|
Стр. 14
- газовая или спиртовая горелка для фиксации препарата, если
он не фиксирован ранее в сушильном шкафу; или металлический
стержень с ватным тампоном, используемого вместо горелки для
фиксации препарата, если он не фиксирован ранее в сушильном шкафу;
- раствор флюоресцентных красителей;
- раствор для обесцвечивания мазков;
- раствор для гашения фона обесцвеченного мазка;
- емкость с дистиллированной водой для промывания мазков;
- штатив для просушивания окрашенных стекол на воздухе в
вертикальном или наклонном положении.
ПРИ ОКРАСКЕ ФЛЮОРОХРОМНЫМИ КРАСИТЕЛЯМИ НИ В КОЕМ СЛУЧАЕ НЕЛЬЗЯ
ПОДОГРЕВАТЬ МАЗКИ И ПОЛЬЗОВАТЬСЯ НАКЛАДКАМИ ИЗ ФИЛЬТРОВАЛЬНОЙ
БУМАГИ!
Промывание мазков в процессе окраски следует производить
только дистиллированной водой, так как водопроводная вода содержит
соединения хлора, которые могут изменять флюоресценцию.
В случае невозможности проведения немедленной микроскопии
окрашенные мазки рекомендуется сохранять, прикрыв черной бумагой
во избежание ослабления флюоресценции.
При окраске мазков необходимо:
- избегать неполного обесцвечивания;
- не делать толстых мазков, так как это затрудняет
обесцвечивание и фиксацию мазка на стекле.
Мазки, которые использовались для флюоресцентной микроскопии,
в случае сомнений в истинности феномена кислотоустойчивости можно
повторно окрасить по методу Ziehl-Neelsen.
В нашей стране наибольшее распространение получили следующие
методы окраски микобактерий люминесцентными красителями:
3.3.2.2. Метод окраски аурамином ОО и родамином С
Реактивы:
- спирт этиловый 96- марки ОП-2, ТУ 6-09-4512-77;
- кислота соляная концентрированная, ГОСТ 3118-77;
- метиленовый синий хлорид, ТУ 6-09-945-75;
- аурамин ОО (аурамин О-Sigma);
- родамин С, ТУ 6-09-2463-77 (родамин В-Sigma);
- вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72.
Приготовление растворов:
Раствор 1. Раствор аурамина - родамина:
Аурамин ОО 1,0 г
Родамин С 0,1 г
Вода дистиллированная 1000 мл.
Каждый краситель растворяют отдельно в 150 - 200 мл
дистиллированной воды и помещают в термостат при 37 -C на 18 - 24
часа. Затем растворы сливают в одну емкость и доводят общий объем
до 1000 мл.
Приготовленной раствор красителей хранят в емкости из темного
стекла в прохладном, защищенном от света месте.
АУРАМИН ОБЛАДАЕТ КАНЦЕРОГЕННОЙ АКТИВНОСТЬЮ, ПОЭТОМУ НЕ СЛЕДУЕТ
ДОПУСКАТЬ ПОПАДАНИЯ НА КОЖУ ЕГО ПОРОШКА ИЛИ РАСТВОРА.
Раствор 2. Обесцвечивающий раствор:
Концентрированная соляная кислота 3 мл
Этиловый спирт 96- 97 мл.
Аккуратно добавить 3 мл концентрированной соляной кислоты к 97
мл этилового спирта.
ВСЕГДА ОСТОРОЖНО ВЛИВАЙТЕ КИСЛОТУ В СПИРТ, НО НЕ НАОБОРОТ!
Раствор 3. Гаситель фона:
Метиленовый синий хлорид 25 мг
Вода дистиллированная 100 мл.
В 100 мл дистиллированной воды растворить 25 мг метиленового
синего хлорида.
Хранение растворов. Написать на этикетке название раствора,
концентрацию, дату приготовления и срок хранения. Растворы
желательно хранить в темной посуде при комнатной температуре в
течение 3 месяцев. Перед использованием растворов их просматривают
для исключения преципитата. Если последний обнаружен, раствор
можно профильтровать.
Процедура окраски:
1. Стекла с фиксированными мазками раскладывают на специальные
штативы "рельсы" для окраски так, чтобы они не касались друг
друга.
2. Мазки заливают раствором 1 на 1 час.
НЕ НАГРЕВАТЬ МАЗКИ И НЕ ИСПОЛЬЗОВАТЬ ПОЛОСКИ ФИЛЬТРОВАЛЬНОЙ
БУМАГИ!
3. Тщательно, но аккуратно промывают мазки дистиллированной
водой.
4. Обесцвечивают раствором 2 (солянокислый спирт) в течение 3
мин.
5. Промывают дистиллированной водой.
6. Гашение фона осуществляют раствором 3 в течение 60 сек.
Если препарат имеет интенсивную синюю окраску, можно очень
аккуратно повторно промыть его дистиллированной водой.
7. Мазки высушивают при комнатной температуре в вертикальном
или наклонном положении.
