|
Стр. 15
документах: в лабораторном регистрационном журнале учета
микроскопических исследований и на бланках, на которых результаты
исследования сообщаются в направившее материал лечебное
учреждение.
3.7. Учет результатов микроскопического исследования
при окраске флюорохромными красителями
Мазки, окрашенные флюорохромными красителями, просматривают
под значительно меньшим увеличением (обычно 250x - 630x), чем
увеличение, используемое для просмотра мазков, окрашенных
карболовым фуксином (1000x). В силу этого поле зрения,
просматриваемое под люминесцентным микроскопом, имеет значительно
большую площадь, чем поле зрения светового микроскопа. Таким
образом, в ответе о результатах исследования мазка, окрашенного
флюорохромами, при увеличении в 250 раз будет содержаться
значительно больше бактерий, чем при исследовании этого же
препарата, окрашенного по Ziehl-Neelsen и просмотренного при
увеличении в 1000 раз. Чтобы уменьшить погрешность в ответах при
использовании разных увеличений, предложено при исследовании и
количественной оценке мазков, окрашенных флюорохромами, количество
выявленных кислотоустойчивых бактерий делить на "фактор
увеличения". Такой пересчет позволяет получить примерное
количество микроорганизмов, которое можно увидеть в том же мазке
при увеличении в 1000 раз с окраской по Ziehl-Neelsen (см. таблицу
4).
Таблица 4
СООТНОШЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ В ЗАВИСИМОСТИ
ОТ МЕТОДА ОКРАСКИ И КРАТНОСТИ УВЕЛИЧЕНИЯ
--------------------T---------T----------------------------------¬
¦ Число КУМ при ¦ Ответ ¦ Число КУМ при окраске ¦
¦ окраске по ¦ ¦ флюоресцентными красителями ¦
¦ Ziehl-Neelsen и ¦ +----------------------------------+
¦ увеличении 1000x ¦ ¦ увеличение люминесцентного ¦
¦ ¦ ¦ микроскопа ¦
¦ ¦ +-----------T-----------T----------+
¦ ¦ ¦ 250x ¦ 450x ¦ 630x ¦
+-------------------+---------+-----------+-----------+----------+
¦0 ¦КУМ не ¦0 ¦0 ¦0 ¦
¦ ¦обнаруже-¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦ны ¦ ¦ ¦ ¦
+-------------------+---------+-----------+-----------+----------+
¦1 - 9 в 100 полях ¦Указать ¦Разделить ¦Разделить ¦Разделить ¦
¦зрения 1 ¦точное ¦результат ¦результат ¦результат ¦
¦ ¦число ¦на 10 ¦на 4 ¦на 2 ¦
+-------------------+---------+ ¦ ¦ ¦
¦10 - 99 в 100 полях¦1+ ¦ ¦ ¦ ¦
¦зрения ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-------------------+---------+ ¦ ¦ ¦
¦1 - 10 в 1 поле ¦2+ ¦ ¦ ¦ ¦
¦зрения ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-------------------+---------+ ¦ ¦ ¦
¦> 10 в 1 поле ¦3+ ¦ ¦ ¦ ¦
¦зрения ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
L-------------------+---------+-----------+-----------+-----------
Пересчет результатов микроскопического исследования с
использованием "фактора увеличения" позволяет получать сравнимые в
различных лабораториях результаты независимо от используемого
метода окраски или степени увеличения.
Пример: Предположим, что при увеличении в 450 раз было
выявлено 20 КУМ в 1 поле зрения. Если, в соответствии с таблицей,
это число разделить на "фактор увеличения" 4, соответствующее
число микобактерий, которое можно увидеть при увеличении в 1000
раз, будет 5 микобактерий в 1 поле зрения. Поэтому при выдаче
результата следует указать "2+", а не "3+", как можно было бы
оценить по первой колонке при выявлении 20 КУМ в 1 поле зрения.
Результаты исследования всех мазков должны регистрироваться в
лабораторном журнале, который должен содержать следующую
информацию:
- порядковый лабораторный номер;
- фамилия больного;
- пол;
- возраст;
- адрес больного;
- районный регистрационный номер больного;
- название медицинского учреждения, направившего материал на
исследование;
- номер истории болезни;
- основание для проведения исследования (диагностика или
мониторинг результатов химиотерапии);
- результат микроскопического исследования.
Положительные результаты исследования рекомендуется вписывать
в журнал красными чернилами.
Затем на основании записей в лабораторном журнале необходимо
подготовить индивидуальные ответы для каждого больного, используя
специальные бланки ответов.
Ответ с результатами микроскопического исследования следует
выдавать как можно быстрее, желательно - не позже чем через 24
часа после получения проб.
В бланке ответа на микроскопическое исследование должны
содержаться следующие сведения:
- паспортные данные пациента;
- наименование учреждения исполнителя;
- наименование учреждения отправителя;
- материал;
- использованный метод окраски и микроскопии;
- среднее количество кислотоустойчивых микобактерий в мазке;
- выявление больших скоплений микроорганизмов, что может
свидетельствовать о гораздо большем количестве бактерий, чем
указано в заключении;
- дата исследования и фамилия сотрудника, проводившего анализ.
