|
Стр. 11
менее чем 1:32.
Оценка результатов. При полном выпадении сенсибилизированного
латекса в виде осадка, состоящего из крупных флоккул, и прозрачной
надосадочной жидкости реакция оценивается как резко положительная.
При положительной реакции надосадочная жидкость слегка мутновата,
осадок состоит из мелких флоккул. При отрицательной - жидкость в
пробирке равномерно мутная, осадка нет. Титр реакции
устанавливается по последнему разведению сыворотки с положительным
результатом. Диагностический титр реакции - 1:8.
Антитела к эхинококковому антигену в сыворотке крови здорового
человека отсутствуют, но возможна неспецифическая агглютинация в
первых 2-3 разведениях в 3-6% случаев от общего числа исследуемых
сывороток (чаще всего это наблюдается при циррозах печени или при
новообразованиях).
Агглютинация может отсутствовать при неплодоносных кистах, при
обызвествлении или гибели эхинококковой кисты и в отдельных
случаях при запущенном осложненном альвеококкозе (желтуха,
кахексия), составляющих в общей сложности до 10-15% от числа
обследованных. Высокие титры реакции (1:32, 1:64) говорят о росте
и плодоносности паразита, а более низкие (1:8, 1:16) - о начале
его гибели и обызвествлении оболочки или о самой ранней стадии
заболевания. После радикальной операции титры реакции снижаются, и
через 1-3 года реакция может стать отрицательной. Сохранение
высоких титров или их подъем говорят о рецидиве заболевания.
Метод II. Реакция латекс - агглютинации с нативным
эхинококковым антигеном
Принцип. Тот же, что и в методе I.
Реагенты.
1. Нативный эхинококковый диагностикум.
а) Нативный антиген. Это - стерильно полученная прозрачная
жидкость из эхинококковых пузырей человека, овец или оленей,
содержащая сколексы. Эхинококковую жидкость проверяют в реакции
латекс - агглютинации на контрольных сыворотках. Пригодной
является эхинококковая жидкость, давшая положительную реакцию с
контрольной гипериммунной агглютинирующей сывороткой кролика или с
сывороткой больного эхинококкозом или альвеококкозом в титрах 1:32
- 1:64 и отрицательную реакцию с контрольной нормальной кроличьей
сывороткой или с сывороткой здорового человека. В замороженном
состоянии при температуре -10-20 град. С эхинококковая жидкость
может сохраняться до 1 года.
б) Рабочий раствор латекса. Полистирольный монодисперсный
технический латекс с диаметром частиц - 0,7-0,85 микрон фильтруют
через обычную фильтровальную бумагу и разводят дистиллированной
водой до конечной концентрации вещества в растворе 0,5%. Годен в
течение 1-2 месяцев при хранении в холодильнике при 4-8 град. С, в
герметически закрытой посуде. Герметически закрытый технический
латекс хранят при комнатной температуре.
Нативный эхинококковый диагностикум получают непосредственно
перед постановкой реакции. Для этого к 10 мл боратно - солевого
буфера приливают 0,1 мл рабочего разведения латекса и 0,5 мл
проверенной эхинококковой жидкости, выдерживают смесь при
комнатной температуре не менее часа и используют в реакции в
качестве антигена.
2. Боратно - солевой буфер, рН - 8,2. Готовят так же, как и
для метода I.
3. Контрольную сыворотку положительную получают от заведомо
больных эхинококкозом или альвеококкозом. При проверке сыворотка
должна давать положительную реакцию в титре 1:32, 1:64.
4. Контрольную сыворотку нормальную получают от здоровых
людей. При проверке сыворотка должна давать отрицательную реакцию.
Кровь для получения контрольных сывороток обрабатывают так же,
как исследуемую кровь.
Обработка исследуемой крови, ход определения, постановка
контролей и оценка результатов - те же, что и в методе I.
4.5.2. Определение титра антител при трихинеллезе
реакцией связывания комплемента на холоду
Принцип. Комплекс антиген - антитело, который образуется при
наличии в крови больного антитрихинеллезных антител, связывает
комплемент. Оставшийся в растворе комплемент оттитровывают
гемолитическим методом. Степень гемолиза сенсибилизированных
эритроцитов прямо пропорциональна количеству комплемента и служит
индикатором наличия или отсутствия в исследуемой сыворотке
антитрихинеллезных антител.
Реагенты.
1. Веронал - мединаловый буфер. Состав буфера: 85,0 г
хлористого натрия, 5,75 г веронала, 3,75 г мединала, 0,22 г CaCl2
х 2H2O, 1,0 г MgCl2 х 6H2O. рН буфера - 7,3-7,5. Приготовление
буфера: 5,75 г веронала растворяют в 500 мл горячей
дистиллированной воды, охлаждают, добавляют другие компоненты и
доводят дистиллированной водой до объема 2.000 мл. Хранят в
холодильнике.
В день постановки опыта готовят рабочий раствор буферной смеси
разведением ее в 5 раз дистиллированной водой. Рабочий раствор
буферной смеси используют для разведения всех ингредиентов реакции
и постановки опыта.
2. Трихинеллезный антиген производства Белорусского научно -
исследовательского института эпидемиологии и микробиологии. В
реакции используют основное разведение - 1:1.000.
3. Комплемент. Используют лиофилизированный комплемент морской
свинки.
4. Гемолитическая сыворотка - инактивированная сыворотка
кролика, иммунизированного эритроцитами барана. Производится
Московским институтом вакцин и сывороток им. Мечникова. Титр
сыворотки указывается на этикетке ампулы. Для опыта сыворотку
берут в тройном титре.
