|
Стр. 6
свободными после свертывания крови. Если их окажется недостаточно,
пробирку со свернувшейся кровью энергично встряхивают для
отделения большего количества эритроцитов.
Можно брать кровь с изотоническим раствором лимоннокислого
натрия (0,25 мл на 1 мл крови), но тогда эритроциты необходимо
отмыть; для этого пробирку с кровью на 3/4 заполняют
физиологическим раствором, содержимое перемешивают и
центрифугируют. Хранят кровь в течение 2-3 суток в холодильнике.
Ход определения. В штатив устанавливают три ряда пробирок: в
каждом ряду по количеству исследуемых образцов эритроцитов для
контроля. На каждых трех пробирках надписывают фамилию и инициалы
лица, кровь которого будут исследовать.
В одинаково обозначенные три пробирки каждого ряда вносят по
0,05 мл (1 капля) исследуемых эритроцитов, в три контрольные
пробирки - по 0,05 мл (1 капля) стандартных резус - положительных
эритроцитов группы 0(I) или группы, одноименной с исследуемой
кровью. В других три контрольные пробирки - по 0,05 мл (1 капля)
стандартных резус - отрицательных эритроцитов той же группы, что и
исследуемая кровь. Затем во все пробирки добавляют по 0,1 мл (2
капли) 10% раствора желатины, предварительно подогретого до 48
град. С (до разжижения), и пробирки слегка встряхивают для
перемешивания. После этого во все пробирки первого ряда вводят по
0,1 мл (2 капли) сыворотки антирезус одной серии, во все пробирки
второго ряда - по 0,1 мл (2 капли) сыворотки антирезус другой
серии. В пробирки третьего ряда сыворотки антирезус не вводят, эти
пробирки служат контролем на отсутствие неспецифической
агглютинации исследуемых эритроцитов в присутствии желатины.
Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и помещают в
водяную баню при 48 град. С на 5 минут или в термостат при той же
температуре на 30 минут. После прогревания в пробирки приливают
8-10 мл физиологического раствора, предварительно подогретого, и
содержимое перемешивают путем перевертывания пробирок. Пробирки
просматривают на свет невооруженным глазом или через лупу.
Оценка результатов. Результат может быть положительным и
отрицательным. При положительном результате, когда эритроциты
резус - положительны, в пробирке наблюдаются легко различимые
красные зерна или хлопья, состоящие из склеенных эритроцитов, на
прозрачном, почти обесцвеченном фоне жидкости. При отрицательном
результате, когда эритроциты резус - отрицательны, в пробирке
видна равномерно окрашенная в розовый цвет, слегка опалесцирующая
жидкость.
Результаты следует считать истинными при совпадении их в обеих
сериях стандартной сыворотки антирезус и после проверки
контрольных образцов, подтверждающих специфичность и активность
стандартной сыворотки: стандартные резус - положительные
эритроциты одноименнной группы или группы 0(I) должны дать
положительный результат, а стандартные резус - отрицательные
эритроциты одноименной группы - отрицательный. Кроме того,
отрицательный результат должен быть также во всех пробирках
третьего ряда, т.е. без сыворотки антирезус.
Примечание. Если при определении резус - принадлежности
наблюдается слабая или сомнительная реакция, то кровь данного лица
исследуют повторно этими же или другими сериями сыворотки
антирезус, причем желательно включить сыворотку с полными
антителами.
4.1.5. Определение резус - фактора методом монглютинации
в сывороточной среде на чашках Петри
Принцип. Исследуемые эритроциты инкубируют со стандартной
сывороткой антирезус, содержащей неполные антитела - резус, в
коллоидной среде - собственной сыворотке. Если исследуемые
эритроциты резус - положительны, происходит их склеивание -
конглютинация, выявляемая при просмотре жидкости в проходящем
свете.
Реагенты.
1. Стандартные сыворотки антирезус с полными антителами,
приготовленные для этого метода, двух различных серий. Группа
стандартной сыворотки должна быть совместима с исследуемой:
сыворотка антирезус группы 0(I) пригодна для определения резус -
фактора в эритроцитах группы 0(I); сыворотка антирезус группы
А(II) пригодна для определения резус - фактора в эритроцитах групп
0(I) и А(II); сыворотка антирезус группы В(III) пригодная для
определения резус - фактора в эритроцитах групп 0(I) и В(III);
сыворотка антирезус группы АВ(IV) и специально приготовленная
"универсальная" сыворотка пригодны для определения резус - фактора
в эритроцитах группы АВ(IV) и любой другой группы крови. Хранят
стандартные сыворотки в холодильнике, срок годности указан на
этикетке.
Если в распоряжении лаборатории не имеется второй серии
сыворотки антирезус для данного метода, то можно пользоваться
любой другой стандартной сывороткой, применяя тот метод, в котором
она активна (метод указан в сопроводительной инструкции).
2. Стандартные эритроциты для контроля. Применяют стандартные
резус - положительные эритроциты группы 0(I) или той же группы,
что и исследуемая кровь, и стандартные резус - отрицательные
эритроциты обязательно той же группы, что и исследуемая кровь.
Специальное оборудование.
Водяная баня на 48 град. С.
Чашки Петри.
Подготовка к определению. Обработка исследуемой крови и крови
для получения стандартных эритроцитов. Кровь для исследования
берут без стабилизатора в количестве 1-2 мл. На пробирках
надписывают фамилию, инициалы и группу крови лица, от которого
взята кровь. Для исследования берут эритроциты, оставшиеся
свободными после свертывания крови. Если их окажется недостаточно,
пробирку со свернувшейся кровью энергично встряхивают для
отделения большего количества эритроцитов. В этой же пробирке
готовят примерно 5% взвесь эритроцитов в той же сыворотке путем
взбалтывания содержимого.
