута), смешивают
с антикоагулянтом в соотношении 9:1, центрифугируют 10 мин. при
1.500 об/мин. Кровь до центрифугирования хранят в бане со льдом.
В пробирку наливают 0,5 мл плазмы, 8 мл дистиллированной воды,
смешивают, добавляют 0,15 мл 1% раствора уксусной кислоты (рН
смеси при этом - 5,3), оставляют на 30 мин. при 4 град. С;
центрифугируют при 1.500 об/мин. в течение 5 минут, сливают
надосадочную жидкость и удаляют остатки жидкости, опрокинув
пробирку на фильтровальную бумагу.
Осадок эуглобулинов растворяют в 0,5 мл боратного раствора.
Две пробы раствора по 0,2 мл переносят в пробирки, диаметром 10
мм, и опускают в баню при 37 град. С. Через 1 минуту к каждой
пробе добавляют по 0,2 мл раствора хлористого кальция. Через
несколько минут образуется сгусток. Время лизиса определяется как
момент полного исчезновения (растворения) сгустка.
Нормальные величины - составляют 183-263 минуты.
Литература.
Kovalski E., Koper M., Niewiarowski S. - Y.Clin. Pathol.,
1959, 12, 215.
3. БИОХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БЕЗБЕЛКОВЫХ АЗОТИСТЫХ КОМПОНЕНТОВ
3.1.1. Определение мочевины в сыворотке крови
уреазным методом по реакции с фенол - гипохлоритом
Принцип. Мочевина под действием уреазы разлагается на
углекислый газ и аммиак. Аммиак определяют колориметрически по
образованию окрашенных продуктов с гипохлоритом и фенолом.
Реактивы.
1. Раствор ЭДТА - динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной
кислоты (трилон "В"). 1 г ЭДТА растворяют в 90 мл дистиллированной
воды, доводят рН до 6,05н раствором едкого натра и доливают водой
до 100 мл. Раствор используют для приготовления раствора уреазы.
2. Раствор уреазы, рН - 6,0. 0,02 г уреазы растворяют в 50 мл
раствора ЭДТА, проверяют рН. Отечественная уреаза выпускается с
активностью около 370 ед Sumner на грамм белка. Уреаза с
активностью 800-1.000 ед Sumner на грамм белка пригодна для
реакции. Уреазу хранят в холодильнике в плотно закрытой упаковке.
Раствор уреазы стабилен в течение месяца при хранении в
холодильнике в посуде с плотно закрытой пробкой.
3. Раствор фенола и нитропруссида натрия (цветной реактив).
0,25 г нитропруссида натрия (чда) растворяют в 500 мл
дистиллированной воды, добавляют 50 мл, или 54 г, фенола (чда), и
доливают дистиллированной водой до 2 литров. Стабилен в течение
месяца при хранении в холодильнике в посуде из темного стекла.
4. Основной раствор гипохлорита натрия (NaOCO). 100 г хлорной
извести (CaOCL2) размешивают в течение 15 минут с 170 мл
дистиллированной воды, после чего прибавляют, непрерывно
помешивая, раствор, состоящий из 170 мл дистиллированной воды и 70
г углекислого натрия (Na2CO3). Масса сначала густеет, затем
разжижается. Оставляют стоять до следующего дня. Надосадочную
жидкость (гипохлорит натрия) сливают и фильтруют через промытый
дистиллированной водой фильтр. Хранят в холодильнике, в посуде из
темного стекла. Срок годности раствора - 1-2 месяца.
Определение активности хлора. 1 мл основного раствора
гипохлорита натрия смешивают с 100 мл дистиллированной воды. К 50
мл этого раствора добавляют 5,0 мл свежеприготовленного 5%
раствора йодистого калия (KI) и 10 мл 6н раствора соляной кислоты.
Титруют 0,1н раствором тиосульфата натрия. Как только раствор
приобретает слабо желтую окраску, добавляют 10 капель 1% раствора
крахмала и титруют до обесцвечивания.
Концентрацию гипохлорита натрия рассчитывают по хлору:
Концентрация активного хлора
в граммах на 100 мл гипохлорита натрия = а x 0,709
где: а - количество миллилитров тиосульфата натрия, пошедших
на титрование,
0,709 - коэффициент пересчета 1,0 мл тиосульфата натрия в
граммпроценты хлора.
После установления концентрации активного хлора основной
раствор гипохлорита натрия разводят так, чтобы концентрация хлора
равнялась 0,5 г на 100 мл. Раствор гипохлорита натрия с
концентрацией хлора 0,5 г на 100 мл смешивают с равным объемом 5н
раствора едкого натра и используют для реакции. Активность хлора
проверяют не реже 1 раза в две недели.
