|
Стр. 7
- фетопротеина человека.
3. АГ - альфа - фетопротеин.
4. 0,85% раствор хлористого натрия.
Трубочки укладывают в определенном порядке на специальной
подставке или на горизонтальной бумаге. Затем из эксикатора
вынимают подготовленное стекло с агаром и вносят в лунки
капиллярами соответствующие реагенты. При заполнении лунок следует
возможно быстрее наливать реагенты в лунки вровень с поверхностью
агара. В центральную лунку заливают АТ, в две периферические,
противоположные друг другу - стандартный АГ, а в оставшиеся 4
лунки - исследуемые сыворотки и 0,85% раствор хлористого натрия
для контроля.
Для уменьшения подсыхания агара делают по краям его
дополнительные лунки, которые заполняют 0,85% раствором хлористого
натрия.
Сразу же после заполнения лунок реагентами стекло помещают в
эксикатор при комнатной температуре.
Оценка результатов. Результаты реакции регистрируются через
24-28 часов. Их оценивают по плюсовой шкале. Реакцию считают
положительной, если линия преципитации иммунодиагностикума
сливается с линией преципитации, образованной антигеном
исследуемой сыворотки и антителами иммунодиагностикума.
В зависимости от места слияния полос реакцию считают:
+ слабо положительной: слияние у лунки с исследуемой
сывороткой (концентрация АФП в сыворотки больного - меньше 50 мкг
на мл).
++ положительной: линии преципитации иммунодиагностикума и
исследуемой сыворотки находятся на одинаковом расстоянии от
центральной лунки (концентрация АФП в сыворотке больного - 50 мкг
на мл).
+++ резко положительной: линия преципитации исследуемой
сыворотки диффузна и сдвинута в сторону центральной лунки, а линия
преципитации иммунодиагностикума резко обрывается (концентрация
АФП в сыворотке больного больше 50 мкг на мл). В этом случае
необходимо поставить повторно опыт с двукратными разведениями
исследуемой сыворотки и установить, во сколько раз в ней больше
альфа - фетопротеина по сравнению со стандартным препаратом.
Реакцию считают отрицательной, если линия преципитации
иммунодиагностикума достигает своими концами лунок с исследуемыми
сыворотками и 0,85% раствором хлористого натрия.
Диагностическими считают все три описанные типа положительных
реакций.
Источники ошибок.
1. Наличие ореола вокруг лунок с исследуемыми сыворотками
может маскировать линии преципитации сывороток со слабо
положительной реакций. Для уменьшения и снятия ореола вокруг лунок
рекомендуется поместить стекло в ванночку с 10-15% раствором
хлористого натрия на 1 час.
2. Изменение концентрации 1% агара при многократном его
нагревании. Поэтому желательно готовить агар только для одного, в
крайнем случае, для нескольких опытов.
3. Подсыхание агара может привести к появлению артефактов, к
размыванию линии преципитации или к ее раздвоению. Для уменьшения
подсыхания агара по краям агаровой пластинки делают дополнительно
лунки, которые заполняют 0,85% раствором хлористого натрия.
Постановка опыта должна занимать не более 10-15-ти минут.
4. Отслойка агара и порча лунок при извлечении агаровых пробок
приводит к искажению формы линии преципитации.
Примечания.
1. АФП обнаруживается в крови больных первичным раком печени,
гепатоцеллюлярной и смешанной формы, в 65-75% случаев, а также в
50% случаев при тератобластомах с элементами эмбрионального рака
или с элементами хориоэпителиомы и семиломы.
2. Холангиомы, опухоли непеченочного происхождения, нераковые
заболевания печени не сопровождаются появлением АФП в крови.
Литература.
1. Абелев Г.И. - Вестник АМН СССР, 1970, 7, 49.
2. Абелев Г.И., Перова С.Д., Храмкова Н.И. и др. - Биохимия,
1963, т. 28, 4, 625.
3. Татаринов Ю.С. - Вопр. мед. химии, 1964, 1, 90.
4. О"Конор Г.Т., Татаринов Ю.С., Абелев Г.И. и Урчель Ж. -
Вестник АМН СССР, 1971, 3, 3.
5. Гусев А.И. - В кн. Иммунохимический анализ, 1968.
4.3. СЕРОДИАГНОСТИКА СИФИЛИСА
Для определения сложных иммунных изменений в организме
больного сифилисом с целью подтверждения диагностики, контроля за
успешностью терапии и определения излеченности в настоящее время
рекомендуются обязательные для применения серологические реакции и
группа специфических серологических реакций на сифилис.
ГРУППА ОБЯЗАТЕЛЬНЫХ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ СЕРОЛОГИЧЕСКИЙ РЕАКЦИЙ:
1. Реакция Вассермана, основанная на феномене связывания
комплемента комплексом липоидный антиген + реагин испытуемой
сыворотки. Индикация образовавшегося комплекса достигается
добавлением гемолитической системы (эритроциты барана +
гемолитическая сыворотка).
2. Модификации реакции Вассермана:
а) количественная методика Боаса с уменьшающимися дозами
испытуемой сыворотки для определения титра реагинов в случае
получения положительных результатов в реакции Вассермана;
б) реакция Григорьева и Раппопорта, основанная на применении в
реакции связывания комплемента естественного комплемента
сыворотки;
в) реакция Вайнштейна и Резниковой, основанная на
использовании естественного комплемента и гемолизина испытуемой
сыворотки.
