|
Стр. 10
окрашивании карболовым фуксином;
- металлический стержень для приготовления ватного тампона,
который используется вместо горелки для подогревания препарата при
окрашивании карболовым фуксином;
- фильтровальная бумага размером ~ 4 x 1,5 см для окраски
мазков карболовым фуксином;
- раствор карболового фуксина;
- 25% раствор серной кислоты или 3% раствор солянокислого
спирта;
- дистиллированная вода для промывания мазков;
- 0,3% раствор хлорида метиленового синего;
- штатив для просушивания окрашенных стекол на воздухе в
вертикальном или наклонном положении.
Реактивы:
- спирт этиловый 96- марки ОП-2, ТУ 6-09-4512-77;
- кислота соляная концентрированная, ГОСТ 3118-77;
- кислота серная концентрированная, ГОСТ 4204-77;
- фенол кристаллический (карболовая кислота), ГОСТ 6417-72;
- фуксин основной, ТУ 6-09-3804-82;
- метиленовый синий хлорид, ТУ 6-09-945-75;
- глицерин, ЧДА, ГОСТ 6259-75;
- вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72.
Приготовление растворов:
Раствор 1. Насыщенный спиртовой раствор фуксина:
- растереть в ступке 0,3 г основного фуксина с 2 - 3 каплями
глицерина, добавить по каплям 10 мл 96- этилового спирта.
Раствор 2. Рабочий раствор фенола (5% водный раствор):
- расплавить 5 г кристаллического фенола путем легкого
подогревания на водяной бане (температура плавления фенола - 41
-C). Добавить слегка подогретую дистиллированную воду до объема
100 мл.
Раствор 3. Рабочий раствор карболового фуксина:
- в 90 мл полученного раствора фенола (2) добавить 10 мл
насыщенного раствора фуксина (1).
Раствор 4. Обесцвечивающие растворы:
а) Раствор серной кислоты
К 75 мл дистиллированной воды осторожно долить 25 мл
концентрированной серной кислоты, постепенно наслаивая ее по
стенкам сосуда. Смешать. Содержимое нагреется.
Никогда не добавляйте воду в кислоту.
б) Раствор солянокислого спирта
Вместо раствора серной кислоты для обесцвечивания можно
использовать 3% солянокислый спирт:
Этиловый спирт 96- 97 мл
Концентрированная соляная кислота 3 мл.
К 97 мл спирта осторожно добавляют 3 мл концентрированной
соляной кислоты.
Всегда осторожно вливайте кислоту в спирт, но не наоборот.
Раствор 5. Рабочий раствор метиленового синего:
- растворить 0,3 г хлорида метиленового синего в 100 мл
дистиллированной воды.
Хранение растворов. Все приготовленные растворы должны быть
профильтрованы через бумажный фильтр и помещены в герметически
закрытые емкости из темного стекла. На каждой емкости должна быть
надпись с названием содержащегося в ней раствора, датой его
приготовления, сроком годности и указанием фамилии специалиста,
готовившего раствор. Растворы хранят при комнатной температуре в
темном месте.
Рабочий раствор карболового фуксина может храниться не более
2-х недель, так как после этого срока фуксин начинает выпадать в
осадок, что изменяет заданные свойства раствора.
Другие рабочие растворы значительно более стойки при хранении.
Однако рекомендуется готовить их одновременно с раствором
карболового фуксина, т.е. через каждые 2 недели. Это позволит быть
уверенным в качестве используемых красителей.
Процедура окраски:
- убедитесь, что подготовленные мазки фиксированы и
промаркированы;
- препараты помещают на подставку ("рельсы") так, чтобы они не
касались друг друга и расстояние между ними составляло порядка 1
см, а маркировка (номер) была направлена в одну сторону.