5. 0,1н раствор тиосульфата натрия. 25 г тиосульфата натрия
растворяют в 1 л дистиллированной воды. (Na2S2O3 x 5H2O)
6. 5н раствор едкого натра.
7. 6н раствор соляной кислоты.
8. 5% раствор йодистого калия.
9. Калибровочный раствор мочевины. 40 мг высушенной до
постоянного веса мочевины растворяют в мерной колбе в 100 мл 0,2%
раствора бензойной кислоты. 1 мл раствора мочевины содержит 0,4 мг
мочевины. (Мочевину можно растворять в дистиллированной воде, но
раствор будет менее стабилен). Раствор хранят в холодильнике.
10. 0,2% раствор бензойной кислоты. 0,2 г кристаллической
бензойной кислоты растворяют в 100 мл дистиллированной воды при
интенсивном перемешивании и нагревании до полного растворения
кристаллов.
Специальное оборудование.
Фотоэлектроколориметр.
Баня водяная.
Колбы мерные.
Пипетка на 0,02 мл.
Ход определения. Опытная проба. 0,5 мл раствора уреазы вносят
в пробирку с притертой пробкой, добавляют 0,02 мл сыворотки.
Пробирки закрывают пробками и инкубируют 15 минут при 37 град. С.
После инкубации добавляют 10 мл цветного реактива (раствора фенола
и нитропруссида натрия) и 1 мл раствора гипохлорита натрия.
Перемешивают и оставляют стоять 20 минут при 37 град. С. Через 10
минут измеряют на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 1 см при длине
волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы.
Окраска стабильна в течение нескольких часов.
Холостую пробу ставят как опытную, но вместо сыворотки берут
дистиллированную воду.
Калибровочную пробу обрабатывают как опытную, но вместо
сыворотки берут калибровочный раствор мочевины. Измеряют при тех
же условиях, что и опытную, против холостой пробы.
Расчет ведут по формуле:
Е1
мг% мочевины = --- х 40,
Е2
где: Е1 - экстинкция опытной пробы,
Е2 - экстинкция калибровочной пробы,
40 - концентрация калибровочного раствора мочевины в ???.
Прямолинейная зависимость между оптической плотностью и
концентрацией мочевины сохраняется от 0 до 200-250 мг% мочевины.
Нормальные величины - сыворотка крови - 20-50 мг% мочевины.
Для пересчета результатов на азот мочевины концентрацию
мочевины в мг% делят на 2,14.
Примечания.
1. Построение калибровочного графика не рекомендуется, так как
интенсивность окраски проб зависит от условий опыта. Поэтому
правильнее обрабатывать калибровочные пробы одновременно с
опытными и вести расчет по формуле.
2. Серия проб не должна превышать 10.
3. Если сыворотка мутная или окрашенная, то ставят
дополнительную холостую пробу, в которую добавляют сыворотку и все
реактивы до инкубации. Экстинкцию этой холостой пробы вычитают из
опытной.
Литература.
1. Wetler H, - Ro. und Lab.Praxis, 1962, 15, 142.
2. Deutsches Arzneibuch, 7 Ausg. Diaqnostische
Laboratoriumsmethoden, Berlin, 1968.
3. Henry R. - Clinical chemistry Principles and technics. New
York, 1964, 266.
3.1.2. Определение мочевины в сыворотке крови
экспресс - методом с применением реактивной бумаги
"Уреатест"
Определение проводится строго по инструкции по применению
реактивной бумаги "Уреатест".
Реактивная бумага "Уреатест" применяется для экспресс -
определения содержания мочевины в сыворотке крови.
"Уреатест" представляет собой полоски хроматографической
бумаги, размером 120х10 мм, пропитанные растворами фермента и
индикатора. Зоны их нанесения разделены красной парафиновой
полосой. При определении бумажку следует держать за свободный
конец.
Метод основан на специфичном действии фермента уреазы
расщеплять мочевину с выделением аммиака. Выделившийся аммиак
окрашивает индикатор в голубой цвет. Высота окрашенной зоны в мм
пропорциональна концентрации мочевины в мг%, что определяется по
кривой, приложенной к комплекту.
С помощью реактивной бумаги можно определить от 20 до 250 мг%
мочевины в сыворотке крови.
Комплект содержит 20 шт. реактивных бумажек, график и
инструкцию.
Ход определения. Сыворотку крови развести дистиллированной
водой 1:1.На конец бумажки, пропитанной ферментом, на расстоянии 3
мм от красной парафиновой полосы мерной пипеткой нанести 0,03 мл
приготовленной сыворотки крови.