Реакции Григорьева - Раппопорта и Вайнштейна - Резниковой
рекомендуются для недостаточно оснащенных лабораторий, где
невозможно из-за отсутствия того или иного прибора поставить
классическую реакцию Вассермана.
3. Реакция Колмера, основанная на феномене двухфазного
связывания комплемента: первая фаза - при температуре 18-20 град.
С. в течение 30 минут; вторая фаза - в холодильнике при
температуре 4-6 град. С. в течение 18-20 часов.
Реакция Колмера обладает более выраженной чувствительностью и
рекомендуется в диагностических целях при первичном сифилисе и
скрыто протекающей сифилитической инфекции.
4. Осадочные реакции, основанные на образовании комплекса
липоидный антиген + реагины испытуемой сыворотки, проявляющегося
макрофлокулятом, видимым простым глазом:
а) реакция Кана, основанная на применении антигена Кана;
б) реакция Закс - Витебского (цитохоль), основанная на
применении антигена, приготовленного по методике Закс -
Витебского.
Для постановки стандартных серологических реакций применяются
неспецифические антигены, исходным материалом для приготовления
которых служат органы здоровых животных. Действующим началом этих
антигенов являются фосфатиды, активизированные добавлением
холестерина.
Для диагностики, наблюдения за успешностью
противосифилитической терапии и для определения извлеченности
рекомендуется комплекс стандартных серологических реакций на
сифилис, состоящий из реакций Вассермана с обязательным
применением: 1) кардиолипинового антигена, как самого
чувствительного, 2) трепонемального озвученного или протеиновой
фракции из трепонем, 3) обычного неспецифического и двух осадочных
реакций - реакции Кана и реакции Закс - Витебского (цитохоль). В
отдельных случаях допустима замена реакции Вассермана одной из
активных модификаций.
ГРУППА СПЕЦИФИЧЕСКИХ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ:
Рекомендуется для исследования сывороток: а) для
дифференцирования биологически ложноположительных реакций от
скрыто протекающего сифилиса у лиц с положительными результатами
стандартных серологических реакций и с отсутствием видимых
клинических проявлений сифилиса; б) для подтверждения диагноза у
лиц с клиническими симптомами сифилиса и с отрицательными
результатами стандартных серологических реакций. Для этих целей
рекомендуются следующие специфические серологические реакции.
1. Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИТ), основанная на
феномене потери подвижности бледных трепонем в присутствии
иммобилизинов и активного комплемента.
2. Модификация реакции иммобилизации бледных трепонем.
Меланжерная методика РИТ Н.М.Овчинникова, основанная на
феномене потери подвижности бледных трепонем в присутствии
иммобилизинов испытуемой сыворотки и активного комплемента.
Анаэробные условия опыта создаются помещением реагирующей смеси в
меланжер (лейкоцитарный смеситель), оба конца которого закрыты
резиновым кольцом.
3. Реакция иммунофлуоресценции (РИФ), основанная на феномене
свечения комплекса бледная трепонема + антитело, участвующее в
реакции иммунофлуоресценции, + видовая антисыворотка, меченая
флуорохромом при исследовании препаратов в люминесцентном
микроскопе.
Модификации реакции иммунофлуоресценции:
а) непрямая методика реакции иммунофлуоресценции с разведением
испытуемой сыворотки в 200 раз - РИФ200;
б) реакция иммунофлуоресценции с адсорбцией сыворотки
специальными сорбентами для удаления субстанций, обусловливающих
возможность неспецифического свечения, - РИФадс.
4. Реакция связывания комплемента с трепонемными антигенами,
полученными из культуральных или патогенных бледных трепонем.
Модификации реакции связывания комплемента:
а) реакция связывания комплемента с малыми объемами
ингредиентов;
б) реакция Колмера в 1/5 объема.
Пользование несколькими серологическими реакциями на сифилис
(специфическими и стандартными) обеспечивает более полное
определение различных антител, которые могут иметь место в
испытуемой сыворотке, и тем самым - более точную серодиагностику
сифилиса.
4.3.1. Реакция связывания комплемента комплексом липоидного
антигена и реагина или трепонемального антигена
и антитрепонемных антител исследуемой сыворотки
(реакция Вассермана, качественный метод)
Принцип. Реагины, находящиеся в сыворотке крови больных
сифилисом, обладают свойством вступать в соединение с
неспецифическими и кардиолипиновыми антигенами. Специфические
антитрепонемные антитела вступают в соединение со специфическими
антигенами (озвученными или протеиновой фракцией трепонем).
Образовавшиеся комплексы сорбируют вводимый в реакцию комплемент.
Индикация образовавшихся комплексов достигается введением
гемолитической системы (эритроциты барана + гемолитическая
сыворотка).
Реагенты.
1. 0,85% раствор хлористого натрия х.ч. (физиологический
раствор).
2. Антигены: неспецифический, кардиолипиновый, сохраняются в
темном шкафу при комнатной температуре.
3. Антигены специфические - протеиновая фракция культуральных
трепонем или ультраозвученный трепонемный антиген, сохраняются в
холодильнике при температуре +2-4 град. С.
4. Комплемент. Применяется смесь сывороток крови, полученной
пункцией сердца у 5-10 здоровых морских свинок. При
консервировании 4% борной кислотой и 5% сернокислым натрием
сохраняется в холодильнике 1-2 месяца. Может быть использован
лиофильно высушенный комплемент.
