|
Стр. 17
- между каплями должны оставаться сухие промежутки.
Индикаторные полоски высушивают в темноте при комнатной
температуре в течение 24 часов. Затем для получения более четких
результатов наносят повторно 1 каплю хлорамина "Б" на уже высохшую
каплю этого раствора. Полоски вновь высушивают, затем помещают в
пробирки, закрывают резиновыми пробками и хранят в холодильнике.
Полоски пригодны к употреблению в течение 3 месяцев.
Процедура исследования:
- добавить в пробирку с исследуемой культурой микобактерий 1 -
1,5 мл стерильной дистиллированной воды. При наличии сливного
роста проткнуть поверхность среды в нескольких местах пипеткой для
облегчения доступа раствора к питательной среде;
- поместить пробирку в термостат на 2 - 3 часа в
полугоризонтальном положении с тем, чтобы жидкость покрывала всю
поверхность среды;
- вынуть пробирку из термостата и перевести ее в вертикальное
положение, позволив жидкости стечь на дно в течение 5 - 6 минут;
- в чистую стерильную пробирку перенести пипеткой 0,5 - 0,6 мл
экстракта;
- индикаторную полоску помеченным карандашом концом, на
который нанесена ПАСК, опустить с помощью пинцета в пробирку с
экстрактом, не допуская смачивания экстрагирующей жидкостью
средней части полоски, на которую был нанесен роданистый калий;
- немедленно закрыть пробирку резиновой пробкой;
- оставить при комнатной температуре на 15 - 30 минут;
допустимо осторожно покачивать пробирку, пока вся полоска не
пропитается экстрактом;
- наблюдать за окрашиванием жидкости на дне пробирки на белом
фоне.
При положительном ниациновом тесте экстракт окрашивается в
желтый цвет разной интенсивности. Любая окраска индикаторной
полоски не принимается во внимание, так как это может происходить
вследствие окисления реактивов в верхней части полоски. Для
дегазации пробирок после проведения реакции пользуются 10%
раствором нашатырного спирта, 10% раствором едкого натра или любым
щелочным дезинфицирующим средством.
5.2.2. Тест на наличие нитратредуктазы
При дифференциации микобактерий туберкулеза применяется также
реакция восстановления нитратов в нитриты. Реакция восстановления
нитратов дает возможность дифференцировать микобактерии
человеческого вида, обладающие нитратредуктазой, от микобактерий
бычьего и птичьего видов и от некоторых нетуберкулезных
микобактерий, у которых этот фермент отсутствует. Из всех
микобактерий нитратредуктазная активность наиболее выражена у
M.tuberculosis. Это позволяет использовать данный тест в сочетании
с ниациновым тестом для дифференциальной диагностики
M.tuberculosis и микобактерий других видов.
Для определения способности микобактерий редуцировать нитраты
используют 4-недельные культуры с обильным ростом, выращенные на
среде Левенштейна-Йенсена.
Принцип метода заключается в определении активности
нитратредуктазы по количеству восстановленного нитрита из нитрата,
что сопровождается цветной реакцией с
парадиметиламинобензальдегидом.
5.2.2.1. Классический метод
Приготовление реактивов
Раствор 1. Нитрат натрия в фосфатном буфере.
0,01 М раствор нитрита натрия в 0,022 М фосфатном буферном
растворе (pH = 7,0) готовится следующим образом:
А. 3,02 г KH2PO4 растворить в 1000 мл дистиллированной воды.
Б. 3,16 г Na2HPO4 растворить в 1000 мл дистиллированной воды.
В. 611 мл раствора Б добавить к 389 мл раствора А, хорошо
смешать (величина pH раствора должна составлять 7,0).
В 1000 мл полученного буферного раствора (В) растворить 0,85 г
NaNO3.
Разлить полученный раствор 1 в емкости по 100 мл.
Стерилизовать в автоклаве при 121 -C в течение 15 минут. При
необходимости этот раствор можно переносить по 2 мл в пробирки с
завинчивающимися крышками.
Раствор 2. Раствор соляной кислоты.
Концентрированная соляная кислота 10 мл
Дистиллированная вода 10 мл.
Медленно влить концентрированную соляную кислоту в
дистиллированную воду, чтобы получить разведение 1:1.
НИКОГДА НЕ ВЛИВАЙТЕ ВОДУ В КИСЛОТУ!
Хранить полученную смесь в герметически закрытой бутыли из
темного стекла в холодильнике.
Раствор 3. Раствор сульфаниламида (0,2%).
Сульфаниламид 0,2 г
Дистиллированная вода 100 мл.
Растворить сульфаниламид в дистиллированной воде. Хранить
полученную смесь в герметически закрытой бутыли из темного стекла
в холодильнике.
Раствор 4. Раствор N-нафтилэтилендиамина (0,1%).
