|
Стр. 13
направленные на снижение концентрации инфекционных аэрозолей в
воздухе (принудительная вентиляция, использование
специализированных устройств обеззараживания воздуха);
в) меры персональной защиты органов дыхания персонала
(защитные маски, респираторы). Указанные меры приведены в
последовательности убывания их эффективности. Например,
персональная респираторная защита малоэффективна при отсутствии
административных мер и мер, направленных на снижение концентрации
инфекционных аэрозолей в воздухе рабочих помещений.
Административные меры включают:
- разделение лаборатории на заразную и чистую зоны; создание
эпидемиологической цепочки последовательного движения исследуемых
материалов в процессе приема, обработки и исследования;
- соответствующее назначение помещений лаборатории; соблюдение
норм санитарно-гигиенических мероприятий и выбор адекватных
дезинфицирующих средств, имеющих соответствующую документацию,
регламентирующую методы применения средств в лабораториях
противотуберкулезных учреждений;
- образовательную подготовку персонала, включающую
представление о путях трансмиссии микобактерий туберкулеза и мерах
профилактики;
- соблюдение правил сбора материала (в первую очередь,
мокроты);
- выбор методик, сокращающих время работы с заразным
материалом и повышающих безопасность лабораторных манипуляций.
Инженерные меры. По мере возрастания сложности инженерные
мероприятия условно делятся на следующие группы:
1) удаление и обмен воздуха в помещениях путем естественной
вентиляции, что допустимо лишь для неинфицированных помещений;
2) организация принудительной вентиляции воздуха в помещениях
и на рабочих местах (общая и локальная вентиляция), исключающей
попадание инфекционного аэрозоля в коридоры и другие смежные
помещения;
3) удаление или обеззараживание инфекционного аэрозоля,
находящегося в воздухе помещений, с использованием технических
средств (фильтрация воздуха, воздействие на микроорганизмы,
приводящее к их уничтожению и гибели).
Общая принудительная вентиляция (приточная, вытяжная или
приточно-вытяжная) должна обеспечивать удаление загрязненного
(инфицированного) воздуха из помещения и отсутствие в помещениях
застойных зон.
Локальная вентиляция должна обеспечивать удаление
инфицированного воздуха из зоны работы с инфекционным материалом и
поступление чистого (неинфицированного) воздуха. Она может
осуществляться с помощью локальных вытяжных зонтов, колпаков,
вытяжек и других технических устройств. При работе с инфекционным
материалом локальные вытяжные установки должны быть оснащены
бактерицидными фильтрами или другими устройствами,
предотвращающими выброс инфекционного аэрозоля наружу.
Обеззараживание воздуха и системы рециркуляции воздуха внутри
помещений. Системы обеззараживания воздуха должны обеспечивать
снижение концентрации инфекционного аэрозоля в воздухе и
поддержание ее на заданном нормативными документами уровне.
Устройства обеззараживания воздуха могут использоваться как в
системе общей вентиляции, так и в автономных устройствах
рециркуляции воздуха в помещении. Их использование должно
осуществляться в строгом соответствии с инструкциями. Например,
эффективность работы ультрафиолетовых облучателей снижается во
много раз при облучении загрязненных поверхностей, высокой
влажности воздуха (после влажной уборки).
При использовании фильтрующих устройств необходимо
контролировать состояние фильтров и осуществлять их своевременную
замену и утилизацию. Кроме того, такие устройства должны
гарантировать высокую эффективность фильтрации инфекционного
аэрозоля и во избежание возможности вторичного попадания
отфильтрованного инфекционного аэрозоля в воздух помещения должны
работать непрерывно.
Устройства, инактивирующие микроорганизмы, должны обеспечивать
разрушение микробных клеток в процессе обработки воздуха и не
оказывать отрицательного влияния на воздушную среду, материалы,
оборудование и человека.
В связи с этим такие установки должны иметь необходимые
документы, разрешающие их использование в противотуберкулезных
учреждениях, а также методическую документацию по правилам
эксплуатации и рекомендации по их использованию в помещении. К
числу таких систем относятся шкафы биологической защиты
(ламинарные шкафы), фильтрующие или обеззараживающие устройства
и/или приборы, сочетающие указанные функции.
Индивидуальная защита органов дыхания. Защитные персональные
маски типа матерчатых или бумажных хирургических предотвращают
распространение микроорганизмов, захватывая крупные жидкие частицы
около рта или носа, но не обеспечивают защиту от вдыхания
подсохших капельных ядер аэрозолей.
Респираторы - это специальные виды масок безопасности. Они
плотно прилегают к лицу, предотвращая просачивание воздуха через
боковые отверстия. Медицинским работникам противотуберкулезных
учреждений и лабораторий рекомендуется использовать респираторы,
обеспечивающие 95%-ную задержку аэрозольных частиц диаметром 0,3
мкм. Эффективность респираторов снижается при увлажнении и
загрязнении, поэтому их хранят завернутыми в чистую ткань, а не в
сохраняющих влагу пластиковых пакетах.