5. Раствор Олсвера. 20,5 г глюкозы, 8,0 г цитрата натрия,
0,552 г лимонной кислоты, 4,2 г хлористого натрия и
дистиллированной воды до 1 литра, рН - 6,1. Стерилизация дробная -
3 дня по 20 минут на кипящей водяной бане. Хранят в холодильнике.
6. Эритроциты барана. Кровь получают у барана путем пункции
яремной вены 1 раз в 10-12 дней в количестве не более 300 мл.
Кровь дефибринируют в стерильной банке со стеклянными бусами,
встряхивая в течение 30 минут, и фильтруют через двойной слой
марли. В таком виде кровь может храниться в холодильнике в течение
3-5 дней. Для сохранения ее на более длительный срок рекомендуется
применять консервирующий раствор Олсвера. Для этого эритроциты
предварительно отмывают 3 раза 5-10 объемами физиологического
раствора и к плотному осадку отмытых эритроцитов добавляют равный
объем раствора Олсвера. Хранят в холодильнике при 3-5 град. С.
Консервированными эритроцитами можно пользоваться через 4 дня
после помещения их в раствор Олсвера. Консервированные эритроциты
годны для употребления в течение двух месяцев.
Перед постановкой реакции свежая дефибринированная кровь или
консервированные эритроциты центрифугируют 5 минут при 2.500
об/мин и жидкость над эритроцитами удаляют. Эритроциты заливают
5-10 объемами буферной смеси и снова центрифугируют. Подобное
отмывание эритроцитов производят 3-4 раза, причем жидкость над
эритроцитами после последнего центрифугирования должна быть
совершенно прозрачной и бесцветной; при наличии гемолиза
эритроциты не пригодны к употреблению. Из плотного осадка
эритроцитов готовят 3% взвесь в буферной смеси в количестве,
необходимом для проведения всего последующего определения.
Правильность приготовления взвеси проверяют по гематокриту или с
помощью ФЭКа. (см. "Определение уровня комплемента в сыворотке
крови путем титрования по 50% гемолизу" - приложение к приказу МЗ
СССР N 290 от 11.IV-72 г.).
Специальное оборудование.
Водяная баня на 56 град. С.
Термостат на 37 град. С.
Микропипетки.
Подготовка к определению.
1. Титрование комплемента. Комплемент титруют перед каждой
постановкой опыта. Исходное разведение 1:20. Каждое титрование
комплемента проводят обязательно в присутствии антигена, взятого в
рабочем разведении. Общий объем реакционной смеси - 1,25 мл.
Титром комплемента является наименьшее его количество, дающее
полный гемолиз. Рабочая доза комплемента в реакции на холоду равна
двойному титру. Титрование комплемента проводят по следующей
схеме.
Схема титрования комплемента в присутствии антигена
-------------------T-------------------------------------------------¬
¦ ¦ Пробирки ¦
+------------------+----T----T----T----T----T----T----T----T---------+
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦Конт- ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦рольные ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +----T----+
¦ Ингредиенты ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦ 7 ¦ 8 ¦ 9 ¦ 10 ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+------------------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+
¦Комплемент (1:20) ¦0,06¦0,08¦0,10¦0,12¦0,14¦0,16¦0,18¦0,20¦- ¦- ¦
¦Буферный раствор ¦0,19¦0,17¦0,15¦0,13¦0,11¦0,09¦0,07¦0,05¦0,50¦0,75¦
¦Антиген (1:1.000) ¦0,25¦0,25¦0,25¦0,25¦0,25¦0,25¦0,25¦0,25¦0,25¦- ¦
+------------------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+
¦ В термостат при 37 град. С на 1 час ¦
+------------------T----T----T----T----T----T----T----T----T----T----+
¦ Гемсистема ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦
+------------------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+
¦ В термостат при 37 град. С на 1 час ¦
L---------------------------------------------------------------------
2. Приготовление гемолитической системы. К 3% взвеси бараньих
эритроцитов приливают при постоянном помешивании равный объем
гемолитической сыворотки, разведенной по утроенному титру.
Полученную смесь переливают в колбу из-под гемолитической
сыворотки (во избежание ее потерь) и помещают в термостат при 37
град. С на 30 минут. Гемсистема, приготовленная для титрования
комплемента, может быть использована для постановки основного
опыта на следующий день при условии хранения ее в холодильнике.
Ход определения. Исследуемую сыворотку, инактивированную при
56 град. С. в течение 30 минут, разливают в пробирки в разведениях
1:5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:160, 1:320 по 0,25 мл. Затем в каждую из
пробирок добавляют по 0,25 мл антигена в исходном разведении.