Допустимо хранить кровь к холодильнике в течение 2-3 суток.
Ход определения. В чашке Петри делают шесть цифровых пометок.
Около каждой из них наносят по 0,1 мл (1 большая капля) сыворотки
антирезус: три - одной серии, три - другой. К первой капле каждой
серии сыворотки добавляют по 0,05 мл (1 капля) взвеси исследуемых
эритроцитов, ко второй капле каждой серии - по 0,05 мл (1 капля)
взвеси стандартных резус - положительных эритроцитов группы 0(I)
или группы, одноименной с исследуемой, и к третьей капле каждой
серии - по 0,05 мл (1 капля) взвеси стандартных резус -
отрицательных эритроцитов той же группы, что и исследуемые.
Перемешивают стеклянной палочкой и чашки Петри на 7-10 минут
опускают на поверхность воды в водяной бане при 48 град. С, после
чего просматривают над источником света при легком покачивании.
Оценка результатов. Результат может быть положительным или
отрицательным. При положительном результате, когда эритроциты -
резус - положительны, на почти бесцветном фоне жидкости легко
различимы красные зерна или хлопья, образованные склеившимися
эритроцитами. При отрицательном результате смесь остается
равномерно окрашенной в красный цвет.
Результаты следует считать истинными при совпадении их в обеих
сериях стандартной сыворотки антирезус и после проверки
контрольных образцов, подтверждающих специфичность и активность
стандартной сыворотки: стандартные резус - положительные
эритроциты группы 0(I) или группы, одноименной с исследуемой,
должны дать положительный результат, а стандартные резус -
отрицательные эритроциты одноименной группы - отрицательный.
Примечание. Если при определении резус - принадлежности
наблюдается слабая или сомнительная реакция, то кровь данного лица
исследуют повторно этими же и другими сериями сыворотки антирезус,
причем желательно включить сыворотку с полными антителами.
4.1.6. Определение резус - фактора на плоскости
при комнатной температуре с помощью сывороток,
приготовленных на альбумине или полиглюкине
(экспресс - метод)
Принцип. Исследуемая кровь без предварительной обработки
смешивается на плоскости со специальной стандартной сывороткой
антирезус, приготовленной на альбумине или полиглюкине. Если
исследуемая кровь резус - положительна, происходит агглютинация,
хорошо видимая невооруженным глазом.
Реагенты.
1. Стандартная сыворотка антирезус, универсальная, АВ(IV),
приготовленная на альбумине или полиглюкине, с указанием на
этикетке и в сопроводительной инструкции о пригодности ее для
данного метода. Хранят в холодильнике, срок годности указан на
этикетке.
2. 0,85% раствор хлористого натрия (физиологический раствор).
3. Контрольная сыворотка группы АВ(IV), не содержащая резус -
антител, приготовленная на альбумине или полиглюкине той же серии
и в тех же соотношениях, что и стандартная сыворотка антирезус,
предназначенная для этого метода. Хранят в холодильнике. Срок
годности указан на этикетке.
Специальное оборудование.
Белая пластинка со смачиваемой поверхностью.
Ход определения. Кровь для исследования берут из пальца
непосредственно перед определением. Можно использовать также
хранившиеся в холодильнике не более двух дней эритроциты, взятые
со дна пробирки после центрифугирования или отстаивания от плазмы
с консервантом. Эритроциты, оставшиеся на дне пробирки после
свертывания крови, использовать не рекомендуется.
На пластинку слева наносят 0,05 мл (1 капля) стандартной
сыворотки антирезус и справа - 0,05 мл (1 капля) контрольной
сыворотки. Рядом с каждой из этих капель наносят не менее 0,02 мл
(1 небольшая капля) свежей цельной крови или осадка эритроцитов.
Стеклянной палочкой перемешивают сначала исследуемую кровь с
контрольной сывороткой, размазывая ее до получения тонкого слоя, а
затем другую каплю исследуемой крови со стандартной сывороткой,
также размазывая ее тонким слоем. Пластинку периодически
покачивают в течение 3-4 минут, после чего в обе каплии добавляют
по 0,05 мл (1 капля) физиологического раствора для снятия
возможной неспецифической агглютинации и продолжают наблюдение при
периодическом покачивании пластинки до истечения 5 минут, после
чего учитывают результат.
Оценка результатов. Реакция может быть положительной или
отрицательной. При положительной реакции агглютинация эритроцитов
наблюдается только в одной капле - слева, с сывороткой антирезус.
При отрицательной реакции агглютинация эритроцитов отсутствует в
обеих каплях, и они остаются равномерно окрашенными. Агрегацию
эритроцитов в зоне подсыхания, по периферии капли, не учитывают.
Если реакция положительная - исследуемая кровь содержит резус
- фактор, и ее относят к резус - положительному типу.
Отрицательная реакция служит показателем того, что исследуемая
кровь не содержит резус - фактора, т.е. является резус -
отрицательной.
В капле контрольной сыворотки агглютинация эритроцитов должна
отсутствовать. Если в контрольной капле имеется агглютинация
эритроцитов, то заключение о резус - принадлежности исследуемого
образца крови не делают и этот образец крови исследуют повторно
другими сериями сывороток антирезус или направляют для
исследования в серологическую лабораторию службы переливания
крови.
Примечание. Метод применяется у постели больного.
4.1.7. Исследование сыворотки на наличие полных
резус - антител методом агглютинации в солевой
среде в пробирках
Принцип. Исследуемую сыворотку смешивают со стандартными резус
- положительными эритроцитами. Реакция протекает в солевой среде.