3.3.2.3. Метод окраски аурамином О
(Hagemann P.К., 1938; CDC 1985; WHO, 1998)
Реактивы:
- спирт этиловый 96- марки ОП-2, ТУ 6-09-4512-77;
- кислота соляная концентрированная, ГОСТ 3118-77;
- фенол кристаллический (карболовая кислота), ГОСТ 6417-72;
- аурамин О-Sigma (2465-27-2);
- акридиновый оранжевый, С.I.46005; или
- перманганат калия, ГОСТ 10163-76;
- вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72;
- безводный двузамещенный фосфат натрия, ГОСТ 4172-66.
Приготовление растворов:
Раствор 1. Спиртовой раствор аурамина О:
Аурамин 0,1 г
Этиловый спирт 10 мл.
Растворить аурамин в спирте.
Аурамин обладает канцерогенной активностью, поэтому не следует
допускать попадания на кожу его порошка или раствора.
Раствор 2. Раствор фенола:
Фенол кристаллический 3,0 г
Дистиллированная вода 87 мл.
Расплавить кристаллы фенола (температура плавления 41 -C) и
растворить в дистиллированной воде, пользуясь подогреванием на
водяной бане. Довести общий объем до 90 мл.
Раствор аурамина О. Смешать растворы 1 и 2 и перелить в плотно
закрывающуюся емкость из темного стекла, которую необходимо
хранить в прохладном затемненном месте. На этикетке обозначить
название раствора, дату приготовления и срок годности. Готовый
раствор может храниться при комнатной температуре в течение 3
месяцев. В процессе хранения раствор может стать мутным, однако
это не влияет на качество окрашивания.
Раствор 3. Обесцвечивающий раствор:
Концентрированная соляная кислота 0,5 мл
Технический 70- этиловый спирт 100 мл.
Аккуратно добавить концентрированную соляную кислоту к спирту.
ВСЕГДА ОСТОРОЖНО ВЛИВАЙТЕ КИСЛОТУ В СПИРТ, НО НЕ НАОБОРОТ!
Напишите на этикетке название раствора, его концентрацию, дату
приготовления и срок хранения. Раствор можно хранить в темной
посуде при комнатной температуре в течение 3 месяцев.
Растворы 4. Гасители фона:
Для дополнительного окрашивания препаратов можно использовать
растворы перманганата калия или акридинового оранжевого.
а) Раствор перманганата калия:
Перманганат калия (KMnO4) 0,5 г
Дистиллированная вода 100 мл.
Растворить перманганат калия в дистиллированной воде и
перелить в плотно закрывающуюся бутыль из темного стекла. На
этикетке обозначить название раствора, концентрацию, дату
приготовления и срок годности.
Готовый раствор может храниться при комнатной температуре в
течение 3 месяцев.
б) Раствор акридинового оранжевого:
Безводный двузамещенный фосфат натрия (Na2HPO4) 0,01 г
Дистиллированная вода 100 мл
Акридиновый оранжевый 0,01 г.
Растворить фосфат натрия в дистиллированной воде. Добавить
акридиновый оранжевый.
Хранение реактивов. Хранят приготовленные растворы в плотно
закрывающейся темной емкости. На этикетке обозначают название
раствора, дату приготовления и срок годности. Готовый раствор
может храниться при комнатной температуре в темном месте в течение
3 месяцев.
Процедура окраски:
1. Стекла с фиксированными мазками раскладывают на специальные
штативы "рельсы" для окраски так, чтобы они не касались друг
друга.
2. Мазки заливают раствором аурамина О на 15 минут.
НЕ НАГРЕВАТЬ МАЗКИ И НЕ ИСПОЛЬЗОВАТЬ ПОЛОСКИ ФИЛЬТРОВАЛЬНОЙ
БУМАГИ!
3. Тщательно, но аккуратно промывают мазки дистиллированной
водой.
4. Обесцвечивают раствором 3 (0,5% раствор солянокислого
спирта) в течение 2 минут.
5. Промывают дистиллированной водой каждое стекло до тех пор,
пока не смоются остатки краски.
6. Гашение фона осуществляют раствором перманганата калия или
акридинового оранжевого в течение 2 минут.
При использовании перманганата калия время его воздействия не
должно превышать 2 минуты. Точность экспозиции имеет решающее
значение, так как при передержке интенсивность флюоресценции
микобактерий может уменьшаться.
7. Мазки промывают дистиллированной водой.
8. Мазки высушивают при комнатной температуре в вертикальном
или наклонном положении.
3.3.2.4. Хранение приготовленных мазков
Приготовленные мазки хранят в защищенном от света месте при
комнатной температуре. Используют специальные коробки. Стекла не
должны соприкасаться друг с другом для исключения повреждения
целостности мазка. Положительные мазки хранят 1 год и более, если
больной находится это время в стационаре. Окрашенные
флюоресцентными красителями мазки чувствительны к дневному и
ультрафиолетовому свету. Во время процесса микроскопирования они
способны обесцветиться за несколько секунд. Для исключения этого
мазки просматривают достаточно быстро, а при необходимости сделать
паузу перекрывают поток света от лампы шторкой. Обесцветившиеся
мазки можно повторно окрасить, однако это не всегда приводит к
полному восстановлению препарата.