Схема постановки реакции связывания комплемента на холоду
-------------T------------------------------------T---------------------------¬
¦ ¦ Опытные пробирки ¦ Контрольные ¦
¦ +------------------------------------+----------T----T----T------+
¦Ингредиенты ¦ Разведения исследуемой сыворотки ¦Анти¦Гем-¦Комп- ¦
¦ +----T----T----T----T----T-----T-----T----T-----+гена¦сис-¦лемен-¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦темы¦та ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦1:5 ¦1:10¦1:20¦1:40¦1¦1:160¦1:320¦1:5 ¦1:5 ¦ ¦ ¦ ¦
+------------+----+----+----+----+----+-----+-----+----+-----+----+----+------+
¦Исследуемая ¦0,25¦0,25¦0,25¦0,25¦0,25¦0,25 ¦0,25 ¦0,25¦0,25 ¦- ¦- ¦- ¦
¦сыворотка ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Антиген ¦0,25¦0,25¦0,25¦0,25¦0,25¦0,25 ¦0,25 ¦- ¦- ¦0,25¦- ¦- ¦
+------------+----+----+----+----+----+-----+-----+----+-----+----+----+------+
¦ При комнатной температуре 15-20 минут ¦
+------------T----T----T----T----T----T-----T-----T----T-----T----T----T------+
¦Комплемент ¦0,25¦0,25¦0,25¦0,25¦0,25¦0,25 ¦0,25 ¦0,25¦0,125¦0,25¦- ¦0,25 ¦
¦(раб.разв.) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Буферная ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦смесь ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦0,25¦0,375¦0,25¦0,75¦0,50 ¦
+------------+----+----+----+----+----+-----+-----+----+-----+----+----+------+
¦ В холодильник при 4 град. С на 18-20 часов ¦
+------------T----T----T----T----T----T-----T-----T----T-----T----T----T------+
¦Гемсистема ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦
L------------+----+----+----+----+----+-----+-----+----+-----+----+----+-------
Пробирки оставляют при комнатной температуре на 15-20 минут;
после этого в каждую пробирку добавляют по 0,25 мл комплемента,
разведенного в рабочей дозе. Одновременно с опытными ставят
контрольные пробирки. Штативы с пробирками помещают в холодильник
на 18-20 часов, а затем в термостат на 15 минут, после чего в
каждую из пробирок приливают по 0,5 мл сенсибилизированной
гемолитической системы, также помещенной за 15 минут до этого в
термостат, и пробирки опять помещают в термостат при 37 град. С на
1 час. Если за это время в контрольных пробирках гемолиз не
наступил, время инкубации следует увеличить и оценку результатов
реакции производить после наступления гемолиза в контроле.
Оценка результатов. Результаты реакции учитывают по системе
четырех плюсов. Титром реакции считают максимальное разведение
сыворотки с задержкой гемолиза на 4+ или 3+. Реакцию на 2+ считают
слабо положительной. Реакцию на 1+ или на +/- - отрицательной.
Примечание. Веронал - мединаловый буфер может быть заменен
солевым раствором (хлористого натрия - 8,5 г, сернокислого магния
- 0,1 г, дистиллированной воды - до 1 литра), который готовится в
день постановки реакции и хранению не подлежит.
4.5.3. Определение титра антител при цистицеркозе
реакцией связывания комплемента на холоду
Принцип. Комплекс антиген - антитело, который образуется при
наличии в крови больного антицистицеркозных антител, связывает
комплемент. Оставшийся в растворе комплемент оттитровывают
гемолитическим методом. Степень гемолиза сенсибилизированных
эритроцитов прямо пропорциональна количеству комплемента и служит
индикатором наличия или отсутствия в исследуемой сыворотке
антицистицеркозных антител.
Реагенты.
1. Веронал - мединаловый буфер. Состав буфера: 85,0 г
хлористого натрия, 5,75 г веронала, 3,75 г мединала, 0,22 г CaCl2
х 2H2O, 1,0 г MgCl2 х 6H2O. рН буфера - 7,3-7,5. Приготовление
буфера: 5,75 г веронала растворяют в 500 мл горячей
дистиллированной воды, охлаждают, добавляют другие компоненты и
доводят дистиллированной водой до объема 2.000 мл. Хранят в
холодильнике.
В день постановки опыта готовят рабочий раствор буферной смеси
разведением ее в 5 раз дистиллированной водой. Рабочий раствор
буферной смеси используется для разведения всех ингредиентов
реакции и постановки опыта.
2. Цистицерковый антиген производства Белорусского научно -
исследовательского института эпидемиологии и микробиологии.
3. Комплемент. Применятся лиофилизированный комплемент морской
свинки.
4. Гемолитическая сыворотка - инактивированная сыворотка
кролика, иммунизированного эритроцитами барана. Производится
Московским институтом вакцин и сывороток им. Мечникова. Титр
сыворотки указывается на этикетке ампулы. Для опыта сыворотку
берут в тройном титре.
5. Раствор Олсвера. 20,5 г глюкозы, 8,0 г цитрата натрия,
0,552 г лимонной кислоты, 4,2 г хлористого натрия и
дистиллированной воды до 1 литра, рН - 6,1. Стерилизация дробная -
3 дня по 20 минут на кипящей водяной бане. Хранят в холодильнике.
6. Эритроциты барана. Кровь получают у барана путем пункции
яремной вены 1 раз в 10-12 дней в количестве не более 300 мл.
Кровь дефибринируют в стерильной банке со стеклянными бусами,
встряхивая в течение 30 минут, и фильтруют через двойной слой
марли. В таком виде кровь может храниться в холодильнике в течение
3-5 дней. Для сохранения ее на более длительный срок рекомендуется
применить консервирующий раствор Олсвера. Для этого эритроциты
предварительно отмывают 3 раза 5-10 объемами физиологического
раствора и к плотному осадку отмытых эритроцитов добавляют равный
объем раствора Олсвера. Хранят в холодильнике при 3-5 град. С.
Консервированными эритроцитами можно пользоваться через 4 дня
после помещения их в раствор Олсвера. Консервированные эритроциты
годны для употребления в течение двух месяцев.