При наличии в исследуемой сыворотке полных резус - антител
происходит агглютинация резус - положительных эритроцитов, наличие
которой устанавливается по форме осадка эритроцитов.
Реагенты.
1. Стандартные эритроциты группы, совместимой с исследуемой
сывороткой, резус - положительные, не менее чем 3 образца,
обязательно содержащие в той или иной комбинации 3 антигена -
резус: Rho(D), rh'(C) и rh"(E). Если антигены rh'(C) и rh"(E) в
эритроцитах не определились, то количество образцов стандартных
резус - положительных эритроцитов должно быть увеличено до 20.
2. Стандартные резус - отрицательные эритроциты (2-3 образца)
группы, совместимой с исследуемой сывороткой.
3. Эритроциты лица, сыворотка которого исследуется - контроль
(не обязательный).
4. 0,85% раствор хлористого натрия (физиологический раствор).
5. 3,8% раствор лимоннокислого натрия.
Специальное оборудование.
Термостат на 37 град. С.
Пробирки высотой 2-2,5 см с внутренним диаметром 0,5-0,6 с
гладким дном сферической формы.
Лупа с 6-8 - кратным увеличением.
Подготовка к определению. Обработка крови для получения
стандартных и контрольных эритроцитов. 0,5-1,0 мл крови помещают в
центрифужные пробирки, емкостью не менее 10 мл, содержащие 0,25 мл
3,8% раствора лимоннокислого натрия. Пробирки на 3/4 заполняют
физиологическим раствором, содержимое перемешивают, центрифугируют
и жидкость над эритроцитами отбрасывают. Такое отмывание повторяют
дважды. Можно также брать кровь без стабилизатора. В этом случае
используют эритроциты, которые остаются на дне пробирки после
свертывания крови. Если этих эритроцитов недостаточно, пробирку со
свернувшейся кровью энергично встряхивают или разбивают сгусток.
Полученные таким образом эритроциты отмывают, как указано выше. Из
отмытых эритроцитов готовят 2% взвесь в других пробирках:
смешивают 2,45 мл (49 капель) физиологического раствора и 0,05 мл
(1 капля) осадка эритроцитов.
Ход определения. Штатив для пробирок покрывают листом бумаги,
на котором накалывают отверстия и сквозь них устанавливают ряд
пробирок по числу образцов эритроцитов, с которыми исследуется
сыворотка. На бумаге, около каждой пробирки, делают надпись. Во
все пробирки вводят по 0,05 мл (1 капля) исследуемой сыворотки и
по 0,05 мл (1 капля) физиологического раствора и перемешивают
встряхиванием. В соответственно обозначенные пробирки вносят по
0,05 мл (1 капля) 2% взвеси стандартных или контрольных
(собственных) эритроцитов, снова перемешивают содержимое пробирок
и помещают их на 1 час в термостат при 37 град. С. После инкубации
штатив с пробирками вынимают и результат реакции оценивают по
наличию или отсутствию агглютинации, которая определяется по форме
осадка эритроцитов на дне пробирки.
Оценка результатов. Наличие агглютинации в пробирках с резус -
положительными образцами эритроцитов и отсутствие ее с резус -
отрицательными и контрольными (собственными) эритроцитами
указывает на наличие в сыворотке полных резус - антител.
Отсутствие агглютинации со всеми образцами эритроцитов указывает
на отсутствие полных резус - антител. Наличие агглютинации в
пробирках с резус - отрицательными или собственными эритроцитами
говорит о наличии антител другой специфичности или о
неспецифической реакции. Такой результат не учитывают, ответа о
наличии полных резус - антител не дают и сыворотку передают для
исследования в специальную лабораторию.
4.1.8. Исследование сыворотки на наличие неполных
резус - антител методом конглютинации с применением
желатины
Принцип. Исследуемую сыворотку инкубируют со стандартными
резус - положительными эритроцитами в коллоидной среде - растворе
желатины. При наличии в исследуемой сыворотке неполных резус -
антител происходит агглютинация резус - положительных эритроцитов,
которая обнаруживается после добавления в инкубационную смесь
физиологического раствора.
Реагенты.
1. Стандартные эритроциты группы, совместимой с исследуемой
сывороткой, резус - положительные, не менее чем 3 образца,
содержащие в той или иной комбинации 3 антигена резус: Rho(D),
rh'(C), rh"(E). Если антигены rh'(C) и rh"(E) в эритроцитах не
определились, то количество образцов стандартных резус -
положительных эритроцитов должно быть увеличено до 20.
2. Стандартные эритроциты, резус - отрицательные, 2-3 образца,
группы, совместимой с исследуемой сывороткой.
3. 10% раствор желатины, выпускаемый в ампулах заводом им.
Семашко. Вскрытые ампулы хранят в холодильнике не более 2-3 дней.
Раствор желатины мутный, с хлопьями или не застывающий при
комнатной температуре, употреблять нельзя.
4. 0,85% раствор хлористого натрия (физиологический раствор).
5. 3,8% раствор лимоннокислого натрия.
6. Эритроциты лица, сыворотка которого исследуется - контроль
(не обязательный).
Специальное оборудование.
Водяная баня или термостат на 48 град. С.
Микроскоп.
Лупа с 2-кратным увеличением.
Пробирки, емкостью не менее 10 мл.
Подготовка к определению. Обработка крови для получения
стандартных и контрольных эритроцитов. Кровь берут не более чем за
2 дня до исследования в количестве 1-3 мл без стабилизатора.
Пробирки нумеруют, на них надписывают фамилию, инициалы, группу
крови и резус - принадлежность лица, от которого взята кровь.
Обычно после свертывания крови на дне пробирки остается небольшое
количество эритроцитов, которые применяют для исследования.