Быстро внести бумажку в чистую сухую пробирку, герметически
закрыть пробкой и оставить на 20 минут при 37 град. С в термостате
или на 30 минут при 20 град. С.
Затем измерить высоту индикаторной зоны, окрашенной в голубой
цвет. По приложенному графику найти содержание мочевины в мг%,
соответствующее результатам измерения в мм.
В случае использования крови или неразбавленной сыворотки
крови результат надо делить на 2.
Хранить в сухом, темном, прохладном месте.
Срок годности 8 месяцев со дня выпуска.
Реактивная бумага разработана Рижским заводом химических
реактивов и новых аналитических форм "Реагент" совместно с
Республиканской клинической больницей им. П.Страдиня Латвийской
ССР.
Литература.
Инструкция по применению реактивной бумаги "Уреатест".
3.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ УГЛЕВОДНОГО ОБМЕНА
3.2.1. Определение глюкозы в крови, плазме (сыворотке),
спинномозговой жидкости глюкозооксидазным методом
Принцип. Глюкоза окисляется кислородом воздуха в присутствии
фермента глюкозооксидазы с образованием в ходе реакции перекиси
водорода. Перекись водорода окисляет о-толидин с образованием
окрашенного соединения, интенсивность окраски которого
пропорциональна концентрации глюкозы.
Реактивы.
1. Глюкозооксидаза (бета-D-глюкоза: оксидоредуктаза, 1.1.3.4.)
Кристаллический препарат. Отечественная глюкозооксидаза
выпускается с активностью, в основном 90-120 тыс.
глюкозооксидазных единиц на 1 г препарата. Хранят в холодильнике в
герметической упаковке.
2. Пероксидаза (перекись водорода: оксидоредуктаза,
1.11.1,7). Кристаллический препарат. Пероксидаза фирмы "Reanal"
(ВНР) со степенью очистки 0,6 (R.Z)<*> пригодна для определения
глюкозы. Хранят в холодильнике в герметической упаковке.
--------------------------------
<*> Reinheitszahl - число, характеризующее степень чистоты
пероксидазы.
3. 0,9% раствор хлористого натрия.
4. 0,25М раствор уксуснокислого натрия. 17 г уксуснокислого
натрия (NaCH3COO х 3H2O) растворяют в небольшом количестве воды в
мерной колбе на 500 мл и доводят дистиллированной водой до метки.
5. 0,25М раствор уксусной кислоты. В мерную колбу на 500 мл
наливают небольшое количество воды, добавляют 7,75 мл ледяной
уксусной кислоты и доводят объем дистиллированной водой до метки.
6. 0,25М ацетатный буфер, рН - 4,8. 0,25М раствор
уксуснокислого натрия смешивают с 0,25М раствором уксусной кислоты
в соотношении 6:4. Проверяют рН на рН - метре. Стабилен при
хранении в холодильнике в течение месяца.
7. 5% раствор сернокислого цинка. 50 г сернокислого цинка
(ZnSO4 х 7H2O) растворяют в 1 л дистиллированной воды. Стабилен
при хранении при комнатной температуре.
8. 0,3н раствор едкого натра. Растворы сернокислого цинка и
едкого натра берут для реакции в эквивалентных количествах, т.е.
они должны нейтрализовать друг друга. Для этого раствор
сернокислого цинка титруют раствором едкого натра до нейтральной
реакции по фенолфталеину (слаборозовая окраска). Если на
титрование пошло равное количество растворов, то они пригодны для
реакции.
9. Орто - толидин (азоамин синий К; 3,3-диметилбензидин), чда.
Имеющийся в продаже орто - толидин перекристаллизовывают из
горячего абсолютного этилового спирта добавлением дистиллированной
воды с последующим быстрым отсасыванием выпавших кристаллов на
воронке Бюхнера и высушиванием о-толидина в вакуум - эксикаторе
над хлористым кальцием.
10. Абсолютный этиловый спирт (коммерческий).
11. 1% раствор о-толидина в абсолютном этиловом спирте. 1 г
о-толидина растворяют в небольшом количестве теплого этилового
спирта. После охлаждения доводят объем этиловым спиртом до 100 мл.
Стабилен в течение нескольких месяцев при хранении в холодильнике
в плотно закрытой посуде из темного стекла.
12. Энзимо - хромогенный реактив. В мерную колбу на 500 мл
помещают 300-400 мл 0,25М ацетатного буфера, рН - 4,8, добавляют
10 мг глюкозооксидазы (навеска взята из расчета активности
глюкозооксидазы - 52.000 ед. на 1 г препарата, при применении
препарата с другой активностью фермента соответственно будет
меняться величина навески), перемешивают до полного растворения,
добавляют 5 мг пероксидазы. Смесь перемешивают до полного
растворения. Добавляют 5 мл 1% раствора о-толидина и доводят объем
до метки ацетатным буфером, фильтруют. Стабилен в течение 3-4
недель при хранении в холодильнике в плотно закрытой посуде из
темного стекла.