2.4.2. Правила приема диагностического материала
Поступающие для исследования пробы материала принимают на
отдельном столе, соблюдая следующие правила:
- прием поступающих проб и их осмотр следует, по возможности,
проводить в одноразовых перчатках и масках;
- перед тем как открыть транспортировочный контейнер,
необходимо протереть его наружную поверхность тампоном, смоченным
соответствующим дезинфицирующим средством (например, 5% раствором
хлорамина или гипохлорита);
- аккуратно открыть крышку контейнера и проверить, нет ли
следов протечки материала на поверхности флаконов. Ни в коем
случае не использовать поврежденные флаконы (разбитые или с
трещинами) - уничтожить их (автоклавирование или кипячение) и
запросить новый образец, отметив в сопроводительном бланке;
- проверить наличие идентификационных номеров на флаконах с
материалом и сверить их с номерами в сопроводительных документах;
- продезинфицировать внутреннюю поверхность
транспортировочного контейнера;
- после работы с флаконами уничтожить одноразовые перчатки и
вымыть руки с мылом;
- выдать водителю обменную стерильную посуду;
- подписать сопроводительные документы;
- занести в регистрационный лабораторный журнал сведения о
каждом пациенте и полученном от него материале.
Бланки направлений следует подвергнуть стерилизации в
сухожаровом шкафу в течение 30 минут при 85 -C.
2.4.3. Оценка качества и количества мокроты
При исследовании мокроты пациентов с подозрением на туберкулез
понятие "качественная мокрота" имеет конкретное определение.
Качественной является свежевыделенная мокрота из глубоких отделов
дыхательных путей с минимальными примесями слюны или носоглоточной
слизи. Наилучшим для исследования считают образец мокроты, в
котором имеются слизистые или слизисто-гнойные комочки,
белесоватые включения. Сероватый, желтоватый или бурый цвет
мокроты также может характеризовать качественный материал. Для
исследования достаточно 3 - 5 мл мокроты, но хорошие результаты
могут быть получены и при исследовании меньших объемов мокроты.
Индуцированная, т.е. полученная при аэрозольных ингаляциях или
других манипуляциях, мокрота напоминает по внешнему виду и
консистенции слюну. Важно, чтобы этот материал по ошибке не был
удален как непригодный для исследования. Поэтому в
сопроводительном документе необходимо отмечать, каким образом
получен материал для анализа.
2.4.4. Техника безопасности при работе с диагностическим
материалом
При работе с заразным материалом необходимо иметь в виду, что
работа с диагностическим материалом является одним из самых
опасных этапов микробиологического исследования. Туберкулез
распространяется воздушно-капельным путем через содержащие
возбудитель мельчайшие аэрозольные частицы, диаметр которых
составляет 1 - 5 мкм. Именно эти мельчайшие частицы составляют ту
фазу аэрозоля, которая способна при дыхании проникать в легочные
альвеолы и оседать в них, формируя начало инфекционного процесса.
В лабораторной работе усилия должны быть направлены на то, чтобы
избежать или свести к минимуму опасность заражения во время тех
манипуляций, при выполнении которых наблюдается наибольшая
вероятность образования и рассеивания потенциально опасных
инфекционных аэрозолей.
В ЛАБОРАТОРИЯХ ОСНОВНЫМИ ИСТОЧНИКАМИ ОБРАЗОВАНИЯ ИНФЕКЦИОННЫХ
АЭРОЗОЛЕЙ ЯВЛЯЮТСЯ МАНИПУЛЯЦИИ, СВЯЗАННЫЕ С ОБРАБОТКОЙ ЗАРАЖЕННОГО
МАТЕРИАЛА.
Аэрозоли могут образовываться при выполнении следующих
манипуляций:
- открывание флаконов с материалом; эта манипуляция особенно
опасна, если между наружной стенкой горлышка флакона и внутренней
поверхностью крышки находятся частицы высохшей мокроты или если
непосредственно перед открыванием флакон подвергался встряхиванию
во время транспортировки;
- приготовление мазков путем нанесения материала на предметное
стекло и распределение его по поверхности стекла;
- прожигание над пламенем горелки не очищенных от остатков
материала бактериологических петель;
- попытки фиксировать над горелкой невысохший влажный мазок,
что приводит к вскипанию и разбрызгиванию частичек материала;
- работа с жидкими культурами или с надосадочной жидкостью;
- забор в пипетку суспензии микроорганизмов, особенно при
использовании автоматических пипеток с фиксированным объемом
жидкости;
- использование высокоскоростных встряхивателей и центрифуг;
- энергичная инокуляция микробных суспензий в пробирки или
флаконы;
- повреждение пробирок при центрифугировании;
- использование ступок при растирании инфицированного
материала;
- приготовление суспензий микобактерий для инокулирования
(особенно опасно использование ступок для растирания культуры).
При выполнении всех этих манипуляций следует соблюдать особую
осторожность, а некоторые желательно исключить из лабораторных
технологий.
Для предупреждения случаев внутрилабораторного заражения
необходимо свести к минимуму возможность образования аэрозолей.
Для защиты лабораторных работников от инфекционных частиц
необходимо проводить работу при включенной локальной вытяжной
вентиляции (там, где это достаточно) или в специально
оборудованных боксах или ламинарных шкафах.
III. МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ
КИСЛОТОУСТОЙЧИВЫХ МИКОБАКТЕРИЙ
Присутствие кислотоустойчивых микобактерий в клиническом
материале может быть установлено при микроскопическом и/или
культуральном исследовании. Однако необходимо иметь в виду, что
микроскопическое исследование не позволяет дифференцировать
микобактерии комплекса Mycobacterium tuberculosis (возбудителей
туберкулеза) от нетуберкулезных ("атипичных") микобактерий -
возбудителей микобактериозов.