5. Гемолизин. Кроличья гемолитическая сыворотка с разными
титрами, сохраняется в холодильнике.
6. Эритроциты барана. Кровь получают у барана путем пункции
яремной вены. Кровь собирают в стерильную банку со стеклянными
бусами, которую встряхивают 10-15 минут. Фильтрованием через марлю
отделяют образовавшиеся сгустки фибрина. Дефибринированная кровь
барана хранится в холодильнике в течение 3-5 дней. При
необходимости более длительного хранения кровь консервируют.
Приготовление консерванта: на 100 мл физиологического раствора, 6
г глюкозы и 4,5 г борной кислоты, смесь кипятят на водяной бане
три дня по 20 минут. К 100 мл дефибринированной бараньей крови
добавляют 15 мл консерванта. Дефибринированная консервированная и
неконсервированная кровь хранится в холодильнике.
Специальное оборудование.
Термостат с температурой +37 град. С.
Холодильник с температурой +4-6 град. С.
Инактиватор (водяная баня) с температурой +56 град. С.
Центрифуга.
Пробирки размером 15х150 мм.
Пробирки размером 15х100 мм.
Пипетки градуированные 1, 2, 5, 10 мл с делениями 0,01 мл.
Цилиндры градуированные 100 и 500 мл с делениями на 5 мл.
Банки стеклянные 50, 100 и 500 мл.
Ход определения. Постановке основного опыта предшествует
подготовительная работа, состоящая из следующих этапов:
1. Обработка испытуемой сыворотки. Для исследования требуется
4-8 мл крови, которую получают пункцией локтевой вены. Пункция
производится стерильной иглой или иглой, надетой на стерильный
шприц, предварительно промытый физиологическим раствором. У
маленьких детей кровь можно брать из темпоральной вены или из
надреза на пятке. Взятие крови производится натощак (через 5-6
часов после приема пищи). За 3-4 дня необходимо отменить прием
наркотических средств, препаратов наперстянки и др. Не
рекомендуется брать кровь для исследования у лихорадящих больных,
после приема алкоголя, после общего наркоза, после травм и
хирургических вмешательств. Собранную в стерильную пробирку кровь
помещают на 1 час в термостат. Образовавшийся сгусток отделяют
стеклянной палочкой от стенок пробирки, и кровь оставляют в
холодильнике на 20-24 часа. За это время над сгустком образуется
прозрачная сыворотка, которую осторожно сливают или отсасывают при
помощи резинового баллона и пастеровской пипетки в другую пробирку
и инактивируют в водяной бане. Такие сыворотки могут сохраняться в
холодильнике в течение 5-6 дней. При необходимости длительного
хранения сывороток (3-4 недели) их консервируют добавлением сухой
борной кислоты (из расчета получения 2% концентрации). В день
исследования сыворотки подвергают повторному нагреванию в водяной
бане в течение 15 минут. Допускается исследование сыворотки крови,
высушенной следующим образом: на 1 мл сыворотки добавляют 3-4
капли 40% раствора пищевого сахара, перемешивают и отдельными
каплями по 0,5 мл высушивают на вощеной бумаге. Для исследования
сухую сыворотку необходимо растворить в физиологическом растворе в
объеме, равном объему высушенной сыворотки. Перед исследованием
проводят инактивирование в водяной бане в течение 30 минут.
Желтушные, хилезные, резко гемолизированные и проросшие
сыворотки для исследования непригодны.
2. Приготовление раствора антигенов. Антигены разводят
соответственно способу и титру, указанному на этикетке. Титр - это
количество антигена на 1 мл физиологического раствора.
3. Приготовление гемолитической системы. Дефибринированную
баранью кровь или эритроциты барана в объеме, необходимом для
работы в данный день, центрифугируют, плазму осторожно отсасывают
и осадок трижды отмывают 5-6 объемами физиологического раствора.
При последнем промывании надосадочная жидкость должна быть
бесцветной. Из плотного осадка готовят 3% взвесь эритроцитов
барана в физиологическом растворе. Равный объем гемолитической
сыворотки, разведенной в физиологическом растворе по утроенному
титру (например, на этикетке указан титр 1:1500; для разведения
титр будет 1:500, т.е. 0,1 на 50 мл физиологического раствора),
объединяют с 3% взвесью эритроцитов барана. Раствор гемолитической
сыворотки приливают к взвеси эритроцитов барана и производят
быстрое смешивание. Полученную гемолитическую систему выдерживают
в термостате 30 минут.
4. Титрование комплемента. Комплемент морской свинки разводят
1:10 в физиологическом растворе. При работе с сухим комплементом
предварительно необходимо растворить содержимое ампулы в
физиологическом растворе в объеме, равном объему высушенного
комплемента.
Нормальную инактивированную сыворотку человека, отрицательную
в реакции Вассермана и в осадочных реакциях, разводят
физиологическим раствором 1:5.
Титрование комплемента производят в 40 пробирках, поставленных
по 10 штук в четыре ряда: три ряда для титрования комплемента в
присутствии трех антигенов и четвертый ряд для титрования
комплемента в присутствии физиологического раствора. Шесть
контрольных пробирок: три для контроля трех антигенов и по одной -
для контроля комплемента, гемолитической сыворотки и
физиологического раствора на гемотоксичность - заполняют до
объединения раствора гемолитической сыворотки и взвеси бараньих
эритроцитов следующим образом (см. табл. 1).