Эритроциты берут со дна пробирки; если при этом захватывается
небольшое количество сыворотки, это не влияет на ход реакции.
Можно брать кровь с изотоническим раствором лимоннокислого
натрия. В этом случае эритроциты необходимо отмыть
физиологическим раствором.
Ход определения. Пробирки устанавливают в штатив и нумеруют.
Количество и нумерация пробирок должны соответствовать количеству
образцов эритроцитов, с которыми исследуется сыворотка. В пробирки
согласно нумерации вводят по 0,05 мл (1 капля) стандартных
эритроцитов. Во все пробирки добавляют по 0,1 мл (2 капли) 10%
раствора желатины, предварительно подогретого до 48 град. С (до
разжижения) и встряхивают их. Затем во все пробирки добавляют по
0,1 мл (2 капли) исследуемой сыворотки, пробирки встряхивают для
тщательного перемешивания содержимого и помещают в водяную баню
при 48 град. С на 15 минут или в термостат при 48 град. С - на 45
минут. После инкубации в пробирки наливают по 5-8 мл
физиологического раствора, предварительно подогретого в той же
водяной бане. Содержимое пробирок перемешивают путем
перевертывания и оценивают полученные результаты визуально или
через лупу с 2-кратным увеличением. В неясных случаях жидкость
микроскопируют с малым увеличением без покровного стекла.
Оценка результатов. Результаты оценивают по наличию или
отсутствию агглютинации эритроцитов. Агглютинаты видны в виде
красных комочков на фоне просветленной жидкости. Наличие
агглютинации в пробирках с образцами резус - положительных
эритроцитов и отсутствие ее с резус - отрицательными и
собственными эритроцитами указывает на наличие в исследуемой
сыворотке неполных резус - антител. Отсутствие агглютинации со
всеми образцами эритроцитов указывает на отсутствие неполных резус
- антител.
Агглютинация в пробирках со стандартными резус -
отрицательными или собственными эритроцитами говорит о наличии
антител другой специфичности или о неспецифической реакции. Такой
результат не учитывают, и сыворотку передают для исследования в
специальную лабораторию.
4.1.9. Исследование сыворотки на наличие
неполных резус - антител непрямой пробой Кумбса
Принцип. Неполные резус - антитела, если они есть в
исследуемой сыворотке, взаимодействуют со стандартными резус -
положительными эритроцитами, не вызывая их агглютинации.
Добавление антисыворотки по отношению к человеческому белку
вызывает агглютинацию резус - положительных эритроцитов,
сенсибилизированных резус - антителами.
Реагенты.
1. Сыворотка для пробы Кумбса.
2. Стандартные эритроциты группы, совместимой с исследуемой
сывороткой, резус - положительные, не менее 3 образцов, содержащих
в той или иной комбинации 3 антигена резус: Rho(D), rh'(C),
rh"(E). Если антигены rh'(C) и rh"(E) не определялись, количество
образцов стандартных резус - положительных эритроцитов должно быть
увеличено до 20.
3. Стандартные эритроциты резус - отрицательные (2-3 образца)
группы, совместимой с исследуемой сывороткой.
4. 0,85% раствор хлористого натрия (физиологический раствор).
5. 3,8% раствор лимоннокислого натрия.
6. Эритроциты лица, сыворотка которого исследуется - контроль
(не обязательный). Если исследуют сыворотку крови больного,
эритроциты которого дают положительный результат в прямой пробе
Кумбса, то они не могут служить контролем.
Специальное оборудование.
Термостат на 37 град. С.
Пробирки высотой 4-10 см с внутренним диаметром 0,5-0,8 см.
Белая пластинка со смачиваемой поверхностью.
Подготовка к определению. Обработка крови для получения
стандартных и контрольных эритроцитов. 0,5-1,0 мл крови помещают в
центрифужные пробирки, содержащие 0,25 мл 3,8% раствора
лимоннокислого натрия. Пробирки нумеруют, на них надписывают
фамилию, инициалы, группу крови и резус - принадлежность лица, от
которого взята кровь. Пробирки на 3/4 заполняют физиологическим
раствором, содержимое перемешивают и центрифугируют. Надосадочную
жидкость отбрасывают. Такое отмывание повторяют дважды. После
отмывания на дне пробирки остаются эритроциты, которые применяют
для исследования сыворотки.
Ход определения. Штатив накрывают листом бумаги, накалывают на
нем отверстия, сквозь которые устанавливают пробирки, и нумеруют
их. Количество и нумерация пробирок должны соответствовать
количеству образцов эритроцитов, с которыми исследуется сыворотка.
Номера пробирок должны быть повторены на листе бумаги у каждой
пробирки. Так же надписывают фамилию донора и резус -
принадлежность стандартных эритроцитов, которые будут внесены в
эту пробирку. Во все пробирки вносят по 0,15 мл (3 капли)
исследуемой сыворотки. Со дна каждой пробирки, содержащей отмытые
стандартные эритроциты, очень тонкой пастеровской пипеткой
набирают 0,01 мл (маленькую каплю) эритроцитов и переносят ее в
пробирку с исследуемой сывороткой согласно нумерации пробирок.
Содержимое пробирок тщательно перемешивают путем встряхивания и
помещают в термостат при 37 град. С на 45 минут. После инкубации
пробирки заполняют на 3/4 физиологическим раствором, перемешивают,
центрифугируют и надосадочную жидкость отбрасывают. Такое
отмывание эритроцитов повторяют 3 раза. Затем пробирки ставят в
штатив соответственно их номерам. В каждую пробирку к отмытым
эритроцитам добавляют столько физиологического раствора, сколько
нужно для получения примерно 5% взвеси эритроцитов (обычно 3-5
капель). 0,05 мл взвеси эритроцитов из каждой пробирки переносят
на белую пластинку и к каждой из них прибавляют по 0,05 мл (1
каплю) сыворотки для пробы Кумбса. Капли тщательно перемешивают
стеклянной палочкой и пластинку слегка покачивают.