3.4. Техника микроскопического исследования препарата
3.4.1. Оборудование и реактивы для проведения
микроскопического исследования препаратов, окрашенных по методу
Ziehl-Neelsen
Для проведения микроскопического исследования при окраске по
методу Ziehl-Neelsen необходимы:
- бинокулярный микроскоп;
- иммерсионное масло;
- капельница для нанесения масла на препарат;
- штатив с окрашенными и высушенными мазками, которые должны
быть расположены в порядке номеров регистрации;
- емкость с ксилолом, спирто-эфирной смесью или 70- спиртом;
- фильтровальная бумага для удаления иммерсионного масла с
поверхности просмотренного препарата;
- коробки для хранения просмотренных мазков;
- мягкая хлопчатобумажная ткань, бумажные салфетки или
марлевые тампоны для протирания линз микроскопа;
- бумага и ручка для записи результатов микроскопического
исследования;
- емкость с дезинфицирующим средством.
Для исследования мазков, окрашенных по Ziehl-Neelsen,
используют световой бинокулярный микроскоп с иммерсионным
объективом 90x или 100x и окулярами 7x или 10x.
3.4.2. Настройка микроскопа для исследования в проходящем
свете
Новое поколение отечественных и зарубежных микроскопов
оснащено самоцентрирующимися галогенными лампами, и настройка
(фокусировка) нити лампы в апертурной диафрагме конденсора
производится на заводе-изготовителе. Это существенно облегчает
настройку освещения микроскопа по Келеру, которая в этих марках
микроскопов сводится к ряду приемов, позволяющих совместить
оптическую ось изображения и ось подсветки.
Перед началом работы убедиться, что электрическое напряжение в
лаборатории соответствует допустимому при работе с микроскопом. В
случае необходимости воспользоваться стабилизатором напряжения.
Осмотреть, нет ли в микроскопе поврежденных или сломанных
деталей.
Включить освещение микроскопа, отрегулировав его на малое
напряжение, которое используется при работе с малым увеличением.
Проверить правильность регулировки и фокусировку
(направленность) источника света.
Убедиться, что конденсор с открытой диафрагмой занимает
верхнее положение, а матовое стекло отсутствует в тракте подсветки
(под конденсором).
Настройку освещения микроскопов рекомендуется производить
следующим образом.
Установить в ход лучей объектив 40x и сфокусировать его на
резкое изображение поверхности препарата.
Установить препарат таким образом, чтобы в поле зрения
микроскопа попал наиболее прозрачный участок.
Вращая кольцо полевой диафрагмы, расположенное на основании
микроскопа, закрыть полевую диафрагму.
С помощью расположенной на конденсоре специальной рукоятки
закрыть апертурную диафрагму.
Перемещая конденсор путем вращения винта вертикального
перемещения конденсора, добиться резкого изображения краев
прикрытой полевой диафрагмы в поле зрения микроскопа.
С помощью фронтально от конденсора расположенных центровочных
винтов добиться перемещения изображения краев прикрытой диафрагмы
в центр поля зрения.
Вращая кольцо полевой диафрагмы, раскрыть ее до размеров поля
зрения.
С помощью рукоятки конденсора раскрыть апертурную диафрагму
приблизительно на 1/3 хода, добиваясь четкого появления окраски
объектов изображения в препарате и достаточной глубины резкости.
Заменить окуляр в правом окулярном тубусе на точечную
диафрагму (из комплекта микроскопа) или на дополнительный
микроскоп МИР-4, который предварительно настроить на изображение.
В первом случае будет видна яркая нить накала лампы. Уменьшая силу
света, необходимо добиться изображения нити. Она должна иметь
сфокусированное изображение. В случае использования
дополнительного окуляра при правильно настроенном микроскопе будет
наблюдаться следующая картина: темный диск, заполняющий поле
зрения, и тонкая полоска света по диаметру выходного зрачка
микрообъектива (должно быть перекрыто ~ 9/10 диаметра выходного
зрачка).
Заменить точечную диафрагму или дополнительный микроскоп на
рабочий окуляр и приступить к наблюдению препарата в светлом поле.
Для большего комфорта можно вставить матовое стекло в тракт
прохождения света, добавив света реостатом лампы.
Этой манипуляцией завершается настройка микроскопа.
МНОГИЕ СОВРЕМЕННЫЕ МИКРОСКОПЫ ОСНАЩЕНЫ ЦЕНТРИРОВАННЫМИ И
НЕПОДВИЖНЫМИ КОНДЕНСОРАМИ, ЧТО ОБЛЕГЧАЕТ ПРОЦЕДУРУ НАСТРОЙКИ.
РЕГУЛИРОВКА ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ ТОЛЬКО С ПОМОЩЬЮ ОТКРЫТИЯ АПЕРТУРЫ
ИРИСОВОЙ ДИАФРАГМЫ ДО 70 - 80%, ЧТО ОБЕСПЕЧИВАЕТ РАВНОМЕРНОЕ
ОСВЕЩЕНИЕ ПОЛЯ ЗРЕНИЯ.
3.4.3. Морфологические характеристики кислотоустойчивых
микобактерий при окраске по методу Ziehl-Neelsen
Кислотоустойчивые микобактерии туберкулеза имеют в длину
примерно 1 - 10 мкм, в ширину - 0,2 - 0,6 мкм. Обычно они видны в
виде тонких изящных палочек, но иногда можно обнаружить изогнутые
или извитые варианты.