Результат следует отправлять в медицинское учреждение,
приславшее пробы.
НИКОГДА НЕ ОГРАНИЧИВАЙТЕСЬ ВЫДАЧЕЙ РЕЗУЛЬТАТА ПАЦИЕНТУ!
3.8. Контроль качества микроскопических исследований
для выявления кислотоустойчивых микобактерий
Целью введения контроля качества является обеспечение условий
проведения исследований, при которых достигается чувствительность
и специфичность метода, заложенные в его характеристику.
Контроль качества лабораторных исследований осуществляется в
нескольких формах:
- внутрилабораторный контроль качества выполняемых
исследований;
- внешний контроль качества микроскопических и культуральных
лабораторных исследований, включающий:
заочную оценку качества с использованием аттестованных
контрольных образцов;
повторный анализ клинических образцов и препаратов в
лабораториях более высокого уровня;
инспекционный контроль, осуществляемый в рамках лицензирования
и аккредитации, в том числе кураторские визиты.
3.8.1. Внутрилабораторное обеспечение качества
микроскопических исследований
Важным элементом обеспечения качества выполняемых исследований
является регулярное осуществление внутрилабораторного контроля
качества микроскопических исследований, который позволяет
осуществлять эффективное и систематическое наблюдение за
проводимой в лаборатории работой.
Контроль качества осуществляется на всех технологических
этапах микроскопического исследования:
- оценки качества поступающих проб;
- контроля за соблюдением рецептуры и методики приготовления
реагентов и красителей;
- правил и сроков хранения реагентов и красителей;
- наблюдения за неукоснительным соблюдением методических
приемов при:
приготовлении мазков (включая качество предметных стекол);
окраске мазков;
проведении микроскопического исследования;
- регулярного контроля качества используемых химических
реактивов и сроков хранения, исправности оборудования;
- периодического контроля результатов бактериоскопии;
- проверки правильности учета и регистрации результатов.
Кроме того, элементом внутрилабораторного контроля качества
является проверка правильности:
- организации рабочих мест (приема и регистрации материала,
приготовления и окраски мазков, микроскопирования);
- настройки оборудования;
- микроскопирования положительных и отрицательных контрольных
образцов;
- своевременности и точности передачи результатов в
учреждение, направившее материал для исследования.
Успех применения контроля качества обеспечивается:
- регулярным его применением в лабораторном подразделении;
- правильно обученными, заинтересованными и ответственными
работниками;
- рациональным применением регламентированных методов;
- анализом допущенных ошибок и немедленным их исправлением.
Одной из форм обеспечения качества бактериоскопических
исследований является использование в ряду клинических мазков двух
дополнительных неокрашенных контрольных мазков, один из которых
заведомо является положительным, а второй - отрицательным мазком.
Просмотр мазков начинают с контрольных, затем просматривают
клинические мазки.
Необходимо еженедельно и ежемесячно обобщать и анализировать
полученные данные для определения процента положительных
результатов и, по возможности, определять причины любых резких
отклонений от средних показателей. При получении в процессе
микроскопии подряд нескольких положительных результатов необходимо
внимательно проанализировать причины этого.
ЗА ОБЕСПЕЧЕНИЕ КАЧЕСТВА ИССЛЕДОВАНИЙ НЕСУТ ОТВЕТСТВЕННОСТЬ ВСЕ
СОТРУДНИКИ ЛАБОРАТОРИИ.
3.8.2. Внешняя оценка качества микроскопических исследований с
использованием контрольных образцов
На территории Российской Федерации функционирует Федеральная
система внешней оценки качества (ФСВОК) клинических лабораторных
исследований, которая контролирует клинико-диагностические и
бактериологические лаборатории путем заочной оценки качества с
использованием контрольных образцов совместно с Федеральной и
региональными референс-лабораториями противотуберкулезной службы
МЗ РФ.
Деятельность системы основана на регулярной проверке
правильности выполняемых лабораторией исследований и
предоставлении информации о результатах оценки их качества.
Участие в ФСВОК является одним из основных и обязательных видов
деятельности клинико-диагностических и бактериологических
лабораторий по обеспечению требуемого качества выполняемых
исследований.
Внешняя оценка качества клинических лабораторных исследований
позволяет своевременно выявить недостатки в работе
клинико-диагностических подразделений, оказать
организационно-методическую и консультативную помощь участвующим в
ФСВОК лабораториям, выработать адекватные рекомендации по
устранению обнаруживаемых ошибок и совершенствованию используемых
методик.
Внешнюю оценку качества микроскопических исследований для
выявления кислотоустойчивых микобактерий осуществляют совместно с
Центром внешнего контроля качества клинических лабораторных
исследований МЗ РФ Федеральная и региональные референс-лаборатории
противотуберкулезной службы.
3.8.3. Повторный анализ клинических образцов и препаратов в
лабораториях более высокого уровня
Определенная доля исследованных и сохраненных мазков
подвергается повторному анализу в курирующих лабораториях по
установленным правилам.