N-нафтилэтилендиамин 0,1 г
Дистиллированная вода 100 мл.
Растворить нафтилэтилендиамин в дистиллированной воде. Хранить
полученную смесь в герметически закрытой бутыли из темного стекла
в холодильнике.
Контроль реактивов
Перед выполнением теста необходимо проконтролировать
пригодность реактивов:
отрицательный контроль - тест с экстрактом из пробирки с
незасеянной средой;
положительный контроль - тест с экстрактом референс-штамма
М.tuberculosis H37Rv.
ПРОЦЕДУРА ВЫПОЛНЕНИЯ КЛАССИЧЕСКОГО ТЕСТА
-----------------------------------------------------------------¬
¦Внести 0,2 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия¦
¦ в пробирку с завинчивающейся крышкой ¦
L-----------------------------------------------------------------
¦
\/
-----------------------------------------------------------------¬
¦ С помощью стерильной бактериологической петли или лопатки ¦
¦ суспендировать в этом растворе четырехнедельную культуру ¦
¦ микобактерий (использовать две лопатки биомассы бактерий) ¦
L-----------------------------------------------------------------
¦
\/
-----------------------------------------------------------------¬
¦ Добавить 2 мл раствора 1 (раствор нитрата натрия в буфере) ¦
L-----------------------------------------------------------------
¦
\/
-----------------------------------------------------------------¬
¦ Хорошо встряхнуть и оставить на 3 часа в водяной бане при ¦
¦ температуре 37 -C ¦
L-----------------------------------------------------------------
¦
\/
-----------------------------------------------------------------¬
¦ Добавить в следующем порядке: ¦
¦ 1 каплю разведенной соляной кислоты (раствор 2), ¦
¦ хорошо встряхнуть пробирку; ¦
¦ 2 капли 0,2% раствора сульфаниламида (раствор 3); ¦
¦ 2 капли 0,1% раствора N-нафтилэтилендиамина (раствор 4) ¦
L-----------------------------------------------------------------
¦
\/
-----------------------------------------------------------------¬
¦ Немедленно проконтролировать появление розового или красного ¦
¦ окрашивания, сравнив его интенсивность с цветовым стандартом ¦
L-----------------------------------------------------------------
Результаты и их интерпретация
Отрицательный результат - окрашивания нет. Если раствор
остается бесцветным, это означает, что результат теста
отрицательный или что процесс восстановления прошел слишком
быстро, при этом нитриты восстановились до нитридов. Для того
чтобы убедиться в истинности результата, необходимо добавить в
пробирку немного порошка цинка (небольшой объем порошка цинка
перенесите из флакона на кончике слегка увлажненного аппликатора).
а) Если в растворе остался нитрат, цинк катализирует реакцию и
появится красное окрашивание, что свидетельствует об истинно
отрицательном результате теста.
б) Если после добавления порошка цинка красного окрашивания
раствора не произошло, это означает, что результат теста
положителен, но процесс восстановления прошел стадию нитрита.
Повторить тест, чтобы подтвердить его результат.
Градации интенсивности окраски:
Бледно-розовая = +/-
Розовая = 1+
Темно-розовая = 2+
Красная = 3+
Темно-красная = 4+
Пурпурно-красная = 5+.
Положительным результат считают только в тех случаях, когда
интенсивность окраски составляет от 3+ до 5+.
5.2.2.2. Модифицированный метод с использованием бумажных
полосок
Для определения способности бактерий редуцировать нитраты
можно использовать коммерческие бумажные полоски. При
использовании данной модификации нитратредуктазного теста надежные
результаты получаются в тех случаях, когда микобактерии интенсивно
редуцируют нитраты (например, М.tuberculosis). Поэтому при
идентификации микобактерий туберкулеза этот метод дает вполне
приемлемые результаты и позволяет сократить трудозатраты, хотя
стоимость бумажных полосок значительно выше.
