|
Стр. 4
Ход определения. Опытная проба. К 2 мл сыворотки добавляют 2,5
мл бидистиллированной воды, 1,5 мл 20% раствора трихлоруксусной
кислоты. После перемешивания содержимое помещают на 15 минут в
водяную баню 90-95 град. С. Смесь центрифугируют при 2.000 об/мин
в течение 20 минут. К 4 мл надосадочной жидкости прибавляют 0,35
мл 70% раствора уксуснокислого аммония, затем 0,3 мл насыщенного
раствора сернокислого гидразина. Измеряют на
фотоэлектроколориметре в кювете с толщиной слоя 1 см при длине
волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) против воды. Затем в
опытную пробу добавляют 0,4 раствора батофенантролина, оставляют
стоять на 40 минут и повторно измеряют при тех же условиях.
Холостая проба. Смешивают 1 мл трихлоруксусной кислоты, 3 мл
воды, прибавляют 0,35 мл 70% раствора уксуснокислого аммония, 0,3
мл насыщенного раствора сернокислого гидразина. Измеряют при тех
же условиях, что и опытные пробы. Через 40 минут к холостой пробе,
так же как и к опытной, добавляют 0,4 мл раствора батофенантролина
и повторно измеряют при тех же условиях.
Калибровочная проба. К 2 мл рабочего калибровочного раствора
добавляют 1 мл бидистиллированной воды, 1 мл 20% раствора
трихлоруксусной кислоты, 0,35 мл 70% раствора уксуснокислого
аммония, 0,3 мл насыщенного раствора сернокислого гидразина и
далее обрабатывают и измеряют как опытные пробы.
Расчет производят по формуле. Из результатов отсчета после
прибавления цветного реактива вычитают результаты того же
исследования до прибавления цветного реактива.
Концентрация железа Еоп - Ехол 100 Еоп - Ехол
в сыворотке крови = ---------- х 4 х ---- = ---------- х 300,
(в мкг%) Ек - Ехол 1,33 Ек - Ехол
где: Еоп - разность между окончательным и предварительным
отсчетом экстинкции опытной пробы.
Ехол - разность между окончательным и предварительным
отсчетом экстинкции холостой пробы,
Ек - то же для калибровочной пробы,
100
---- - коэффициент пересчета на 100 мл сыворотки.
1,33
Прямолинейная зависимость между оптической плотностью и
концентрацией железа сохраняется до концентрации 1.000 мкг%.
Нормальные величины - 65-175 мкг%.
Примечания.
1. Сыворотка крови должна быть свободной от гемолиза.
2. Кровь следует брать в специальную пробирку, промытую
бидистиллированной водой.
3. Посуду промывают 5н раствором соляной кислоты и
ополаскивают бидистиллированной водой.
4. Не рекомендуется употреблять трихлоруксусную кислоту с
высоким содержанием в ней железа. Разность экстинкций холостой
пробы не должен быть более 0,05.
Литература.
1. Henry R.I., Sobel C., Chiamory N. - Clin. Chim. Acta, 1958,
3, 523.
2. Идельсон Л.И., Радзивиловская Э.Г., Аполлонова Л.А. - Пр.
гематологии и переливания крови, 1970, 5, 47.
3.4.2. Определение магния в сыворотке (плазме) крови
по цветной реакции с титановым желтым
Принцип. Магний реагирует с титановым желтым в щелочной среде
с образованием окрашенных соединений. Интенсивность окраски
пропорциональна концентрации магния.
Реактивы:
1. 10% раствор вольфрамовокислого натрия.
2. 0,67н раствор серной кислоты.
3. 6% раствор едкого натра.
4. 2% раствор солянокислого гидроксиламина. Хранят в посуде из
темного стекла.
5. 0,075% раствор титанового желтого. 18,7 мг титанового
желтого растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды в
мерной колбе на 25 мл и доводят дистиллированной водой до метки.
Хранят в посуде из темного стекла в холодильнике, в течение 10
дней.
6. 0,1% раствор метилового красного в 95% этаноле.
7. 2мг% калибровочный раствор сернокислого магния.
205 мг сернокислого магния (хч) (MgSO4 х 7H2O) растворяют в
небольшом количестве дистиллированной воды в мерной колбе на 1
литр и доводят дистиллированной водой до метки. 1 мл раствора
содержит 0,02 мг магния.
Специальное оборудование.
Фотоэлектроколориметр.
Пробирки центрифужные мерные, на 10 мл.
Колбы мерные.
Ход определения. Опытная проба. В центрифужную пробирку
наливают 2 мл дистиллированной воды, 1 мл сыворотки (плазмы), 1 мл
10% раствора вольфрамовокислого натрия, смешивают, добавляют 1 мл
0,67н раствора серной кислоты. Тщательно перемешивают стеклянной
палочкой. Через 15 минут центирифугируют при 3,5-4 тыс. об/мин в
течение 10 минут. Надосадочная жидкость должна быть прозрачной. К
2,5 мл надосадочной жидкости в мерной центрифужной пробирке на 10
мл добавляют 1 каплю индикатора - метилового красного и
нейтрализуют несколькими каплями 0,8% раствора едкого натра до
желтой окраски раствора.
К этому раствору добавляют 1 мл 2% раствора гидроксиламина, 1
мл 0,075% раствора титанового желтого и 2 мл 6% раствора едкого
натра. Затем раствор доводят до объема 10 мл дистиллированной
водой.
Измеряют в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 500-560
нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы.
Холостая проба. В центрифужной пробирке на 10 мл смешивают 1,5
мл дистиллированной воды, 0,5 мл 10% раствора вольфрамовокислого
натрия, 0,5 мл 0,67н раствора серной кислоты, добавляют 1 каплю
индикатора метилового красного и далее обрабатывают как опытную
пробу.