НА ОСНОВАНИИ МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ВОЗМОЖНО СДЕЛАТЬ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ТОЛЬКО О НАЛИЧИИ ИЛИ ОТСУТСТВИИ В ПРЕПАРАТЕ
КИСЛОУСТОЙЧИВЫХ МИКОБАКТЕРИЙ.
Это объясняется тем, что в природе существует большое число
нетуберкулезных кислотоустойчивых микобактерий, вызывающих
микобактериозы, а также кислотоустойчивых сапрофитов, не
вызывающих заболевания человека. Микроскопически они неотличимы от
Mycobacterium tuberculosis.
Несмотря на указанные недостатки, бактериоскопия остается
одним из основных методов микробиологических исследований. Ее
преимущество заключается в быстроте получения результата и
относительной простоте исследования. Метод позволяет в короткие
сроки (от одного часа) обнаружить наиболее эпидемически опасных
больных туберкулезом и микобактериозами, выделяющих большие
количества микобактерий, и остается актуальным микробиологическим
методом при выявлении больных туберкулезом и микобактериозами на
первичных этапах обследования больных, а также при динамическом
наблюдении за состоянием микобактериальной популяции в процессе
лечения. Кроме того, микроскопическое подтверждение тинкториальных
свойств культуры остается обязательным исследованием при ее
диагностике.
3.1. Подготовка материала для микроскопического
исследования на кислотоустойчивые микобактерии
Чтобы обнаружить микобактерии туберкулеза методами
микроскопии, в 1 мл исследуемого материала должно содержаться не
менее 10000 микробных клеток. В мокроте больных с туберкулезом
органов дыхания (особенно при наличии у них полостей распада
легочной ткани) обычно содержится значительное количество
кислотоустойчивых бактерий, что позволяет выявить их при
микроскопическом исследовании. Однако бактериовыделение не
является регулярным процессом, и это требует определенной тактики
сбора материала. Чувствительность этого метода можно повысить,
если ввести кратность обследования пациента. Установлено, что при
последовательных исследованиях результативность микроскопической
диагностики туберкулеза органов дыхания повышается следующим
образом: при однократном исследовании - 80 - 83%, двукратном - на
10 - 14% больше и при исследовании трех проб мокроты - еще на 5 -
8% больше. Таким образом, при подозрении на туберкулез органов
дыхания рекомендуется исследовать не менее трех проб мокроты.
ОТРИЦАТЕЛЬНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ НЕ
ИСКЛЮЧАЕТ ДИАГНОЗ ТУБЕРКУЛЕЗА, ТАК КАК В МОКРОТЕ ПАЦИЕНТА МОЖЕТ
СОДЕРЖАТЬСЯ МЕНЬШЕ МИКОБАКТЕРИЙ, ЧЕМ МОЖЕТ ВЫЯВИТЬ
МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ.
Эффективность бактериоскопии существенно возрастает, если
контролируется качество собираемого материала. Нарушение
технологий подготовки мазков может быть причиной отрицательного
результата микроскопического исследования.
3.2. Приготовление мазков
для микроскопических исследований
По способу подготовки материала методы микроскопического
исследования условно делят на два вида:
- метод прямой микроскопии, когда мазок приготавливается
непосредственно из нативного необработанного диагностического
материала или осадка (при исследовании жидкого материала);
- метод микроскопии мазка из осадка материала, подготовленного
для культурального исследования путем обработки гомогенизирующими
и обеззараживающими средствами и последующего центрифугирования.
При соблюдении условий методик второй метод более
информативен, примерно на 20 - 30%, чем прямая микроскопия, так
как при подготовке осадка происходит освобождение микробов из
окружающей их слизи и обогащение диагностической квоты материала
при центрифугировании.
В тех случаях, когда мазок подвергается окраске флюорохромными
красителями и исследуется в люминесцентном микроскопе, необходимо
иметь в виду, что качественная и эффективная окраска
флюорохромными красителями требует обязательного соблюдения
кислотности (pH) мазка, а также освобождения микобактерий от
окружающей их слизи, которая препятствует проникновению красителя
в микробную клетку. Несоблюдение этих условий приводит к снижению
эффективности люминесцентной микроскопии.
ПРИ КУЛЬТУРАЛЬНОМ ИССЛЕДОВАНИИ МАЗОК И ПОСЕВ ПРОИЗВОДЯТСЯ
ОБЯЗАТЕЛЬНО ИЗ ОДНОЙ И ТОЙ ЖЕ ПОРЦИИ МАТЕРИАЛА. ЭТО ОСНОВНОЕ
ТРЕБОВАНИЕ ПРАВИЛЬНОГО МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ.
3.2.1. Оборудование и реактивы для приготовления
диагностических мазков
Перед началом работы оборудование, реактивы и материалы
необходимо разместить так, чтобы было удобно работать и в
дальнейшем стараться соблюдать этот привычный порядок.
Все манипуляции по приготовлению мазков из диагностического
материала должны быть стандартизованными, а для максимальной
безопасности все материалы и реагенты всегда должны находиться на
одних и тех же постоянных местах и располагаться в одном и том же
порядке.