Лаборатория должна соблюдать правильность хранения препаратов,
обеспечивая их целостность и исходное качество, при котором
получен результат. Препараты должны сопровождаться
соответствующими документами. Обычно реанализу подвергают все
положительные мазки и каждый десятый отрицательный.
3.8.4. Инспекционный контроль качества микроскопических
исследований
Инспекционный контроль (кураторские визиты) осуществляется с
целью проведения текущей оценки основных показателей работы
лабораторий и проверки достоверности получаемых в них результатов
микроскопических исследований путем очной проверки деятельности
лабораторий при их посещении представителями лицензирующего органа
и курирующей лаборатории.
Кураторские визиты являются наиболее эффективными методами
оперативного контроля качества лабораторной диагностики. План
проведения кураторских визитов и основные разделы работы
лаборатории, подлежащие проверке, определяются заранее.
3.9. Организация и управление работой лаборатории.
Общие правила безопасности при организации исследований
В связи с высокой трансмиссивностью микобактерий туберкулеза
и, как следствие, с высоким риском заболевания среди сотрудников
микробиологических подразделений устройство лаборатории,
расположение и организация рабочих мест должны предотвращать как
развитие внутрибольничной туберкулезной инфекции, так и
контаминацию рабочих мест, а также обеспечивать необходимые меры
биологической безопасности при работе персонала с возбудителем
туберкулеза, исключения физических и химических рисков при работе
в лаборатории.
Необходимые мероприятия должны включать (см. раздел 3
настоящей Инструкции):
а) административные меры, предотвращающие распространение
инфекционных аэрозолей из загрязненных зон в неинфицированные
помещения лаборатории и лечебного учреждения в целом;
б) инженерные (проектные и технические) мероприятия,
направленные на снижение концентрации инфекционных аэрозолей в
воздухе (принудительная вентиляция, использование
специализированных устройств обеззараживания воздуха);
в) меры персональной защиты персонала (защитные маски,
респираторы, одежда, перчатки).
Во время работы двери в лабораторию должны быть закрыты.
Расположение рабочих зон, оборудования и реагентов должно быть
постоянным и логичным - в соответствии с последовательностью
выполнения работы и соблюдением эпидемиологической цепочки.
Рабочие помещения должны содержаться в чистоте и обеззараживаться
бактерицидными лампами (не менее 40 минут перед началом работы и в
конце рабочего дня). Столы должны протираться раствором
соответствующего дезинфицирующего средства (например, 5% раствором
хлорамина) <*> два раза в день - перед началом работы и после ее
окончания. Эффективность ультрафиолетовых облучателей зависит от
влажности и степени загрязненности воздуха и рабочих поверхностей,
что необходимо учитывать при проведении санитарных гигиенических
мероприятий в лаборатории.
--------------------------------
<*> Дезинфицирующие средства, используемые в лабораториях в
противотуберкулезных целях, содержат фенолы, гипохлориты, спирт,
формальдегиды, йодофоры и глутаральдегиды. Тип дезинфицирующего
вещества зависит от материала, подлежащего дезинфекции. Не следует
пользоваться ароматизированными "антисептиками". Неверно
распространенное мнение о том, что дезинфицирующие средства,
эффективные против различных видов микроорганизмов, столь же
эффективны и против микобактерий. Целый ряд распространенных
дезинфектантов обладают незначительной или не обладают вовсе
микобактерицидной активностью, а средства на основе четвертичного
аммония неэффективны в рекомендуемых концентрациях. Перекиси
водорода в низких концентрациях (менее 3% также мало эффективны в
отношении микобактерий туберкулеза).
Помещения лаборатории должны быть удобными в расположении, не
иметь порогов и функционально пригодными для предназначенных
работ.
У каждого рабочего места должны быть вывешены методические
инструкции по проведению выполняемых на этом месте рабочих
процедур. Все манипуляции на каждом рабочем месте должны
выполняться в строгом соответствии с инструкцией. Любые изменения
вносятся в эти документы только по указанию заведующего
лабораторией и должны быть завизированы его подписью с указанием
даты изменения методики.
Все документы должны храниться в течение 2 лет.
В работе должны использоваться методы лабораторных
исследований, которые регламентированы в нормативных документах и
зарегистрированы в реестре Минздрава РФ.
Лабораторное оборудование
Оборудование должно полностью удовлетворять стандартным
требованиям и спецификациям.
Технические паспорта всего оборудования и инструкции по
применению оборудования и уходу за ним необходимо хранить в
специальной папке.
Для обеспечения точности и правильности работы оборудование
должно регулярно проверяться специалистом соответствующего
профиля.
Для регистрации профилактических осмотров всего оборудования
следует иметь отдельный журнал.
В случае возникновения неисправности в работе того или иного
прибора работа на нем немедленно прекращается. И прибор
консервируется до прихода специалиста по ремонту и эксплуатации
данного прибора.