Оценка результатов. Результат выявляется в виде наличия или
отсутствия агглютинации эритроцитов. Обычно агглютинация
начинается в течение первых 10-30 секунд, но при слабом титре
резус - антител может наступить значительно позже; поэтому
наблюдение следует продолжать в течение 20 минут. При наличии
агглютинации образуются комочки эритроцитов на фоне просветленной
жидкости. При отсутствии агглютинации смесь эритроцитов и
сыворотки остается равномерно окрашенной в красный цвет.
Наличие агглютинации с резус - положительными эритроцитами и
отсутствие ее с резус - отрицательными и собственными эритроцитами
указывает на наличие в сыворотке неполных резус - антител.
Отсутствие агглютинации со всеми образцами эритроцитов указывает
на отсутствие в сыворотке неполных антител. Агглютинация со
стандартными резус - отрицательными или собственными эритроцитами
говорит о наличии антител другой специфичности или о
неспецифической реакции. Такой результат не учитывают и сыворотку
передают на исследование в специальную лабораторию.
4.1.10. Определение титра полных резус - антител
методом агглютинации в солевой среде в пробирках
Принцип. Стандартные резус - положительные эритроциты
агглютинируются в солевой среде исследуемой сывороткой, содержащей
резус - антитела, взятой в разных разведениях, в зависимости от
активности антител в этой сыворотке.
Реагенты.
1. Смесь стандартных резус - положительных эритроцитов от 4-5
лиц.
2. 0,85% раствор хлористого натрия (физиологический раствор).
3. 3,8% раствор лимоннокислого натрия.
Специальное оборудование.
Термостат на 37 град. С.
Пробирки высотой 2-2,5 см с внутренним диаметром 0,5-0,6 см, с
гладким дном сферической формы.
Лупа с 6-8 - кратным увеличением.
Подготовка к определению. Обработка крови для получения
стандартных эритроцитов. 0,5-1,0 мл крови помещают в центрифужные
пробирки, содержащие 0,25 мл 3,8% раствора лимоннокислого натрия.
Пробирки на 3/4 заполняют физиологическим раствором, перемешивают
центрифугируют и жидкость над эритроцитами отбрасывают. Такое
отмывание делают дважды. Можно использовать и те эритроциты,
которые обычно остаются на дне пробирки после свертывания крови,
взятой без стабилизатора, но с обязательным отмыванием
физиологическим раствором, как описано выше. В опыт берут смесь
резус - положительных эритроцитов, взятых в равных количествах от
4-5 лиц. Из смеси эритроцитов готовят 2% взвесь в физиологическом
растворе. Для этого к 2,45 мл (49 капель) физиологического
раствора прибавляют 0,05 мл (1 капля) осадка отмытых эритроцитов.
Ход определения. Штатив накрывают листом белой бумаги, на нем
накалывают отверстия, сквозь которые устанавливают пробирки, по 10
штук на каждую исследуемую сыворотку. Во все пробирки вносят по
0,1 мл (2 капли) физиологического раствора. В первую пробирку с
физиологическим раствором вносят 0,1 мл (2 капли) исследуемой
сыворотки, перемешивают и переносят 0,1 мл (2 капли) смеси во
вторую пробирку, перемешивают, 0,1 мл (2 капли) новой смеси
переносят в третью пробирку и т.д. до последней, десятой,
пробирки, из которой 0,1 мл (2 капли) выливают. В результате в
пробирках получаются разведения сыворотки от 1:2 до 1:1024, что
обозначают на бумаге около пробирок. В каждую пробирку добавляют
по 0,05 мл (1 капля) 2% взвеси стандартных резус - положительных
эритроцитов, перемешивают и помещают в термостат при 37 град. С на
1 час. После инкубации оценивают полученные результаты по форме
осадка эритроцитов на дне пробирки.
Оценка результатов. Результат реакции может быть положительным
(наличие агглютинации) и отрицательным (отсутствие агглютинации).
Последнее разведение сыворотки, в котором наблюдается агглютинация
эритроцитов, принимают за титр выявленных полных резус - антител.
Если агглютинация эритроцитов наблюдается во всех разведениях
сыворотки, следует повторить исследование, продолжив разведение
сыворотки.
4.1.11. Определение титра неполных резус - антител
методом конглютинации с применением желатины.
Принцип. Стандартные резус - положительные эритроциты
агглютинируются в среде с раствором желатины исследуемой
сывороткой, содержащей резус - антитела, взятой в разведениях в
зависимости от активности антител в этой сыворотке, от 4-5 лиц.
Реагенты.
1. Смесь стандартных резус - положительных эритроцитов, взятых
в равных количествах.
2. 10% раствор желатины, выпускаемый в ампулах заводом им.
Семашко. Вскрытые ампулы хранить в холодильнике не более 2-3 дней.
Раствор желатины мутный, с хлопьями или не застывающий при
комнатной температуре употреблять нельзя.
3. 0,85% раствор хлористого натрия (физиологический раствор).
4. 3,8% раствор лимоннокислого натрия.
Специальное оборудование.
Водяная баня или термостат на 48 град. С.
Лупа с 2-кратным увеличением или микроскоп.
Пробирка, объемом не менее 10 мл.