Свежеприготовленный реактив бесцветен или окрашен в
слабозеленый цвет. Годен к употреблению через 2 часа после
приготовления. Если реактив имеет интенсивно зеленый цвет, то это
свидетельствует о загрязнении о-толидина. В этом случае о-толидин
необходимо перекристаллизовать.
13. 0,2% раствор бензойной кислоты. Раствор готовят при
нагревании.
14. Стандартный раствор D-глюкозы в 0,2% растворе бензойной
кислоты. Высушенную до полного веса при 37 град. С D-глюкозу
хранят в эксикаторе. 500 мг глюкозы растворяют в мерной колбе на
100 мл в 0,2% растворе бензойной кислоты. Оставляют стоять на
свету в течение 12-16 часов. 1 мл стандартного раствора содержит 5
мг глюкозы.
Специальное оборудование.
Фотоэлектроколориметр или
спектрофотометр.
Секундомер.
Колбы мерные.
Ход определения. Опытная проба. В центрифужную пробирку
помещают 1,1 мл 0,9% раствора хлористого натрия, добавляют 0,1 мл
крови (плазмы, сыворотки, спинномозговой жидкости). Несколько раз
промывают пипетку, приливают 0,4 мл 5% раствора сернокислого цинка
и 0,4 мл 0,3н раствора едкого натра. Тщательно перемешивают и
через 10 минут центрифугируют при 2.500 об/мин в течение 10 минут.
Тотчас же сливают надосадочную жидкость.
К 1 мл надосадочной жидкости добавляют 3 мл энзимо -
хромогенного реактива, доведенного предварительно до комнатной
температуры. Осторожно перемешивают и измеряют на
фотоэлектроколориметре на 20-23 минуте в кювете с толщиной слоя 1
см при длине волны 625 нм (красный светофильтр) против холостой
пробы.
Холостая проба. К 1 мл дистиллированной воды добавляют 3 мл
энзимо - хромогенного реактива.
Серия не должна превышать 10-15 проб; при этом надо строго
соблюдать, чтобы время с момента добавления энзимо - хромогенного
реактива до измерения было во всех пробах одинаковым.
Расчет производят по формуле:
Еоп
Соп = ---- х Сст, где:
Ест
Соп - концентрация глюкозы в крови в мг%.
Сст - концентрация глюкозы в калибровочном растворе в мг% (100
мг%).
Еоп - экстинкция опытной пробы.
Ест - экстинкция калибровочной пробы.
от условий опыта, то калибровочную пробу ставят параллельно с
опытной пробой и обрабатывают ее так же, как опытную пробу. На 1
серию ставят 1 калибровочную пробу.
Линейная зависимость между оптической плотностью и
концентрацией глюкозы сохраняется от 0 до 400 мг%.
Нормальные величины: Кровь - 56-94 мг%, в плазме и сыворотке -
55-100 мг%. Спинномозговая жидкость - 50-70 мг%.
Примечания.
1. Цельная кровь исследуется немедленно после взятия.
2. В каждую последующую пробу серии энзимо - хромогенный
реактив добавляется с интервалом в 1 минуту.
3. Для получения более точных результатов время максимума
окрашивания (20-23 минуты) устанавливается в каждой серии
определений по нарастанию экстинкции первой опытной пробы.
4. За 3 дня до исследования исключить прием аскорбиновой
кислоты, антибиотиков тетрациклинового ряда.
Литература.
1. Middleton Y.E., Griffith W. - Brit. Med. - Y., 1957, 2,
1525.
2. Marks V. - Clin. Chim. Acta, 1959, 4, 3, 395.
3. Лукомская И.С., Городецкий В.К. - Биохимия, 1961, т. 26,
вып. 3, 477-482.
3.3. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЛИПИДНОГО ОБМЕНА
3.3.1. Определение общих липидов в сыворотке крови по
цветной реакции с сульфофосфованилиновым реактивом
Принцип. Продукты распада ненасыщенных липидов образуют с
реактивом, состоящим из серной, ортофосфорной кислот и ванилина,
окрашенное соединение; интенсивность окраски пропорциональна
содержанию общих липидов сыворотки крови.
Реактивы.
1. Серная кислота, концентрированная, для пробы Саваля.
2. Ортофосфорная кислота, концентрированная.