Перед постановкой реакции свежую дефибринированную кровь или
консервированные эритроциты центрифугируют 5 минут при 2.500
об/мин и жидкость над эритроцитами удаляют. Эритроциты заливают
5-10 объемами буферной смеси и снова центрифугируют. Подобное
отмывание эритроцитов производят 3-4 раза, причем жидкость над
эритроцитами после последнего центрифугирования должна быть
совершенно прозрачной и бесцветной; при наличии гемолиза
эритроциты не пригодны к употреблению. Из плотного осадка
эритроцитов готовят 3% взвесь в буферной смеси в количестве,
необходимом для проведения всего последующего определения.
Правильность приготовления взвеси проверяют по гематокриту или с
помощью ФЭКа. (см. "Определение уровня комплемента в сыворотке
крови путем титрования по 50% гемолизу" - приложение к приказу МЗ
СССР N 290 от 11.IV-72 г.).
Специальное оборудование.
Водяная баня на 56 град. С.
Термостат на 37 град. С.
Микропипетки.
Подготовка к определению.
1. Титрование комплемента. Комплемент титруют перед каждой
постановкой опыта. Исходное разведение 1:20. Титрование
комплемента проводится в присутствии антигена, взятого в рабочем
разведении. Объем реакционной смеси - 1,25 мл. Титром комплемента
является наименьшее его количество, дающее полный гемолиз. Рабочая
доза комплемента в реакции связывания комплемента на холоду равна
двойному титру (см. схему).
Схема титрования комплемента в присутствии антигена
-------------------T-------------------------------------------------¬
¦ ¦ Пробирки ¦
¦ +----T----T----T----T----T----T----T----T---------+
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦Конт- ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦рольные ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +----T----+
¦ Ингредиенты ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦ 7 ¦ 8 ¦ 9 ¦ 10 ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+------------------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+
¦Комплемент (1:20) ¦0,06¦0,08¦0,10¦0,12¦0,14¦0,16¦0,18¦0,20¦- ¦- ¦
¦Буферный раствор ¦0,19¦0,17¦0,15¦0,13¦0,11¦0,09¦0,07¦0,05¦0,50¦0,75¦
¦Антиген ¦0,25¦0,25¦0,25¦0,25¦0,25¦0,25¦0,25¦0,25¦0,25¦- ¦
+------------------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+
¦ В термостат при 37 град. С на 1 час ¦
+------------------T----T----T----T----T----T----T----T----T----T----+
¦ Гемсистема ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦
+------------------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+
¦ В термостат при 37 град. С на 1 час ¦
L---------------------------------------------------------------------
2. Приготовление гемолитической системы. К 3% взвеси бараньих
эритроцитов приливают при постоянном помешивании равный объем
гемолитической сыворотки, разведенной по утроенному титру.
Полученную смесь переливают в колбу из-под гемолитической
сыворотки (во избежание ее потерь) и помещают в термостат при 37
град. С на 30 минут. Гемсистема, приготовленная для титрования
комплемента, может быть использована на следующий день для
постановки основного опыта при условии ее хранения в холодильнике.
Ход определения. Исследуемую инактивированную сыворотку
разливают в пробирки в различных разведениях (см. схему) в объеме
0,25 мл. Затем в каждую из пробирок добавляют по 0,25 мл антигена
в рабочем разведении. Пробирки оставляют при комнатной температуре
на 15-20 минут и только после этого в каждую пробирку добавляют по
0,25 мл комплемента, разведенного в рабочей дозе. Контрольные
пробирки ставят одновременно с опытными. Штативы с пробирками
помещают в холодильник на 18-20 часов, а затем в термостат на 15
минут, после чего в каждую пробирку приливают по 0,5 мл
сенсибилизированной гемолитической системы, также за 15 минут до
этого помещенной в термостат. Все пробирки опять помещают в
термостат при 37 град. С на 1 час. Если за это время в контрольных
пробирках гемолиз не наступил, время инкубации следует увеличить и
оценку результатов реакции производить после наступления гемолиза
в контроле.
Схема постановки реакции связывания комплемента на холоду
-------------T------------------------------------T---------------------------¬
¦ ¦ Опытные пробирки ¦ Контрольные ¦
¦ +------------------------------------+----------T----T----T------+
¦Ингредиенты ¦ Разведения исследуемой сыворотки ¦Анти¦Гем-¦Комп- ¦
¦ +----T----T----T----T----T-----T-----T----T-----+гена¦сис-¦лемен-¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦темы¦та ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦1:5 ¦1:10¦1:20¦1:40¦1¦1:160¦1:320¦1:5 ¦1:5 ¦ ¦ ¦ ¦
+------------+----+----+----+----+----+-----+-----+----+-----+----+----+------+
¦Исследуемая ¦0,25¦0,25¦0,25¦0,25¦0,25¦0,25 ¦0,25 ¦0,25¦0,25 ¦- ¦- ¦- ¦
¦сыворотка ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Антиген ¦0,25¦0,25¦0,25¦0,25¦0,25¦0,25 ¦0,25 ¦- ¦- ¦0,25¦- ¦- ¦
+------------+----+----+----+----+----+-----+-----+----+-----+----+----+------+
¦ При комнатной температуре 15-20 минут ¦
+------------T----T----T----T----T----T-----T-----T----T-----T----T----T------+
¦Комплемент ¦0,25¦0,25¦0,25¦0,25¦0,25¦0,25 ¦0,25 ¦0,25¦0,125¦0,25¦- ¦0,25 ¦
¦(раб.разв.) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Буферная ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦смесь ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦0,25¦0,375¦0,25¦0,75¦0,50 ¦
+------------+----+----+----+----+----+-----+-----+----+-----+----+----+------+
¦ В холодильник при 4 град. С на 18-20 часов ¦
¦ В термостат при 37 град. С на 15 минут ¦
+------------T----T----T----T----T----T-----T-----T----T-----T----T----T------+
¦Гемсистема ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦
L------------+----+----+----+----+----+-----+-----+----+-----+----+----+-------
Оценка результатов. Результаты реакции учитывают по системе
четырех плюсов. Титром реакции считают максимальное разведение
сыворотки с задержкой гемолиза на 4+ или 3+. Реакцию на 2+ считают
слабо положительной. Реакцию на + или на +/- - отрицательной.