Правила хранения и эксплуатации микроскопов
Срок службы микроскопа рассчитан на 10 лет с учетом
естественного старения. Микроскоп является точным и дорогостоящим
прибором, поэтому требует очень бережного обращения как с
механической его частью, так и с оптикой. При этом вовсе не
обязательно знать устройство и работу микроскопа в деталях - этим
должны заниматься профессионалы. Однако иметь представление о
правилах настройки и работы с микроскопом и хранении необходимо
работникам лаборатории.
Технические правила эксплуатации прилагаются к микроскопу.
Если микроскоп временно не используется, его следует хранить в
футляре или накрывать пластиковым чехлом.
Повышенная влажность воздуха помещения может способствовать
размножению на линзах плесневых грибов и появлению ржавчины на
металлических частях прибора. Для снижения влажности воздуха в
футляр микроскопа следует поместить чашку Петри с цветным
силикагелем (имеет голубой цвет). Когда силикагель насытится
влагой, его цвет изменится с голубого на розовый. В таком случае
силикагель можно заменить новым или дегидратировать его в
сухожаровом шкафу. После восстановления первоначального цвета
силикагель можно использовать повторно.
Для удаления налета плесневых грибов с линз объектива
используется тампон, смоченный в растворе противогрибкового
препарата. При необходимости такую обработку можно повторить, а
затем насухо протереть линзы специальной мягкой тканью. Линзы
окуляров не протирают растворителями.
Нельзя хранить микроскоп поблизости от химических реактивов и
кислот, а также в помещениях или местах с высокой влажностью.
При переноске микроскопа следует держать его двумя руками - за
штатив и за основание. Нельзя переносить микроскоп, держа его
только одной рукой. Следует избегать необоснованно частых
передвижений микроскопа.
Микроскоп следует устанавливать на прочной ровной поверхности.
В непосредственной близости от него нельзя устанавливать
оборудование, вызывающее вибрацию (например, центрифуги).
Если микроскоп используется каждый день, желательно держать
его на одном постоянном месте, накрывая после работы
полиэтиленовым или пластиковым чехлом.
На линзах микроскопа от грязи или песчинок могут появиться
царапины. Объективы и окуляры протираются только специальной
мягкой тканью для линз или безворсовыми салфеткой или тампоном.
Не следует допускать попадания иммерсионного масла на
предметный столик микроскопа. Во избежание контаминации мазков в
процессе микроскопического исследования и получения
ложноположительных результатов после просмотра каждого очередного
препарата следует тщательно вытирать объектив от иммерсионного
масла.
Необходимо следить, чтобы иммерсионное масло не попадало на
неиспользуемые объективы, находящиеся в револьвере микроскопа. При
случайном загрязнении необходимо сразу же тщательно их вытереть.
Нельзя разбирать микроскоп; в случае появления какой-либо
неисправности ремонт должен производиться только специалистом.
Для сохранения микроскопа в рабочем состоянии необходимо
соблюдать следующие правила:
После использования в течение рабочего дня необходимо:
- проверить фиксацию объективов в револьверном устройстве;
- удалить с помощью ксилола, спирто-эфирной смеси или 70-
спирта масло с объектива, конденсора и предметного столика;
- несколько приподнять предметный столик, не допуская
соприкосновения с ним объективов, но в то же время и не оставляя
их на длительное время в верхнем положении;
- установить регулятор напряжения на минимальное значение;
- выключить источник света;
- накрыть микроскоп чехлом.
Так как основными загрязнителями оптической системы
микроскопов и наиболее частой причиной их выхода из строя являются
пыль и грибы, во внерабочем состоянии микроскоп всегда должен быть
накрыт чехлом и храниться в сухом помещении.
Для сохранности иммерсионных объективов следует обратить
особое внимание на правильное выполнение их очистки от остатков
иммерсионного масла. Очистку объектива рекомендуется производить
следующим образом:
- вывинтить объектив из револьверного устройства или
установить его в положение, удобное для чистки;
- сухой салфеткой одним движением руки снять иммерсионное
масло с передней линзы объектива;
- смочить другую салфетку в смеси спирта и эфира с таким
расчетом, чтобы она была слегка увлажненной;
- аккуратно протереть линзу объектива; при сильном загрязнении
операцию можно повторить, используя чистый вновь смоченный тампон;
- по окончании очистки линзу протирают сухим тампоном.
Операции очистки следует проводить очень аккуратно и
осторожно; необходимо следить за степенью увлажненности салфетки;
она должна быть слегка увлажнена растворителем.
Ежемесячно необходимо:
- удалить пыль с корпуса микроскопа специальной щеткой с
подачей воздуха (простое устройство может быть сделано из
пастеровской пипетки и прикрепленной к ней резиновой груши);
- очистить объективы, окуляры и конденсоры тампоном или
кусочком специальной ткани, смоченной ксилолом, спирто-эфирной
смесью или спиртом;
- снять с предметного столика препаратоводитель предметных
стекол и очистить его;
- протереть влажной тканью отверстие источника света в
основании микроскопа.
Через каждые 6 месяцев микроскоп должен подвергаться
профилактическому осмотру, чистке и смазке, которые проводятся
специалистом.