Подготовка к определению. Обработка крови для получения
стандартных эритроцитов. Кровь берут не более чем за 2-3 дня до
исследования в количестве 1 - 3 мл без стабилизатора. Пробирку
надписывают. Для исследования применяют эритроциты, оставшиеся на
дне пробирки после свертывания крови. Эритроциты берут со дна
пробирки. Если при этом захватывается небольшое количество
сыворотки, это не влияет на ход реакции. Можно брать кровь с 3,8%
раствором лимоннокислого натрия. В этом случае эритроциты следует
отмывать физиологическим раствором.
Ход определения. В штатив устанавливают пробирки, по 10 штук
на каждую исследуемую сыворотку. Во все пробирки вносят пипеткой
по 0,1 мл (2 капли) физиологического раствора. В первую пробирку с
физиологическим раствором вносят 0,1 мл (2 капли) исследуемой
сыворотки, перемешивают и переносят 0,1 мл (2 капли) во вторую
пробирку. Из второй пробирки после перемешивания переносят 0,1 мл
(2 капли) в третью и т.д. до последней, 10-й пробирки, из которой
0,1 мл (2 капли) выливают. В результате в пробирках получают
разведения сыворотки от 1:2 до 1:1024, что обозначают на бумаге
около пробирок. Пробирки встряхивают и затем добавляют в них по 2
капли 10% раствора желатины, предварительно подогретого до 48
град. С. (до разжижения). Затем в каждую пробирку добавляют по 1
капле смеси стандартных эритроцитов. Пробирки снова встряхивают и
помещают в водяную баню при 48 град. С на 15 минут или в термостат
при той же температуре на 30 минут. После инкубации в них доливают
по 5-8 мл подогретого физиологического раствора и оценивают
результаты, просматривая пробирки на свет невооруженным глазом,
через лупу или под микроскопом.
Оценка результатов. Результат реакции может быть положительным
(наличие агглютинации) или отрицательным (отсутствие
агглютинации). Последнее разведение сыворотки, в котором
наблюдается агглютинация эритроцитов, принимают за титр выявленных
неполных резус - антител.
Если агглютинация эритроцитов наблюдается во всех разведениях
сыворотки, следует повторить исследование, продолжив разведение
сыворотки.
4.1.12. Определение титра неполных резус - антител
непрямой пробой Кумбса
Принцип. Стандартные резус - положительные эритроциты
агглютинируются при добавлении сыворотки для пробы Кумбса после
предварительной сенсибилизации их исследуемой сывороткой,
содержащей резус - антитела, взятой в разведении в зависимости от
активности неполных антител этой сыворотки.
Реагенты.
1. Сыворотка для пробы Кумбса.
2. Смесь стандартных резус - положительных эритроцитов, взятых
в равных количествах, от 4-5 лиц.
3. 0,85% раствор хлористого натрия (физиологический раствор).
4. 3,8% раствор лимоннокислого натрия.
Специальное оборудование.
Термостат на 37 град. С.
Белые пластинки со смачиваемой поверхностью.
Подготовка к определению. Обработка крови для получения
стандартных эритроцитов. 0,5-1,0 мл крови помещают в центрифужные
пробирки, емкостью не менее 10 мл, содержащие по 0,25 мл
изотонического раствора лимоннокислого натрия. Пробирки на 3/4
заполняют физиологическим раствором, содержимое перемешивают и
центрифугируют. Надосадочную жидкость отбрасывают. Такое отмывание
эритроцитов повторяют дважды. После отмывания на дне пробирки
остаются эритроциты, которые применяют для исследования сыворотки.
Ход определения. Штатив накрывают листом бумаги с наколотыми
отверстиями, сквозь которые устанавливают пробирки, по 10 штук в
ряд на каждую исследуемую сыворотку. Пробирки нумеруют, эти же
номера надписывают на бумаге у каждой пробирки. Во все пробирки
вносят по 0,15 мл (3 капли) физиологического раствора. В первую
пробирку с физиологическим раствором вносят 0,15 мл (3 капли)
исследуемой сыворотки, перемешивают и 0,15 мл (3 капли) переносят
во вторую пробирку, перемешивают. Из второй пробирки 0,15 мл (3
капли) смеси переносят в третью и т.д. до последней, 10-й
пробирки, из которой 0,15 мл (3 капли) выливают. В результате в
пробирках получаются разведения исследуемой сыворотки от 1:2 до
1:1024. Во все пробирки добавляют по 0,01 мл (1 маленькая капля)
смеси стандартных эритроцитов, содержимое пробирок перемешивают и
помещают в термостат при 37 град. С на 45 минут. После инкубации
пробирки на 3/4 заполняют физиологическим раствором, содержимое
пробирок перемешивают и центрифугируют. Надосадочную жидкость
отбрасывают. Такое отмывание эритроцитов делают 3 раза. К отмытым
эритроцитам добавляют столько физиологического раствора, сколько
нужно для получения 5% взвеси эритроцитов (приблизительно 3-5
капель). Из каждой пробирки на пластинку переносят по 0,05 мл (1
капля) 5% взвеси эритроцитов и к каждой капле взвеси эритроцитов
прибавляют по 0,05 мл (1 капля) сыворотки для пробы Кумбса,
которую перемешивают с эритроцитами. Через 5 минут при
периодическом покачивании пластинки оценивают результат.
Оценка результатов. Результат может быть положительным
(наличие агглютинации) или отрицательным (отсутствие
агглютинации). Последнее разведение сыворотки, в котором
наблюдается агглютинация эритроцитов, принимают за титр выявленных
неполных резус - антител.
Если агглютинация наблюдается во всех разведениях сыворотки,
следует повторить исследование, продолжив разведение сыворотки.
4.1.13. Прямая проба Кумбса
Принцип. При наличии на исследуемых эритроцитах фиксированных
in vivo антител происходит их агглютинация сывороткой для пробы
Кумбса, содержащей антитела к человеческому белку.
Реагенты.