Примечание. Веронал - мединаловый буфер может быть заменен
солевым раствором (хлористого натрия - 8,5 г, сернокислого магния
- 0,1 г, дистиллированной воды - до 1 литра), который готовится в
день постановки реакции и хранению не подлежит.
5. КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ПАРАЗИТОЛОГИЯ
5.1. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА
НА НАЛИЧИЕ ПРОСТЕЙШИХ
5.1.1. Обнаружение простейших кишечника в фекалиях
методом нативного мазка и мазка с раствором Люголя
Принцип. Живые движущиеся простейшие кишечника обнаруживаются
при просматривании эмульсии фекалий в физиологическом растворе под
микроскопом. Окрашенные, но неподвижные простейшие обнаруживаются
в эмульсии фекалий в растворе Люголя при просматривании под
микроскопом.
Реактивы.
1. 0,85% раствор хлористого натрия (физиологический раствор).
2. Раствор Люголя (йодистый калий - 3 г, йод кристаллический -
1,5 г, вода дистиллированная - 100 мл). Стабилен при хранении в
темной посуде при комнатной температуре в течение 1 месяца.
Специальное оборудование.
Микроскоп.
Стекла предметные.
Стекла покровные.
Палочки деревянные - длиной 10-15 см, толщиной и шириной - 2-3
мм. Их можно получить расщеплением деревянных шпателей на 4-5
частей.
Ход обнаружения. На предметное стекло наносят 0,1 мл (2 капли)
физиологического раствора и рядом, на расстоянии 2-3 см, столько
же раствора Люголя. Деревянной палочкой берут частицу фекалий (на
конце палочки) и эмульгируют ее в капле физиологического раствора.
Затем той же палочкой берут другую частицу фекалий и эмульгируют
ее в капле раствора Люголя. Обе капли накрывают покровным стеклом
и просматривают сначала при малом увеличении микроскопа, а затем
при большом, без иммерсии.
Эмульсия фекалий должна быть средней консистенции, т.е. она не
должна быть слишком густой, так как тогда ее трудно просматривать
под микроскопом при большом увеличении. В то же время, порция
фекалий, взятая для приготовления эмульсии, не должна быть слишком
маленькой, так как тогда количество простейших в препарате может
оказаться недостаточным для их обнаружения. Через правильно
приготовленный препарат должен быть хорошо виден печатный шрифт.
Оценка результатов. Просматривают 2-3 препарата, отмечая всех
замеченных простейших. В сомнительных случаях, при получении
отрицательного результата, анализ повторяют - на протяжении 1-2
недель должно быть сделано три анализа. Метод позволяет выявить
наличие как вегетативных, так и цистных стадий простейших
кишечника в материале разного типа. Этим методом, наряду с
непатогенными простейшими, можно выявить возбудителей двух
основных заболеваний кишечника, вызываемых простейшими:
дизентерийную амебу (Entamoeba histolitica) и балантидия
(Balantidium coli), а также условнопатогенную лямблию (Lamblia
intestinalis).
Дизентерийная амеба в фекалиях человека может встречаться в
виде трех форм: вегетативной тканевой, вегетативной просветной и
цистной. Обнаружение вегетативной тканевой формы у обследуемого
позволяет безошибочно поставить диагноз амебиаза. Вегетативные
просветные формы и цисты обычно обнаруживаются у здоровых
носителей, обнаружения их недостаточно для диагностики амебиаза.
Однако они могут встретиться и у больного в период ремиссии.
Тканевая форма в нативном препарате выглядит как активно
подвижная амеба, достигающая в длину 25-40 мкм, передвигающаяся
посредством широких псевдоподий, которые образуются толчкообразным
изливанием цитоплазмы. Цитоплазма - мелкозерниста и не содержит
включений. У части амеб обнаруживают заглоченные эритроциты, что
является важнейшим диагностическим признаком данной формы. В
мазке, окрашенном раствором Люголя, удается различить ядро,
диаметром около 5 мкм, окаймленное по периферии ободком. Маленькая
кариосома расположена в центре ядра. В нативном мазке ядро обычно
не различимо. Просветная форма мельче тканевой, ее длина около 15
мкм. Эритроциты в протоплазме отсутствуют, но имеются иные
включения из кишечного содержимого. Цисты - округлые или (реже)
овальные, диаметром от 11 до 15 мкм. В нативном препарате они
выглядят как светопреломляющие тельца без отчетливо различимых
внутренних деталей. В мазке, окрашенном раствором Люголя, в цисте
удается различить от 1 до 4 ядер (в зависимости от зрелости
цисты), гликогеновую вакуоль и хроматоидные тела.
Балантидий легко узнать в нативном мазке благодаря крупным
размерам и активному движению. Это - организм овальной формы,
достигающий в длину 60-80 мкм, все тело которого покрыто
многочисленными ресничками.