При окраске карболовым фуксином микобактерии туберкулеза
выявляются в виде тонких, слегка изогнутых палочек
малиново-красного цвета, содержащих различное количество гранул.
Микроорганизмы, располагающиеся поодиночке, парами или в виде
групп, хорошо выделяются на голубом фоне других компонентов
препарата. Нередко в нативных препаратах бактериальные клетки
могут располагаться в виде римской цифры "V".
Внутри отдельных микробных клеток могут обнаруживаться участки
более интенсивного окрашивания, в результате чего они похожи на
"бусы", а более слабо окрашенные участки могут быть видны в виде
"полос".
В препарате могут выявляться также измененные коккоподобные
кислотоустойчивые формы возбудителя, округлые сферические или
мицелиеподобные структуры. Однако в случае обнаружения измененных
форм кислотоустойчивых микроорганизмов положительный ответ должен
быть подтвержден дополнительными методами исследования.
Клетки, выращенные на питательной среде, отличаются внешне от
видимых в нативном препарате. Как правило, в первом случае
микобактерии чуть толще и короче, окраска их ярче. Клетки могут
быть агломерированы или сплетаться в колонии с образованием кос
или сплетений.
Некоторые другие микроорганизмы, не относящиеся к
М.tuberculosis, могут иметь различные формы - от длинных палочек
до кокковидных форм с различной интенсивностью окрашивания.
Различную степень кислотоустойчивой окраски можно наблюдать не
только у микобактерий, но и у других микроорганизмов. Это могут
быть Rhodococcux, Nocardia, Legionella, а также цисты
Cryptosporidium и Isospora.
Быстрорастущие микобактерии могут отличаться по степени
кислотоустойчивой окраски - при частичной потере кислотоустойчивой
окраски они приобретают фиолетово-малиновый цвет.
3.4.4. Оборудование и реактивы для проведения
микроскопического исследования препаратов, окрашенных
флюорохромными красителями
Для проведения микроскопического исследования при окраске
флюорохромами необходимы:
- люминесцентный микроскоп;
- штатив с окрашенными и высушенными мазками, которые должны
располагаться в порядке номеров регистрации;
- коробки для хранения просмотренных мазков;
- мягкая хлопчатобумажная ткань, бумажные салфетки или тампоны
для протирания линз микроскопа;
- бумага и ручка для записи результатов микроскопического
исследования;
- емкость с дезинфицирующим средством.
Для исследования мазков, окрашенных флюорохромными
красителями, используют люминесцентный микроскоп с набором
объективов и окуляров, позволяющих получить увеличение объекта
наблюдения в пределах 250x - 630x. Необходимо использовать
объективы, предназначенные для люминесцентной микроскопии.
3.4.5. Осветительные системы и настройка люминесцентного
микроскопа
Освещение объектов на предметном стекле осуществляется сверху
через коллектор, систему светофильтров, светоделительную пластину
и объектив микроскопа.
Подготовка к работе и настройка освещения (на примере РПО-8
ЛОМО)
1. Присоединить фонарь ртутной лампы к источнику питания.
2. Закрыть шторку микроскопа.
3. Включить источник питания и зажечь лампу, руководствуясь
описанием источника питания, изложенным в паспорте микроскопа.
НЕЛЬЗЯ ВЫКЛЮЧАТЬ РТУТНУЮ ЛАМПУ РАНЕЕ ЧЕМ ЧЕРЕЗ 15 МИНУТ ПОСЛЕ
ЕЕ ЗАЖИГАНИЯ. ПОВТОРНОЕ ВКЛЮЧЕНИЕ РТУТНОЙ ЛАМПЫ ДОПУСКАЕТСЯ ТОЛЬКО
ЧЕРЕЗ 10 МИНУТ ПОСЛЕ ЕЕ ВЫКЛЮЧЕНИЯ (ПОСЛЕ ЕЕ ПОЛНОГО ОХЛАЖДЕНИЯ).
4. Дать прогреться фонарю не менее 10 минут после зажигания
ртутной лампы.
5. Установить переключатель, расположенный слева на тубусе
микроскопа, в положение СП, установить в тубус направляющую с
пластиной СП.
6. Установить в гнездо тубуса теплозащитную кювету или
теплозащитный светофильтр СЗС 24 в прямоугольной оправе.
7. Установить в гнездо тубуса нейтральный светофильтр НСЗ-2 в
прямоугольной оправе.
8. Установить в правую окулярную трубку бинокулярной насадки
точечную диафрагму.
9. Поворотом револьверной головки ввести в ход лучей свободное
от объектива отверстие.
10. Открыть шторку (полевую диафрагму), расположенную в
осветительной ветви осветителя.
11. Поместить на предметный столик лист белой бумаги.
12. Отцентрировать изображение светящейся дуги лампы
относительно свободного отверстия, для чего с помощью
центрировочных винтов при лампе переместить изображение нити лампы
в центр светящегося круга от отверстия.
13. Прикрыть полевую диафрагму.
14. Добиться резкого изображения дуги на бумаге, для чего с
помощью рукоятки переместить коллектор в осветительной части
микроскопа вдоль оптической оси.
15. Проверить окончательную центрировку электродов лампы,
наблюдая изображение электродов и светящейся дуги лампы через
точечную диафрагму.