3. 0,6% водный раствор ванилина. 0,6 г ванилина растворяют
нагреванием на водяной бане в небольшом количестве
дистиллированной воды; после охлаждения доводят объем до 100 мл.
Стабилен при хранении при комнатной температуре.
4. Фосфорнованилиновая смесь. 4 части концентрированной
ортофосфорной кислоты смешивают с 1 частью 0,6% раствора ванилина.
Смесь хранят в посуде из темного стекла при комнатной температуре.
5. Хлороформ, хч или для наркоза.
6. Основной калибровочный раствор триолеина, 1.200 мг%, в
хлороформе. Взвешивают на аналитических весах 1.200 мг триолеина в
мерной колбе на 100 мл и доводят хлороформом до метки. Хранят в
холодильнике, в посуде из темного стекла с притертой пробкой.
Специальное оборудование.
Фотоэлектроколориметр.
Водяная баня.
Колбы мерные.
Ход определения. Опытная проба. К 0,1 мл сыворотки прибавляют
5 мл концентрированной серной кислоты. Содержимое пробирки
тщательно перемешивают и помещают на 10 минут в кипящую водяную
баню. Пробирки вынимают и сразу охлаждают под водопроводной водой
до комнатной температуры. Из каждой пробирки по 0,2 мл смеси
помещают в чистую сухую пробирку, добавляют 3 мл
фосфорнованилиновой смеси, тщательно перемешивают и оставляют
стоять 45 минут в темноте при комнатной температуре. Измеряют на
фотоэлектроколориметре при длине волны 500-560 нм (зеленый
светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см против холостой
пробы.
Холостую пробу ставят как и опытную, но вместо сыворотки берут
0,1 мл воды.
Расчет производят по калибровочному графику или по формуле.
Построение калибровочного графика. Из основного калибровочного
раствора готовят рабочие калибровочные растворы, как указано в
таблице:
-------------T-------------------T---------------T---------------¬
¦ NN ¦ Калибровочный ¦ Хлороформ ¦ Концентрация¦
¦ пробирок ¦ раствор ¦ (мл) ¦ общих ¦
¦ ¦ триолеина ¦ ¦ липидов ¦
¦ ¦ (мл) ¦ ¦ (мг%) ¦
+------------+-------------------+---------------+---------------+
¦ 1 ¦ 0,17 ¦ 0,83 ¦ 200 ¦
¦ 2 ¦ 0,33 ¦ 0,67 ¦ 400 ¦
¦ 3 ¦ 0,5 ¦ 0,5 ¦ 600 ¦
¦ 4 ¦ 0,67 ¦ 0,33 ¦ 800 ¦
¦ 5 ¦ 0,83 ¦ 0,17 ¦ 1000 ¦
¦ 6 ¦ 1,0 ¦ - ¦ 1200 ¦
L------------+-------------------+---------------+----------------
Из каждого разведения берут по 0,1 мл рабочего калибровочного
раствора и далее обрабатывают как опыт. По полученным данным
строят калибровочный график. Прямолинейная зависимость между
содержанием общих липидов и оптической плотностью сохраняется до
1200 мг%.
Еоп
Расчет по формуле: Общие липиды в мг% = ---- х Ск
Ек
Нормальные величины - 350-800 мг%.
Примечания.
1. Исследование проводят строго натощак.
2. Сыворотку можно хранить в холодильнике в течение 3-6 дней
(не замораживая).
3. При концентрации общих липидов выше 1.200 мг% сыворотку
разводят водой и результаты умножают на разведение.
4. Посуду, применяемую для определения общих липидов, мыть
отдельно от другой посуды. Необходимо тщательно прополоскать ее
дистиллированной водой и спиртом (этанолом или метанолом).
Литература.
1. Zollner N., Kirsch K. - Z.fur ges. exp. Med., 1962. 135,
545-561.
2. Knight Y., Anderson S., Rawle Y. - Clin. Chem. 1972, 18,
N 3, 199-200.
3.3.2. Определение триглицеридов в сыворотке крови
по цветной реакции с хромотроповой кислотой
Принцип. Триглицериды гидролизуются с освобождением глицерина.
Глицерин количественно окисляется до формальдегида метаперйодатом
натрия. Образующиеся при этом йодаты и непрореагировавшие
перйодаты восстанавливаются в йодиты избытком бисульфита натрия,
после чего формальдегид определяют по цветной реакции с
хромотроповой кислотой.
Реактивы.
1. Хлороформ, хч или для наркоза.
2. Метанол (метиловый спирт), хч.
3. Смесь хлороформа с метанолом в соотношении 2:1.
4. Эфир для наркоза.