Для приготовления мазков необходимы:
- флаконы с поступившим в лабораторию исследуемым материалом;
- деревянные палочки (аппликаторы) или бактериологические
петли диаметром 3 мм для забора сгустков мокроты и распределения
их на стекле;
- одноразовые предметные стекла (обезжиренные, без царапин и
сколов), ГОСТ 9284-75;
- не смываемый при окраске маркировочный карандаш для
нанесения идентификационного номера на стекло (алмазный карандаш);
- пинцет или щипцы для взятия предметных стекол с мазками;
- емкость (колба, эксикатор, стеклянная банка и т.д.) с
отмытым речным песком, залитым техническим спиртом (70-), для
очистки бактериологической петли от остатков материала перед
очередной стерилизацией ее в пламени горелки;
- спиртовка или газовая горелка Бунзена для прокаливания
петли;
- одноразовые или стерильные стеклянные чашки Петри для отбора
гнойных комочков материала;
- стерильные мерные пипетки на 10 мл и 5 мл для переноса
мокроты в чашки Петри;
- лотки (подносы), выстланные фильтровальной бумагой, для
просушивания приготовленных мазков;
- контейнеры для сбора и последующего автоклавирования
инфицированного материала и загрязненной посуды;
- емкость с дезинфицирующим раствором для обработки
поверхности стола или других объектов по окончании работы и при
случайном попадании на них диагностического материала;
- ватные шарики для обработки загрязненных поверхностей
дезинфицирующим раствором.
3.2.2. Подготовка предметных стекол
Процедура приготовления мазков начинается с подготовки
предметных стекол. Необходимо использовать только новые, отмытые и
обезжиренные в спирте или смеси Никифорова (96- этиловый спирт +
диэтиловый эфир в соотношении 1:1) стекла без царапин и сколов.
Стекла должны соответствовать ГОСТу. Не рекомендуется использовать
саморезанные стекла, которые приводят к значительным аберрациям
исследуемого изображения или обусловливают образование артефактов.
При повторном использовании стекла могут быть недостаточно хорошо
отмыты от предыдущего материала, что может привести к получению
ложноположительных результатов.
СТЕКЛА, НА КОТОРЫХ ПРИ МИКРОСКОПИЧЕСКОМ ИССЛЕДОВАНИИ БЫЛИ
ОБНАРУЖЕНЫ КИСЛОТОУСТОЙЧИВЫЕ МИКОБАКТЕРИИ, СОХРАНЯЮТСЯ В
ЛАБОРАТОРИИ В ТЕЧЕНИЕ 1 ГОДА, А ЗАТЕМ ПОДЛЕЖАТ ОБЯЗАТЕЛЬНОМУ
УНИЧТОЖЕНИЮ И НЕ ДОЛЖНЫ ИСПОЛЬЗОВАТЬСЯ ПОВТОРНО.
Новые предметные стекла кипятят в 1% растворе питьевой соды
(10 г двууглекислого натрия на 1 л воды), промывают в 1% растворе
соляной кислоты (к 1 л воды добавляют 10 мл концентрированной
соляной кислоты), а затем в проточной воде. Протирают насухо. Для
обезжиривания вымытые и высушенные стекла помещают в герметически
закрытые емкости со смесью Никифорова или с 96- этиловым спиртом.
Стекла должны подвергаться обезжириванию не менее суток.
Непосредственно перед приготовлением мазков стекла повторно
протираются насухо.
3.2.3. Приготовление мазков из нативного материала и
необработанного осадка жидких материалов
Если мазок будет окрашиваться по методу Ziehl-Neelsen и
исследоваться в световом микроскопе, pH мазка не корригируется.
В случае окраски флюорохромными красителями для исследования в
люминесцентном микроскопе перед нанесением материала на предметное
стекло необходимо добиться нейтрального значения pH (6,8 - 7,0).
Уровень pH осадка определяют с помощью бумажной индикаторной
полоски.
Перед приготовлением мазка на один конец стекла (или его
матовую часть) наносят полный номер пробы исследуемого материала,
под которым он зарегистрирован в лабораторном регистрационном
журнале при приеме материала. Номер наносят с помощью алмазного
карандаша или несмываемого маркера с таким расчетом, чтобы в
процессе окраски этот номер сохранился.
НЕ СЛЕДУЕТ КАСАТЬСЯ ЧИСТОЙ ПОВЕРХНОСТИ СТЕКЛА РУКАМИ ИЛИ
ПЕРЧАТКАМИ!
Приготовление мазков для прямой микроскопии из нативной
мокроты.
Если материал поступил в емкости, в которой невозможно
обнаружить и выбрать частицы для приготовления мазка, его
переносят в чашку Петри, под дно которой подложена черная бумага.
При этом проявляют известную осторожность, чтобы избежать
образования аэрозолей.
Так как в необработанной нативной мокроте микобактерии
наиболее часто располагаются в плотных комочках распада тканей,
следует иметь в виду, что результат микроскопического исследования
в значительной степени зависит от правильности выбора этих гнойных
комочков.
При приготовлении мазков наиболее удобно пользоваться
деревянной палочкой, которую перед работой разламывают пополам.
Затем из разных участков образца мокроты выбирают 2 - 3 наиболее
плотных гнойных небольших комочка, переносят их на стекло, при
необходимости разминают и равномерно распределяют тонким слоем в
центре стекла на поверхности приблизительно размером 1 x 2 см в
виде овала. Забор комочков производят с помощью сломанных концов
палочки, что обеспечивает более надежную фиксацию материала к
палочке и облегчает последующее его нанесение на поверхность
предметного стекла и приготовление мазка посредством растирания.
На одно предметное стекло следует наносить только один мазок.