Таблица 1
ЗАПОЛНЕНИЕ КОНТРОЛЬНЫХ ПРОБИРОК
--------------------------------T--------------------------------¬
¦ ¦ Пробирки ¦
¦ Реактивы +-----T-----T----T----T-----T----+
¦ ¦ I ¦ II ¦III ¦ IV ¦ V ¦ VI ¦
+-------------------------------+-----+-----+----+----+-----+----+
¦2,5% взвесь эритроцитов барана ¦ 0,25¦ 0,25¦0,25¦0,25¦0,25 ¦0,25¦
¦Раствор гемолитической ¦ - ¦ 0,25¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦
¦сыворотки по тройному титру ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Раствор комплемента 1:10 ¦ 0,25¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦
¦Раствор антигена I по титру ¦ - ¦ - ¦ - ¦0,5 ¦ - ¦ - ¦
¦Раствор антигена II по титру ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ 0,5 ¦ - ¦
¦Раствор антигена III по титру ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦0,5 ¦
¦Физиологический раствор ¦ 0,75¦ 0,75¦1,0 ¦0,5 ¦ 0,5 ¦0,5 ¦
L-------------------------------+-----+-----+----+----+-----+-----
После 45 минут пребывания в термостате во всех пробирках
должен отсутствовать гемолиз.
Комплемент, разведенный 1:10, разливают в 10 пробирок
четвертого ряда в дозах, 0,1; 0,2; 0,24; 0,3; 0,36; 0,4; 0,44;
0,5; 0,56; 0,6. Общий объем содержимого пробирок доводят до 1 мл
соответствующими объемами физиологического раствора: 0,9; 0,8;
0,76; 0,7; 0,64; 0,6; 0,56; 0,5; 0,44; 0,4. Полученную в каждой
пробирке смесь переносят по 0,25 в соответствующие пробирки трех
рядов. Нормальную человеческую сыворотку, разведенную
физиологическим раствором 1:5, разливают во все 40 пробирок по
0,25 мл. Антиген I, разведенный по титру физиологическим
раствором, приливают по 0,25 мл в 10 пробирок первого ряда;
антиген II, разведенный по титру физиологическим раствором,
приливают по 0,25 мл в 10 пробирок второго ряда; антиген III,
разведенный по титру физиологическим раствором, приливают по 0,25
мл в 10 пробирок третьего ряда; физиологический раствор приливают
по 0,25 мл в 10 пробирок четвертого ряда. После 45-минутной
инкубации в термостате во все 40 пробирок приливают по 0,5 мл
гемолитической системы. Повторная инкубация в термостате
продолжается 45 минут (см. табл. 2)
Титром комплемента считается его наименьшее количество,
обеспечивающее полный гемолиз бараньих эритроцитов в присутствии
антигена и нормальной человеческой сыворотки. Для основного опыта
необходима рабочая доза комплемента, т.е, надбавка к титру в
пределах 20-30% в зависимости от степени гемолиза в последних
пробирках с меньшим количеством комплемента. Например, полный
гемолиз получен в четвертой пробирке - рабочая доза комплемента
будет равна 3,6%. Готовят необходимый для данного рабочего дня
объем комплемента, разведенного по рабочей дозе, исходя из расчета
1 мл комплемента на каждую испытуемую сыворотку. Например, на 200
испытуемых сывороток необходимо 200 мл комплемента, разведенного
по рабочей дозе. Следовательно, к 192,8 мл физиологического
раствора нужно прибавить 7,2 мл комплемента морских свинок.
5. Основной опыт. Каждую испытуемую инактивированную
сыворотку, разведенную 1:5 физиологическим раствором, исследуют в
4-х пробирках, предварительно разлив в каждую по 0,25 мл. В первую
пробирку приливают 0,25 мл антигена I, разведенного по титру; во
вторую - 0,25 мл антигена II, разведенного по титру; в третью -
0,25 мл антигена III, разведенного по титру; в четвертую
(контрольную) - 0,25 мл физиологического раствора. Комплемент,
разведенный по рабочей дозе, добавляют по 0,25 мл во все опытные и
контрольные пробирки. После первичной 45 - минутной инкубации в
термостате добавляют во все опытные и контрольные пробирки по 0,5
мл гемолитической системы. Легким встряхиванием перемешивают
содержимое пробирок и помещают их в термостат на 45-60 минут (см.
табл. 3). После наступления гемолиза в контрольных пробирках
регистрируют результат реакции по наличию или отсутствию гемолиза
в опытных пробирках.
Оценка результатов. Для обозначения позитивности реакции
Вассермана пользуются системой четырех плюсов: полная задержка
гемолиза - 4+ (резко положительная реакция); значительная задержка
гемолиза - 3+ (положительная реакция); частичная задержка гемолиза
- 2+ (слабо положительная реакция); незначительная задержка
гемолиза - + или +/- (сомнительная реакция).
Источники ошибок.
1. Неправильно выбранная доза комплемента (избыток или
недостаток в опыте).
2. Неправильное хранение испытуемой сыворотки.
3. Длительное хранение испытуемой сыворотки.