5. 0,37% раствор хлористого калия. 0,37 г хлористого калия
растворяют в 100 мл воды. Стабилен 2-3 месяца при хранении при
комнатной температуре.
6. Смесь для промывания липидного экстракта - хлороформ:
метанол: вода (3:48:47).
7. Этанол (этиловый спирт), абсолютный.
8. 2.5% раствор едкого кали. 0,25 г едкого кали растворяют в
10 мл дистиллированной воды. Раствор стабилен при хранении при
комнатной температуре.
9. Спиртовой раствор едкого кали. Смешивают extempore 1 объем
2,5% водного раствора едкого кали и 19 объемов абсолютного спирта.
10. 0,02М раствор натрия метапериодата (натрия йоднокислого
мета, NaIO4). 0,426 г метапериодата натрия растворяют в мерной
колбе на 100 мл в небольшом количестве воды и доводят
дистиллированной водой до метки. Раствор стабилен около года при
хранении при комнатной температуре в посуде из темного стекла.
11. 5% раствор бисульфита натрия. 5 г бисульфита натрия
(метабисульфита натрия) растворяют в 100 мл дистиллированной воды.
Стабилен при хранении при комнатной температуре в течение месяца.
12. Раствор хромотроповой кислоты. 1 г динатриевой соли
хромотроповой кислоты (ч) (1,8-диоксинафталин-3,6-дисульфоновой
кислоты динатриевой соли) растворяют в 100 мл дистиллированной
воды; раствор фильтруют, добавляют 300 мл концентрированной серной
кислоты и 150 мл дистиллированной воды. Стабилен в течение 3-4
недель при хранении в холодильнике, в посуде из темного стекла.
13. 0,7М раствор серной кислоты. В мерную колбу на 100 мл к
небольшому количеству дистиллированной воды добавляют 3,7 мл
серной кислоты, смешивают и после охлаждения доводят объем
дистиллированной водой до метки.
14. Кремневая кислота, очищенная, активированная. Кремневую
кислоту предварительно очищают и активируют.
Очистка кремневой кислоты. К 500 г кремневой кислоты, водной,
ч или чда, добавляют 2 л дистиллированной воды, тщательно
размешивают и оставляют стоять полученную суспензию на 1 час.
Верхний слой отсасывают водоструйным насосом, нижний слой
фильтруют. Кремневую кислоту промывают 3 раза абсолютным метанолом
и несколько раз хлороформом. Очищенную кремневую кислоту
активируют в сушильном шкафу при температуре 110 град. С в течение
12 часов. Хранят в герметично закрытой посуде. Перед работой
кремневую кислоту вновь активируют в течение 1 часа при
температуре 100 град. С.
15. Основной калибровочный раствор триолеина (0,01М). 0,815 мл
триолеина (0,884 г триолеина) растворяют в небольшом количестве
хлороформа в мерной колбе на 100 мл и доводят хлороформом до
метки.
Рабочий раствор триолеина. 1 мл основного калибровочного
раствора доводят хлороформом до 100 мл. 1 мл этого раствора
содержит 0,1 мкМ триолеина.
Вместо триолеина в качестве калибровочного вещества можно
употреблять трибутирин.
Основной калибровочный раствор трибутирина (0,01М). 302 мг
трибутирина растворяют в небольшом количестве хлороформа в мерной
колбе на 100 мл и доводят хлороформом до метки.
Рабочий раствор трибутирина. 1 мл основного калибровочного
раствора доводят хлороформом до 100 мл. 1 мл этого раствора
содержит 0,1 мкМ трибутирина.
Специальное оборудование.
Фотоэлектроколориметр.
Баня водяная.
Насос водоструйный.
Колбы мерные.
Ход определения. Опытная проба. 1) Получение общего липидного
экстракта. К 0,5 мл сыворотки добавляют 10 мл смеси хлороформ -
метанол (2:1), энергично встряхивают 30 секунд и фильтруют через
бумажный обезжиренный фильтр. Для обезжиривания помещают
обеззоленные фильтры в посуду со смесью Блюра или Фолча, оставляют
на сутки и высушивают на воздухе. Хранят в плотно закрытой посуде.
Пробирки промывают 3 мл смеси хлороформ - метанол (2:1) и вновь
фильтруют. Объем фильтрата доводят до 12 мл смесью хлороформ -
метанол. Добавляют 2,4 мл 0,37% раствора хлористого калия.