Исследуемый материал и бланки исследований
Микроскопическое исследование производится только при наличии
письменного направления на исследование от уполномоченных лиц.
По устной просьбе, не подтвержденной получением
соответствующих документов, исследования не проводятся.
Бланки направлений на исследование хранятся отдельно от
полученного материала. Загрязненные бланки перед регистрацией в
лабораторном журнале стерилизуются в сухожаровом шкафу или (при
отсутствии шкафа) проглаживаются горячим утюгом.
Бланки направлений должны быть правильно оформлены, а каждая
полученная проба диагностического материала правильно
промаркирована. Не следует производить исследование безымянных
проб или проб с неправильно оформленными направлениями.
При регистрации необходимо оценить качество пробы, чтобы
отобрать и отделить пробы, содержащие слюну. Ответ может быть
сформулирован следующим образом: "Поступившая проба похожа на
слюну. Рекомендуется повторить сбор мокроты". Диагностический
материал в виде слюны может быть исследован только при прямом
назначении врача в исключительных случаях, когда другой
диагностический материал не может быть собран.
Для сокращения затрат времени на оформление ответов можно
использовать резиновые штампы со стандартными формулировками.
Протекшие или поврежденные флаконы с материалом следует
немедленно удалить, подвергнуть автоклавированию и запросить новую
(повторную) пробу.
На бланке направления на исследование необходимо отметить
время доставки материала в лабораторию и фиксировать любые
задержки в поступлении проб, что имеет особое значение при
отрицательных результатах.
Следует указывать примерный объем полученной для исследования
пробы мокроты.
Реактивы и красители
Все флаконы с реактивами и красителями заводского производства
должны иметь отметку о дате получения и вскрытия заводской
упаковки. Любые некачественные материалы следует специально
помечать и немедленно удалять из лаборатории.
В лаборатории или на складе следует иметь запас реактивов и
расходных материалов на 6 месяцев работы.
Необходимо регулярно контролировать сроки годности препаратов
и реактивов и обновлять запасы, чтобы не было материалов с
истекшим сроком хранения.
Окрашивание и исследование мазка
При окраске мазков не следует помещать на штатив ("рельсы") и
окрашивать одновременно более 12 стекол. Соприкосновение стекол
боковыми краями может привести к переносу краски и микобактерий с
одного стекла на соседние.
В процессе окраски мазков при их промывании проточной водой не
следует пользоваться резиновыми трубками или наконечниками для
направления струи воды на препарат. В окружающей среде и
водопроводной воде содержится значительное количество
кислотоустойчивых сапрофитов, которые легко размножаются на
резиновых поверхностях в условиях повышенной влажности. Во время
промывания мазков при прохождении струи воды через загрязненные
микобактериями резиновые трубки или наконечники микобактерии могут
попасть на препарат и обусловить ложноположительный результат
анализа.
В число исследуемых мазков, подлежащих окрашиванию, необходимо
ежедневно включать контрольные неокрашенные положительный и
отрицательный препараты. Вначале микроскопируют контрольные мазки,
а затем - мазки от больных.
Окрашенные для исследования мазки непригодны, если:
При окраске карболовым фуксином:
- в положительном контрольном мазке микобактерии не окрашены в
красный цвет;
- в отрицательном контрольном мазке после обесцвечивания видны
красные клетки;
- не произошло достаточного обесцвечивания фона.
При окраске флюорохромными красителями:
- отрицательные контрольные мазки дают флюоресцирующее
свечение;
- в положительных контрольных мазках не обнаруживаются
светящиеся микобактерии или они дают тусклую флюоресценцию;
- фон недостаточно обесцветился или имеет флюоресцентное
свечение.
По окончании микроскопического исследования необходимо:
- с помощью ксилола, спирт-эфирной смеси или спирта удалить с
препарата иммерсионное масло и поместить препараты в отдельные
коробки, где они сохраняются для последующего проведения внешнего
контроля качества или перепроверки результата микроскопии;
- не следует очищать стекло слишком энергично, чтобы не
повредить препарат и не удалить с него краску;
- все положительные и отрицательные мазки необходимо
укладывать в отдельные коробки для сохранения в том порядке, в
котором проводилось исследование, чтобы в дальнейшем можно было
провести внешний контроль качества в соответствии с установленным
порядком.
Выдача ответов и администрирование
Результаты микроскопического исследования следует передавать в
медицинское учреждение или непосредственно врачу, направившему
материал на исследование.
Результаты бактериоскопии следует отсылать как можно быстрее -
желательно в течение 24 часов с момента получения проб мокроты.
Необходимо еженедельно и ежемесячно обобщать и анализировать
полученные данные для ведения статистики исследований.
IV. КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
МИКОБАКТЕРИЙ КОМПЛЕКСА М.TUBERCULOSIS
Поступивший в лабораторию материал перед обработкой и посевом
должен быть зарегистрирован в лабораторном регистрационном
журнале. Каждой пробе материала необходимо присвоить порядковый
регистрационный лабораторный номер, который должен использоваться
при всех последующих лабораторных исследованиях.