ПРОЦЕДУРА ВЫПОЛНЕНИЯ ТЕСТА
-----------------------------------------------------------------¬
¦Внести 1 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия в¦
¦ пробирку с завинчивающейся крышкой ¦
L-----------------------------------------------------------------
¦
\/
-----------------------------------------------------------------¬
¦ С помощью бактериологической лопатки суспендировать в этом ¦
¦изотоническом растворе четырехнедельную культуру микобактерий в ¦
¦ объеме 2-х лопаток ¦
L-----------------------------------------------------------------
¦
\/
-----------------------------------------------------------------¬
¦ С помощью стерильного пинцета аккуратно внести в пробирку ¦
¦ бумажную полоску для нитратредуктазного теста; при этом не ¦
¦ допускается увлажнение полоски каплями жидкости на стенках ¦
¦ пробирки ¦
L-----------------------------------------------------------------
¦
\/
-----------------------------------------------------------------¬
¦ Тщательно закрыть крышку и оставить пробирку в вертикальном ¦
¦ положении на 2 часа при температуре 37 -C. ¦
¦ После первого часа инкубации осторожно встряхнуть пробирку, не ¦
¦ наклоняя ее и не переворачивая ¦
L-----------------------------------------------------------------
¦
\/
-----------------------------------------------------------------¬
¦После двух часов инкубации пробирку шестикратно наклонить, чтобы¦
¦ индикаторная полоска смочилась полностью ¦
L-----------------------------------------------------------------
¦
\/
-----------------------------------------------------------------¬
¦ Оставить пробирку на 10 минут в наклонном положении, чтобы ¦
¦ жидкость покрывала всю полоску ¦
L-----------------------------------------------------------------
¦
\/
-----------------------------------------------------------------¬
¦Появление красного окрашивания в верхней части полоски означает ¦
¦ положительный результат теста ¦
L-----------------------------------------------------------------
Результаты и их интерпретация
Отрицательный результат - отсутствие окрашивания.
Положительный результат - верхняя часть полоски приобретает
красный цвет (оттенок от розового до темно-красного).
Предосторожности
Перед проведением теста убедиться, что срок годности
коммерческих тест-полосок не истек.
Полоски чувствительны к солнечному свету, а также к повышенной
температуре и влажности, поэтому их следует хранить в оригинальной
упаковке в непрозрачном контейнере с крышкой при температуре 2 - 8
-C.
Не следует использовать обесцвеченные полоски. Если полоски
обесцветились, они подлежат уничтожению, так как произошло
снижение активности реагента.
Результаты следует расценивать как сомнительные, если в
положительном контроле получены слабоположительные или
отрицательные результаты.
Стандарты интенсивности окраски, характеризующие активность
нитратредуктазы
Чтобы обеспечить унификацию положительных результатов теста по
выявлению способности микобактерий восстанавливать нитраты,
рекомендуется использовать заранее приготовленную серию
стандартов, соответствующих различной активности нитратредуктазы.
Активность этой ферментной системы выражается в интенсивности
окраски - от "+/-" до "5+" (см. выше). Эти стандарты можно хранить
неопределенно долго и использовать при каждой постановке
нитратредуктазного теста.
Реагенты
Растворы:
1. 0,067 М раствор фосфата натрия двузамещенного (9,47 г
безводного Na2HPO4 на 1000 мл воды).
2. 0,067 М раствор фосфата калия однозамещенного (9,07 г
KH2PO4 на 1000 мл воды).
3. 0,067 M раствор фосфата натрия трехзамещенного (25,47 г
Na3PO4 x 12H2O на 1000 мл воды).
4. 1% спиртовой раствор фенолфталеина (1 г на 100 мл 95%
этилового спирта).
5. 1% спиртовой раствор бромтимолового синего (1 г на 100 мл
95% этилового спирта).
6. 0,01% раствор бромтимолового синего: внести 1,0 мл 1%
раствора бромтимолового синего в 100 мл дистиллированной воды.
Рабочий буферный раствор:
Смешать 35 мл раствора N 1, 5 мл раствора N 2 и 100 мл
раствора N 3.
7. К 10 мл рабочего буферного раствора добавить 0,1 мл
раствора N 4 и 0,2 мл раствора N 6.
Процедура:
Поставить в штатив 8 чистых пробирок (пробирки N 1 - 8).
Внести 2 мл рабочего буферного раствора в 7 пробирок (с N 2 до
N 8).
Внести 2 мл раствора N 7 в пробирку N 1. Это - цветовой
стандарт, соответствующий реакции максимальной интенсивности
("5+").
В пробирку N 2 внести 2 мл раствора N 7. Хорошо перемешать и
перенести 2 мл в следующую пробирку (N 3). Продолжить серию
двукратных разведений вплоть до пробирки N 8, из которой вылить 2
мл смеси.
В результате будут получены следующие цветовые стандарты:
пробирка N 1 = 5+
пробирка N 2 = 4+
пробирка N 3 = 3+
пробирка N 5 = 2+
пробирка N 6 = 1+
пробирка N 8 = +/-.
Автоклавировать пробирки, закрыть их герметично и хранить при
5 -C.
5.2.3. Каталазный тест
Каталаза - это внутриклеточный растворимый фермент, который
способен расщеплять перекись водорода на воду и кислород, т.е.
обеспечивать следующую химическую реакцию: 2H2O2 = 2H2O + O2. При
этом в реагирующей смеси образуются пузырьки кислорода, что
указывает на наличие каталазной активности. Почти все виды
микобактерий обладают каталазной активностью, за исключением
М.bovis и некоторых резистентных к изониазиду штаммов
М.tuberculosis.
В клетках микобактерий присутствует ряд изоферментов каталазы,
отличающихся по термостабильности. Необходимо отметить, что
нетуберкулезные микобактерии и некоторые сапрофиты синтезируют
термостабильную каталазу.