От правильной настройки (центрировки) люминесцентного
осветителя зависит интенсивность и равномерность свечения объектов
в поле зрения.
Настройка микроскопа для наблюдения объектов в свете
люминесценции
1. Вставить в пазы корпуса осветителя выбранные для работы
возбуждающий (ФС 1-4) и запирающий (СЗС 21-2) светофильтры или
направляющую с пластиной.
2. Установить в гнездо светофильтр БС 8-3 вместо светофильтра
НСЗ-2.
3. Вставить окуляры в окулярные трубки бинокулярной насадки.
4. Установить в револьверное устройство полный набор
объективов.
5. Ввести в ход лучей выбранный рабочий объектив.
6. Установить на предметном столике микроскопа препарат и
закрепить его с помощью препаратоводителя.
7. Открыть полевую диафрагму до размеров поля зрения в
окуляре.
8. Раздвинуть окуляры до полного совмещения изображений,
видимых правым и левым глазом исследователя.
9. С помощью механизмов грубой и точной фокусировки (макро- и
микровинт) добиться оптимальной резкости изображения. Если объект
наблюдения недостаточно контрастный, сфокусировать прибор можно,
ориентируясь на маркировку, нанесенную на препарат.
10. Проверить равномерность освещения поля зрения, перемещая
рукоятку коллектора.
Микроскоп готов к работе.
Для предохранения препаратов от выцветания в перерывах между
наблюдениями необходимо закрывать шторку лампы, находящуюся в
осветительном тракте ртутной лампы.
3.4.6. Порядок проведения микроскопического исследования
Современные микроскопы являются сложными техническими
устройствами, чувствительными к настройке и правилам эксплуатации.
Перед началом работы они должны быть настроены и адаптированы под
зрение микроскописта. Это лучше поручить инженерной службе, но
можно провести самостоятельно, руководствуясь инструкцией к
микроскопу и вышеприведенным описанием. Несоблюдение правил
настройки может привести к существенному снижению эффективности
микроскопических исследований и даже невозможности их проведения.
Исследование мазков, окрашенных по методу Ziehl-Neelsen,
производится в проходящем свете с помощью светового микроскопа.
Рекомендуется это делать с помощью бинокулярного микроскопа.
При исследовании мазков, окрашенных флюоресцентными
красителями, используется люминесцентный микроскоп. При этом одной
из важных особенностей работы в этом случае является то, что
окрашенные флюорохромными красителями мазки не подлежат
длительному хранению при дневном свете или длительному просмотру,
так как интенсивность люминесценции окрашенного объекта при этом
быстро снижается.
Работу начинают с определения положительных мазков предыдущего
дня или просмотра. Это позволит относительно быстро оценить
состояние настройки и готовности микроскопа к работе.
Перед началом микроскопического исследования в световом
микроскопе необходимо:
- проверить наличие на столе для микроскопии необходимого для
проведения микроскопического исследования оборудования и
дополнительных материалов;
- снять чехол, которым накрыт микроскоп;
- осмотреть микроскоп и протереть сухой салфеткой механические
части микроскопа;
- убедиться в целости оптической системы;
- включить осветительную систему и убедиться в достаточности
освещения, ее настройки;
- с помощью бумажной салфетки или ватного тампона, смоченного
спирто-эфирной смесью, протереть линзы микроскопа;
- убедиться в том, что подготовленные для микроскопии
окрашенные препараты достаточно хорошо высушены;
- вращая винт грубой фокусировки (макровинт), опустить
предметный столик, максимально отдалив его от объектива;
- поворотом револьверного устройства установить объектив с
малым увеличением (10x) точно над конденсором;
- поместить на столик предметное стекло таким образом, чтобы
мазок находился прямо под объективом; при этом обязательно
убедиться, что мазок находится в верхней плоскости предметного
стекла, а не снизу;
- закрепить препарат на столике с помощью клемм
препаратоводителя;
- с помощью винтов препаратоводителя выбрать участок мазка для
просмотра;
- раздвинуть окуляры до полного совмещения изображений,
видимых правым и левым глазом исследователя;
- глядя сбоку, внимательно контролировать расстояние между
стеклом и линзой объектива. Медленно вращая винт грубой
фокусировки (макровинт), поднять предметный столик с препаратом к
объективу, но не допускать соприкосновения предметного стекла с
линзой объектива;
- глядя через окуляр, отрегулировать интенсивность светового
потока так, чтобы свет был ярким, но комфортным. Для этого лучше
всего использовать регулятор накала лампы, использовать темные или
матовые фильтры и в крайнем случае изменить степень открытия
диафрагмы.
Положение конденсора изменять не рекомендуется;
- продолжая смотреть через окуляр, медленно повернуть
макровинт, чтобы предметный столик отошел от линзы объектива.
Обычно достаточно нескольких поворотов винта;
- затем, глядя в окуляр, медленно вращать микровинт до тех
пор, пока не появится изображение мазка. Небольшими поворотами
микровинта настроить изображение до получения достаточной
резкости.