Расчет производят по калибровочному графику.
Построение калибровочного графика. Из основного калибровочного
раствора готовят разведения, как указано в таблице
-------------T-------------T------------------T---------------¬
¦Основной ¦Содержание Mg¦ Дистиллированная ¦Концентрация Mg¦
¦калибровоч- ¦ в основном ¦ вода ¦ в сыворотке ¦
¦ный раствор ¦калибровочном¦ (мл) +-------T-------+
¦(мл) ¦растворе (мг)¦ ¦ мг% ¦ мэкв ¦
+------------+-------------+------------------+-------+-------+
¦ 0,25 ¦ 0,005 ¦ до 6,0 ¦ 1 ¦ 0,82 ¦
¦ 0,5 ¦ 0,01 ¦ до 6,0 ¦ 2 ¦ 1,64 ¦
¦ 0,75 ¦ 0,015 ¦ до 6,0 ¦ 3 ¦ 2,46 ¦
¦ 1,0 ¦ 0,02 ¦ до 6,0 ¦ 4 ¦ 3,27 ¦
¦ 1,25 ¦ 0,025 ¦ до 6,0 ¦ 5 ¦ 4,1 ¦
¦ 1,5 ¦ 0,03 ¦ до 6,0 ¦ 6 ¦ 4,92 ¦
L------------+-------------+------------------+-------+--------
Ко всем растворам добавляют по 1 мл 2% раствора гидроксиламина,
1 мл 0,075% раствора титанового желтого и 2 мл 6% раствора едкого
натра. Измеряют при тех условиях, что и опытные пробы против
холостой пробы.
Холостая проба. 1 мл 2% раствора гидроксиламина, 1 мл 0,075%
раствора титанового желтого, 2 мл 6% раствора едкого натра и
доводят до 10 мл дистиллированной водой.
Прямолинейная зависимость между оптической плотностью и
концентрацией магния сохраняется от 0 до 6,0 мэкв/л.
Нормальные величины. Содержание магния в сыворотке и плазме -
1,7-2,4 мг%, или 1,5-2,0 мэкв/л.
Примечание. Сыворотка крови не должна быть гемолизирована.
Литература.
Kunkel H.O., Pearson P.B., Schweiqert B.S. - Y.Lab. and Clin.
Med., 1947, 32, 8, 1027-1033.
3.4.3. Определение магния в сыворотке (плазме) крови
и моче по цветной реакции с магоном
Принцип. Магний реагирует с магоном в щелочной среде с
образованием окрашенных соединений. Интенсивность окраски
пропорциональна концентрации магния.
Содержание магния в сыворотке (плазме) крови и в моче по этой
реакции можно определить готовым набором реактивов, выпускаемым
фирмой "Лахема" (ЧССР).
Набор Био - Ла - Тест "Магний" состоит из следующих реактивов:
1. 2,8 х 10 (в минус четвертой степени) М раствор магона.
2. 0,1М основной буферный раствор тетрабората натрия -
1-(2-оксиазо)-2 нафтол-3-(2,4-диметил)-карбоксанилид.
3. 20 мг% основной калибровочный раствор магния.
Приготовление рабочих растворов.
1. Рабочий буферный раствор. В колбу, емкостью 250 мл,
наливают 50 мл основного буферного раствора и доводят до метки
дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают. Рабочий
буферный раствор устойчив в течение нескольких месяцев.
2. Рабочий раствор магона готовят смешиванием равных объемов
раствора магона и рабочего буферного раствора. Рабочий раствор
магона устойчив ограниченное время, поэтому готовить его нужно
ежедневно. Используют через 10 минут после приготовления.
3. Рабочий калибровочный раствор магния. В мерную колбу на 50
мл наливают 5,0 мл основного калибровочного раствора и доводят до
метки дистиллированной водой. Концентрация рабочего
калибровочного раствора - 2 мг%.
Ход определения. В пробирку вносят 0,03 мл сыворотки или мочи,
разбавленной в 3 раза дистиллированной водой, добавляют 4,0 мл
свежеприготовленного рабочего раствора магона и перемешивают.
Измеряют на ФЭКе при 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете
с толщиной слоя 1 см против холостой пробы.
Холостую пробу ставят как опытную, но вместо сыворотки или
мочи добавляют дистиллированную воду.
Калибровочная проба. Параллельно с опытной пробой ставят
калибровочную, в которую вместо сыворотки добавляют рабочий
калибровочный раствор магния.
Расчет ведут по калибровочному графику или по формуле:
Концентрация Еоп
магния в мг% = ---- х 2, где:
Ек
Еоп - экстинкция опытной пробы,
Ек - экстинкция калибровочной пробы,
2 - содержание магния в калибровочном растворе в мг%.
Концентрация магния в мэкв/л = концентрация магния в мг%
-------------------------
1,22
Построение калибровочного графика. Из основного калибровочного
раствора (20 мг%) готовят рабочие калибровочные растворы 1, 2, 3,
4 мг% путем соответствующего разведения основного раствора
дистиллированной водой.
Из каждого рабочего калибровочного раствора берут по 0,03 мл и
обрабатывают как опытные пробы.
Нормальные величины. Содержание магния в сыворотке - 1,7-2,6
мг%, или 1,4-2,1 мэкв/л.
Примечание. Стабильность окраски получаемых растворов
сохраняется в течение 20-30 минут.
Литература.
Инструкция к набору реактивов Био - Ла - Тест для определения
магния в биологических жидкостях. "Лахема" (ЧССР).