При изучении каталазной активности микобактерий используют как
качественные, так и количественные тесты:
- качественный (капельный) тест, указывающий на наличие
каталазы (выполняется при комнатной температуре);
- полуколичественный тест, указывающий на уровень каталазной
активности (измеряется высотой столбика пузырьков в пробирке);
- тест на термостабильность каталазы - тест определения
наличия каталазы при 68 -C и pH = 7,0.
Чувствительные к противотуберкулезным препаратам штаммы
M.tuberculosis продуцируют каталазу, активность которой определяют
капельным методом. При постановке полуколичественного теста
столбик пузырьков газа не превышает 45 мм.
ПОСЛЕ ПРОГРЕВАНИЯ БАКТЕРИЙ ПРИ 68 -C И PH = 7,0 В ТЕЧЕНИЕ 20
МИНУТ МИКОБАКТЕРИИ КОМПЛЕКСА M.TUBERCULOSIS ДАЮТ ОТРИЦАТЕЛЬНЫЙ
РЕЗУЛЬТАТ.
Для постановки этих тестов следует использовать двухнедельные
культуры, дорощенные на среде Левенштейна-Йенсена при 35 - 37 -C.
Для выполнения указанных тестов пробирки с питательной средой
помещают в свертыватель для коагуляции в вертикальном положении.
При инкубации в стандартных условиях пробирки должны быть закрыты
пробками, обеспечивающими газообмен и влажность. Продолжительность
инкубации - 14 дней.
Реактивы:
0,067 М фосфатный буферный раствор, pH = 7,0.
Раствор 1:
Na2HPO4 безводный 9,47 г
Дистиллированная вода 1000 мл.
Растворить навеску Na2HPO4 в дистиллированной воде, чтобы
получить 0,067 М раствор.
Раствор 2:
KH2PO4 9,07 г
Дистиллированная вода 1000 мл.
Растворить навеску KH2PO4 в дистиллированной воде, чтобы
получить 0,067 М раствор.
Дня получения 0,067 М фосфатного буфера смешать 611 мл
раствора 1 и 389 мл раствора 2.
Раствор 3. Перекись водорода, 30%.
30% раствор перекиси водорода (H2O2) хранят в холодильнике.
Проверить, чтобы при постановке теста был использован 30%
раствор перекиси водорода, а не 3% раствор, который обычно
получают из аптек.
При работе с 30% раствором перекиси водорода используют
резиновые перчатки и защитный щиток для глаз.
Раствор 4. 10% твин 80:
Твин 80 10 мл
Дистиллированная вода 90 мл.
Смешать твин 80 с дистиллированной водой и автоклавировать при
121 -C в течение 10 минут. В процессе автоклавирования твин 80
может образовать осадок, который можно растворить при покачивании
флакона сразу же после автоклавирования или в процессе охлаждения.
Готовый раствор хранить в холодильнике.
Готовый каталазный реагент (смесь твина с перекисью водорода).
Непосредственно перед постановкой теста смешать равные объемы
10% раствора твина 80 и 30% раствора перекиси водорода. Для
исследования каждого штамма требуется 1,0 мл каталазного реагента.
Контроли для тестов:
Капельный метод
В качестве отрицательного контроля используют пробирку со
средой Левенштейна-Йенсена без инокуляции культурой микобактерий,
а в качестве положительного контроля - пробирку с референс-штаммом
М.tuberculosis H37Rv, выращенным на среде Левенштейна-Йенсена.
Полуколичественный метод и тест на термостабильность каталазы
при 68 -C
В качестве отрицательного контроля используют пробирку со
средой Левенштейна-Йенсена без инокуляции культурой микобактерий,
а в качестве положительного контроля - пробирку с референс-штаммом
М.terrae, выращенным на среде Левенштейна-Йенсена.
Процедура исследования:
Капельный метод
Для постановки теста использовать двухнедельную культуру
микобактерий на среде Левенштейна-Йенсена, заранее убедившись в
наличии роста микобактерий. В пробирку с ростом микобактерий
добавить 1 - 2 капли свежеприготовленной смеси твина 80 с
перекисью водорода (готовый каталазный реагент). Наблюдать в
течение 5 минут, происходит ли образование пузырьков газа.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ИНТЕРПРЕТАЦИЯ
-----------------------------T-----------------------------------¬
¦Отрицательный ¦Пузырьки газа не образуются ¦
+----------------------------+-----------------------------------+
¦Положительный ¦Несколько медленно образующихся ¦
¦(медленный) ¦пузырьков (1 - 3 мин.) ¦
+----------------------------+-----------------------------------+
¦Положительный ¦Немедленное бурное образование ¦
¦(быстрый) ¦пузырьков ¦
L----------------------------+------------------------------------
Полуколичественный метод
Для постановки теста использовать двухнедельную культуру
микобактерий на среде Левенштейна-Йенсена, заранее убедившись в
наличии роста микобактерий. В пробирку с ростом микобактерий
добавить 1 мл свежеприготовленной смеси твина-80 с перекисью
водорода, плотно закрыть пробирку и оставить на 5 минут при
комнатной температуре. В пробирке образуется столбик пены.