Содержимое пробирок энергично встряхивают 30 сек. и оставляют
стоять на 2-3 часа (можно на сутки) для образования двух фаз (двух
слоев). Образовавшийся верхний слой отсасывают пипеткой с помощью
водоструйного насоса (не задевая нижнего слоя). На нижний слой
наслаивают два раза по 1 мл смеси хлороформ:метанол:вода (3:48:47)
и отсасывают смесь (промывание липидного экстракта). Затем к
нижнему слою добавляют по каплям метанол для просветления
липидного экстракта. Объем полученного очищенного экстракта
доводят смесью хлороформ - метанол (2:1) до 10 мл и тщательно
перемешивают.
2) Определение триглицеридов. 4 мл экстракта выпаривают на
водяной бане при 60-80 град. С. Сухой остаток растворяют в 7 мл
хлороформа и в полученный раствор вносят 500 мг активированной
кремневой кислоты; содержимое пробирок энергично встряхивают 30
сек. Затем смесь фильтруют через обезжиренный фильтр, промывают
дважды пробирки хлороформом по 2 мл и вновь фильтруют.
Хлороформ выпаривают досуха в водяной бане при температуре
70-80 град. С. После выпаривания в пробирки вносят по 1 мл
спиртового раствора едкого кали и вновь помещают в водяную баню
при 60-65 град. С на 30 минут (для гидролиза). Затем пробирки
вынимают, охлаждают до комнатной температуры и прибавляют по 1,6
мл 0,7М раствора серной кислоты, перемешивают и добавляют 4 мл
эфира. Содержимое пробирок энергично встряхивают в течение 1
минуты. Отстоявшийся верхний эфирный слой осторожно отсасывают
пипеткой с помощью водоструйного насоса.
Из оставшегося нижнего слоя берут 0,6 мл, добавляют 0,1 мл
0,02М раствора натрия метапериодата, тщательно перемешивают. Через
10 минут добавляют 0,1 мл 5% раствора бисульфита натрия, энергично
встряхивают (раствор сначала желтеет, а затем светлеет), через 5
минут добавляют 2,5 мл раствора хромотроповой кислоты, встряхивают
и ставят на 30 минут в кипящую водяную баню (развивается темно -
вишневое окрашивание). После охлаждения в бане со льдом измеряют
на ФОКе против холостой пробы при длине волны 500-560 нм (зеленый
светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см.
Холостая проба. 2 пробирки с 1 мл хлороформа выпаривают на
водяной бане 70-80 град. С досуха, добавляют по 1 мл спиртового
раствора едкого кали и вновь помещают в водяную баню 60-65 град. С
на 30 минут. Далее определение ведут как и в опытной пробе.
Калибровочная проба обрабатывается как и холостая проба,
но вместо 1 мл хлороформа берут 1 мл рабочего калибровочного
раствора.
Расчет производят по формуле:
0,1 х Еоп х 500 х 850 Еоп
Содержание три- = ---------------------- = ---- х 42,5
глицеридов в мг% Ек х 1.000 Ек
где: Еоп - экстинкция опытной пробы,
Ек - экстинкция калибровочной пробы,
0,1 - содержание триолеина в мкМ в 1 мл рабочего
калибровочного раствора,
500 - коэффициент пересчета на 100 мл сыворотки,
850
----- - коэффициент пересчета на миллиграммы (850 -
1.000
средневзвешенный молекулярный вес жирных кислот триглицеридов в
организме человека).
Нормальные величины - 50-150 мг%.
Примечания.
1. Исследование необходимо проводить строго натощак после
12-часового голодания.
2. Пробирки для работы должны быть абсолютно чистыми и сухими.
Необходимо после обычного мытья тщательно прополаскивать их
дистиллированной водой и спиртом (этанолом или метанолом).
Литература.
1. Carlson L.A. - Atheroscler. Res., 1963, 3, 334.
2. Van Handel E. - Clin. Chem., 1961, 7, 249.
3. Биохимические методы исследования в клинике. Справочник.
Под ред. А.А.Покровского. М., 1969, 294.
3.3.3. Определение бета - липопротеидов в сыворотке крови
турбидиметрическим методом
Принцип. При добавлении гепарина к сыворотке крови образуется
в присутствии хлористого кальция гепарин - липопротеиновый
комплекс. Возникающая мутность пропорциональна содержанию бета -
липопротеидов.
Реактивы.
1. 0,025М раствор хлористого кальция. 0,5475 г 6-водного
хлористого кальция (CaCl2 x 6H2O) или 0,3675 г 2-водного
хлористого кальция (CaCl2 x 2H2O) растворяют в небольшом
количестве дистиллированной воды в мерной колбе на 100 мл и
доводят объем дистиллированной водой до метки.
Для приготовления 0,025М раствора хлористого кальция из
ампулированного раствора хлористого кальция 2,8 мл 10%
ампулированного раствора хлористого кальция помещают в мерную
колбу на 100 мл и доводят дистиллированной водой до метки.