Таблица 2
Схема титрования комплемента
--------------------T--------------------------------------------¬
¦ ¦ NN пробирок ¦
¦ Реактивы +---T---T----T---T----T---T----T---T----T----+
¦ ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦ 7 ¦ 8 ¦ 9 ¦10 ¦
+-------------------+---+---+----+---+----+---+----+---+----+----+
¦ Комплемент (1:10)¦0,1¦0,2¦0,24¦0,3¦0,36¦0,4¦0,44¦0,5¦0,56¦0,6 ¦
¦ физиологический ¦0,9¦0,8¦0,76¦0,6¦0,64¦0,6¦0,56¦0,5¦0,44¦0,4 ¦
¦ раствор ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-------------------+---+---+----+---+----+---+----+---+----+----+
¦ После тщательного перемешивания из каждой пробирки переносят¦
¦по 0,25 мл в соответствующие пробирки третьего, второго и¦
¦первого ряда. К оставшимся объемам разведенного комплемента 4-го¦
¦ряда добавляется физиологический раствор (вместо антигена)¦
¦по 0,25 мл во все 10 пробирок. ¦
¦ ¦
¦ Третий ряд, ¦
¦ Антиген III по 0,25 мл во все 10 пробирок. ¦
¦ ¦
¦ Второй ряд ¦
¦ Антиген II по 0,25 мл во все 10 пробирок. ¦
¦ ¦
¦ Первый ряд ¦
¦ Антиген I по 0,25 мл во все 10 пробирок. ¦
¦ ¦
¦ Нормальная человеческая ¦
¦ сыворотка (1:5) по 0,25 мл во все 40 пробирок ¦
¦ Инкубация в термостате 45 минут ¦
¦ ¦
¦ Гемолитическая система по 0,5 мл во все 40 пробирок ¦
¦ Инкубация в термостате 45 минут ¦
L-----------------------------------------------------------------
Таблица 3
СХЕМА ОСНОВНОГО ОПЫТА РЕАКЦИИ ВАССЕРМАНА
----------------------------T------------------------------------¬
¦ Ингредиенты (в мл) ¦ NN пробирок ¦
¦ (общий объем - 1,25 мл) +--------T-----T--------T------------+
¦ ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦4 (контроль)¦
+---------------------------+--------+-----+--------+------------+
¦ Испытуемая сыворотка, ¦ 0,25 ¦0,25 ¦ 0,25 ¦ 0,25 ¦
¦ инактивированная, ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ разведенная 1:5 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ Антиген I, разведенный ¦ 0,25 ¦ - ¦ - ¦ - ¦
¦ по титру ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ Антиген II, разведенный ¦ - ¦0,25 ¦ - ¦ - ¦
¦ по титру ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ Антиген III, разведенный¦ - ¦ - ¦ 0,25 ¦ - ¦
¦ по титру ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ Физиологический раствор ¦ - ¦ - ¦ - ¦ 0,25 ¦
¦ Комплемент, разведенный ¦ 0,25 ¦0,25 ¦ 0,25 ¦ 0,25 ¦
¦ по рабочей дозе ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+---------------------------+--------+-----+--------+------------+
¦ Встряхнуть, в термостат на 45 минут ¦
+---------------------------T--------T-----T--------T------------+
¦ Гемолитическая ¦ 0,5 ¦0,5 ¦ 0,5 ¦ 0,5 ¦
¦ система ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+---------------------------+--------+-----+--------+------------+
¦ Встряхнуть, в термостат на 45-60 минут ¦
¦ (до наступления гемолиза в контрольных пробирках) ¦
L-----------------------------------------------------------------
4.3.2. Реакция связывания комплемента комплексом
липоидного антигена и реагина или трепонемального
антигена и антитрепонемальных антител исследуемой сыворотки
(Количественный метод реакции Вассермана)
Принцип. Определение титра реагинов в положительных сыворотках
путем исследования в реакции связывания комплемента уменьшающихся
объемов сыворотки, разведенной физиологическим раствором.
Реагенты.
физиологический раствор, антигены, комплемент, гемолизин,
эритроциты барана приготовляют и хранят так же, как при постановке
качественной методики реакции Вассермана.
Специальное оборудование.
Центрифуга.
Термостат с температурой +37 град. С.
Холодильник с температурой +4-6 град. С.
Инактиватор (водяная баня) с температурой +56 град. С.
Ход определения. Постановке основного опыта предшествует
подготовительная работа, состоящая из следующих этапов:
1. Подготовка испытуемой сыворотки. Сыворотку, обнаружившую
резко положительные результаты при исследовании в реакции
Вассермана, повторно инактивируют 15 минут при температуре 56
град. С в водяной бане. Если исследуется новая порция той же
сыворотки, инактивирование удлиняется до 30 минут.
2. Разведение антигена, приготовление гемолитической системы
проводится так же, как при постановке качественной методики
реакции Вассермана.
3. Титрование комплемента. Титрование комплемента, контроль
ингредиентов на гемотоксичность и выбор рабочей дозы комплемента
производят так же, как и при постановке качественной реакции
Вассермана.
Основной опыт. Каждая сыворотка исследуется в восьми
пробирках. В первую пробирку наливается 0,8 мл физиологического
раствора, со второй по седьмую пробирку - по 0,25 мл
физиологического раствора. В первую пробирку вносят 0,2 мл
испытуемой сыворотки, содержимое перемешивают, затем 0,25 мл
удаляют, а 0,25 мл переносят во вторую и восьмую пробирки. После
перемешивания переносят 0,25 мл из второй пробирки в третью, из
третьей - в четвертую и так далее до седьмой пробирки, из которой
0,25 мл разведенной сыворотки удаляют. В восьмую пробирку
(контрольную) приливают 0,25 мл физиологического раствора, а во
все остальные пробирки по 0,25 мл антигена, разведенного по титру.