Использованные для приготовления мазка палочки удаляют в банку
с дезинфицирующим раствором или в контейнер с отработанным
заразным материалом. Для каждой порции мокроты используется новая
чистая палочка!
Практикуется также приготовление мазков с помощью
бактериологических петель или препаровальных игл. Удобно
пользоваться двумя петлями или иглами. В случае, когда мазок
готовят с помощью бактериологической петли, она может быть
использована повторно после очистки от остатков мокроты путем 2 -
3-кратного погружения ее в банку с песком, залитым спиртом, и
последующего прожигания в пламени горелки до появления красного
цвета. После прокаливания петлю следует охладить, оставив ее на 1
- 2 минуты в штативе-петледержателе.
Песок для очистки петель может использоваться длительное время
при условии периодического обновления раствора спирта с таким
расчетом, чтобы его уровень превышал уровень песка не менее чем на
3 см.
Приготовление мазка из осадка необработанного нативного
материала.
Такие мазки приготавливают из полученного после
центрифугирования осадка любого жидкого диагностического материала
(бронхоальвеолярные смывы, промывные воды бронхов или желудка,
моча, пунктаты из закрытых полостей, экссудаты). Осадок
представляет собой обогащенную фракцию диагностического материала
и значительно чаще позволяет получить положительные результаты.
Особенностью существования М.tuberculosis в жидкостях является
способность их долгое время находиться во взвешенном состоянии. В
связи с этим рекомендуется производить центрифугирование при 3000g
(см. раздел по культуральным исследованиям данной Инструкции).
Для приготовления мазка надосадочную жидкость аккуратно
удаляют, полученный в пробирке осадок перемешивают и с помощью
пипетки наносят на стекло 1 - 2 капли осадка, распределяя его
тонким слоем в центре стекла на площади не менее 1 см x 2 см.
Необходимо иметь в виду, что мазки из осадка жидких материалов
(моча, промывные воды бронхов, экссудаты и пр.) легко смываются в
процессе окраски. Поэтому мазки из осадка жидких материалов
желательно приготавливать на стеклах, предварительно обработанных
яичным белком.
Для этого белок куриного яйца в течение 30 - 40 минут взбивают
с чистыми стерильными стеклянными бусами в стерильной посуде и
оставляют на 1 - 1,5 часа при комнатной температуре. Затем жидкую
часть взбитой смеси отбирают пипеткой, переносят ее в другую
посуду и, смачивая в ней ватный тампон, аккуратно наносят ее на
чистые обезжиренные предметные стекла, равномерно распределяя по
2/3 их поверхности. 1/3 предметного стекла оставляется не
обработанной белком для последующего нанесения на нее номера
пробы. Обработанные белком стекла раскладывают на чистой
фильтровальной бумаге и высушивают при комнатной температуре.
Другим способом закрепления осадка жидкого материала является
использование сыворотки крови. На чистом стекле каплю сыворотки
смешивают с 1 - 2 каплями осадка материала и распределяют смесь по
стеклу.
3.2.4. Приготовление мазков из осадка диагностического
материала, подготовленного для культурального исследования
Культуральное исследование любого диагностического материала
обязательно включает параллельное микроскопическое исследование
осадка этого материала, полученного после обработки детергентами с
последующим отмыванием либо нейтрализацией и центрифугированием.
ВСЕ МАЗКИ ИЗ ОСАДКА ПРИГОТАВЛИВАЮТ ПОСЛЕ ВЫПОЛНЕНИЯ ПРОЦЕДУРЫ
ПОСЕВА!
При этом чаще всего используется та же пипетка, которой
производился посев. С помощью этой пипетки на стекло наносят 1 - 2
капли осадка, который распределяют тонким слоем в центре стекла на
площади 1 см x 2 см.
Процедура приготовления мазка из осадка обработанного
материала:
1. Оставшийся после посева осадок встряхивают, забирают в
пипетку.
2. 1 - 2 капли осадка наносят на предметное стекло, формируя
мазок размером ~ 1 x 2 см.
3. Мазок из осадка жидких материалов (моча, промывные воды и
др.) во избежание смывания материала при окраске желательно
приготавливать на стеклах, предварительно обработанных яичным
белком.
При приготовлении мазка для микроскопического исследования
необходимо добиваться правильной его толщины. Если мазок слишком
тонкий и содержит мало материала, при микроскопическом
исследовании можно получить ложноотрицательный результат.
Если мазок слишком толстый, это затрудняет его фиксацию,
материал недостаточно плотно прикрепляется к стеклу и может быть
частично или полностью удален при окраске. Кроме того, толстый
мазок плохо просматривается при микроскопическом исследовании.
Не рекомендуется готовить мазки способом "растяжки" материала
между двух предметных стекол. Такой способ сопровождается
образованием биологически опасного аэрозоля.
ЧЕРЕЗ ПРАВИЛЬНО ПРИГОТОВЛЕННЫЙ МАЗОК МОЖНО ЧИТАТЬ ГАЗЕТНЫЙ
ШРИФТ, РАСПОЛОЖЕННЫЙ ПОЗАДИ СТЕКЛА НА РАССТОЯНИИ 5 - 10 СМ.
Ограниченная площадь мазка (~ 1 см x 2 см в центре стекла)
значительно повышает безопасность манипуляции и последующей
микроскопии, так как периферические части и ребра предметного
стекла остаются не загрязненными инфекционным материалом.