Измерить высоту этого столбика от уровня жидкости в пробирке
до верхнего края пены.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ИНТЕРПРЕТАЦИЯ
------------------------------T----------------------------------¬
¦Каталазная активность слабая ¦Высота столбика пены менее 31 мм ¦
¦или отсутствует ¦ ¦
+-----------------------------+----------------------------------+
¦Неопределенный результат ¦Высота столбика пены от 31 мм ¦
¦ ¦до 45 мм ¦
+-----------------------------+----------------------------------+
¦Высокая каталазная активность¦Высота столбика пены более 45 мм ¦
L-----------------------------+-----------------------------------
Тест на термостабильность катализы при 68 -C и pH = 7,0
ПРОЦЕДУРА ИССЛЕДОВАНИЯ
-----------------------------------------------------------------¬
¦ С помощью стерильной пипетки внести с соблюдением правил ¦
¦асептики 0,5 мл 0,067 М фосфатного буферного раствора (pH = 7,0)¦
¦ в пробирку размерами 16 x 125 мм с завинчивающейся крышкой ¦
L-----------------------------------------------------------------
¦
\/
-----------------------------------------------------------------¬
¦ С помощью стерильной бактериологической петли или лопатки ¦
¦суспендировать в этом растворе исследуемую культуру микобактерий¦
¦ (использовать несколько петель биомассы) ¦
L-----------------------------------------------------------------
¦
\/
-----------------------------------------------------------------¬
¦Поставить пробирки с бактериальными суспензиями в предварительно¦
¦ нагретую водяную баню на 2 часа при температуре 68 -C. ¦
¦ Температура и продолжительность инкубации имеют чрезвычайно ¦
¦ важное значение ¦
L-----------------------------------------------------------------
¦
\/
-----------------------------------------------------------------¬
¦ Вынуть пробирки из водяной бани и оставить при комнатной ¦
¦ температуре до полного остывания ¦
L-----------------------------------------------------------------
¦
\/
-----------------------------------------------------------------¬
¦Внести в каждую пробирку 0,5 мл свежеприготовленной смеси твина ¦
¦ 80 с перекисью водорода и плотно закрыть пробки ¦
L-----------------------------------------------------------------
¦
\/
-----------------------------------------------------------------¬
¦Наблюдать за образованием пузырьков, появляющихся на поверхности¦
¦ жидкости. Не встряхивать пробирку, так как при этом твин 80 ¦
¦ может спонтанно образовывать пузырьки, что станет причиной ¦
¦ ложноположительного результата ¦
L-----------------------------------------------------------------
¦
\/
-----------------------------------------------------------------¬
¦ Пробирки с отрицательными результатами не выбрасывать раньше ¦
¦ чем через 20 минут ¦
L-----------------------------------------------------------------
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ИНТЕРПРЕТАЦИЯ
----------------------------T-----T------------------------------¬
¦Положительный результат ¦ + ¦Образуются пузырьки газа ¦
+---------------------------+-----+------------------------------+
¦Отрицательный результат ¦ - ¦Пузырьков газа нет ¦
L---------------------------+-----+-------------------------------
В редких случаях может наблюдаться небольшое количество
пузырьков, поднимающихся от осадка бактериальных клеток; при этом
пена в пробирке не образуется. В таких случаях результаты
каталазного теста также считают положительными.
5.2.4. Тест с салициловокислым натрием (салициловый тест)
Микобактерии комплекса М.tuberculosis не обладают способностью
утилизировать салициловокислый натрий, который оказывает на рост
микобактерий туберкулеза угнетающее воздействие. Это свойство
салицилата натрия используется как один из основных биохимических
методов дифференциации М.tuberculosis и нетуберкулезных
микобактерий.
Для проведения этого теста готовят среду Левенштейна-Йенсена,
в состав которой до свертывания вводят салицилат натрия в
количестве, позволяющем получить концентрацию препарата, равную
1000 мкг/мл. В качестве контрольной используют пробирку со
стандартной средой Левенштейна-Йенсена.
Указанный тест чаше всего ставят одновременно с постановкой
опыта по определению лекарственной устойчивости, добавляя к набору
пробирок 1 пробирку с 1000 мкг/мл салициловокислого натрия. Посев
суспензии исследуемой культуры микобактерий и учет результатов
теста производят одновременно с посевом на среды, содержащие
противотуберкулезные препараты, и учетом лекарственной
устойчивости.