После легкого встряхивания во все пробирки приливают по 0,25 мл
комплемента, разведенного по рабочей дозе. Первичная инкубация в
термостате продолжается 45 минут, после чего во все пробирки
приливают по 0,5 мл гемолитической системы. Встряхнув пробирки, их
помещают в термостат на 45 минут и после наступления полного
гемолиза в восьмой (контрольной) пробирке регистрируют результаты
реакции (см. табл. 4).
Оценка результатов. Титром реагинов исследуемой сыворотки
является наибольшее разведение, давшее полную задержку гемолиза -
4+ или значительную задержку гемолиза - 3+.
Источники ошибок.
1. Неправильный выбор рабочей дозы комплемента (избыток или
недостаток в опыте).
2. Неправильное хранение испытуемой сыворотки.
3. Длительное хранение испытуемой сыворотки.
Таблица 4
Схема основного опыта количественной реакции Вассермана
-----------------T------------------------------------------------¬
¦ Ингредиенты ¦ NN пробирок ¦
¦ (в мл) +-----T-----T-----T-----T-----T-----T-----T------+
¦ ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦ 7 ¦ 8 ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦контр.¦
+----------------+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+------+
¦Физиологический ¦ 0,8 ¦0,25 ¦0,25 ¦0,25 ¦0,25 ¦0,25 ¦0,25 ¦ ¦
¦раствор ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Испытуемая ¦ 0,2 ¦-0,25¦-0,25¦-0,25¦-0,25¦-0,25¦-0,25¦-0,25 ¦
¦сыворотка ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦-0,25¦ ¦
+----------------+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+------+
¦ ¦
¦ После перемешивания из первой пробирки 0,25 удаляют, а 0,25 ¦
¦переносят во вторую и восьмую пробирки и далее последовательно ¦
¦переносят по 0,25 мл из пробирки в пробирку до седьмой, из ¦
¦которой 0,25 мл удаляют. Получается разведение: ¦
¦ 1:5 1:10 1:20 1:40 1 1:160 1:320 1:5 ¦
+----------------T-----T-----T-----T-----T-----T-----T-----T------+
¦Антиген по титру¦ 0,25¦0,25 ¦0,25 ¦0,25 ¦0,25 ¦0,25 ¦0,25 ¦ - ¦
¦Физиологический ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦0,25 ¦
¦раствор ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦комплемент в ¦ 0,25¦0,25 ¦0,25 ¦0,25 ¦0,25 ¦0,25 ¦0,25 ¦0,25 ¦
¦рабочей дозе ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+----------------+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+------+
¦ Встряхнуть, поставить в термостат на 45 минут ¦
+----------------T-----T-----T-----T-----T-----T-----T-----T------+
¦Гемолитическая ¦ 0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦0,5 ¦
¦система ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+----------------+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+------+
¦ Встряхнуть, поставить в термостат до наступления ¦
¦ полного гемолиза в контрольных пробирках ¦
L------------------------------------------------------------------
4.3.3. Реакция связывания комплемента комплексом
липоидного антигена и реагина с использованием
естественного комплемента исследуемой сыворотки
(реакция Григорьева - Раппопорта)
Принцип. Реагины, находящиеся в сыворотке крови больных
сифилисом, обладают свойством вступать в соединение с
кардиолипиновым и неспецифическим антигенами. Образовавшиеся
комплексы сорбируют естественный комплемент испытуемой сыворотки.
Индикация образовавшихся комплексов достигается введением
гемолитической системы (дефибринированная баранья кровь +
гемолитическая сыворотка).
Реагенты.
1. 0,85% раствор хлористого натрия х.ч. (физиологический
раствор).
2. Антигены: обычный неспецифический и кардиолипиновый.
Сохраняются в темном шкафу в пробирках с корковыми пробками.
3. Гемолизин - кроличья гемолитическая сыворотка с разными
титрами. Сохраняется в холодильнике.
4. Дефибринированная кровь барана.
Специальное оборудование.
Центрифуга.
Холодильник с температурой +4-6 град. С.
Термостат с температурой +37 град. С.
Пробирки размером 15х150 мм.
Пробирки размером 15х100 мм.
Пипетки градуированные 1, 2, 5 и 10 мл с делениями 0,01 мл.
Цилиндры градуированные.
Банки стеклянные.
Ход определения.
Постановке основного опыта предшествует подготовительная
работа, состоящая из следующих этапов.
1. Обработка испытуемой сыворотки. Кровь в объеме 4-5 мл,
взятую натощак из локтевой вены, оставляют стоять при комнатной
температуре. Образовавшийся в пробирке сгусток отделяют стеклянной
палочкой от стенки пробирки, образовавшуюся прозрачную сыворотку
осторожно сливают или отсасывают при помощи резинового баллона и
пастеровской пипетки в другую пробирку. В реакции используется
сыворотка не ранее 8 часов и не позже 36 часов после взятия крови.
Высушенные сыворотки для исследования не пригодны.
2. Приготовление растворов антигенов. Антигены разводят
согласно способу и титру, указанным на этикете. Титр - это
количество антигена на 1 мл физиологического раствора.
3. Приготовление гемолитической системы. Гемолитическую
сыворотку разводят по усиленному в 4 раза титру (например, при
титре гемолиза 1:1200, обозначенном на этикетке, пользуются титром
1:300, т.е. 0,1 на 30 мл физиологического раствора). Для получения
взвеси бараньих эритроцитов берут 1 мл дефибринированной крови на
24 мл физиологического раствора. Разведенную гемолитическую
сыворотку и взвесь бараньих эритроцитов объединяют в равных
объемах в количестве, необходимом для данного дня работы.