Лямблии у человека присутствуют в виде вегетативных форм,
которые образуют цисты, выделяющиеся с фекалиями. Вегетативные
формы могут быть найдены в содержимом двенадцатиперстной кишки,
полученном при зондировании, или в жидких фекалиях. В нативном
препарате это - активно подвижные простейшие, движение которых
осуществляется посредством 4-х пар жгутов. Вытянутое тело
расширено в передней части, в задней - переходит в заостренный
"хвост". Передняя часть тела уплощена и имеет округлое вдавление -
так называемый присасывательный диск. В мазке, окрашенном
раствором Люголя, у лямблии хорошо различимы два ядра, симметрично
расположенные относительно продольной оси тела в передней его
части. Цисты лямблии - образования овальной формы длиной около
12-13 мкм и шириной около 8 мкм. Характерной особенностью их
является то, что внутреннее тело всегда на некотором протяжении
отходит от оболочки. Циста имеет 2 или 4 ядра, сконцентрированных
у одного из ее полюсов, и продольный пучок жгутов, проходящий
вдоль продольной оси и хорошо различимый на препаратах, окрашенных
раствором Люголя. Обнаружение цист в фекалиях указывает на наличие
в тонком кишечнике пациента вегетативных форм лямблий.
Примечания.
1. Жидкие фекалии для исследования должны быть взяты не более
чем через 30 минут после дефекации, оформленные - не более чем
через 2 часа после дефекации.
2. В фекалиях не должно быть посторонних примесей -
дезинфицирующих агентов, воды, мочи и т.п.
3. Стеклянные палочки для данного метода не пригодны, так как
кусочки слизи, в которых часто находятся паразиты, с них
соскальзывают.
4. Деревянные палочки используются только для одного образца,
а затем сжигаются.
Литература.
Наставление по лечению и профилактике болезней, вызываемых
простейшими кишечника. Утв. МЗ СССР 29.12.1970 г.
5.1.2. Обнаружение простейших кишечника в фекалиях
с применением консервантов
Принцип. Простейшие кишечника фиксируются в фекалиях
консервирующим раствором. Морфологические признаки вегетативных
форм и цист простейших кишечника сохраняются неизменными
длительный срок.
Реактивы.
1. Консервант Барроу:
а) Консервирующий раствор:
Хлористый натрий - 0,7 г
Формалин концентрированный - 5,0 мл
Спирт этиловый 96 град. - 12,5 мл
Фенол кристаллический - 2,0 г
Вода дистиллированная до - 100,0 мл
б) Красящий раствор
0,01% раствор тионина или азура.
Консервантом Барроу пользуются в тех случаях, когда
исследование консервированного материала возможно осуществить в
сроки, не превышающие 1 месяц.
2. Консервант Сафаралиева:
Сернокислый цинк - 1,65 г
Формалин концентрированный - 10,0 мл
Фенол кристаллический - 2,5 г
Уксусная кислота концентрированная - 5,0 мл
Метиленовый синий - 0,2 г
Вода дистиллированная до - 100,0 мл
Консервантом Сафаралиева пользуются в тех случаях, когда
консервированный материал должен храниться до исследования более 1
месяца.
Специальное оборудование.
Микроскоп.
Пенициллиновые флаконы.
Деревянные или стеклянные палочки.
Ход обнаружения. Консервант разливают в пенициллиновые флаконы
примерно до половины их объема. Исследуемый материал от каждого
больного немедленно после взятия переносят во флаконы в
количестве, соответствующем примерно 1/3 объема взятого
консерванта. При помощи палочки готовится эмульсия фекалий. Флакон
закрывают резиновой пробкой, которую закрепляют липкой лентой. На
каждом флаконе должна быть этикетка, содержащая данные об
обследуемом.
Перед исследованием консервированный материал не следует
перемешивать. Каплю придонного осадка пипеткой переносят на
предметное стекло и тщательно растирают стеклянной или деревянной
палочкой до получения эмульсии. Если материал был собран в
консервант Барроу, добавляют каплю красителя. После этого каплю
накрывают покровным стеклом и просматривают под большим
увеличением микроскопа. В отдельных случаях целесообразно
использовать масляную иммерсию.
Оценка результатов. Просматривают 2-3 препарата, отмечая всех
замеченных простейших. Дифференциальную диагностику их следует
проводить по тем же признакам, которые были описаны для мазка с
раствором Люголя. Следует, однако, учитывать, что в отличие от
раствора Люголя, красители, применяемые в консервантах, не
окрашивают гликогена и - напротив - позволяют выявить хроматоидные
тела. Структуры простейших в консервантах окрашиваются красителем
в синий цвет. Внутренняя структура балантидиев в консервированном
материале становится неразличимой, поэтому их определяют по
войлокообразному слою ресничек по периферии клетки.
Примечание.
При отсутствии тионина или азура можно применять 0,01% раствор
метиленового синего.
Литература.
1. Сафаралиев Р.С. - Мед. паразитол. и паризитар. бол., 1963,
3, 321.
2. Burrows P.B. - Amer. Y.Clin. Pathol., 1967,48, 3, 342.
5.1.3. Обнаружение простейших кишечника в фекалиях
методом формалин - эфирного обогащения
Принцип. При формалин - эфирной обработке фекалий происходит
отделение и концентрирование цист простейших кишечника.
Реактивы.
1. Раствор формалина: формалин концентрированный 10 мл,
хлористый натрий 0,85 г и вода дистиллированная до 100 мл.
2. Эфир серный.
3. Раствор Люголя: йодистый калий 3,0 г, йод кристаллический
1,5 г и вода дистиллированная до 100 мл. Стабилен в течение 1
месяца при хранении в темной посуде при комнатной температуре.