3.2.5. Фиксация мазков
Приготовленные вышеуказанным способом мазки помещают на 15 -
30 минут на лотки (подносы), выстланные фильтровальной бумагой, и
высушивают при комнатной температуре в вытяжном шкафу или при
отсутствии такового - на столе, в специально отведенном месте.
Ни в коем случае не допускается фиксация сырых мазков над
пламенем горелки!
При окраске по Ziehl-Neelsen стекла с высохшими мазками
пинцетом или специальными щипцами берут за конец, на который
нанесена маркировка, и трижды медленно проводят через верхнюю
треть пламени спиртовки или газовой горелки до исчезновения
признаков запотевания стекла. Общая продолжительность пребывания
мазка в пламени не должна превышать 3 - 5 секунд. Затем стекла
помещают на специальную подставку ("рельсы") для окрашивания.
При окраске мазков флюорохромными красителями рекомендуется
фиксация в сухожаровом шкафу при 85 -C в течение 45 минут. Однако
при отсутствии такой возможности допускается фиксация над пламенем
горелки.
В плане охраны труда оптимальным является метод, предложенный
A. Hain. Этот метод фиксации мазков используется как при окраске
по Ziehl-Neelsen, так и люминесцентными красителями. Согласно
этому методу предметные стекла с мазками раскладывают на жестяные
или эмалированные подносы и помещают в сушильный шкаф, где сначала
высушивают при 37 -C. Затем температуру повышают до 105 -C и,
спустя 10 минут, шкаф выключают. При таком методе достигается
надежное прикрепление материала к стеклу и гибель микобактерий,
как находящихся в материале мазка, так и случайно попавших на
поднос. Фиксирующая температура не должна превышать 105 -C, чтобы
не изменить тинкториальные свойства микобактерий.
Высушенные и фиксированные мазки должны сразу же окрашиваться.
Нефиксированные мазки ни в коем случае не должны оставляться
открытыми на ночь, так как это увеличивает опасность
распространения.
Фильтровальная бумага, которой был выстлан лоток (поднос), по
окончании фиксации каждой серии мазков подлежит обязательному
сжиганию или автоклавированию, а лоток обжигается спиртом. Лотки
ежедневно выстилаются чистой бумагой.
3.3. Методы окраски диагностических мазков
Для окраски мазков, приготовленных непосредственно из
диагностического материала (метод прямой микроскопии) и из осадка,
обработанного для культурального исследования, используются
методы, позволяющие выявлять кислотоустойчивые микроорганизмы:
- окраска по методу Ziehl-Neelsen для исследования в световом
микроскопе;
- окраска флюорохромными красителями для исследования в
люминесцентном микроскопе.
Люминесцентную микроскопию рекомендуется использовать при
большом количестве исследуемых ежедневно мазков (более 30 мазков в
день).
3.3.1. Окраска препаратов для световой микроскопии по методу
Ziehl-Neelsen
Метод окраски по Ziehl-Neelsen является наиболее
распространенным методом для выявления кислотоустойчивых
микобактерий. Он основан на использовании нескольких специальных
методических приемов:
- окраска фуксином (с подогреванием) - при одновременном
воздействии нагревания и сильного протравливающего действия
карболовой кислоты повышается способность красителя проникать в
микробную клетку и особенно в структуры ее клеточной стенки,
состоящей из липидов, миколовых кислот и восков. Обычные
анилиновые красители не проникают в клеточную стенку микобактерий,
и последние не окрашиваются;
- обесцвечивание (3 мин.) - последующая обработка мазка 25%
раствором серной кислоты или 3% раствором солянокислого спирта
приводит к обесцвечиванию красителя, проникшего в структуры, не
обладающие достаточной гидрофобностью и стойкостью к разрушению в
кислоте (кислотоустойчивостью). Только кислото- и спиртоустойчивые
микроорганизмы стойко удерживают краситель и остаются после
обесцвечивания окрашенными в малиново-красный цвет;
- контрастирующая окраска (1 мин.) - обесцвеченные элементы
мазка докрашивают метиленовым синим для придания контрастности
препарату.
3.3.1.1. Оборудование и реактивы для окраски по методу
Ziehl-Neelsen
Для окраски мазков по методу Ziehl-Neelsen необходимы:
- раковина или специальный вместительный лоток для проведения
окраски;
- специальный штатив ("рельсы") для окраски мазков на
предметных стеклах;
- пинцет или щипцы для взятия предметных стекол с мазками;
- газовая или спиртовая горелка для фиксации препарата (если
мазки не фиксированы в сушильном шкафу) и подогревания его при
окрашивании карболовым фуксином; или
- металлический стержень с ватным тампоном, который
используется вместо горелки для подогревания препарата при
окрашивании карболовым фуксином;
- фильтровальная бумага размером ~ 4 x 1,5 см для окраски
мазков карболовым фуксином;
- раствор карболового фуксина;
- 25% раствор серной кислоты или
- 3% раствор солянокислого спирта;
- дистиллированная вода для промывания мазков;
- 0,3% раствор хлорида метиленового синего;
- штатив для просушивания окрашенных стекол на воздухе в
вертикальном или наклонном положении.
Реактивы:
- спирт этиловый 96- марки ОП-2, ТУ 6-09-4512-77;
- кислота соляная концентрированная, ГОСТ 3118-77;
- кислота серная концентрированная, ГОСТ 4204-77;
- фенол кристаллический, ГОСТ 6417-72;
- фуксин основной, ТУ 6-09-3804-82;
- метиленовый синий хлорид, ТУ 6-09-945-75;
- глицерин, ЧДА, ГОСТ 6259-75;
- вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72.