4.1. Принципы предпосевной обработки
диагностического материала
Обычные микробиологические методики для выделения чистых
культур возбудителей не могут быть использованы при проведении
бактериологических исследований на туберкулез. Это объясняется
тем, что микобактерии туберкулеза очень требовательны к составу
питательной среды. Их рост происходит очень медленно и зависит от
соблюдения ряда условий. Колонии микобактерий, видимые
невооруженным глазом, появляются через 3 - 6 недель. В связи с
этим во избежание высыхания питательной среды для посевов обычно
применяют бактериологические пробирки с герметичными пробками
(резиновые, силиконовые) или производят парафинирование
ватно-марлевых пробок.
Большинство проб клинического материала, поступающего в
микробиологическую лабораторию для культурального исследования на
туберкулез, в различной степени загрязнены быстрорастущими
бактериями, бурный рост которых на богатых питательных средах
мешает развитию микобактерий и затрудняет их выделение. Поэтому
перед посевом на питательную среду диагностический материал
подвергают специальной обработке, обеспечивающей деконтаминацию
(обеззараживание), то есть гибель гноеродной и гнилостной
микрофлоры.
Микобактерии туберкулеза, выделяющиеся из дыхательных путей
больного, как правило, окружены большим количеством слизистых
веществ, затрудняющих их выделение. В связи с этим мокроту и
другие сходные материалы перед посевом подвергают разжижению и
гомогенизации.
Все препараты, используемые в настоящее время для разжижения и
деконтаминации диагностического материала, обладают более или
менее выраженной токсичностью в отношении микобактерий. Чтобы
обеспечить выживание достаточной части микобактериальной
популяции, необходимо использовать щадящие методы обработки,
позволяющие, с одной стороны, подавить быстрорастущие гноеродные и
гнилостные микроорганизмы, а с другой - максимально сохранить
жизнеспособность присутствующих в материале микобактерий.
Частота контаминации посевов в лабораториях, проводящих
исследование свежесобранных проб, при культивировании мокроты на
плотных яичных средах обычно составляет 2 - 3%. Если клинический
материал до поступления и лабораторию хранится в течение
нескольких дней в нерегламентированных условиях, частота
контаминации может достигать 5% и более, что недопустимо.
Контаминация менее 2% свидетельствует о нарушениях режима
обработки материала. Для унификации результатов исследования
необходимо, чтобы микробиологические лаборатории использовали для
гомогенизации и деконтаминации диагностического материала один из
стандартных методов, изложенных ниже.
4.1.1. Стандартные методы разжижения и деконтаминации
Перед посевом исследуемый материал необходимо гомогенизировать
и освободить от сопутствующей гноеродной и гнилостной микрофлоры.
Для этого мокроту, экссудаты и другой негомогенный материал
собирают в стерильные флаконы со стеклянными бусами или битым
стеклом, добавляют щелочь или кислоту и подвергают встряхиванию.
ВСЕ ПРОЦЕДУРЫ ПО ПЕРЕНОСУ МАТЕРИАЛА ИЗ ОДНОЙ ПОСУДЫ В ДРУГУЮ
ПРИ ОБРАБОТКЕ И ПОСЕВЕ ПРОИЗВОДЯТСЯ ТОЛЬКО СТЕРИЛЬНЫМИ ПИПЕТКАМИ.
ЗАПРЕЩАЕТСЯ ПЕРЕНОС МАТЕРИАЛА ПУТЕМ ПЕРЕЛИВАНИЯ ЕГО ЧЕРЕЗ КРАЙ
ФЛАКОНОВ, ПРОБИРОК И ПР.
Жидкие материалы предварительно центрифугируют и обработке
подвергают только осадок.
Все реактивы, используемые при приготовлении растворов для
обработки диагностических материалов, должны иметь степень очистки
не менее категории "химически чистый" (ХЧ). Могут использоваться
как отечественные, так и импортные реактивы, имеющие степень
очистки не менее чем "химически чистый".
Для предпосевной обработки диагностического материала
рекомендуется использовать следующие методы и детергенты.
4.1.1.1. Обработка материала 10% раствором трехзамещенного
фосфорнокислого натрия
Трехзамещенный фосфорнокислый натрий (Na3PO4) хорошо подавляет
сопутствующую флору и даже при 2 - 3-дневном хранении материала
при +4 -C не повреждает микобактерии и мало влияет на их
способность к росту на питательных средах.
1. Исследуемый материал, находящийся в стерильном флаконе с 6
- 8 стеклянными бусинами или битым стеклом, залить равным объемом
10% трехзамещенного фосфата натрия и поместить на 10 мин. во
встряхиватель.
2. Флакон с материалом поместить на 18 - 20 часов в термостат
при 37 -C.
3. После этого материал стерильной пипеткой объемом 5 - 10 мл
перенести в пробирки, уравновесить их и центрифугировать при 3000
x g <*> в течение 15 минут. При указанном режиме происходит
осаждение 95% присутствующих в материале микобактерий.