3.4.4. Определение калия в биологических жидкостях
методом пламенной фотометрии
Принцип. Распыленную в воздухе биологическую жидкость вводят в
горящую газовую смесь с высокой температурой. В этих условиях
многие элементы имеют характерные для них спектры испускания.
Концентрация исследуемого электролита пропорциональна
интенсивности соответствующего участка спектра испускания пламени,
что регистрируется прибором.
Реактивы.
1. Основные калибровочные растворы для определения калия в
плазме (сыворотке), спинномозговой жидкости, экссудатах,
транссудатах, желудочном содержимом, эритроцитах. Основные
калибровочные растворы готовят из химически чистых солей
хлористого натрия, хлористого калия, углекислого кальция, дважды
перекристаллизованных и высушенных до постоянного веса.
а) 2,5418 г хлористого натрия растворяют в небольшом
количестве бидистиллированной воды в мерной колбе на 1 л и доводят
бидистиллированной водой до метки.
б) 1,9069 г хлористого калия растворяют в небольшом количестве
бидистиллированной воды в мерной колбе на 1 л и доводят
бидистиллированной водой до метки.
в) 2,4972 г углекислого кальция растворяют в 50 мл 1 н
раствора соляной кислоты в мерной колбе на 1 л и доводят
бидистиллированной водой до метки.
2. Основные калибровочные растворы для определения калия в
моче.
а) 22,285 г сернокислого калия растворяют в мерной колбе на 1
л в небольшом количестве бидистиллированной воды и доводят
бидистиллированной водой до метки.
б) 127,09 г хлористого натрия растворяют в небольшом
количестве бидистиллированной воды в мерной колбе на 1 л и доводят
бидистиллированной водой до метки.
3. Гепарин (антикоагулянт)
Специальное оборудование.
Пламенный фотометр.
Компрессор.
Колбы мерные.
Бюксы, диаметром 10-15 мм.
Баллоны с ацетиленом.
Ход определения. Подготовка материала к определению.
Плазма или сыворотка. Кровь центрифугируют в течение 15 минут
при 3.000 об/мин. Плазму<*> (сыворотку) осторожно отсасывают и
разводят дистиллированной водой до 1:10. Отделять плазму
(сыворотку) от эритроцитов следует не позднее чем через 1 час
после взятия крови.
--------------------------------
<*> Для получения плазмы на 5-10 мл крови в пробирку добавляют
1 каплю (0,02 мл) гепарина.
Спинномозговую жидкость, экссудат, транссудат разводят
дистиллированной водой 1:10.
Желудочное содержимое предварительно разводят дистиллированной
водой 1:50, а затем делают разведение дистиллированной водой 1:10.
Эритроциты. Гепаринизированную кровь центрифугируют в течение
30 минут при 3.000 об/мин. Затем плазму с верхним слоем
эритроцитов отсасывают. Эритроциты набирают пипеткой из нижней
части пробирки, гемолизируют дистиллированной водой, т.е. разводят
дистиллированной водой в соотношении 1:260.
Моча. Собирают суточную мочу, измеряют ее количество.
Небольшое количество мочи центрифугируют, разводят
дистиллированной водой 1:100.
Ход определения. Определение ведут согласно инструкции,
прилагаемой к прибору. При включении прибора сначала пропускают
сжатый воздух, потом ацетилен или другой газ. В бюксы, диаметром
10-15 мм, вносят соответствующим образом приготовленную
биологическую жидкость и рабочие калибровочные растворы
(приготовление рабочих калибровочных растворов - см. построение
калибровочного графика). Исследование начинают с настройки
прибора. Для этого калибровочные растворы вводят в горящую газовую
смесь пламенного фотометра и настраивают показания гальванометра в
соответствии с калибровочным графиком. Затем распыляют растворы
исследуемых биологических жидкостей. До и после каждого
определения распыляют дистиллированную воду для удаления следов
ионов. В ходе определения несколько раз проверяют работу прибора
при помощи одного из калибровочных растворов. После окончания
исследования прибор промывают в течение 20 минут дистиллированной
водой.
Расчет производят по калибровочному графику.
Построение калибровочного графика. Из основных калибровочных
растворов готовят рабочие растворы, как указано в таблицах.