НИКОГДА НЕ ПОДНИМАЙТЕ СТОЛИК МИКРОСКОПА, ГЛЯДЯ В ОКУЛЯР. ЭТО
МОЖЕТ ПРИВЕСТИ К СОПРИКОСНОВЕНИЮ ФРОНТАЛЬНОЙ ЛИНЗЫ ОБЪЕКТИВА С
ПРЕДМЕТНЫМ СТЕКЛОМ, ПОВРЕЖДЕНИЮ ЛИНЗЫ ИЛИ К ПОРЧЕ ПРЕПАРАТА;
- глядя правым глазом в правый окуляр, сфокусировать
изображение;
- глядя левым глазом в левый объектив, сфокусировать
изображение путем поворота дополнительного фокусировочного кольца,
расположенного на левом окуляре.
3.4.7. Исследование объекта с большим увеличением с помощью
"сухой" оптической системы
Порядок работы
После работы с препаратом под малым или средним увеличением,
не меняя фокусировки, выбрать объектив с более сильным
увеличением.
Убедиться, что этот объектив не касается предметного стекла, и
поворотом револьверного устройства поместить выбранный объектив
непосредственно над препаратом. При этом мазок должен оставаться
почти в фокусе объектива.
С помощью микровинта сфокусировать резкость изображения.
Правильная настройка света также может улучшить качество
изображения.
Все манипуляции по настройке проводятся при сфокусированном на
объект микроскопе. При настройке объект должен быть выведен из
поля зрения, иными словами, после получения резкого изображения
объекта предметное стекло смещается, чтобы поле зрения под
объективом было прозрачным.
3.4.8. Работа с объективом масляной иммерсии
Порядок работы:
Добиться четкого изображения объекта в поле зрения с помощью
сухого объектива малого увеличения и определить наиболее
подходящий для исследования участок препарата.
Поворотом револьвера вывести сухой объектив из хода лучей и
сместить объективы так, чтобы стал свободным доступ к препарату.
Нанести на выбранный участок препарата одну каплю
иммерсионного масла. Капля должна свободно упасть на стекло (при
этом желательно немного смазать иммерсионным маслом фронтальную
линзу объектива).
ПИПЕТКА КАПЕЛЬНИЦЫ МАСЛА НИ В КОЕМ СЛУЧАЕ НЕ ДОЛЖНА
СОПРИКОСНУТЬСЯ С МАЗКОМ!
В противном случае это может привести к переносу микобактерий
с одного мазка на другой, к загрязнению иммерсионного масла и
получению ложноположительного результата микроскопического
исследования.
Поворотом головки револьверного устройства установить объектив
с сильным увеличением (90x - 100x) непосредственно над препаратом.
Под визуальным контролем (глядя сбоку) медленно вращают
макровинт грубой фокусировки и поднимают столик микроскопа до
появления мениска в момент соприкосновения фронтальной линзы
объектива с поверхностью капли масла.
НИКОГДА НЕ КАСАЙТЕСЬ ЛИНЗОЙ ПРЕДМЕТНОГО СТЕКЛА. ЭТО МОЖЕТ
ПОВРЕДИТЬ ЛИНЗУ ИЛИ РАЗБИТЬ ПРЕПАРАТ.
Глядя в окуляр, с помощью винтов грубой и точной регулировки
произвести настройку на резкость. Во время выполнения этой
манипуляции будьте особенно внимательны и смещайте винты на
небольшой ход, не допуская бесконтрольно полного оборота винтов.
В случае появления в поле зрения пузырьков воздуха операцию
настройки (момент соприкосновения фронтальной линзы объектива с
иммерсией) необходимо повторить, протерев объектив салфеткой со
спиртом.
Микроскоп готов к работе.
При микроскопическом исследовании мазка, окрашенного по
Ziehl-Neelsen, следует просматривать не менее 100 полей зрения. В
том случае, если результат такого исследования оказывается
отрицательным, необходимо просмотреть еще 200 полей зрения.
При микроскопическом исследовании препарата необходимо быть
уверенным, что ни одно поле зрения препарата не просматривается
повторно, поэтому рекомендуется просматривать препарат всегда по
одной и той же схеме:
- либо 3 параллельных прохода по длине препарата,
- либо 9 параллельных проходов по ширине.
Микроскопировать начинают с левого верхнего выбранного в мазке
поля зрения, постепенно передвигаясь либо вдоль продольной оси
препарата до конца мазка, либо смещаясь вниз и затем вновь
поднимаясь вверх и т.д., проходя все поля зрения до границы мазка.
При увеличении микроскопа 1000x, т.е. 100x для
масляно-иммерсионного объектива и 10x для окуляра, при
исследовании одной длины мазка (~ 20 мм) за один продольный проход
просматривается около 100 - 120 полей зрения (диаметр поля зрения
- 0,16 - 0,2 мм).
При люминесцентной микроскопии с использованием объектива 25x
и окуляра 10x площадь поля зрения примерно в 10 раз больше,
поэтому просматривается меньшее число полей зрения. Однако при
отрицательном результате или малом количестве выявляемых
микобактерий следует просматривать не менее 100 полей зрения.
При значительном количестве кислотоустойчивых микобактерий
достаточно исследовать 20 - 50 полей зрения как при окраске по
Ziehl-Neelsen, так и при люминесцентной микроскопии (см.
таблицу 3).