--------------------------------
<*> Ускорение центрифугирования ("относительная сила
центрифугирования" (ОСЦ)) измеряется в относительных единицах к
ускорению свободного падения "g". Формула расчета ОСЦ:
2
ОСЦ = 1,12Rmax (об./мин./1000) ,
где: Rmax - максимальный радиус от центра вращения ротора до
дна пробирки в мм.
Например, при R = 180 мм и 1500 об./мин. (центрифуга ЦЛ1-3)
ОСЦ = 450g. При увеличении частоты вращения до 3000 об./мин. ОСЦ
возрастает до 1800g. Необходимое число оборотов в мин. можно
рассчитать по формуле:
-1 ________________
Об.мин. = 1000 \/ОСЦ / (1,12Rmax).
4. Надосадочную жидкость отобрать стерильной пипеткой на 10 -
5 мл и перенести ее в емкость с дезинфицирующим раствором, оставив
в каждой пробирке 1,2 - 1,5 мл осадка.
5. Использованную пипетку опустить в емкость с дезинфицирующим
раствором.
6. К осадку стерильно добавить несколько капель 6% соляной
кислоты до получения нейтрального значения pH, определяемого
индикаторной бумажной полоской.
7. Встряхнуть пробирку с осадком и поместить ее в штатив в
порядке регистрационных номеров материала.
8. Для снижения токсичного воздействия на микобактерии
различных остатков веществ (в том числе возможных химиопрепаратов)
вводят еще одну процедуру отмывки 10 - 15 мл дистиллированной
воды.
Супернатант удаляют, а осадок в объеме 0,8 - 1,0 мл готовят к
инокулированию и приготовлению мазка.
Далее см. разделы 4.3.1. Процедура посева и 4.3.2. Инкубация и
др.
Реактивы.
Трехзамещенный фосфорнокислый натрий (Na3PO4) - ГОСТ 4274-76;
Кислота соляная (HCl) концентрированная - ГОСТ 3118-77;
Бумага индикаторная универсальная - ТУ 6-09-1181-76.
Приготовление растворов.
1. 100 г трехзамещенного фосфата натрия растворяют в 800 мл
дистиллированной воды и доводят объем раствора до 1 л.
2. 6 мл концентрированной соляной кислоты добавляют к 94 мл
дистиллированной воды.
НИКОГДА НЕ ДОБАВЛЯТЬ ВОДУ В КИСЛОТУ!
4.1.1.2. Обработка материала 3% серной кислотой
ОБЩЕЕ ВРЕМЯ ОБРАБОТКИ КИСЛОТОЙ НЕ ДОЛЖНО ПРЕВЫШАТЬ 20 МИН.!
Несмотря на то, что микобактерии туберкулеза не теряют
жизнеспособности в сильно закисленной среде, необходимо помнить,
что длительная экспозиция материала в растворе серной кислоты
губительно действует на микобактерии. Поэтому раствором серной
кислоты производят обработку материала, содержащего большое
количество сопутствующей микрофлоры. Этот метод рекомендован для
обработки мочи, гнойных экссудатов и отделяемого ран,
резецированных тканей, органов экспериментальных животных и пр.
При обработке 3% раствором серной кислоты рекомендуется
следующий порядок манипуляций:
1. Для работы правильно собранный материал (60 - 100 мл)
используют целиком для получения осадка, так как микобактерии,
имея удельный вес, близкий к 1,0, могут подолгу не оседать,
находясь во взвешенном состоянии.
2. Из этого материала методом наслоения поэтапным
центрифугированием получить осадок. Для этого перенести в 1 - 2
центрифужные пробирки приблизительно по 15 - 20 мл материала.
3. Уравновесить пробирки и центрифугировать материал при 3000
x g в течение 15 мин.
4. Надосадочную жидкость отобрать пипеткой на 10 - 5 мл и
перенести ее в емкость с дезинфицирующим раствором, оставив в
каждой пробирке 0,8 - 1,2 мл осадка.
5. Полученные в разных пробирках осадки одного и того же
материала с помощью той же стерильной пипетки перенести в одну
пробирку, плотно закрыть ее пробкой и встряхнуть.
6. Использованную пипетку опустить в емкость с дезинфицирующим
раствором.
7. К полученному осадку добавить равный объем 3% раствора
серной кислоты.
8. Выдержать полученную с кислотой смесь 10 мин. при комнатной
температуре (не превышать время экспозиции!).
9. Центрифугировать смесь при 3000g в течение 10 мин. (не
превышать время экспозиции!).
10. Стерильной пипеткой на 5 - 10 мл отобрать надосадочную
жидкость и перенести ее в емкость с дезинфицирующим раствором,
оставив приблизительно 0,8 - 1,2 мл осадка.
11. К осадку добавить стерильной пипеткой 15 мл стерильного
0,9% раствора хлористого натрия.
12. Пробирки уравновесить и повторно центрифугировать материал
при 3000g в течение 15 мин.
13. Стерильной пипеткой на 5 - 10 мл отобрать надосадочную
жидкость и перенести ее в емкость с дезинфицирующим раствором,
оставив приблизительно 1,5 мл осадка.