Специальное оборудование.
Стекла предметные.
Стекла покровные.
Палочки деревянные, длиной 10-15 см и толщиной 2-3 мм.
Ход обнаружения. В пробирки наливают по 6 мл раствора
формалина. Частицу фекалий, величиной с небольшую горошину,
деревянной палочкой вносят в пробирку и тщательно эмульгируют в
растворе формалина. Затем в пробирку добавляют 2 мл эфира,
закрывают ее резиновой пробкой, энергично встряхивают в течение 1
минуты и центрифугируют 3 минуты при 1500 об/мин. После
центрифугирования между слоями формалина и эфира должен
образоваться слой фекалий, деревянной палочкой осторожно отделяют
его от стенок пробирки и выливают все содержимое пробирки за
исключением придонного осадка. Держа пробирку отверстием вниз,
быстро протирают ватным тампоном ее внутренние стенки, чтобы
удалить возможно большее количество жидкости. Переворачивают
пробирку отверстием вверх, пипеткой забирают оставшуюся жидкость
со дна пробирки, переносят на предметное стекло, добавляют каплю
раствора Люголя, накрывают покровным стеклом и микроскопируют при
малом и среднем увеличении микроскопа. В случае необходимости
можно хранить эмульсию фекалий в формалине в течение 1-2 суток.
Оценка результатов. При просматривании препарата отмечают все
обнаруженные простейшие кишечника. Метод позволяет выявить цистные
формы простейших кишечника.
Литература.
Ritchie L.S. - Bull. U.S. Army. med. dept., 1948, 8, 326.
5.1.4. Обнаружение лейшманий в мазке костного мозга
Принцип. Обнаружение лейшманий в фиксированном и окрашенном
мазке костного мозга.
Реактивы.
1. Метиловый спирт, или абсолютный этиловый спирт, или смесь
Никифорова (смесь равных количеств серного эфира и абсолютного
этилового спирта).
2. Фосфатный буфер рН 6,9-7,1: смешивают 40 мл раствора KH2PO4
(9,078 г сухого вещества KH2PO4 в 1 л раствора) и 60 мл раствора
Na2HPO4 (11,876 г сухого вещества в 1 л раствора).
3. Азур - эозин по Романовскому.
4. Рабочий раствор для окраски по Романовскому. Готовят
непосредственно перед окрашиванием путем разведения азур - эозина
по Романовскому в фосфатном буфере рН 6,9-7,1. Перед употреблением
новой краски всегда необходимо проверить ее качество и подобрать
оптимальные условия для окраски препаратов. Удобнее всего это
сделать на тонких мазках крови человека. Определяют: 1.
пригодность данной серии краски к работе; 2. рабочую концентрацию
краски, т.е. разведение основного раствора краски по Романовскому;
3. продолжительность окраски препарата. В правильно окрашенном
препарате не должно быть видно осадка краски. Эритроциты
приобретают розовато - серый оттенок. Ядра лейкоцитов окрашиваются
в насыщенный красно - фиолетовый цвет. Отчетливо видны
хроматиновые структуры. Цитоплазма клеток приобретает голубой цвет
у лимфоцитов, голубовато - серый - у моноцитов.
Специальное оборудование.
Микроскоп.
Фотокюветы.
Стекла предметные.
Стекло шлифованное.
Ход обнаружения. Приготовление мазка. Материал, полученный при
пункции костного мозга в любом количестве, немедленно после взятия
переносят на предметное стекло и очень осторожно, чтобы не
раздавить и не деформировать клетки, размазывают при помощи
шлифованного стекла тонким слоем. Если пунктат плотный, мазок
можно делать по принципу отпечатков, держа комочек пунктата
пинцетом или иглой, или прикасаясь к нему другим предметным
стеклом. При значительной примеси крови в пунктате из него на
стекле выделяют маленькие беловатые жировые комочки, если они
различимы, и готовят мазки из них.
Фиксация мазка. Приготовленный мазок высушивают на воздухе,
затем фиксируют 30 минут в абсолютном этиловом спирте либо в смеси
Никифорова или 5 минут - в метаноле и снова высушивают на воздухе,
Фиксированные мазки могут храниться несколько дней.
Окраска мазка. Предметные стекла с мазками укладывают на
стеклянные палочки, положенные в фотокювету, мазками кверху. На
всю поверхность мазка наливают разведенную в буфере краску
Романовского (примерно 3-5 мл) и оставляют на 30-50 минут.
Продолжительность окраски зависит от температуры помещения - в
теплом помещении она меньше, в холодном - больше. После окраски
препарат споласкивают дистиллированной или кипяченой водой и
высушивают.
Высушенный мазок просматривают под микроскопом с иммерсионной
системой без покровного стекла.
Оценка результатов. В разгар болезни лейшмании обычно
содержатся в значительном количестве и обнаруживаются легко уже
через несколько минут просмотра; однако, в ранней стадии болезни и
в леченых случаях для обнаружения возбудителя требуется более
длительный просмотр всего мазка (не менее 40 минут).
Лейшмании обнаруживаются в макрофагах или внеклеточно. Они
имеют вид округлых, овальных или рисовидных телец диаметром 3-5
мкм. Цитоплазма окрашена в серовато - голубой цвет, ядро - в
красно - фиолетовый. В цитоплазме имеется кинетопласт - округлое
или палочкообразное образование, окрашивающееся более интенсивно,
чем ядро.