Микобактерии комплекса M.tuberculosis не дают роста на среде с
салициловокислым натрием.
При наличии лекарственной устойчивости ко всем основным
противотуберкулезным препаратам необходимо убедиться, что
исследуемая культура не принадлежит к нетуберкулезным
микобактериям, для которых этот феномен является характерным. При
этом следует иметь в виду, что видимый рост на среде с
салициловокислым натрием появляется значительно позже срока,
установленного для учета лекарственной устойчивости. Поэтому в
таких случаях после учета результатов определения лекарственной
устойчивости контрольную пробирку и пробирку с салициловокислым
натрием следует сбрасывать не сразу, а лишь после окончания всех
дифференцирующих тестов.
5.3. Дополнительные биохимические тесты
Для принципиального отличия микобактерий комплекса
M.tuberculosis от нетуберкулезных микобактерий применяются
вышеперечисленные в таблице 6 дополнительные биохимические тесты.
Все химические вещества, используемые в этих тестах, обладают
способностью подавлять рост микобактерий комплекса M.tuberculosis.
Во всех тестах применяется специально приготовленная среда
Левенштейна-Йенсена, содержащая соответственно: 500 мкг/мл
паранитробензойной кислоты или 5% натрия хлорида. В качестве
контроля в каждом из тестов используется пробирка со стандартной
средой Левенштейна-Йенсена.
5.3.1. Тест с паранитробензойной кислотой (PNB-тест)
В лабораториях, в которых оборудование и/или отсутствие
реагентов не позволяют производить постановку ниацинового и
нитратредуктазного тестов, для идентификации микобактерий
туберкулеза может быть использована комбинация одного или
нескольких описанных выше каталазных тестов, а также определение
способности к росту при 37 -C на среде Левенштейна-Йенсена,
содержащей паранитробензойную кислоту (PNB-тест).
Приготовление среды с паранитробензойной кислотой
50 мг паранитробензойной кислоты (ПНБ) хорошо растирают в
ступке, добавляют 5 мл дистиллированной воды и примерно 20 капель
(1,0 мл) 4% едкого натра до pH = 8. После полного растворения ПНБ
добавляют 2 - 3 капли 6% соляной кислоты, доводя pH до 7,0.
Полученный раствор добавляют к 95 мл предварительно
профильтрованной яичной среды, получая таким образом конечную
концентрацию паранитробензойной кислоты в среде, равную 500
мкг/мл. Свертывание среды производят в обычном порядке.
Процедура исследования
Перед проведением теста необходимо приготовить пробирки с
питательной средой Левенштейна-Йенсена, содержащей
паранитробензойную кислоту в концентрации 500 мкг/мл. В качестве
контроля используются пробирки со стандартной средой
Левенштейна-Йенсена.
Произвести посев в две пробирки со средой Левенштейна-Йенсена,
одна из которых содержит паранитробензойную кислоту в концентрации
500 мкг/л, другая - контрольная без паранитробензойной кислоты.
В процессе инкубации при 37 -C пробирки исследуются на 3-й,
7-й, 14-й и 21-й день.
5.3.2. Тест с 5% хлоридом натрия
Данный тест используется для дифференциации микобактерий
комплекса М.tuberculosis и выполняется аналогично тесту с
паранитробензойной кислотой на среде Левенштейна-Йенсена,
содержащей 5% хлорида натрия. Метод основан на способности ряда
видов нетуберкулезных микобактерий расти на среде, содержащей 5%
хлорида натрия. Микобактерии комплекса М.tuberculosis на этой
среде не растут.
5.3.3. Пиразинамидазный тест
Тест применяется как дополнительный для дифференциации
М.tuberculosis от М.bovis. Тест основан на способности
М.tuberculosis в течение 4-х дней дезаминировать пиразинамид до
пиразиновой кислоты и аммония, что указывает на наличие
пиразинамидазы. М.bovis не проявляет пиразинамидазной активности
даже после 7 дней инкубации.
5.3.4. Тест с гидразидом тиофен-2-карбоксиловой кислоты (ТСН)
Тест используется для дифференциации М.bovis от М.tuberculosis
и других медленнорастущих микобактерий. Только М.bovis
чувствительны к низким концентрациям ТСН (от 1 до 5 мкг/мл).
М.tuberculosis и другие микобактерии обычно устойчивы к действию
этого химического соединения.