14. Добавить в пробирку 1 - 2 капли 4% едкого натра до
получения нейтрального значения pH, определяемого индикаторной
бумажной полоской.
15. Встряхнуть пробирку с осадком и поместить в штатив,
расположив ее по порядку регистрационных номеров материала.
Далее см. разделы 4.3.1. Процедура посева и 4.3.2. Инкубация и
др.
Реактивы:
1. Серная кислота (H2SO4) концентрированная - ГОСТ 4204-77.
2. Едкий натр (NaOH) - ГОСТ 4328-77.
Приготовление растворов
1. 3% раствор серной кислоты. К 97 мл дистиллированной воды
добавляют 3 мл концентрированной серной кислоты, осторожно
наслаивая ее по стенкам сосуда.
ВНИМАНИЕ! КИСЛОТУ СЛЕДУЕТ ДОБАВЛЯТЬ В ВОДУ, А НЕ НАОБОРОТ!
НЕ ПИПЕТИРУЙТЕ КОНЦЕНТРИРОВАННУЮ СЕРНУЮ КИСЛОТУ РТОМ!
2. 4% раствор едкого натра. 40 г NaOH заливают
дистиллированной водой до объема 1 литр.
Обработка материала 4% раствором едкого натра
(модифицированный метод Петрова)
ОБЩЕЕ ВРЕМЯ ОБРАБОТКИ МАТЕРИАЛА ЩЕЛОЧЬЮ НЕ ДОЛЖНО ПРЕВЫШАТЬ 40
МИН.!
Обработка с помощью NaOH является достаточно жесткой и может
приводить к гибели до 60% микобактерий, содержащихся в исследуемом
образце материала. Данный показатель не зависит от дополнительной
гибели бактерий за счет повышенной температуры при
центрифугировании и других факторов.
Гидроокись натрия токсична по отношению как к загрязняющим
микроорганизмам, так и к микобактериям туберкулеза.
Поэтому при использовании данного метода необходимо строго
соблюдать указанное время обработки.
1. Исследуемый материал, находящийся в стерильном флаконе с 6
- 8 стеклянными бусинами или битым стеклом, залить двойным объемом
4% раствора едкого натра и поместить на 10 мин. во встряхиватель.
2. Выдержать полученную со щелочью смесь 15 мин. при комнатной
температуре с периодическим ручным встряхиванием (не превышать
время экспозиции!).
3. Стерильной пипеткой объемом 5 - 10 мл перенести
обработанный материал в пробирки.
4. Пробирки уравновесить и центрифугировать материал при 3000g
в течение 15 мин.
5. Стерильной пипеткой объемом 5 - 10 мл перенести
надосадочную жидкость в емкость с дезинфицирующим раствором,
оставив в пробирке 0,8 - 1,2 мл осадка.
6. К осадку добавить стерильной пипеткой 15 мл стерильного
0,9% раствора хлористого натрия.
7. Пробирки уравновесить и повторно центрифугировать материал
при 3000g в течение 15 мин.
8. Стерильной пипеткой объемом 5 - 10 мл перенести
надосадочную жидкость в емкость с дезинфицирующим раствором,
оставив в пробирке 1,2 - 1,5 мл осадка.
9. К осадку добавить 1 - 2 капли 10% раствора соляной кислоты
до получения нейтрального значения pH, определяемого индикаторной
бумажной полоской.
10. Закрыть пробирку и встряхнуть ее содержимое.
11. Пробирку с осадком поместить в штатив, расположив ее по
порядку регистрационных номеров материала.
Реактивы.
1. Едкий натр (NaOH) - ГОСТ 4328-77.
2. Кислота соляная (HCl) концентрированная - ГОСТ 3118-77.
Приготовление растворов.
1. 4% раствор едкого натра. 40 г едкого натра заливают
дистиллированной водой до объема 1 литр.
2. 10% раствор соляной кислоты. 10 мл концентрированной
соляной кислоты добавляют к 90 мл дистиллированной воды.
Растворы стерилизуют 20 мин. при 1 атмосфере.
4.1.2. Альтернативные методы обработки материала
В регионах с достаточными материальными ресурсами могут
применяться более дорогие и трудоемкие методы гомогенизации и
деконтаминации (Kent Р.Т., Kubica G.P. Public Health
Mycobacteriology: A Guide for the Level III Laboratory. US
Department of Health and Human Services, Centers for Disease
Control, USA, 1985). К ним относятся следующие методы:
4.1.2.1. Метод с использованием N-ацетил-l-цистеина и
гидроокиси натрия (NALC-NaOH)*
Применение муколитического препарата NALC, используемого для
быстрого разжижения мокроты, позволяет снизить концентрацию
деконтаминирующего вещества (NaOH) до конечной концентрации 1%.
Цитрат натрия включен в литическую смесь для связывания ионов
тяжелых металлов, которые могут присутствовать в пробе и
инактивировать действие N-ацетил-L-цистеина. Этот метод дает
больший выход высеваемости микобактерий, однако требует больше
|