Максимально на стандартные "рельсы" помещают не более 12 стекол;
- на каждое стекло накладывают полоску фильтровальной бумаги
так, чтобы она полностью закрывала мазок. Это делают для того,
чтобы краска не разливалась по стеклу. Одновременно за счет
использования фильтровальной бумаги предотвращается осаждение на
мазок кристаллов краски, которые при микроскопическом исследовании
могут быть ошибочно приняты за кислотоустойчивые микобактерии;
- наливают на бумагу раствор карболового фуксина с избытком и
нагревают препарат над пламенем горелки до легкого появления
паров. При подогревании препарата следят за тем, чтобы краска не
закипела, а фильтровальная бумага не высыхала. Подогретый мазок
оставляют на 5 минут, чтобы краситель проник в клеточную стенку
микобактерий и окрасил ее;
- пинцетом снимают и удаляют фильтровальную бумагу;
- осторожно смывают остатки краски слабой струей
дистиллированной воды до тех пор, пока не прекратится видимое
отхождение краски. При промывании мазков используют холодную воду
или воду комнатной температуры;
- перед тем как нанести на стекло следующий раствор, щипцами
или пинцетом берут каждое стекло за маркированный конец и
наклоняют, чтобы с него стекла вода; это предотвращает разбавление
следующего реактива;
- мазок обесцвечивают 3 минуты одним из обесцвечивающих
растворов, полностью покрывая всю поверхность мазка;
- мазок тщательно промывают дистиллированной водой и
докрашивают в течение 1 минуты, не превышая экспозицию, 0,3%
раствором метиленового синего;
- вновь аккуратно промывают проточной водой, наклоняя каждое
стекло, чтобы стекала вода;
- высушивают на открытом воздухе при комнатной температуре в
вертикальном или наклонном положении.
Не следует промокать препарат.
В результате микобактерии туберкулеза окрашиваются в
малиново-красный цвет, а другие микроорганизмы и клеточные
элементы - в голубой.
При использовании 0,3% раствора метиленового синего для
окраски фона препарата (контрастирующая окраска) следует иметь в
виду, что при толстом мазке или превышении времени окраски этот
краситель может как бы "скрыть" кислотоустойчивые микобактерии.
Если в процессе окраски произошло загрязнение краской нижней
свободной от мазка поверхности предметного стекла, перед
микроскопией следует аккуратно протереть ее тампоном, смоченным
солянокислым спиртом.
Препарат исследуют с масляной иммерсией в световом микроскопе.
10.3. Окраска препаратов для люминесцентной микроскопии
Метод основан на наблюдении микроскопических объектов с
использованием их способности к свечению. По сравнению с методами
обычной микроскопии исследование в свете люминесценции обладает
рядом преимуществ: цветное свечение, высокая степень контрастности
светящихся объектов на темпом фоне, значительно большая площадь
поля зрения.
Суть люминесцентной микроскопии заключается в том, что объекты
(бактериальные клетки), окрашенные специальными красителями
(флюорохромами), под действием облучения их ультрафиолетом
испускают излучение в видимом спектре света. В случае, когда
объект не окрашен специальными красителями, ультрафиолетовый свет,
проходя через объектив и попадая на препарат, поглощается
молекулярными структурами объекта и остается невидимым или почти
невидимым для человеческого глаза. Если же какие-либо объекты
окрашены специальным красителем, то молекулы красителя под
действием ультрафиолета возбуждаются и начинают испускать кванты
света в длинноволновой области, иначе говоря - светиться. В этом
случае клетка становится источником света определенного спектра и
хорошо видна на общем темном контрастном фоне препарата.
Источник света должен содержать в своем спектре длину волны,
возбуждающую молекулы красителя, а светофильтры подбираются таким
образом, чтобы добиться хорошего расхождения между длинами волн
возбуждающего ультрафиолетового света и излучения, испускаемого
возбужденными объектами.
При люминесцентной микроскопии используют специальный
микроскоп. Источником света в нем служит кварц-галогеновая или
ртутная лампа. Для красителей системы аурамин/родамин используют
подборку из следующих фильтров (на примере микроскопа РПО8 ЛОМО):
- возбуждающий фильтр ФС 1-4,
- запирающий фильтр СЗС 21-2 и
- нейтральный фильтр БС 8-3.
Светофильтры возбуждения служат для выделения из потока
излучения источника света тех лучей, которые обеспечивают
возбуждение и свечение объекта; эти фильтры устанавливаются в
ветви осветителя.
Запирающий светофильтр служит для ограничения (срезания) света
возбуждения и пропускания только света люминесценции; этот фильтр
устанавливается в наблюдательной ветви.