Возбудителем висцерального лейшманиоза является Leishmania
donovani - внутриклеточный паразит, поражающий гистофагоцитную
систему. В СССР распространена средиземноморская форма
висцерального лейшманиоза, которым болеют преимущественно дети
младшего возраста. Встречается в виде спорадических случаев во
всех республиках Закавказья и Средней Азии, а также в Казахстане;
завозные случаи возможны в любом районе СССР. Без лечения
заболевание в большинстве случаев заканчивается летально.
Примечание. За лейшманий иногда ошибочно принимают:
1) кровяные пластинки или "осколки" клеток (комочки
цитоплазмы, содержащие ядерное вещество), встречающиеся в мазках
костного мозга;
2) посторонние микроорганизмы (например, одноклеточные
водоросли), попавшие в мазок во время окраски. В мазке они
окрашиваются более интенсивно, чем лейшмании - темно - синего
цвета цитоплазма и ярко - малинового ядро, кинетопласт отсутствует.
Литература.
1. Кассирский И.А., Алексеев Г.А. Клиническая гематология. М.,
1962.
2. Кассирский И.А., Алексеев Г.А. Болезни крови и кроветворной
системы. М., 1962.
5.1.5. Обнаружение лейшманий
в мазке из кожного инфильтрата
Принцип. Обнаружение лейшманий в фиксированном и окрашенном
мазке содержимого инфильтрата.
Реактивы и специальное оборудование.
Те же, что и в методе обнаружения лейшманий в мазке костного
мозга.
Ход обнаружения. Материал для исследования берут из бугорка
(на ранней стадии развития процесса) или из краевого инфильтрата
язвы (на более поздней стадии), несколько отступя от края язвы.
После очищения ватой со спиртом бугорок или выбранный участок
инфильтрата сдавливают двумя пальцами для обескровливания и, не
ослабляя давления пальцев, концом острого скальпеля (лучше -
глазного) делают поверхностный надрез кожи. В случае появления
крови ее следует удалить марлевым тампоном. Со дна и краев надреза
делают этим же скальпелем соскоб пораженной ткани и быстро
размазывают содержимое соскоба тонким слоем на предметном стекле.
Готовят несколько таких мазков. Мазок высушивают на воздухе,
фиксируют метанолом или смесью Никифорова и окрашивают по
Романовскому.
Оценка результатов. В препарате должны быть хорошо различимы
клетки инфильтрата - макрофаги, эндотелиальные, плазматические,
лимфоидные клетки, фибробласты и небольшая примесь клеток
периферической крови. Наличие в препарате эпителиальных клеток, а
также бесструктурных глыбок, окрашивающихся в равномерно сиреневый
цвет, означает, что соскоб был взят слишком поверхностно и должен
быть повторен. В мазке не должно быть слишком много крови, а также
гноя и бактерий. Лейшмании (Leishmania tropica) обнаруживаются в
макрофагах, а также вне клеток в виде округлых, овальных или
удлиненных телец размером 3-5 мкм. При окраске по Романовскому
цитоплазма лейшманий приобретает светло - голубой или синеватый
цвет, ядро - красно - фиолетовый. Хорошо виден более интенсивно
окрашенный, чем ядро, кинетопласт.
Лейшмании легко обнаруживаются в бугорках и в краевом
инфильтрате язвы на начальных стадиях изъязвления. В гнойном
отделяемом язвы могут быть обнаружены лишь деформированные и
разрушающиеся лейшмании, по которым трудно поставить диагноз. На
стадии заживления в пораженных тканях лейшмании обнаруживаются
редко.
Литература.
1. Кожевников П.В., Добротворская Н.В., Латышев Н.И. Учение о
кожном лейшманиозе. М., 1947.
5.1.6. Обнаружение лейшманий
в соскобе пораженных тканей культуральным методом
Принцип. При посеве соскоба пораженных тканей больного на
определенную питательную среду лейшмании размножаются и могут быть
обнаружены под микроскопом.
Реактивы.
Среда NNN для выращивания лейшманий. Состав среды: агар 14,0
г, хлористый натрий 6,0 г, дефибринированная кровь кролика, взятая
из сердца непосредственно перед приготовлением среды, примерно 150
мл, вода дистиллированная 900 мл.
В дистиллированную воду добавляют хлористый натрий и агар.
Колбу со средой нагревают до полного расплавления агара и
стерилизуют в автоклаве при 1,5 атм. 20-30 минут. В охлажденный до
56 град. С агар добавляют стерильно дефибринированную кровь
кролика, размешивают вращением колбы и разливают по 4 мл стерильно
пипеткой в пробирки. Колба с кровяным агаром во время разлива
находится на водяной бане при 56 град. С. Пробирки со средой
скашивают. После застывания агара их помещают на 1 сутки в
термостат при 37 град. С для контроля стерильности и получения
конденсационной жидкости. Если на дне пробирки образуется
недостаточно конденсационной жидкости, то перед посевом в пробирки
можно добавить стерильно около 1 мл одного из следующих растворов:
0,85% раствора хлористого натрия, 1% раствор пептона, раствора
Хенкса, гидролизата лактальбумина или других питательных растворов
в изотонической концентрации.
Ход обнаружения. При выделении культуры тщательно соблюдают
правила стерильности. Исследуемый участок кожи протирают ватным
тампоном с 70% спиртом. После испарения спирта острым концом
стерильного глазного скальпеля делают надрез бугорка длиной 2-3
мм. Со дна надреза стерильной пастеровской пипеткой делают соскоб
ткани и полученную каплю серозно - кровянистой жидкости переносят
в пробирку со средой NNN. Манипуляцию делают несколько раз,
|