Таблица
Рабочие калибровочные растворы для определения калия
в плазме (сыворотке), спинномозговой жидкости,
транссудате, экссудате, желудочном содержимом
---------------------------------T----------------T--------------¬
¦ Основные калибровочные растворы¦Дистиллированная¦Концентрация ¦
¦ (мл) ¦ вода ¦калия в калиб-¦
¦ ¦ (мл) ¦ровочной пробе¦
+---------T-----------T----------+ +-----T--------+
¦ KCl ¦ NaCl ¦ CaCO3 ¦ ¦(мг%)¦(мэкв/л)¦
+---------+-----------+----------+----------------+-----+--------+
¦ 0,6 ¦ 16,5 ¦ 0,2 ¦ 82,7 ¦ 12 ¦ 3,08 ¦
¦ 0,8 ¦ 16,5 ¦ 0,4 ¦ 82,3 ¦ 16 ¦ 4,10 ¦
¦ 1,0 ¦ 16,5 ¦ 0,5 ¦ 82,0 ¦ 20 ¦ 5,12 ¦
¦ 1,2 ¦ 16,5 ¦ 0,6 ¦ 81,7 ¦ 24 ¦ 6,15 ¦
¦ 1,4 ¦ 16,5 ¦ 0,8 ¦ 81,3 ¦ 28 ¦ 7,18 ¦
L---------+-----------+----------+----------------+-----+---------
Таблица
Рабочие калибровочные растворы
для определения калия в эритроцитах
---------------T---------T-------------------------------------¬
¦ Основной ¦Дистилли-¦ Концентрация калия ¦
¦калибровочный ¦рованная +----------------------T--------------+
¦ раствор KCl ¦вода ¦в калибровочной пробе ¦в эритроцитах ¦
¦ (мл) ¦(мл) +---------T------------+-----T--------+
¦ ¦ ¦(мг%) ¦(мэкв/л) ¦(мг%)¦(мэкв/л)¦
+--------------+---------+---------+------------+-----+--------+
¦ 1,0 ¦ до 100 ¦ 1,0 ¦ 0,256 ¦ 260 ¦ 66,6 ¦
¦ 1,1 ¦ до 100 ¦ 1,1 ¦ 0,282 ¦ 286 ¦ 73,3 ¦
¦ 1,2 ¦ до 100 ¦ 1,2 ¦ 0,307 ¦ 312 ¦ 80,0 ¦
¦ 1,3 ¦ до 100 ¦ 1,3 ¦ 0,333 ¦ 338 ¦ 86,6 ¦
¦ 1,4 ¦ до 100 ¦ 1,4 ¦ 0,359 ¦ 364 ¦ 93,3 ¦
¦ 1,5 ¦ до 100 ¦ 1,5 ¦ 0,384 ¦ 390 ¦ 100,0 ¦
¦ 1,6 ¦ до 100 ¦ 1,6 ¦ 0,412 ¦ 416 ¦ 106,6 ¦
L--------------+---------+---------+------------+-----+---------
Таблица
Рабочие калибровочные растворы
для определения калия в моче
---------------T--------------T---------T----------------------¬
¦ Основной ¦ Основной ¦Дистилли-¦ Концентрация К и Na ¦
¦калибровочный ¦калибровочный ¦рованная ¦ в калибровочной пробе¦
¦раствор K2SO4 ¦ раствор NaCl ¦вода ¦ ¦
¦ (мл) ¦ (мл) ¦(мл) ¦ ¦
+--------------+--------------+---------+----------------------+
¦ 5 ¦ 4 ¦ до 100 ¦ 50 мг К + 200 мг Na ¦
¦ 10 ¦ 4 ¦ до 100 ¦ 100 мг К + 200 мг Na ¦
¦ 15 ¦ 4 ¦ до 100 ¦ 150 мг К + 200 мг Na ¦
¦ 20 ¦ 4 ¦ до 100 ¦ 200 мг К + 200 мг Na ¦
¦ 25 ¦ 4 ¦ до 100 ¦ 250 мг К + 200 мг Na ¦
¦ 30 ¦ 4 ¦ до 100 ¦ 300 мг К + 200 мг Na ¦
L--------------+--------------+---------+-----------------------
Рабочие калибровочные растворы обрабатывают как опытные пробы
и по полученным данным строят калибровочный график.
Для расчета количества калия в моче показания калибровочного
графика умножают на суточное количество мочи (в мл) и результат
выражают в граммах.
Концентрация калия в биологической жидкости в
миллиэквивалентах/л равна: С х К, где:
С - концентрация калия в мэкв, найденная по калибровочному
графику,
К - разведение биологической жидкости.
Нормальные величины. Содержание калия:
Плазма 13,6-20,8 мг%
- 3,44-5,3 мэкв/л
Эритроциты 305-574 мг%
- 77,8-95,7 мэкв/л
Моча 1,5-3 г в суточном количестве
Желудочное 21,8-157,7 мг%
содержимое - 5,6-35,3 мэкв/л
3.4.5. Определение натрия в биологических жидкостях
методом пламенной фотометрии
Принцип. Тот же.
Реактивы. Те же.
Специальное оборудование. То же.
Ход определения. Подготовка материала к определению
производится так же, как при определении калия, за исключением
того, что сыворотку разводят 1:100, а эритроциты гемолизируют
дистиллированной водой в соотношении 1:26. Ход определения тот же,
что и при определении в биологических жидкостях калия.
Расчет производится по калибровочному графику.
Построение калибровочного графика. Из основных калибровочных
растворов готовят рабочие растворы, как указано в таблицах.