Стабилен при хранении в холодильнике.
2. Раствор гепарина (1 мл должен содержать 1.000 МЕ). 1 мл
препарата гепарина фирмы "Гедеон Рихтер" (ВНР), содержащего 5000
МЕ в 1 мл, доводят дистиллированной водой до 5 мл. Отечественный
гепарин с содержанием 5.000 МЕ, 10.000 МЕ и 20.000 МЕ в 1 мл
разводят так, чтобы раствор содержал 1.000 МЕ в 1 мл.
Специальное оборудование.
Фотоэлектроколориметр.
Колбы мерные.
Секундомер.
Ход определения. В пробирку, содержащую 2 мл 0,025М раствора
хлористого кальция, добавляют 0,2 мл сыворотки, тщательно
перемешивают и измеряют оптическую плотность (Е1) на
фотоэлектроколориметре при длине волны 630-690 нм (красный
светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см против
дистиллированной воды. Затем добавляют 0,04 мл 1% раствора
гепарина, тщательно перемешивают и точно через 4 минуты
по секундомеру вновь измеряют оптическую плотность (Е2). Разница
экстинкций (Е2-Е1) соответствует оптической плотности,
обусловленной содержанием бета - липопротеидов.
Расчет. Содержание бета - липопротеидов выражают в единицах
экстинкции, умноженных на 100:
Содержание
бета - липопротеидов = (Е2 - Е1) х 100
Нормальные величины содержания бета - липопротеидов сыворотки
крови здоровых людей соответствуют 35-55 ед.
Примечание.
1. Кровь исследуют у пациента после 12-часового голодания.
2. При высоких концентрациях бета - липопротеидов сыворотку
разводят физиологическим раствором, полученные результаты умножают
на разведение.
3. Расчет можно вести по калибровочному графику, построенному
по калибровочному раствору бета - липопротеидов. Однако выделение
чистых бета - липопротеидов для получения калибровочного раствора
технически трудно. Кроме того, бета - липопротеиды - соединения
малоустойчивые, и денатурируются при высушивании и замораживании.
Поэтому было предложено выражать результаты в единицах экстинкции,
умноженных на 100.
Литература.
1. Burstein M., Samaille Y. - C.R.Acad. Sci., 1956, 243, 2185.
2. Ледвина М. - Лабор. дело, 1960, 3, 13.
3.4. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МИНЕРАЛЬНОГО ОБМЕНА
3.4.1. Определение железа в сыворотке крови по цветной
реакции с батофенантролином
Принцип. При реакции комплексирования железа с
батофенантролином образуется окрашенное соединение, интенсивность
окраски которого пропорциональна концентрации железа.
Реактивы.
1. 20% раствор трихлоруксусной кислоты.
2. 70% раствор уксуснокислого аммония. 70 г уксуснокислого
аммония и 30 мл воды.
3. Насыщенный водный раствор сернокислого гидразина. 2,5 г
сернокислого гидразина растворяют в 100 мл бидистиллированной
воды. Хранят при комнатной температуре в посуде из темного стекла.
4. Хлорсульфоновая кислота (ч).
5. 20% раствор едкого натра.
6. 0,05% раствор батофенантролина
(4,7-дифенил-1,10-фенантролин). 100 мг батофенантролина помещают в
пробирку, прибавляют 0,5 мл хлорсульфоновой кислоты, кипятят 30
секунд, после охлаждения медленно добавляют 10 мл
бидистиллированной воды, нагревают 5 минут на кипящей водяной
бане. Содержимое пробирки переносят в мерную колбу на 200 мл,
добавляют 100 мл бидистиллированной воды, затем 20% раствор едкого
натра до получения рН - 4,0 и доводят бидистиллированной водой до
метки.
7. 0,3н раствор соляной кислоты.
8. Серная кислота концентрированная.
9. Основной калибровочный раствор железа. 1 мл раствора
содержит 100 мкг железа. 703,2 мг соли Мора (аммоний - железо (II)
сернокислый (NH4)2Fe(SO4)2 х 6H2O) растворяют в 5 мл 0,3М раствора
соляной кислоты в мерной колбе на 1 л и доводят объем до метки
бидистиллированной водой, подкисленной предварительно 1 мл серной
кислоты.
Рабочий раствор готовят разведением основного раствора
подкисленной бидистиллированной водой в 50 раз. 1 мл рабочего
раствора содержит 2 мкг железа.
Специальное оборудование.
Фотоэлектроколориметр.
Водяная баня.
Колбы мерные.
Ход определения. Опытная проба. К 2 мл сыворотки добавляют 2,5
|