1. Сыворотка для пробы Кумбса. Хранят в холодильнике в
замороженном состоянии. Срок годности указан на этикетке.
2. 0,85% раствор хлористого натрия (физиологический раствор).
3. 3,8% раствор лимоннокислого натрия.
Специальное оборудование.
Термостат на 37 град. С.
Белая пластинка со смачиваемой поверхностью.
Подготовка к определению. Обработка исследуемой крови.
0,25-0,5 мл (5-10 капель) крови помещают в центрифужную пробирку,
на 3/4 заполняют ее физиологическим раствором, перемешивают и
ценрифугируют. Надосадочную жидкость отбрасывают, а пробирку вновь
наполняют физиологическим раствором, перемешивают и снова
центрифугируют. Процедуру повторяют. Допускается хранение крови до
отмывания в холодильнике, но не более 2-х дней. В этом случае
кровь берут с 3,8% раствором лимоннокислого натрия (0,25 мл на 0,5
мл крови). После отмывания эритроцитов из них готовят в этой же
пробирке 5% взвесь в физиологическом растворе: смешивают одну
часть эритроцитов с 19-ю частями физиологического раствора.
Ход определения. 0,05 мл (1 капля) 5% взвеси исследуемых
эритроцитов переносят на пластинку и покачивают в течение 3-х
минут. Наступление агглютинации во взвеси эритроцитов до
добавления сыворотки для пробы Кумбса свидетельствует об ауто- или
панагглютинации исследуемой крови. В этом случае следует повторить
все этапы постановки пробы, начиная с отмывания эритроцитов, но
при температуре 37 град. С. Если агглютинация не наступила, к
взвеси исследуемых эритроцитов добавляют 0,05 мл (1 капля)
сыворотки для пробы Кумбса и тщательно перемешивают сухой
стеклянной палочкой. Наблюдение за ними ведут в течение 10 минут
при периодическом покачивании пластинки.
Оценка результатов. Появление агглютинации в смеси исследуемых
эритроцитов и сыворотки для пробы Кумбса расценивают как
положительный результат, отсутствие агглютинации - как
отрицательный результат прямой пробы Кумбса.
4.1.14. Определение титра антител прямой пробой Кумбса
Принцип. Исследуемые эритроциты, сенсибилизированные in vivo
антителами, обрабатывают сывороткой для пробы Кумбса, взятой в
разных разведениях. Степень разведения сыворотки для пробы Кумбса,
в котором наблюдается агглютинация, косвенно указывает на степень
сенсибилизации эритроцитов.
Реагенты.
Те же, что для прямой пробы Кумбса.
Специальное оборудование.
То же, что для прямой пробы Кумбса.
Подготовка к определению. Обработка исследуемой крови. Та же,
что и для прямой пробы Кумбса.
Ход определения. На пластинке готовят двукратные разведения
сыворотки для пробы Кумбса в физиологическом растворе от 1:2 до
1:1024, всего 10 разведений. На пластинке надписывают степень
разведения сывороток, "1:1", "1:4" и т.д. до "1:1024". Затем возле
каждого обозначения наносят по 0,1 мл (2 капли) физиологического
раствора. В физиологический раствор, возле надписи "1:2" вносят
0,1 мл (2 капли) сыворотки для пробы Кумбса, перемешивают той же
пипеткой и переносят 0,1 мл (2 капли) смеси в физиологический
раствор возле надписи "1:4", перемешивают и 0,1 мл (2 капли) новой
смеси переносят в физиологический раствор возле надписи "1:8" и
т.д. Из последней полученной смеси, возле обозначения "1:1024" 0,1
мл (2 капли) удаляют. К каждому разведению сыворотки на пластинке
добавляют по 0,05 мл (1 капля) 5% взвеси исследуемых эритроцитов,
тщательно перемешивают стеклянной палочкой эритроциты с
разведенной сывороткой, начиная с последнего ее разведения
("1:1024") и наблюдают 10 минут, периодически слегка покачивая
пластинку.
Оценка результатов. Последнее разведение сыворотки, в котором
за это время появилась агглютинация эритроцитов, принимают за титр
прямой пробы Кумбса. Если агглютинация эритроцитов наблюдается во
всех разведениях, следует повторить исследование, продолжив
разведение сыворотки. Титр прямой пробы Кумбса зависит от
активности примененного образца сыворотки для пробы Кумбса,
поэтому сравнительное титрование следует производить одной и той
же серией этой сыворотки.
Литература.
1. Материалы по вопросам службы крови. М., 1970.
2. Сборник инструкций по изосерологии. (Утв. МЗ СССР). Сост.
М.А.Умнова. М., 1965.
4.2. ИММУНОДИАГНОСТИКА ПЕРВИЧНЫХ ГЕПАТОМ И ТЕРАТОБЛАСТОМ
4.2.1. Определение альфа - фетопротеина человека
реакцией микропреципитации в агаре
Принцип. Моноспецифическая антисыворотка против альфа -
фетопротеина человека, реагируя в агаре со стандартными альфа -
фетопротеином и с альфа - фетопротеином, содержащимся в сыворотке
крови больного, образует с каждым из них полосы преципитации.
Полосы преципитации, образованные антигенами и антисывороткой к
ним, сливаются, что указывает на серологическое тождество
сравниваемых антигенов.
Реагенты.
1. Агар фирмы "Дифко" или сухой агар - агар.
2. 0,85% раствор хлористого натрия.
3. Иммунодиагностикум для первичного рака печени (ПРП) и
тератобластом (ТБ). Иммунодиагностикум выпускается Институтом
эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи АМН СССР.