Приготовление растворов
Раствор 1. Насыщенный спиртовой раствор фуксина:
- растереть в ступке 0,3 г основного фуксина с 2 - 3 каплями
глицерина, добавить по каплям 10 мл 96- этилового спирта.
Раствор 2. Рабочий раствор фенола (5% водный раствор):
- расплавить 5 г кристаллического фенола путем легкого
подогревания на водяной бане (температура плавления фенола - 41
-C). Добавить слегка подогретую дистиллированную воду до объема
100 мл.
Раствор 3. Рабочий раствор карболового фуксина:
- в 90 мл раствора 2 добавить 10 мл раствора 1.
Раствор 4. Обесцвечивающие растворы:
а) Раствор серной кислоты
К 75 мл дистиллированной воды осторожно долить 25 мл
концентрированной серной кислоты, постепенно наслаивая ее по
стенкам сосуда. Смешать. Содержимое нагреется.
НИКОГДА НЕ ДОБАВЛЯЙТЕ ВОДУ В КИСЛОТУ!
б) Раствор солянокислого спирта
Вместо раствора серной кислоты для обесцвечивания можно
использовать 3% солянокислый спирт:
Этиловый спирт 96- 97 мл
Концентрированная соляная кислота 3 мл.
К 97 мл спирта осторожно добавить 3 мл концентрированной
соляной кислоты.
ВСЕГДА ОСТОРОЖНО ВЛИВАЙТЕ КИСЛОТУ В СПИРТ, НО НЕ НАОБОРОТ!
Раствор 5. Рабочий раствор метиленового синего:
- растворить 0,3 г хлорида метиленового синего в 100 мл
дистиллированной воды.
Хранение растворов. Вес приготовленные растворы должны быть
профильтрованы через бумажный фильтр и помещены в герметически
закрытые емкости из темного стекла. На каждой емкости должна быть
надпись с названием содержащегося в ней раствора, датой его
приготовления, сроком годности и указанием фамилии специалиста,
готовившего раствор. Растворы хранят при комнатной температуре в
темном месте.
Рабочий раствор карболового фуксина может храниться не более
2-х недель, так как после этого срока фуксин начинает выпадать в
осадок, что изменяет заданные свойства раствора.
Другие рабочие растворы значительно более стойки при хранении.
Однако рекомендуется готовить их одновременно с раствором
карболового фуксина, т.е. через каждые 2 недели. Это позволит быть
уверенным в качестве используемых красителей.
3.3.1.2. Процедура окраски:
- убедитесь, что подготовленные мазки фиксированы и
промаркированы;
- препараты помещают на подставку ("рельсы") так, чтобы они не
касались друг друга, и расстояние между ними составляло порядка 1
см, а маркировка (номер) была направлена в одну сторону.
Максимально на стандартные "рельсы" помещают не более 12 стекол;
- на каждое стекло накладывают полоску фильтровальной бумаги
так, чтобы она полностью закрывала мазок. Это делают для того,
чтобы краска не разливалась по стеклу. Одновременно за счет
использования фильтровальной бумаги предотвращается осаждение на
мазок кристаллов краски, которые при микроскопическом исследовании
могут быть ошибочно приняты за кислотоустойчивые микобактерии;
- наливают на бумагу раствор карболового фуксина с избытком и
нагревают препарат над пламенем горелки до легкого появления
паров. При подогревании препарата следят за тем, чтобы краска не
закипела, а фильтровальная бумага не высыхала. Подогретый мазок
оставляют на 5 минут, чтобы краситель проник в клеточную стенку
микобактерий и окрасил ее;
- пинцетом снимают и удаляют фильтровальную бумагу;
- осторожно (!) смывают остатки краски слабой струей
дистиллированной воды до тех пор, пока не прекратится видимое
отхождение краски. При промывании мазков следует использовать
холодную воду или воду комнатной температуры;
- перед тем как нанести на стекло следующий раствор, щипцами
или пинцетом берут каждое стекло за маркированный конец и
наклоняют, чтобы с него стекла вода; это предотвращает разбавление
следующего реактива;
- мазок обесцвечивают 3 минуты одним из обесцвечивающих
растворов, полностью покрывая всю поверхность мазка;
- мазок тщательно промывают дистиллированной водой и
докрашивают в течение до 1 минуты (не превышать экспозицию!) 0,3%
раствором метиленового синего;
- вновь аккуратно промывают проточной водой, наклоняя каждое
стекло, чтобы стекала вода;
- высушивают на открытом воздухе при комнатной температуре в
вертикальном или наклонном положении.
НЕ СЛЕДУЕТ ПРОМОКАТЬ ПРЕПАРАТ!
В результате микобактерии туберкулеза окрашиваются в
малиново-красный цвет, а другие микроорганизмы и клеточные
элементы - в голубой.
При использовании 0,3% раствора метиленового синего для
окраски фона препарата (контрастирующая окраска) следует иметь в
виду, что при толстом мазке или превышении времени окраски этот
краситель может как бы "скрыть" кислотоустойчивые микобактерии.
Если в процессе окраски произошло загрязнение краской нижней
свободной от мазка поверхности предметного стекла, перед
микроскопией следует аккуратно протереть ее тампоном, смоченным
солянокислым спиртом.