Микобактерии комплекса M.tuberculosis
характеризует следующая совокупность признаков
-----------------------------------------------------------------¬
¦Медленная скорость роста (более 3-х недель). ¦
¦Температура роста в пределах 35 - 37 -C. ¦
¦Отсутствие пигментообразования (цвет слоновой кости). ¦
¦Выраженная кислотоустойчивая окраска. ¦
¦Положительный ниациновый тест. ¦
¦Положительный нитратредуктазный тест. ¦
¦Отсутствие термостабильной каталазы (68 -C). ¦
¦Отсутствие роста на среде Левенштейна-Йенсена, содержащей: ¦
¦- 1000 мкг/мл натрия салициловокислого; ¦
¦- 500 мкг/мл паранитробензойной кислоты; ¦
¦- 5% хлорида натрия. ¦
¦Рост в присутствии 1 - 5 мкг/мл ТСН. ¦
L-----------------------------------------------------------------
VI. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ
МИКОБАКТЕРИЙ К ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫМ ПРЕПАРАТАМ
Определение спектра и степени устойчивости микобактерий к
противотуберкулезным препаратам имеет важное значение для тактики
химиотерапии больных, контроля за эффективностью лечения,
определения прогноза заболевания и проведения эпидемиологического
мониторинга лекарственной устойчивости микобактерий в пределах
отдельной территории, страны и мирового сообщества. Степень
лекарственной устойчивости микобактерий определяется в
соответствии с установленными критериями, которые зависят как от
противотуберкулезной активности лекарственного препарата, так и
его концентрации в очаге поражения, величины максимальной
терапевтической дозы, фармакокинетики препарата и многих других
факторов.
В настоящее время для определения лекарственной устойчивости
микобактерий к противотуберкулезным препаратам в международной
практике используются следующие методы:
- метод пропорций на среде Левенштейна-Йенсена или на среде
Миддлбрука 7Н10;
- метод абсолютных концентраций на плотной яичной среде
Левенштейна-Йенсена;
- метод коэффициента резистентности;
- радиометрический метод Bactec R 460.
Выбор того или иного метода определяется традиционно
сложившимися методическими подходами, используемыми в данной
стране. Однако необходимо иметь в виду, что обязательным условием
эффективного мониторинга, обеспечения эпидемиологического надзора
за лекарственной устойчивостью микобактерий и распространением
лекарственно-устойчивых штаммов возбудителя, а также сопоставления
результатов исследований и эффективности лечения в масштабах
страны должен использоваться только один из предложенных
унифицированных методов.
В нашей стране получило распространение определение
лекарственной устойчивости методом абсолютных концентраций на
среде Левенштейна-Йенсена.
При всех методах определения лекарственной устойчивости
необходимым звеном в деятельности лаборатории является обеспечение
контроля качества исследований.
6.1. Виды лекарственной устойчивости
Чувствительность микобактерий к противотуберкулезным
препаратам определяется неспособностью штамма расти на среде,
содержащей препарат, при стандартных условиях постановки опыта.
Чувствительными к данному препарату считаются те штаммы
микобактерий, на которые этот препарат в критической концентрации
оказывает бактерицидное или бактериостатическое действие в
соответствии с принятым критерием устойчивости.
Устойчивость (резистентность) определяется как снижение
чувствительности до такой степени, что данный штамм микобактерий
способен размножаться при воздействии на него препарата в
критической или более высокой концентрации.
Наряду с понятиями "чувствительность" и "устойчивость" к
противотуберкулезным препаратам в настоящее время используются
также термины, определяющие различные аспекты лекарственной
устойчивости. Так, в случае наличия лекарственной устойчивости к
двум или более лекарственным препаратам данный штамм микобактерий
определяется как полирезистентный.
Особое место среди полирезистентных занимают микобактерии, у
которых обнаруживается лекарственная устойчивость к двум основным
противотуберкулезным препаратам (изониазиду и рифампицину) -
штаммы, обладающие лекарственной устойчивостью одновременно к
изониазиду и рифампицину, независимо от наличия устойчивости к
другим противотуберкулезным препаратам, обозначаются как штаммы с
множественной лекарственной устойчивостью (или штаммы с МЛУ).
Этим штаммам уделяется особое внимание, так как лечение
пациентов, у которых процесс вызван такими штаммами, представляет
большие трудности. Оно является длительным, дорогостоящим и
требует использования препаратов резервного ряда, многие из
которых дорогостоящие и могут вызывать тяжелые побочные реакции.
Кроме того, некоторые штаммы с множественной лекарственной
устойчивостью обладают повышенной способностью к распространению
(трансмиссивностью) и вызывают тяжелые прогрессирующие формы
заболевания, нередко приводящие к неблагоприятным исходам.
Наряду с перечисленными определениями различных видов спектра
лекарственной устойчивости микобактерий, в международной практике
принято различать первичную и приобретенную лекарственную
устойчивость.
Первичная лекарственная устойчивость определяется как
устойчивость, обнаруженная у микобактерий, выделенных от пациента,
никогда не принимавшего противотуберкулезные препараты или
получавшего такое лечение менее одного месяца. В данном случае
подразумевается, что больной заразился лекарственно-устойчивым
штаммом микобактерий. Первичная лекарственная устойчивость
характеризует состояние микобактериальной популяции, циркулирующей
в данной территории, и ее показатели важны для оценки степени
напряженности эпидемической ситуации.