Иммунодиагностикум представляет собой лиофильно высушенный
препарат, состоящий из моноспецифической кроличьей антисыворотки
против альфа - фетопротеина человека (АТ) и альфа - фетопротеина
человека (АГ). 1 мл рабочего разведения АТ и 2 мл АГ составляют
рабочую дозу иммунодиагностикума, которая достаточна для
проведения 40-50 исследований.
Специальное оборудование.
Штампы или отдельные пробойники для просечения контуров лунок.
Штамп и специальные стекла для постановки опыта входят в комплект
иммунодиагностикума.
Подставка для стекол, сделанная из плексигласа.
Горизонтальный столик, на котором производится заливка агара.
Уровень.
Вакуум - насос или централизованный вакуум.
Металлическая трубочка, диаметром 0,8-1,5 мм, для отсоса
агаровых пробок.
Пластинки стеклянные для постановки опыта.
Эксикатор.
Трубки стеклянные с равномерно оттянутыми капиллярными
концами.
Колба с носиком для подключения к вакууму.
Ход определения. Постановке основного опыта предшествует
подготовительная работа, состоящая из следующих этапов.
1. Обработка исследуемой сыворотки. Кровь у больного берут из
локтевой вены или из пальца в количестве 1,0-3,0 мл, ставят на 1
час в термостат или на 2 час при комнатной температуре. Затем
сыворотку отделяют от сгустка, ценрифугируют 20 минут при 2.000
об/мин и отсасывают.
2. Приготовление 1% агара. Отвешивают определенное количество
агара "Дифко" и добавляют требуемый объем 0,85% раствора
хлористого натрия.
Если агара фирмы "Дифко" в лаборатории нет, то пользуются
сухим агар - агаром, из которого готовят 2% преципитированный
агар. Для этого 20 г сухого агар - агара заливают 1 л
дистиллированной воды, расплавляют на огне и добавляют 50 мл 10%
раствора хлористого кальция. Выпавший осадок отбрасывают. Затем
производят очистку полученного агара. Для этого преципитированный
агар сначала разогревают и разливают в ванночки слоем толщиной
0,5-1,0 см. Застывший агар затем разрезают на квадраты с длиной
сторон 0,5-1,0 см и промывают проточной водопроводной водой,
которую заменяют 3-4 раза. Агар отжимают от воды в марле,
переносят в колбу, разогревают на кипящей водяной бане и фильтруют
2-3 раза через бумажный фильтр. К готовому агару добавляют равный
объем 1,8% раствора хлористого натрия и раствор мертиолата
(1:10000) и затем разливают его в стерильные колбы по 50-100 мл.
Перед применением агар разогревают на кипящей водяной бане,
охлаждают до температуры 60-70 град. С и заливают на стекло.
Приготовленный подобным образом агар имеет необходимую
концентрацию (1%), достаточную прозрачность, не прорастает в
течение опыта и по своим рабочим свойствам не уступает агару фирмы
"Дифко".
3. Подготовка стекол и заливка агара. Реакцию преципитации в
агаре можно ставить не только на стеклах, входящих в комплект
иммунодиагностикума, но и на самодельных стеклах, которые готовят
следующим образом. Отмытые от эмульсии стекла фотопластинок (9Х12)
делят на 2-3 равные части стеклянными пластинками, шириной 4-5 мм
и толщиной 2 мм. Такие же пластинки применяют в качестве боковых
бортиков. Разделительные и боковые пластинки приклеивают к стеклу
универсальным клеем (N 88). Такие стекла удобно использовать для
одновременного исследования большого числа сывороток больных.
Отмытые и обезжиренные стекла проводят несколько раз над
пламенем газовой горелки. Затем стекла помещают на строго
горизонтальную поверхность (устанавливают по уровню) и в каждый
отсек заливают по 5-6 мл агара. Заливка агара на горизонтальной
поверхности дает возможность всегда получать стандартную толщину
слоя агара, а наличие пластинок и боковых бортиков предохраняет от
подсыхания агара с краев. Сразу же после застывания агара (5-7
минут) стекла помещают во влажную камеру на подставку на 30-40
минут. В качестве влажной камеры можно использовать эксикатор, на
дно которого наливают дистиллированную воду с добавлением
антисептика (тимол или мертиолат). Заметного подсыхания агара в
такой камере не отмечается в течение нескольких суток. При
использовании стандартного стекла из комплекта иммунодиагностикума
необходимость в эксикаторе отпадает.
4. Приготовление лунок. К приготовлению лунок приступают через
30-40 минут после застывания агара во влажной камере. Для
просечения контуров лунок в агаре применяются стандартные штампы.
Контуры лунок просекают штампом вручную. Агар из просеченных лунок
отсасывают с помощью металлической трубки, в качестве которой
могут быть использованы обычные инъекционные иглы с наружным
диаметром от 0,8 до 1,5 мм и срезанным острым концом.
В случаях, когда нет штампов, можно пользоваться отельными
трубками - пробойниками, изготовленными из латуни и нержавеющей
стали, с диаметром 4 мм. Конец трубки затачивают сверлом или
шабером со стороны внутреннего диаметра трубки. Наружная
поверхность трубки должна быть тщательно отшлифована. При этом
необходимо заранее приготовить трафареты штампов. Такие трафареты,
нарисованные на бумаге, подкладывают под стекло с агаром, и по ним
пробойником просекают контуры лунок, из которых потом отсасывают
агаровые пробки. Агаровые пробки отсасывают с помощью вакуумного
или водоструйного насоса. После приготовления лунок стекла сразу
же помещают в эксикатор.
Основной опыт. В стеклянные трубки с оттянутыми концами
набирают необходимые для опыта реагенты:
1. Исследуемые сыворотки больных.
2. АТ - кроличья моноспецифическая антисыворотка против альфа
- фетопротеина человека.
|