Наблюдательные (сменные) фильтры имеют разное назначение:
фильтры для защиты глаз от попадания красных и инфракрасных лучей;
теплозащитные фильтры и др. В отечественных микроскопах
применяются фильтры из стекла БС8 для предохранения объектов
микроскопии от выцветания.
Люминесцентные красители (аурамин ОО, родамин С и др.)
связываются с воскоподобными структурами микробной клетки. При
облучении окрашенных клеток возбуждающим источником света
(определенный спектр ультрафиолетового излучения) они начинают
светиться оранжевым или ярко-желтым светом на черном или
темно-зеленом фоне.
За счет свечения вокруг клетки образуется ореол, благодаря
которому видимые размеры светящейся клетки превышают ее физические
размеры. В связи с этим окрашенные флюорохромными красителями
препараты обычно исследуются при увеличении 250x - 450x, тогда как
окрашенные фуксином - при увеличении 800x - 1000x. Разница в
увеличении позволяет микроскописту видеть одновременно в 4 - 10
раз большее поле зрения, что существенно сокращает время,
необходимое для просмотра мазка. Подсчитано, что если
микроскопическое исследование необходимой площади мазка при
окраске по Ziehl-Neelsen продолжается приблизительно 10 минут, то
для исследования той же площади мазка методом люминесцентной
микроскопии потребуется только 2 - 3 минуты.
Наряду с этим при люминесцентной микроскопии отмечается
большая резкость и контрастность микроскопической картины, что
повышает комфортность микроскопического исследования. Для глаза
исследователя значительно легче обнаружить флюоресцирующие
оранжевые или ярко-желтые микобактерии на темном (при гашении фона
метиленовым синим или перманганатом калия) или темно-красном (при
гашении фона акридиновым оранжевым) фоне, чем выявить красные
микобактерии на голубом фоне клеточного детрита при окраске по
Ziehl-Neelsen. Это делает метод люминесцентной микроскопии
особенно ценным при исследовании олигобациллярного материала.
Указанные преимущества наиболее выражены при использовании
люминесцентной микроскопии в лабораториях, выполняющих ежедневно
большое число исследований (порядка 30 и более).
Мазки для люминесцентной микроскопии предпочтительно готовить
из осадка после обработки материала детергентом с последующим
отмыванием и центрифугированием. Перед нанесением материала осадка
на предметное стекло необходимо добиться нейтрального значения pH
(6,8 - 7,0). С этой целью осадок нейтрализуют несколькими каплями
6% раствора соляной кислоты или 6% едкого натра (в зависимости от
метода обработки материала), тщательно встряхивают и с помощью
бумажной индикаторной полоски определяют уровень pH (оптимально
6,8) осадка.
Во всех сомнительных случаях микроскопической картины для
контроля следует использовать микроскопию мазка, повторно
окрашенного по методу Ziehl-Neelsen.
10.4. Оборудование и реактивы для окраски
флюорохромными красителями
Для окраски препаратов флюорохромными красителями необходимы:
- раковина или специальный вместительный лоток для проведения
окраски;
- специальный штатив ("рельсы") для окраски мазков на
предметных стеклах;
- пинцет или щипцы для взятия предметных стекол с мазками:
- газовая или спиртовая горелка для фиксации препарата, если
он не фиксирован ранее в сушильном шкафу;
- металлический стержень для приготовления ватного тампона,
используемого вместо горелки для фиксации препарата перед
окраской, если он не фиксирован ранее в сушильном шкафу;
- раствор флюоресцентных красителей;
- раствор для обесцвечивания мазков;
- раствор для гашения фона обесцвеченного мазка;
- емкость с дистиллированной водой для промывания мазков;
- штатив для просушивания окрашенных стекол на воздухе в
вертикальном или наклонном положении.
При окраске флюорохромными красителями ни в коем случае нельзя
подогревать мазки и пользоваться фильтровальной бумагой.
Промывание мазков в процессе окраски следует производить
только дистиллированной водой, так как водопроводная вода содержит
соединения хлора, которые могут изменять флюоресценцию.
Микроскопию производят по возможности сразу же после окончания
процедуры окраски люминесцентными красителями и высыхания мазков.
В случае невозможности проведения немедленной микроскопии
окрашенные мазки рекомендуется сохранять, прикрыв черной бумагой
во избежание ослабления флюоресценции.