Препарат исследуют с масляной иммерсией в световом микроскопе.
3.3.2. Окраска препаратов для люминесцентной микроскопии
Метод основан на наблюдении микроскопических объектов с
использованием их способности к свечению. По сравнению с методами
обычной микроскопии исследование в свете люминесценции обладает
рядом преимуществ: цветное свечение, высокая степень контрастности
светящихся объектов на темном фоне, значительно большая площадь
поля зрения.
Суть люминесцентной микроскопии заключается в том, что объекты
(бактериальные клетки), окрашенные специальными красителями
(флюорохромами), под действием облучения их ультрафиолетом
испускают излучение в видимом спектре света. В случае, когда
объект не окрашен специальными красителями, ультрафиолетовый свет,
проходя через объектив и попадая на препарат, поглощается
молекулярными структурами объекта и остается невидимым или почти
невидимым для человеческого глаза. Если же какие-либо объекты
окрашены специальным красителем, то молекулы красителя под
действием ультрафиолета возбуждаются и начинают испускать кванты
света в длинноволновой области, иначе говоря - светиться. В этом
случае клетка становится источником света определенного спектра и
хорошо видна на общем темном контрастном фоне препарата.
Источник света должен содержать в своем спектре длину волны,
возбуждающую молекулы красителя, а светофильтры подбираются таким
образом, чтобы добиться хорошего расхождения между длинами волн
возбуждающего ультрафиолетового света и излучения, испускаемого
возбужденными объектами.
При люминесцентной микроскопии используют специальный
микроскоп. Источником света в нем служит кварц-галогеновая или
ртутная лампа. Для красителей системы аурамин/родамин используют
подборку из следующих фильтров (на примере микроскопа РПО8 ЛОМО):
- возбуждающий фильтр ФС 1-4,
- запирающий фильтр СЗС 21-2 и
- нейтральный фильтр БС 8-3.
Светофильтры возбуждения служат для выделения из потока
излучения источника света тех лучей, которые обеспечивают
возбуждение и свечение объекта; эти фильтры устанавливаются в
ветви осветителя.
Запирающий светофильтр служит для ограничения (срезания) света
возбуждения и пропускания только света люминесценции; этот фильтр
устанавливается в наблюдательной ветви.
Наблюдательные (сменные) фильтры имеют разное назначение:
фильтры для защиты глаз от попадания красных и инфракрасных лучей;
теплозащитные фильтры и др. В отечественных микроскопах
применяются фильтры из стекла БС8 для предохранения объектов
микроскопии от выцветания.
Люминесцентные красители (аурамин ОО, родамин С и др.)
связываются с воскоподобными структурами микробной клетки. При
облучении окрашенных клеток возбуждающим светом они начинают
светиться оранжевым или ярко-желтым светом на черном или
темно-зеленом фоне.
За счет свечения вокруг клетки образуется ореол, благодаря
которому видимые размеры светящейся клетки превышают ее физические
размеры. В связи с этим окрашенные флюорохромными красителями
препараты обычно исследуются при увеличении 250x - 450x, тогда как
окрашенные фуксином - при увеличении 800x - 1000x. Разница в
увеличении позволяет микроскописту видеть одновременно в 4 - 10
раз большее поле зрения, что существенно сокращает время,
необходимое для просмотра мазка. Подсчитано, что если
микроскопическое исследование необходимой площади мазка при
окраске по Ziehl-Neelsen продолжается приблизительно 10 минут, то
для исследования той же площади мазка методом люминесцентной
микроскопии потребуется только 2 - 3 минуты.
Наряду с этим при люминесцентной микроскопии отмечается
значительно большая резкость и контрастность микроскопической
картины, что повышает комфортность микроскопического исследования.
Для глаза исследователя значительно легче обнаружить
флюоресцирующие оранжевые или ярко-желтые микобактерии на темном
(при гашении фона метиленовым синим или перманганатом калия) или
темно-красном (при гашении фона акридиновым оранжевым) фоне, чем
выявить красные микобактерии на голубом фоне клеточного детрита
при окраске по Ziehl-Neelsen. Это делает метод люминесцентной
микроскопии особенно ценным при исследовании олигобациллярного
материала.
Указанные преимущества наиболее выражены при использовании
люминесцентной микроскопии в лабораториях, выполняющих ежедневно
большое число исследований (порядка 30 и более).
Мазки для люминесцентной микроскопии предпочтительно готовить
из осадка после обработки материала детергентом с последующим
отмыванием и центрифугированием. Перед нанесением материала осадка
на предметное стекло необходимо добиться нейтрального значения pH
(6,8 - 7,0). С этой целью осадок нейтрализуют несколькими каплями
6% раствора соляной кислоты или 6% едкого натра (в зависимости от
метода обработки материала), тщательно встряхивают и с помощью
бумажной индикаторной полоски определяют уровень pH (оптимально
6,8) осадка.
Во всех сомнительных случаях микроскопической картины для
контроля следует использовать микроскопию мазка, повторно
окрашенного по методу Ziehl-Neelsen.
3.3.2.1. Оборудование и реактивы для окраски флюорохромными
красителями:
- раковина или специальный вместительный лоток для проведения
окраски;
- специальный штатив ("рельсы") для окраски мазков на
предметных стеклах;
- пинцет или щипцы для взятия предметных стекол с мазками;
- газовая или спиртовая горелка для фиксации препарата, если
|