По окончании микроскопического исследования каждого препарата
следует:
- освободить препарат от держателей - клемм препаратоводителя;
- снять препарат с предметного столика микроскопа;
- сверить идентификационный номер и записать результат
микроскопии на специальном листе бумаги, на котором перед началом
микроскопии написать в столбик порядковые номера препаратов,
подлежащих исследованию;
- затем, удерживая препарат за ребра стекла в участке, где
нанесен порядковый номер, положить препарат на покрытый
фильтровальной бумагой поднос (лоток) в вытяжной шкаф;
- для удаления иммерсионного масла накрыть препарат полоской
фильтровальной бумаги;
- смочить ее несколькими каплями ксилола, спирто-эфирной
смесью или спиртом;
- через 2 - 3 минуты фильтровальную бумагу удалить;
- очищенный от иммерсионного масла препарат поместить в
коробку для просмотренных стекол.
При большом количестве исследуемых препаратов рекомендуется
заранее подготовить 2 выстланных фильтровальной бумагой подноса
(лотка) - для положительных и отрицательных препаратов - и
удаление иммерсионного масла производить по окончании
микроскопического исследования одновременно со всех просмотренных
препаратов или части их.
В зависимости от результатов микроскопического исследования
просмотренный препарат поместить в коробку для положительных или
для отрицательных препаратов.
Перед тем как взять для исследования следующий препарат,
необходимо протереть иммерсионную линзу кусочком специальной ткани
или марлевым тампоном с рекомендованным растворителем.
По окончании микроскопического исследования всей партии мазков
выполнить следующие процедуры:
- с помощью бумажной или марлевой салфетки протереть линзы
микроскопа спирто-эфирной смесью или спиртом;
- опустить предметный столик микроскопа, отдалив его от
объективов;
- уменьшить интенсивность освещения и выключить источник
освещения микроскопа;
- накрыть микроскоп полиэтиленовым или пластиковым пакетом;
- расставить все необходимое для микроскопии оборудование и
дополнительные материалы в установленном порядке;
- снять и удалить одноразовые перчатки;
- вымыть руки с мылом;
- перенести результаты микроскопического исследования в
лабораторный регистрационный журнал и на бланки ответов.
3.5. Причины ошибок при микроскопических исследованиях
3.5.1. Ложноположительные результаты
Они могут быть обусловлены следующими причинами:
- плохая обработка многоразовых флаконов для сбора материала,
в которых могут оставаться микобактерии;
- повторное использование предметных стекол после
положительного предыдущего мазка;
- использование для приготовления мазка загрязненных
бациллярным материалом бактериологических петель, пипеток или
деревянных палочек;
- применение предметных стекол с царапинами и другими
дефектами, в результате чего появляются артефакты, иногда ошибочно
принимаемые за микобактерии; красная краска может иногда
задерживаться на царапинах и создавать ошибочное представление о
том, что видно кислотоустойчивую микобактерию. Такие царапины
нередко образуют параллельные ряды. Обычно они более грубые и
больше по размерам, чем микобактерии. Их несложно определить, так
как они находятся на стекле в более глубокой плоскости (под
мазком), и исчезают, если установить фокус на клетки (лейкоциты,
эпителиальные клетки);
- использование плохо профильтрованного или длительно
хранившегося раствора фуксина с начавшейся кристаллизацией;
- наличие микобактерий в иммерсионном масле, если иммерсионные
линзы не были очищены после положительных препаратов или
иммерсионное масло загрязнено микобактериями, если пипетка,
которой оно наносится на мазок, случайно соприкасалась с
положительным мазком;
- недостаточное обесцвечивание мазка, что может привести к
сохранению красной окраски на некоторых некислотоустойчивых
бактериях;
- волокна шерсти, хлопка, фильтровальной бумаги; обычно они
встречаются как единичные находки, чаще всего в одном поле зрения;
- пыльца некоторых видов сосны, которая может обнаруживаться в
виде редко встречающихся в препарате коротких кокковидных палочек.
3.5.2. Ложноотрицательные результаты
Они могут быть обусловлены следующими причинами:
- плохим качеством или недостаточным количеством исследуемого
материала;
- исследованием слюны вместо мокроты;
- нарушением условий хранения, транспортировки, консервации
материала (высокая температура и низкая влажность, а также
воздействие на материал прямого солнечного света или
ультрафиолетового излучения, под влиянием которых содержащиеся в
материале микобактерии могут утратить присущую им
кислотоустойчивость);
- неудачным выбором частиц мокроты для приготовления мазка;
- приготовлением слишком тонкого или толстого мазка, плохой
его фиксацией над пламенем горелки или несоблюдением режимов
окрашивания (неправильная экспозиция при окраске);
- нарушением методики просмотра мазка (малое число
просмотренных полей зрения);
- плохим качеством красителей и реагентов;
- хранение предназначенных для исследования окрашенных мазков
в месте, доступном прямым солнечным лучам или ультрафиолетовому
свету, парам кислот;
- при повторном просмотре мазков (реанализ) ложноотрицательный
результат может быть обусловлен тем, что после первичного
просмотра с препарата не было удалено иммерсионное масло (при
длительном воздействии оно обесцвечивает окраску) или препарат
тщательно протирали при удалении иммерсионного масла, что вызвало
повреждение мазка.