При окраске мазков необходимо:
- избегать неполного обесцвечивания, т.к. кислотоустойчивые
микобактерии практически не обесцвечиваются;
- не делать толстых мазков, так как это затрудняет
обесцвечивание и фиксацию мазка на стекле.
Мазки, которые использовались для флюоресцентной микроскопии,
в случае сомнений в истинности феномена кислотоустойчивости можно
повторно окрасить по методу Ziehl-Neelsen.
В нашей стране наибольшее распространение получили следующие
методы окраски микобактерий люминесцентными красителями.
10.4.1. Метод окраски аурамином ОО и родамином С
Реактивы:
- спирт этиловый 96- марки ОП-2, ТУ 6-09-4512-77;
- кислота соляная концентрированная, ГОСТ 3118-77;
- метиленовый синий хлорид, ТУ 6-09-945-75;
- аурамин ОО (аурамин О-Sigma);
- родамин С, ТУ-6-09-2463-77 (родамин В-Sigma);
- вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72.
Приготовление растворов:
Раствор 1. Раствор аурамина - родамина:
Аурамин ОО 1,0 г
Родамин С 0,1 г
Вода дистиллированная 1000 мл.
Каждый краситель растворяют отдельно в 150 - 200 мл
дистиллированной воды и помещают в термостат при 37 -C на 18 - 24
часа. Затем растворы сливают в одну емкость и доводят общий объем
до 1000 мл. Приготовленный раствор красителей хранят в емкости из
темного стекла в прохладном, защищенном от света месте.
Аурамин обладает канцерогенной активностью, поэтому не следует
допускать попадания на кожу его порошка или раствора.
Раствор 2. Обесцвечивающий раствор:
Концентрированная соляная кислота 3 мл
Этиловый спирт 96- 97 мл.
Аккуратно добавить 3 мл концентрированной соляной кислоты к 97
мл этилового спирта.
Предупреждение: осторожно вливайте кислоту в спирт, но не
наоборот.
Раствор 3. Гаситель фона:
Метиленовый синий хлорид 25 мг
Вода дистиллированная 100 мл.
В 100 мл дистиллированной воды растворить 25 мг метиленового
синего хлорида.
Хранение растворов.
Написать на этикетке название раствора, концентрацию, дату
приготовления и срок хранения. Растворы желательно хранить в
темной посуде при комнатной температуре в течение 3 месяцев. Перед
использованием растворов их просматривают для исключения
преципитата. Если последний обнаружен, раствор можно
профильтровать.
Процедура окраски:
- стекла с фиксированными мазками раскладывают на специальные
штативы "рельсы" для окраски так, чтобы они не касались друг
друга;
- мазки заливают раствором 1 на 1 час.
Предупреждение: нельзя нагревать мазки и использовать полоски
фильтровальной бумаги;
- тщательно, но аккуратно промывают мазки дистиллированной
водой;
- обесцвечивают раствором 2 (солянокислый спирт) в течение 3
минут;
- промывают дистиллированной водой;
- гашение фона осуществляют раствором 3 в течение 1 минуты.
Если препарат имеет интенсивную синюю окраску, можно очень
аккуратно повторно промыть его дистиллированной водой;
- мазки высушивают при комнатной температуре в вертикальном
или наклонном положении.
10.4.2. Метод окраски аурамином О
Реактивы:
- спирт этиловый 96- марки ОП-2, ТУ 6-09-4512-77;
- кислота соляная концентрированная, ГОСТ 3118-77;
- фенол кристаллический (карболовая кислота), ГОСТ 6417-72;
- аурамин О-Sigma (2465-27-2);
- акридиновый оранжевый, С.I.46005 или перманганат калия,
ГОСТ 10163-76;
- вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72;
- безводный двузамещенный фосфат натрия, ГОСТ 4172-66.
Приготовление растворов:
Раствор 1. Спиртовой раствор аурамина О:
Аурамин 0,1 г
Этиловый спирт 96- 10 мл.
Растворить аурамин в спирте.
Раствор 2. Раствор фенола:
Фенол кристаллический 3,0 г
Дистиллированная вода 87 мл.
Расплавить кристаллы фенола (температура плавления 41 -C) и
растворить его в дистиллированной воде, пользуясь подогреванием на
водяной бане. Довести общий объем до 90 мл.