Разведение гемолитической сыворотки вливают во взвесь бараньих
эритроцитов, быстро перемешивают и оставляют при комнатной
температуре на 20 минут для сенсибилизации. Гемолитическая система
годна в течение 12 часов с момента приготовления.
Основной опыт. Каждую испытуемую активную сыворотку исследуют
в трех пробирках, в которые отмеривают по 0,2 мл. В первую
добавляют 0,3 мл антигена серии I, во вторую - 0,3 мл антигена
серии II; физиологический раствор приливают в первую пробирку в
объеме 0,5 мл, во вторую - 0,5 мл и в третью пробирку - 0,8 мл.
Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и оставляют их при
комнатной температуре (20-22 град. С) на 20-25 минут при
периодическом встряхивании. После первичной инкубации во все
пробирки доливают гемолитическую систему по 1,0 мл и, перемешав
содержимое пробирок встряхиванием, оставляют их при той же
температуре на 25-30 минут до полного гемолиза в контрольных
пробирках (см. табл. 5).
Таблица 5
СХЕМА ОСНОВНОГО ОПЫТА РЕАКЦИИ ГРИГОРЬЕВА - РАППОПОРТА
----------------------------------T------------------------------¬
¦ ¦ NN пробирок ¦
¦ Ингредиенты (в мл) +------T---------T-------------+
¦ ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 (контроль)¦
+---------------------------------+------+---------+-------------+
¦ Испытуемая активная сыворотка ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦
¦ Антиген серии I ¦ 0,3 ¦ - ¦ - ¦
¦ Антиген серии II ¦ - ¦ 0,3 ¦ - ¦
¦ Физиологический раствор ¦ 0,5 ¦ 0,5 ¦ 0,8 ¦
+---------------------------------+------+---------+-------------+
¦ Встряхивание, инкубация при комнатной температуре 20-30 минут¦
+---------------------------------T------T---------T-------------+
¦ Гемолитическая система ¦ 1,0 ¦ 1,0 ¦ 1,0 ¦
+---------------------------------+------+---------+-------------+
¦ Встряхивание, инкубация при комнатной температуре 20-30 минут¦
¦ После полного гемолиза в контрольных пробирках ¦
¦ немедленный учет результатов реакции ¦
L-----------------------------------------------------------------
В случае отсутствия в некоторых сыворотках гемолиза в
контрольных пробирках исследование их повторяют с введением в
каждую пробирку дополнительно к испытуемой сыворотке по 0,2 мл
активной отрицательной сыворотки из этого же опыта. При этом
соответственно уменьшается объем физиологического раствора в
каждой пробирке.
Оценка результатов. Для обозначения позитивности реакции
Григорьева - Раппопорта пользуются системой четырех плюсов: полная
задержка гемолиза - 4+ (резко положительная реакция); значительная
задержка гемолиза - 3+ (положительная реакция); частичная задержка
гемолиза - 2+ (слабо положительная реакция); незначительная
задержка гемолиза - + или +/- (сомнительная реакция).
Источник ошибок. Длительное хранение испытуемой сыворотки.
4.3.4. Реакция связывания комплемента комплексом липоидного
антигена и реагина с использованием естественного
комплемента и гемолизина исследуемой сыворотки
(реакция Вайнштейна - Резниковой)
Принцип. Реагины, находящиеся в сыворотке крови больных
сифилисом, обладают свойством вступать в соединение с
кардиолипиновым и неспецифическим антигенами. Образовавшиеся
комплексы сорбируют естественный комплемент испытуемой сыворотки.
Индикация образовавшихся комплексов достигается введением 1%
дефибринированной бараньей крови; роль гемолитической сыворотки
выполняют естественные гемолизины испытуемой сыворотки.
Реагенты.
1. Физиологический раствор, антигены - обычный неспецифический
и кардиолипиновый.
2. Дефибринированная кровь барана.
Специальное оборудование.
Холодильник с температурой +4-6 град. С.
Ход определения. Постановке основного опыта предшествует
подготовительная работа, состоящая из следующих этапов.
1. Обработка испытуемой сыворотки. Для исследования требуется
4-5 мл крови. Взятую кровь оставляют при комнатной температуре.
Образовавшийся сгусток стеклянной палочкой отделяют от стенок
пробирки, прозрачную сыворотку осторожно сливают или отсасывают
при помощи резинового баллона и пастеровской пипетки в другую
пробирку. В реакции используются сыворотки не ранее 8 и не позже
24 часов после взятия крови. Высушенные сыворотки для исследования
не пригодны.
2. Приготовление растворов антигенов. Антигены разводят в
физиологическом растворе по утроенному титру. Например, на
этикетке указан титр - 0,002; значит, в 1 мл физиологического
раствора необходимо внести 0,006 мл антигена.
3. Приготовление 1% дефибринированной бараньей крови. На 100
мл физиологического раствора берут 1 мл дефибринированной бараньей
крови, готовят объем, необходимый для данного дня работы.
Основной опыт. Каждую испытуемую активную сыворотку исследуют
в трех пробирках, в которые отмеривают ее по 0,2 мл. В первую
пробирку добавляют 0,3 мл антигена серии I, во вторую - 0,3 мл
антигена серии II, в третью - 0,3 мл физиологического раствора.