Таблица
Рабочие калибровочные растворы для определения натрия
в плазме (сыворотке), спинномозговой жидкости,
транссудате, экссудате, желудочном содержимом
------------------T--------------------T-------------------------¬
¦ Основной ¦ Дистиллированная ¦ Концентрация натрия ¦
¦ калибровочный ¦ вода ¦ в калибровочной пробе ¦
¦ раствор NaCl ¦ (мл) +-----------T-------------+
¦ (мл) ¦ ¦ (мг%) ¦ (мэкв/л) ¦
+-----------------+--------------------+-----------+-------------+
¦ 2,6 ¦ 97,4 ¦ 260 ¦ 113,0 ¦
¦ 2,8 ¦ 97,2 ¦ 280 ¦ 121,7 ¦
¦ 3,0 ¦ 97,0 ¦ 300 ¦ 130,4 ¦
¦ 3,4 ¦ 96,6 ¦ 340 ¦ 147,8 ¦
¦ 3,8 ¦ 96,2 ¦ 380 ¦ 165,2 ¦
¦ 4,0 ¦ 96,0 ¦ 400 ¦ 174,3 ¦
¦ 4,2 ¦ 95,8 ¦ 420 ¦ 182,6 ¦
L-----------------+--------------------+-----------+--------------
Таблица
Рабочие калибровочные растворы
для определения натрия в эритроцитах
------------------T---------T------------------------------------¬
¦ Основные ¦Дистилли-¦ Концентрация натрия ¦
¦ калибровочные ¦рованная +---------------------T--------------+
¦ растворы ¦вода ¦в калибровочной пробе¦в эритроцитах ¦
+--------T--------+(мл) +--------T------------+-----T--------+
¦NaCl(мл)¦KCL (мл)¦ ¦(мг%) ¦(мэкв/л) ¦(мг%)¦(мэкв/л)¦
+--------+--------+---------+--------+------------+-----+--------+
¦ 0,4 ¦ 14 ¦ до 100 ¦ 0,4 ¦ 0,174 ¦10,4 ¦ 4,52 ¦
¦ 0,5 ¦ 14 ¦ до 100 ¦ 0,5 ¦ 0,217 ¦13,0 ¦ 5,65 ¦
¦ 1,0 ¦ 14 ¦ до 100 ¦ 1,0 ¦ 0,434 ¦26,0 ¦ 11,3 ¦
¦ 1,5 ¦ 14 ¦ до 100 ¦ 1,5 ¦ 0,652 ¦39,0 ¦ 16,9 ¦
¦ 2,0 ¦ 14 ¦ до 100 ¦ 2,0 ¦ 0,869 ¦52,0 ¦ 22,6 ¦
¦ 2,5 ¦ 14 ¦ до 100 ¦ 2,5 ¦ 1,086 ¦65,0 ¦ 28,2 ¦
L--------+--------+---------+--------+------------+-----+---------
Таблица
Рабочие калибровочные растворы
для определения натрия в моче
---------------T--------------T---------T----------------------¬
¦ Основной ¦ Основной ¦Дистилли-¦ Концентрация Na и K ¦
¦калибровочный ¦калибровочный ¦рованная ¦ в калибровочной пробе¦
¦ раствор NaCl ¦ раствор K2SO4¦вода ¦ ¦
¦ (мл) ¦ (мл) ¦(мл) ¦ ¦
+--------------+--------------+---------+----------------------+
¦ 2 ¦ 15 ¦ до 100 ¦ 100 мг Na + 150 мг K ¦
¦ 3 ¦ 15 ¦ до 100 ¦ 150 мг Na + 150 мг K ¦
¦ 4 ¦ 15 ¦ до 100 ¦ 200 мг Na + 150 мг K ¦
¦ 5 ¦ 15 ¦ до 100 ¦ 250 мг Na + 150 мг K ¦
¦ 6 ¦ 15 ¦ до 100 ¦ 300 мг Na + 150 мг K ¦
¦ 7 ¦ 15 ¦ до 100 ¦ 350 мг Na + 150 мг K ¦
L--------------+--------------+---------+-----------------------
Рабочие калибровочные растворы обрабатывают как опытные пробы
и по полученным данным строят калибровочный график.
Для расчета количества Na в моче показания калибровочного
графика умножают на суточное количество мочи (в мл) и результат
выражают в граммах.
Нормальные величины. Содержание натрия:
плазма 300-360 мг%
- 130,5-156,6 мэкв/л
эритроциты 31-50 мг%
- 13,48-21,75 мэкв/л
моча - 3-6 г в суточном количестве
желудочное 72-435,4 мг%
содержимое - 31,3-189,3 мэкв/л
Литература.
1. Thiele W. - Yenaer. Rundschau, 1961, 2, 82.
2. Меньшиков В.В. - Методы клинической биохимии гормонов и
медиаторов. М., 1969, 145.
3. Крохалев А.А. - Лабор.дело, 1961, 5, 12.
4. Gabsch H. - Ch. In: Moderne chemische Methoden in der
Klinik. Leipzig, 1961, 646-655.
5. Hald P.W., Mason W.B. In: Standard Methods of Clinical
Chemistry. V.II. New York. 1958, 165-185.
3.5. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ
3.5.1. Определение активности альфа - амилазы в сыворотке
крови, моче и дуоденальном содержимом амилокластическим
методом со стойким крахмальным субстратом
(метод Каравея)
Принцип. альфа - амилаза гидролизует расщепление крахмала с
образованием конечных продуктов, не дающих цветной реакции с
йодом. Об активности альфа - амилазы судят по измерению уменьшения
концентрации крахмала.
Реактивы.
1. Субстратно - буферный раствор, рН-7. 13,3 г безводного
двузамещенного фосфорнокислого натрия и 4,3 г бензойной кислоты
растворяют в 250 мл дистиллированной воды и доводят до кипения.
Суспензируют 0,2 г растворимого крахмала (крахмал для
колориметрии) в небольшом количестве холодной воды и вводят в
кипящий раствор. Кипятят 1 минуту, охлаждают и доводят
дистиллированной водой до 500 мл. Стабилен при хранении при
комнатной температуре. Субстратно - буферный раствор должен быть
прозрачным.
2. 0,1н основной раствор йода. 3,567 г йодноватокислого калия
(KIO3) и 45 г йодистого калия (KI) растворяют в 800 мл
дистиллированной воды и медленно, при помешивании, добавляют 9 мл
концентрированной соляной кислоты; затем объем доводят до 1 л
дистиллированной водой.
3. 0,01н рабочий раствор йода. 25 г фтористого калия
растворяют в 350 мл дистиллированной воды, добавляют 50 мл
основного раствора йода и доливают дистиллированной водой до
объема 500 мл. Хранят в посуде из темного стекла в холодильнике.
Годен в течение 2 месяцев. Если в рабочий раствор йода не
добавлять фтористого калия, то его следует готовить ежедневно.
Специальное оборудование.
Фотоэлектроколориметр.
Термостат.