Раствор аурамина О. Смешать растворы 1 и 2 и перелить в плотно
закрывающуюся емкость из темного стекла, которую необходимо
хранить в прохладном затемненном месте. В процессе хранения
раствор может стать мутным, однако это не влияет на качество
окрашивания.
Раствор 3. Обесцвечивающий раствор:
Концентрированная соляная кислота 0,5 мл
Технический 70- этиловый спирт 100 мл.
Аккуратно добавить концентрированную соляную кислоту к 70-
этиловому спирту.
Растворы 4. Гасители фона:
Для дополнительного окрашивания препаратов можно использовать
растворы перманганата калия или акридинового оранжевого.
а) Раствор перманганата калия:
Перманганат калия (KMnO4) 0,5 г
Дистиллированная вода 100 мл.
Растворить пермганганат калия в дистиллированной воде и
перелить в плотно закрывающуюся бутыль из темного стекла. На
этикетке обозначить название раствора, дату приготовления и срок
годности. Готовый раствор может храниться при комнатной
температуре в течение 3 месяцев.
б) Раствор акридинового оранжевого:
Безводный двузамещенный фосфат натрия (Na2HPO4) 0,01 г
Дистиллированная вода 100 мл
Акридиновый оранжевый 0,01 г.
Растворить фосфат натрия в дистиллированной воде. Добавить
акридиновый оранжевый.
Хранение реактивов. Хранят приготовленные растворы в плотно
закрывающейся темной емкости. На этикетке обозначают название
раствора, дату приготовления и срок годности. Готовый раствор
может храниться при комнатной температуре в темном месте в течение
3 месяцев.
Процедура окраски:
- стекла с фиксированными мазками раскладывают на специальные
штативы "рельсы" для окраски так, чтобы они не касались друг
друга;
- мазки заливают раствором аурамина О на 15 минут;
- тщательно, но аккуратно промывают мазки дистиллированной
водой;
- обесцвечивают раствором 3 (0,5% раствор солянокислого
спирта) в течение 2 минут;
- промывают дистиллированной водой каждое стекло до тех пор,
пока не смоются все остатки краски;
- гашение фона осуществляют раствором перманганата калия или
акридинового оранжевого в течение 2 минут. При использовании
перманганата калия время его воздействия не должно превышать 2
минут. Точность экспозиции имеет решающее значение, так как при
передержке интенсивность флюоресценции микобактерий может
уменьшаться;
- мазки промывают дистиллированной водой;
- мазки высушивают при комнатной температуре в вертикальном
или наклонном положении.
Нельзя нагревать мазки и использовать полоски фильтровальной
бумаги.
10.4.3. Хранение приготовленных мазков
Приготовленные мазки хранят в защищенном от света месте при
комнатной температуре. Используют специальные коробки. Стекла не
должны соприкасаться друг с другом для исключения повреждения
целостности мазка. Положительные мазки хранят 1 год и более, если
больной находится это время в стационаре. Окрашенные
флюоресцентными красителями мазки чувствительны к
ультрафиолетовому свету, особенно во время процесса
бактериоскопии, и способны за несколько секунд обесцветиться. Для
исключения этого мазки просматривают достаточно быстро, а при
необходимости сделать паузу перекрывают поток света от лампы
шторкой. Обесцветившиеся мазки можно повторно окрасить, однако это
не всегда приводит к полному восстановлению препарата.
XI. ТЕХНИКА МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ПРЕПАРАТА
11.1. Оборудование и реактивы для проведения
микроскопического исследования препаратов, окрашенных
по методу Ziehl-Neelsen
Для проведения микроскопического исследования при окраске по
методу Ziehl-Neelsen необходимы:
- бинокулярный микроскоп;
- иммерсионное масло;
- капельница для нанесения масла на препарат;
- штатив с окрашенными и высушенными мазками, которые должны
быть расположены в порядке номеров регистрации;
- емкость с ксилолом, спирто-эфирной смесью или 70- спиртом,
фильтровальная бумага для удаления иммерсионного масла с
поверхности просмотренного препарата;
- коробки для хранения просмотренных мазков;
- мягкая хлопчатобумажная ткань, бумажные салфетки или
марлевые тампоны для протирания линз микроскопа;
- бумага и ручка для записи результатов микроскопического
исследования;
- емкость с дезинфицирующим средством.