После 3-минутного встряхивания во все пробирки приливают по 0,75
мл 1% дефибринированной бараньей крови. Содержимое пробирок
перемешивают встряхиванием и оставляют при комнатной температуре
на 45-60 минут. После наступления полного гемолиза в контрольных
пробирках регистрируют результат реакции (см. табл. 6).
В случае отсутствия в некоторых сыворотках гемолиза в
контрольных пробирках исследование их повторяют при введении в
каждую пробирку по 0,1 мл активной отрицательной сыворотки из
этого же опыта (см. табл. 7).
Таблица 6
СХЕМА ОСНОВНОГО ОПЫТА РЕАКЦИИ ВАЙНШТЕЙНА - РЕЗНИКОВОЙ
----------------------------------T------------------------------¬
¦ ¦ NN пробирок ¦
¦ Ингредиенты (в мл) +------T--------T--------------+
¦ ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 (контроль)¦
+---------------------------------+------+--------+--------------+
¦ Испытуемая активная сыворотка ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦
¦ Антиген серии I ¦ 0,3 ¦ - ¦ - ¦
¦ Антиген серии II ¦ - ¦ 0,3 ¦ - ¦
¦ Физиологический раствор ¦ - ¦ - ¦ 0,3 ¦
+---------------------------------+------+--------+--------------+
¦ Встряхивание в течение 3 минут ¦
+---------------------------------T------T--------T--------------+
¦ 1% дефибринированная баранья ¦ 0,75 ¦ 0,75 ¦ 0,75 ¦
¦ кровь ¦ ¦ ¦ ¦
+---------------------------------+------+--------+--------------+
¦ Встряхивание, инкубация при комнатной температуре 45-60 минут¦
¦ После полного гемолиза в контрольных пробирках ¦
¦ немедленный учет результатов реакции ¦
L-----------------------------------------------------------------
Таблица 7
Схема основного опыта реакции Вайнштейна - Резниковой
при исследовании сывороток с недостаточной активностью
естественного комплемента и гемолизина
----------------------------------T------------------------------¬
¦ ¦ NN пробирок ¦
¦ Ингредиенты (в мл) +------T--------T--------------+
¦ ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 (контроль)¦
+---------------------------------+------+--------+--------------+
¦ Испытуемая активная сыворотка ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦
¦ Отрицательная активная сыворотка¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦
¦ Антиген серии I ¦ 0,3 ¦ - ¦ - ¦
¦ Антиген серии II ¦ - ¦ 0,3 ¦ - ¦
¦ Физиологический раствор ¦ - ¦ - ¦ 0,3 ¦
+---------------------------------+------+--------+--------------+
¦ Встряхивание в течение 3 минут ¦
+---------------------------------T------T--------T--------------+
¦ 1% дефибринированная баранья ¦ 0,75 ¦ 0,75 ¦ 0,75 ¦
¦ кровь ¦ ¦ ¦ ¦
+---------------------------------+------+--------+--------------+
¦ Встряхивание, инкубация при комнатной температуре 45-60 минут¦
¦ После полного гемолиза в контрольных пробирках ¦
¦ немедленный учет результатов реакции ¦
L-----------------------------------------------------------------
Оценка результатов. Для обозначения позитивности реакции
Вайнштейна - Резниковой пользуются системой четырех плюсов: полная
задержка гемолиза - 4+ (резко положительная реакция); значительная
задержка гемолиза - 3+ (положительная реакция); частичная задержка
гемолиза - 2+ (слабо положительная реакция); незначительная
задержка гемолиза - + или +/- (сомнительная реакция).
Источник ошибок. Длительное хранение испытуемых сывороток.
4.3.5. Реакция трехфазного связывания комплемента
комплексом липоидного антигена и реагина исследуемой
сыворотки (реакция Колмера, качественный метод)
Принцип. Реагины, находящиеся в сыворотке крови больных
сифилисом, обладают свойством вступать в соединение с
неспецифическим и кардиолипиновым антигенами. Индикация
образовавшихся комплексов достигается введением гемолитической
системы (бараньи эритроциты + гемолитическая сыворотка).
Особенностью данной реакции является трехфазность температурных
режимов, при которых протекает связывание комплемента.
Реагенты.
1. Солевой раствор: хлористый натрий (х.ч.) - 8,5 г,
сернокислый магний (х.ч.) - 0,1 г, дистиллированная вода - 1 л.
2. Антигены: неспецифический и кардиолипиновый. Сохраняют в
темном шкафу в пробирках под корковыми пробками.
3. Комплемент - смесь сывороток крови морских свинок. Может
быть использован лиофильно высушенный или жидкий, консервированный
5 г сернокислого натрия и 4 г борной кислоты на 100 мл. Хранится в
холодильнике.
4. Гемолизин - кроличья гемолитическая сыворотка с разными
титрами. Консервируется нейтральным глицерином, сохраняется в
холодильнике.
5. Эритроциты барана.
Специальное оборудование.
Центрифуга.
Термостат с температурой +37 град. С.
Холодильник с температурой +4 град. С.
Инактиватор (водяная баня) с температурой +56 град. С.
Пробирки: 15х100 мм и 15х150 мм.
Стеклянные банки емкостью 200 и 500 мл.
Пипетки градуированные на 1, 2, 5 и 10 мл.
Цилиндры градуированные на 100 и 500 мл.
Ход определения. Постановке основного опыта предшествует
|