Ход определения. Опытная проба. Микровариант. 5 мл субстратно
- буферного раствора помещают в колбу, емкостью 50 мл, нагревают 5
мин. при 37 град. С, добавляют 0,1 мл биологической жидкости:
сыворотки, профильтрованной мочи или дуоденального содержимого
(предварительно разведенного 0,85% раствором хлористого натрия в
100 раз). Инкубируют 7,5 минут при 37 град. С. Время инкубации
следует строго отсчитывать по секундомеру с момента добавления
биологической жидкости в крахмальный субстрат. Тотчас же после
инкубации добавляют 5 мл рабочего раствора йода и доводят объем
дистиллированной водой до 50 мл. Измеряют на ФЭКе в кювете с
толщиной слоя 1 см при длине волны 630-690 нм (красный
светофильтр) против воды.
Холостую пробу ставят как опытную, но сыворотку добавляют
после инкубации, вместе с рабочим раствором йода. Измеряют при тех
же условиях, что и опытную пробу, против воды.
Ультрамикровариант. Ход определения опытной и холостой пробы
тот же, что и при микроварианте, но объем всех реактивов и
исследуемой биологической жидкости уменьшают в 5 раз. Определение
проводят в пробирках, калиброванных на 10 мл.
Расчет. Активность альфа - амилазы выражают в мг крахмала,
гидролизованного 1 мл биологической жидкости за 1 час инкубации
при 37 град. С. Расчет производят по формуле:
Активность Е1 - Е2 Е1 - Е2
амилазы = ------- х 2 х 8 х 10 х К = ------- х 160 х К,
в мг/мл/час Е1 Е1
где: Е1 - экстинкция холостой пробы,
Е2 - экстинкция опытной пробы,
2 - количество мг крахмала, введенного в опытную и
холостую пробы,
8 - коэффициент пересчета на 1 час инкубации,
10 - коэффициент пересчета на 1 мл биологической жидкости,
К - коэффициент разведения биологической жидкости.
При применении ультрамикроварианта окончательная формула
расчета - та же:
Активность Е1 - Е2
амилазы = ------- x 160 x К
в мг/мл/час Е1
При активности фермента выше 140 мг крахмала биологическую
жидкость следует развести 0,85% раствором хлористого натрия и
коэффициент разведения учитывать при расчете активности фермента.
Нормальные величины:
Сыворотка крови - 12-32 мг крахмала мл/час.
Моча - 20-160 мг крахмала мл/час.
Дуоденальное содержимое - 6-16 г крахмала мл/час.
Примечания.
1. Гемолиз не влияет на активность фермента.
2. Для определения активности амилазы рекомендуется
исследовать свежую биологическую жидкость.
3. Нормальные величины активности фермента для сыворотки крови
и мочи желательно проверять на донорах в каждой лаборатории.
4. Серия исследований должны быть не больше, чем 5-7 проб.
Литература.
1. Caraway W.T. - Amer. Y.Clin.Pathol., 1959, 32, 97.
2. Клиническая ферментология. Под ред. Э.Щеклик. Варшава,
1966.
3.5.2. Определение активности лактатдегидрогеназы
в сыворотке крови по реакции с
2,4-динитрофенилгидразином (метод Севела, Товарек)
Принцип. L-лактат под действием фермента сыворотки в
присутствии НАД окисляется в пируват; при реакции пирувата с
2,4-динитрофенилгидразином образуется окрашенный гидразон
пировиноградной кислоты, интенсивность окраски которого
пропорциональна активности фермента.
Реактивы.
1. 0,45М раствор молочнокислого натрия. В мерную колбу
емкостью 100 мл, вносят 5 мл 80% молочной кислоты (коммерческой),
добавляют 2н раствор едкого натра до получения рН-7,5 и доводят
объем дистиллированной водой до метки. Хранят в посуде из темного
стекла в холодильнике.
2. 0,03М раствор пирофосфорнокислого натрия, рН-8,8. 6,69 г
пирофосфорнокислого натрия (Na4P2O7 х 10H2O) растворяют в
небольшом количестве дистиллированной воды, добавляют 1н раствор
соляной кислоты до получения рН-8,8 и доводят объем
дистиллированной водой до 500 мл. Стабилен в течение месяца при
хранении в холодильнике.
3. Раствор никотинамид - аденин - динуклеотида (НАД). Готовят
из расчета 3 мг НАД на 1 мл дистиллированной воды. Раствор
стабилен в течение 4 недель при хранении в холодильнике.
4. Расчет 2,4-динитрофенилгидразина. 19,8 мг
2,4-динитрофенилгидразина растворяют в небольшом количестве 1н
раствора соляной кислоты при нагревании на водяной бане. После
охлаждения доводят объем 1н раствором соляной кислоты до 100 мл.
На следующий день реактив фильтруют. Раствор хранят в посуде из
темного стекла. Стабилен в течение 1 года.
5. 0,4н раствор едкого натра.
6. 1н раствор соляной кислоты.
7. Калибровочный раствор пировинограднокислого натрия. 11 мг
кристаллического пировинограднокислого натрия растворяют в
небольшом количестве дистиллированной воды, переносят в мерную
колбу, емкостью 100 мл, и доводят объем раствора до метки
дистиллированной водой. 1,0 мл раствора содержит 88 мкг
пировиноградной кислоты.
Рабочий калибровочный раствор готовят разведением основного в
10 раз дистиллированной водой. 1 мл рабочего раствора содержат 8,8
мкг пировиноградной кислоты.
Специальное оборудование.
Фотоэлектроколориметр.
Термостат.
Колбы мерные.