Для исследования мазков, окрашенных по Ziehl-Neelsen,
используют световой бинокулярный микроскоп с иммерсионным
объективом 90x или 100x и окулярами 7x или 10x.
11.2. Морфологические характеристики кислотоустойчивых
микобактерий при окраске по методу Ziehl-Neelsen
Кислотоустойчивые микобактерий туберкулеза имеют в длину
примерно 1 - 10 мкм, в ширину - 0,2 - 0,6 мкм. Обычно они видны в
виде тонких изящных палочек, но иногда можно обнаружить изогнутые
или извитые варианты.
При окраске карболовым фуксином микобактерии туберкулеза
выявляются в виде тонких, слегка изогнутых палочек
малиново-красного цвета, содержащих различное количество гранул.
Микроорганизмы, располагающиеся по одиночке, парами или в виде
групп, хорошо выделяются на голубом фоне других компонентов
препарата. Нередко бактериальные клетки могут располагаться в виде
римской цифры "V".
Внутри отдельных микробных клеток могут обнаруживаться участки
более интенсивного окрашивания, в результате чего они похожи на
"бусы", а более слабо окрашенные участки могут быть видны в виде
"полос".
В препарате могут выявляться также измененные коккоподобные
кислотоустойчивые формы возбудителя, округлые сферические или
мицелиеподобные структуры. Однако в случае обнаружения измененных
форм кислотоустойчивых микроорганизмов положительный ответ должен
быть подтвержден дополнительными методами исследования.
Некоторые другие микроорганизмы, не относящиеся к
М.tuberculosis, могут иметь различные формы - от длинных палочек
до кокковидных форм с различной интенсивностью окрашивания.
Различную степень кислотоустойчивой окраски можно наблюдать не
только у микобактерий, но и у других микроорганизмов. Это могут
быть Rhodococcus, Nocardia, Legionella, а также цисты
Cryptosporidium и Isospora.
Быстрорастущие микобактерии могут отличаться по степени
кислотоустойчивой окраски - при частичной потере кислотоустойчивой
окраски они приобретают фиолетово-малиновый цвет.
11.3. Оборудование и реактивы для проведения
микроскопического исследования препаратов, окрашенных
флюорохромными красителями
Для проведения микроскопического исследования при окраске
флюорохромами необходимы:
- люминесцентный микроскоп;
- штатив с окрашенными и высушенными мазками, которые должны
быть расположены в порядке номеров регистрации;
- коробки для хранения просмотренных мазков;
- мягкая хлопчатобумажная ткань или марлевые тампоны для
протирания линз микроскопа;
- бумага и ручка для записи результатов микроскопического
исследования;
- емкость с дезинфицирующим средством.
Для исследования мазков, окрашенных флюорохромными
красителями, используют люминесцентный микроскоп с набором
объективов и окуляров, позволяющих получить увеличение объекта
наблюдения в пределах 250x - 630x. Необходимо использовать
объективы, предназначенные для люминесцентной микроскопии.
11.4. Порядок проведения микроскопического исследования
Современные микроскопы являются сложными техническими
устройствами, чувствительными к настройке и правилам эксплуатации.
Перед началом работы они должны быть настроены и адаптированы под
зрение микроскописта. Это лучше поручить инженерной службе, но
можно провести самостоятельно, используя рекомендации по настройке
и эксплуатации микроскопа (Приложение N 3 настоящей Инструкции).
Несоблюдение правил настройки может привести к существенному
снижению эффективности микроскопических исследований.
Исследование мазков, окрашенных по методу Ziehl-Neelsen,
производится в проходящем свете с помощью светового микроскопа.
Исследование рекомендуется производить с помощью бинокулярного
микроскопа или монокулярного микроскопа, оснащенного бинокулярной
насадкой.
При исследовании мазков, окрашенных флюоресцентными
красителями, используется люминесцентный микроскоп. При этом одной
из важных особенностей работы с мазками, окрашенными
флюорохромами, является то, что они не подлежат длительному
наблюдению в выбранном поле зрения, так как интенсивность
люминесценции окрашенного объекта быстро снижается. Другой
особенностью работы является необходимость строгого соблюдения
режима работы люминесцентного микроскопа.