3.5.3. Операторские ошибки (ложноположительные или
ложноотрицательные)
Неправильная маркировка флаконов с диагностическим материалом.
Отсутствие маркировки на стекле или повреждение ее в процессе
окраски или обесцвечивания.
Неправильная регистрация результатов.
Таблица 2
ВОЗМОЖНЫЕ ПРИЧИНЫ НЕИСПРАВНОСТЕЙ
ПРИ МИКРОСКОПИИ И СПОСОБЫ ИХ УСТРАНЕНИЯ
----------------------T---------------------T--------------------¬
¦ Неисправность ¦ Возможная причина ¦ Способ устранения ¦
+---------------------+---------------------+--------------------+
¦Тусклое поле зрения ¦Низкое положение ¦Поднять конденсор ¦
¦ ¦конденсора ¦ ¦
¦ ¦Закрытая диафрагма ¦Открыть диафрагму ¦
¦ ¦конденсора ¦ ¦
+---------------------+---------------------+--------------------+
¦Темные объекты в поле¦Грязный окуляр ¦Протереть окуляр ¦
¦зрения, смещающиеся ¦Линзы микроскопа ¦Необходим ремонт ¦
¦при повороте окуляра ¦контаминированы ¦окуляра ¦
¦ ¦грибами ¦ ¦
¦ ¦На линзах окуляра ¦Заменить окуляр ¦
¦ ¦имеются царапины ¦ ¦
+---------------------+---------------------+--------------------+
¦Недостаточно четкое ¦Перевернут ¦Перевернуть ¦
¦изображение ¦препарат ¦предметное стекло ¦
¦ ¦(мазок находится ¦Передвинуть 100x ¦
¦ ¦снизу стекла) ¦объектив ¦
¦ ¦Пузырек воздуха в ¦Заменить масло ¦
¦ ¦масле ¦ ¦
¦ ¦Плохое качество масла¦ ¦
¦ ¦Загрязнены линзы ¦Протереть линзы ¦
+---------------------+---------------------+--------------------+
¦Нечеткое изображение ¦Поверхности линз ¦Очистить линзы ¦
¦при малом увеличении ¦загрязнены маслом ¦ ¦
¦ ¦или грязью ¦ ¦
¦ ¦Повреждение линз ¦Заменить ¦
¦ ¦ ¦поврежденные линзы ¦
L---------------------+---------------------+---------------------
Учет результатов микроскопического исследования
3.6. Учет результатов микроскопического исследования
при окраске по методу Ziehl-Neelsen
Количество кислотоустойчивых микобактерий (КУМ),
обнаруживаемых при микроскопическом исследовании, является очень
важным информационным показателем, так как оно характеризует
степень эпидемической опасности больного и тяжесть заболевания.
Поэтому микроскопическое исследование должно быть не только
качественным, но и количественным. При использовании объектива 90x
или 100x и окуляра 7x - 10x (общее увеличение - 630 - 1000x)
целесообразна следующая градация результатов световой иммерсионной
микроскопии (см. таблицу 3).
Таблица 3
ГРАДАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
ПРИ ОКРАСКЕ ПО МЕТОДУ ZIEHL-NEELSEN
----------------T---------------T----------------T---------------¬
¦ Результат ¦ Минимальное ¦ Форма записи ¦ Интерпретация ¦
¦ исследования ¦ число полей ¦ результата ¦ результата ¦
¦ ¦ зрения (п/з), ¦ ¦ исследования ¦
¦ ¦ обязательных ¦ ¦ ¦
¦ ¦ для просмотра ¦ ¦ ¦
+---------------+---------------+----------------+---------------+
¦КУМ не ¦300 ¦ОТР ¦Отрицательный ¦
¦обнаружены в ¦ ¦ ¦ ¦
¦300 п/з ¦ ¦ ¦ ¦
+---------------+---------------+----------------+---------------+
¦1 - 2 КУМ в 300¦300 ¦Рекомендуется ¦Результат не ¦
¦п/з ¦ ¦повторить ¦оценивается ¦
¦ ¦ ¦исследование ¦ ¦
+---------------+---------------+----------------+---------------+
¦1 - 9 КУМ в 100¦100 ¦"____" КУМ в 100¦Положительный ¦
¦п/з ¦ ¦п/з <*> ¦ ¦
+---------------+---------------+----------------+---------------+
¦10 - 99 КУМ в ¦100 ¦1+ <**> ¦Положительный ¦
¦100 п/з ¦ ¦ ¦ ¦
+---------------+---------------+----------------+---------------+
¦1 - 10 КУМ в 1 ¦50 ¦2+ <**> ¦Положительный ¦
¦п/з ¦ ¦ ¦ ¦
+---------------+---------------+----------------+---------------+
¦Более 10 КУМ ¦20 ¦3+ <**> ¦Положительный ¦
¦в 1 п/з ¦ ¦ ¦ ¦
L---------------+---------------+----------------+----------------
--------------------------------
<*> Указать точное число найденных КУМ.
<**> Соответствие градаций:
Точное число - единичные КУМ в препарате;
1+ - единичные КУМ в поле зрения;
2+ - умеренное количество КУМ;
3+ - значительное количество КУМ.
Результаты микроскопического исследования отражаются в двух
документах: в лабораторном регистрационном журнале учета
|