Ход определения. Опытная проба. 0,1 мл сыворотки, разведенной
1:2, смешивают с 0,3 мл раствора НАД, прогревают 5 мин при 37
град. С. Затем добавляют 0,8 мл 0,03М раствора пирофосфорнокислого
натрия и 0,2 мл 0,45М раствора молочнокислого натрия,
предварительно прогретых при 37 град. С, и инкубируют смесь при 37
град. С в течение 15 минут. Тотчас же после инкубации добавляют
0,5 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина, выдерживают 20 мин. при
комнатной температуре. Затем добавляют 5 мл 0,4н раствора едкого
натра, перемешивают и через 10 мин. измеряют на ФЭКе в кювете с
толщиной слоя 1 см при длине волны 500-560 нм (зеленый
светофильтр) против холостой пробы.
Холостую пробу ставят как опытную, но сыворотку добавляют
после инкубации.
Расчет активности производят по калибровочному графику.
Активность лактатдегидрогеназы выражают в микромолях
пировиноградной кислоты, образовавшихся при инкубации 1 мл
сыворотки в течение 1 часа при 37 град. С.
Построение калибровочного графика. Из рабочего калибровочного
раствора пировиноградного натрия готовят ряд разведений, как
указано в таблице. Затем в пробирки приливают по 0,5 мл раствора
2,4-динитрофенилгидразина. Далее калибровочные пробы обрабатывают
и измеряют, как опытные.
----T------------T-----------T-------T----------------T----------¬
¦NN ¦ Рабочий ¦0,03М ¦Дистил-¦Содержание пиро-¦Активность¦
¦п/п¦калибровочн.¦раствор ¦лиро- ¦виноградной кис-¦в мкмолях ¦
¦ ¦ раствор ¦пирофосфор-¦ванная ¦лоты в калибро- ¦ за 1 час ¦
¦ ¦ пирувата ¦нокислого ¦вода ¦вочной пробе ¦ на 1 мл ¦
¦ ¦ натрия ¦натрия ¦(мл) +-------T--------+сыворотки ¦
¦ ¦ (мл) ¦(мл) ¦ ¦ мкг ¦ мкмоль ¦ ¦
+---+------------+-----------+-------+-------+--------+----------+
¦1 ¦ 0,1 ¦ 0,8 ¦ 0,5 ¦0,88 ¦ 0,01 ¦ 1,2 ¦
¦2 ¦ 0,2 ¦ 0,8 ¦ 0,4 ¦1,76 ¦ 0,02 ¦ 2,4 ¦
¦3 ¦ 0,4 ¦ 0,8 ¦ 0,2 ¦3,52 ¦ 0,04 ¦ 4,8 ¦
¦4 ¦ 0,6 ¦ 0,8 ¦ - ¦ 5,28 ¦ 0,06 ¦ 7,2 ¦
¦5 ¦ 0,8 ¦ 0,6 ¦ - ¦ 7,04 ¦ 0,08 ¦ 9,6 ¦
L---+------------+-----------+-------+-------+--------+-----------
Холостую пробу ставят как калибровочную, но вместо
калибровочного раствора добавляют дистиллированную воду.
Пересчет активности лактатдегидрогеназы на микромоли
пировиноградной кислоты на 1 мл сыворотки за 1 час инкубации при
37 град. С производят по формуле:
Активность С х 30 х 4
лактатдегидрогеназы = ---------- ,
в мкМ/мл/час 88
где: С - микрограммы пировиноградной кислоты в калибровочной
пробе,
30 - коэффициент пересчета на 1,0 мл сыворотки,
4 - коэффициент пересчета на 1 час инкубации,
88 - вес 1 микромоля пировиноградной кислоты в микрограммах.
Прямолинейная зависимость между концентрацией пировиноградной
кислоты и оптической плотностью сохраняется от 0 до 10
микромолей/мл/час.
Нормальные величины - от 0,8 до 4,0 мкМ пировиноградной
кислоты на 1 мл сыворотки за 1 час инкубации при 37 град. С.
Примечания.
1. Сыворотка крови должна быть свободной от гемолиза.
2. Для исследования рекомендуется использовать свежую
сыворотку. Фермент не стабилен при хранении сыворотки при
температуре -8-20 град. С.
3. Щавелевоуксусную плазму употреблять не рекомендуется, так
как соли щавелевой кислоты ингибируют фермент.
Литература.
1. Sevela M., Tovarek Y. - Cas. Lek. Cesk., 1959, 98, 27, 844.
3.5.3. Определение активности сорбитолдегидрогеназы
в сыворотке крови по реакции с резорцином
(метод Севела, Товарек)
Принцип. d-сорбитол под действием фермента сыворотки в
присутствии НАД превращается во фруктозу; при реакции фруктозы с
резорцином образуется розово - красное окрашивание, интенсивность
которого пропорциональна количеству образовавшейся фруктозы.
Реактивы.
1. 0,5М раствор d-сорбитола на 0,05М трис - буфере.
0,225 г d-сорбитола (флакон N 1 по набору)<*> растворяют в 2,5
мл 0,05М трис - буфера. Раствор стабилен в течение 4 недель при
хранении в холодильнике.
--------------------------------
<*> Набор реактивов для определения активности
сорбитолдегидрогеназы в сыворотке крови, производство СССР.
2. 0,05М трис - буфер, рН-8,8. 70,5 мг триса
(оксиметиламинометан) (флакон N 2 по набору) растворяют в 2,5 мл
дистиллированной воды, прибавляют 0,4 мл 0,2н раствора соляной
кислоты. Проверяют рН. Доводят дистиллированной водой до 10 мл.
Раствор стабилен в течение года при хранении при комнатной
температуре.
3. 0,006М раствор никотинамид - аденин - динуклеотида (НАД).
25,0 мг НАД (флакон N 3 по набору) растворяют в 4,5 мл трис -
буфера. Раствор стабилен в течение 4 недель при хранении в
холодильнике.