Приобретенная (вторичная) лекарственная устойчивость
определяется как устойчивость микобактерий, выявленных у больного
туберкулезом, получавшего лечение противотуберкулезными
препаратами в течение месяца и более. Вторичная лекарственная
устойчивость является косвенным показателем эффективности
проводимой химиотерапии.
6.2. Критерии лекарственной устойчивости
Уровень устойчивости данного штамма в целом выражается той
максимальной концентрацией препарата (количество мкг в 1 мл
питательной среды), при которой еще наблюдается размножение
микобактерий (по числу колоний на плотных средах).
Лекарственно-устойчивые микроорганизмы способны размножаться
при таком содержании препарата в среде, которое оказывает на
чувствительные особи бактериостатическое или бактерицидное
воздействие.
Критические концентрации. Критерии лекарственной устойчивости.
Для различных препаратов установлена определенная критическая
концентрация. Она имеет клиническое значение, так как отражает
воздействие препарата на микобактерии туберкулеза в условиях
макроорганизма.
КРИТЕРИЕМ УСТОЙЧИВОСТИ МИКОБАКТЕРИАЛЬНОЙ ПОПУЛЯЦИИ НАЗЫВАЮТ
ПОКАЗАТЕЛЬ РОСТА МИКОБАКТЕРИАЛЬНОГО ПУЛА, ВЫРАЖЕННЫЙ В АБСОЛЮТНЫХ
(ЧИСЛО КОЕ) ИЛИ ОТНОСИТЕЛЬНЫХ ЕДИНИЦАХ (ПРОПОРЦИЯ КОЕ), НА
ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЕ, СОДЕРЖАЩЕЙ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫЙ ПРЕПАРАТ В
КРИТИЧЕСКОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ, ПРЕВЫШЕНИЕ КОТОРОГО СЧИТАЕТСЯ НАЛИЧИЕМ
ПРИЗНАКА УСТОЙЧИВОСТИ МИКОБАКТЕРИЙ.
Для метода абсолютных концентраций появление более 20 КОЕ
микобактерий на питательной среде, содержащей лекарственный
препарат в критической концентрации, свидетельствует о том, что
данный штамм микобактерий обладает лекарственной устойчивостью.
При этом необходимо иметь в виду, что объем засеваемой суспензии
7
клеток стандартизован и соответствует 1 x 10 микробных тел.
Для разных по составу питательных сред критическая
концентрация одного и того же препарата различна. Значения
критических концентраций существенно отличаются также при
использовании разных методов определения лекарственной
чувствительности.
Таблица 8
КРИТИЧЕСКИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ
ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ МЕТОДОМ АБСОЛЮТНЫХ
КОНЦЕНТРАЦИЙ НА СРЕДЕ ЛЕВЕНШТЕЙНА-ЙЕНСЕНА
------------------------------------------T----------------------¬
¦ Название препарата ¦Концентрация в мкг/мл ¦
+-----------------------------------------+----------------------+
¦ Препараты основного ряда ¦
+-----------------------------------------T----------------------+
¦Стрептомицин ¦ 10 ¦
+-----------------------------------------+----------------------+
¦Изониазид ¦ 1 ¦
+-----------------------------------------+----------------------+
¦Рифампицин ¦ 40 ¦
+-----------------------------------------+----------------------+
¦Этамбутол ¦ 2 ¦
+-----------------------------------------+----------------------+
¦ Препараты резервного ряда <*> ¦
+-----------------------------------------T----------------------+
¦Канамицин ¦ 30 ¦
+-----------------------------------------+----------------------+
¦Протионамид (этионамид) ¦ 30 ¦
+-----------------------------------------+----------------------+
¦Циклосерин ¦ 30 ¦
+-----------------------------------------+----------------------+
¦Капреомицин ¦ 30 ¦
+-----------------------------------------+----------------------+
¦Офлоксацин ¦ 2 ¦
+-----------------------------------------+----------------------+
¦ПАСК ¦ 1 ¦
+-----------------------------------------+----------------------+
¦Пиразинамид ¦ 200 ¦
L-----------------------------------------+-----------------------
--------------------------------
<*> Критические концентрации препаратов II ряда носят
ориентировочный характер и будут окончательно установлены после
дополнительных исследований.
6.3. Метод абсолютных концентраций
В России для определения лекарственной устойчивости
микобактерий традиционно используется метод абсолютных
концентраций на плотной яичной питательной среде
Левенштейна-Йенсена.
В большинстве случаев этот метод применяется для непрямого
определения лекарственной устойчивости. Непрямым методом
называется метод определения лекарственной устойчивости после
выделения культуры микобактерий. Он позволяет исследовать любое
количество микобактерий в диагностическом материале, поскольку для
|