4. 10% раствор трихлоруксусной кислоты (флакон N 4 по набору).
5. 0,1% раствор резорцина в 96 град. этаноле (флакон N 5 по
набору).
6. 30% раствор соляной кислоты.
7. 0,2н раствор соляной кислоты.
8. Калибровочный раствор фруктозы.27 мг фруктозы растворяют в
небольшом количестве 0,9% раствора хлористого натрия, переносят в
мерную колбу на 100 мл и доводят объем до метки 0,9% раствором
хлористого натрия (флакон N 6 по набору).
Специальное оборудование.
Фотоэлектроколориметр.
Термостат.
Колбы мерные.
Ход определения. Опытная проба. В центрифужную пробирку вносят
0,1 мл 0,5М раствора d-сорбитола и 0,3 мл сыворотки, прогревают 5
минут при +37 град. С, затем добавляют 0,2 мл 0,006М раствора НАД,
предварительно прогретого при 37 град. С, и инкубируют 30 минут
при 37 град. С. Инкубацию прерывают добавлением 0,4 мл 10%
раствора трихлоруксусной кислоты. Центрифугируют. В чистую
пробирку вносят 0,5 мл надосадочной жидкости, 0,5 мл раствора
резорцина, 1,5 мл 30% раствора соляной кислоты, перемешивают и
помещают в водяную баню при 80 град. С точно на 8 минут,
охлаждают. Возникающее розово - красное окрашивание измеряют на
ФЭКе при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с
толщиной слоя 0,5 см против холостой пробы.
Холостую пробу ставят как опытную, но раствор трихлоруксусной
кислоты добавляют до инкубации.
Расчет активности производят по калибровочному графику.
Активность сорбитолдегидрогеназы выражают в микромолях фруктозы,
образовавшейся при инкубации 1 мл сыворотки в течение 1 часа при
37 град. С.
Построение калибровочного графика. Из калибровочного раствора
фруктозы готовят ряд разведений с добавлением реактивов, как
указано в таблице. Далее калибровочные пробы помещают в водяную
баню при 80 град. С на 8 минут, охлаждают и измеряют при тех же
условиях, что и опытные пробы, против холостой пробы.
В холостую пробу вместо калибровочного раствора добавляют
0,9% раствор хлористого натрия.
Пересчет активности сорбитолдегидрогеназы на микромоли
фруктозы на 1 мл сыворотки за 1 час инкубации при 37 град. С
производят по формуле:
Активность сорбитолдегидрогеназы С х 3,3 х 2
в мкмолях/мл/час = -----------
180
-----T-----------T----T----T----T-------T-----T-----T----------T--------¬
¦NN ¦Калибровоч-¦0,9%¦Р-р ¦Трис¦Раствор¦Раст-¦30% ¦Содержа- ¦Актив- ¦
¦про-¦ный раствор¦р-р ¦сор-¦- ¦три- ¦вор ¦р-р ¦ние фрук- ¦ность в ¦
¦би ¦фруктозы ¦NaCl¦би- ¦бу- ¦хлор- ¦ре- ¦соля-¦тозы в ка-¦мкмолях/¦
¦рок ¦(мл) ¦ ¦тола¦фер ¦уксус- ¦зор- ¦ной ¦либровоч- ¦час/мл ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ной ¦цина ¦кис- ¦ной пробе ¦сыворот-¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦кислоты¦ ¦лоты ¦ (мкг) ¦ки ¦
+----+-----------+----+----+----+-------+-----+-----+----------+--------+
¦ 1 ¦0,2 калибр.¦0,1 ¦ 0,1¦ 0,2¦ 0,4 ¦ 1,0 ¦ 3,0 ¦ 5,4 ¦ 0,2 ¦
¦ ¦раствора, ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦развед. в¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦10 раз 0,9%¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦р-ром NaCl ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+----+-----------+----+----+----+-------+-----+-----+----------+--------+
¦ 2 ¦ 0,05 ¦0,25¦0,1 ¦ 0,2¦ 0,4 ¦ 1,0 ¦ 3,0 ¦ 13,5 ¦ 0,5 ¦
+----+-----------+----+----+----+-------+-----+-----+----------+--------+
¦ 3 ¦ 0,1 ¦0,2 ¦0,1 ¦ 0,2¦ 0,4 ¦ 1,0 ¦ 3,0 ¦ 27,0 ¦ 1,0 ¦
+----+-----------+----+----+----+-------+-----+-----+----------+--------+
¦ 4 ¦ 0,2 ¦0,1 ¦0,1 ¦ 0,2¦ 0,4 ¦ 1,0 ¦ 3,0 ¦ 54,0 ¦ 2,0 ¦
+----+-----------+----+----+----+-------+-----+-----+----------+--------+
¦ 5 ¦ 0,3 ¦- ¦0,1 ¦ 0,2¦ 0,4 ¦ 1,0 ¦ 3,0 ¦ 81,0 ¦ 3,0 ¦
L----+-----------+----+----+----+-------+-----+-----+----------+---------
где: С - мкг фруктозы в калибровочной пробе,
3,3 - коэффициент пересчета на 1 мл сыворотки,
2 - коэффициент пересчета на 1 час инкубации,
180 - вес 1 микромоля фруктозы в мкг.
Прямолинейная зависимость сохраняется от 0 до 3,0 микромолей
фруктозы на мл/час.
Нормальные величины. В сыворотке крови здоровых людей
активность сорбитолдегидрогеназы равна нулю или очень небольшим
величинам - 0,02+/-0,002 мкм/час на 1,0 мл.
Примечания.
1. Сыворотка должна быть свободной от гемолиза.
2. Фермент сыворотки термолабилен. Чтобы избежать потери
|