Ртутную лампу нельзя выключать ранее чем через 15 минут после
ее зажигания. Повторное включение ртутной лампы допускается только
через 10 минут после ее выключения (полного ее охлаждения).
Для предохранения препаратов от выцветания в перерывах между
наблюдениями необходимо закрывать лампу шторкой.
Перед началом микроскопического исследования необходимо:
- проверить наличие на столе для микроскопии необходимого для
проведения микроскопического исследования оборудования и
дополнительных материалов;
- снять чехол, которым накрыт микроскоп;
- осмотреть микроскоп и протереть сухой салфеткой механические
части микроскопа;
- убедиться в целости оптической системы;
- включить осветительную систему и убедиться в достаточности
освещения;
- с помощью бумажной салфетки или марлевого тампона,
смоченного спирто-эфирной смесью, протереть линзы объективов
микроскопа;
- убедиться в том, что подготовленные для микроскопии
окрашенные препараты достаточно хорошо высушены;
- с помощью вращения винта грубой фокусировки (макровинта)
опустить предметный столик, максимально отдалив его от объектива;
- поворотом револьверного устройства установить объектив с
малым увеличением (10x) точно над конденсором;
- поместить на столик предметное стекло так, чтобы мазок
находился прямо под объективом (при этом обязательно убедиться,
что мазок находится в верхней плоскости предметного стекла, а не
снизу);
- закрепить препарат на столике с помощью клемм или
препаратоводителя;
- с помощью винтов препаратоводителя выбрать участок мазка для
начала просмотра;
- раздвинуть окуляры до полного совмещения изображений,
видимых правым и левым глазом исследователя;
- глядя сбоку, внимательно контролировать расстояние между
стеклом и линзой объектива. Медленно вращая винт грубой
фокусировки (макровинт), поднять предметный столик с препаратом к
объективу, но не допускать соприкосновения предметного стекла с
линзой объектива;
- глядя через окуляр, отрегулировать интенсивность светового
потока так, чтобы свет был ярким, но комфортным. Для этого
используют регулятор накала лампы, темные или матовые фильтры и
лишь в крайнем случае изменяют степень открытия диафрагмы.
Положение конденсора не изменяют;
- продолжая смотреть через окуляр, медленно повернуть
макровинт, чтобы предметный столик отошел от линзы объектива.
Обычно для получения изображения достаточно несколько поворотов
винта;
- затем, глядя в окуляр, медленно вращать микровинт до тех
пор, пока не появится изображение мазка. Небольшими поворотами
микровинта настроить изображение до получения достаточной
резкости. Никогда не поднимайте столик микроскопа, глядя в окуляр.
Это может привести к соприкосновению фронтальной линзы объектива с
предметным стеклом, повреждению линзы или порче препарата;
- глядя правым глазом в правый окуляр, сфокусировать
изображение;
- глядя левым глазом в левый объектив, сфокусировать
изображение путем поворота дополнительного фокусировочного кольца,
расположенного на левом окуляре.
Для исследования объекта с большим увеличением с помощью
"сухой" оптической системы, глядя на препарат сбоку, выбрать
объектив с более сильным увеличением. Убедиться, что этот объектив
не касается предметного стекла, и поворотом револьверного
устройства переместить выбранный объектив, установив его
непосредственно над препаратом. При этом мазок должен оставаться
почти в фокусе объектива.
С помощью микровинта сфокусировать резкость изображения.
Правильная настройка света также может улучшить качество
изображения.
Все манипуляции по настройке проводятся при сфокусированном на
объект микроскопе. При настройке объект должен быть выведен из
поля зрения, иными словами, после получения резкого изображения
объекта предметное стекло смещается таким образом, чтобы поле
зрения под объективом было прозрачным.
Работа с объективом масляной иммерсии.
Порядок работы:
- добиться четкого изображения объекта в поле зрения с помощью
сухого объектива малого увеличения и определить наиболее
подходящий для исследования участок препарата;
- поворотом револьверного устройства сместить сухой объектив
так, чтобы стал свободным доступ к препарату;
- нанести на выбранный участок препарата одну каплю
иммерсионного масла. Капля должна свободно упасть на стекло (при
этом желательно немного смазать иммерсионным маслом фронтальную
линзу объектива). Пипетка капельницы масла ни в коем случае не
должна соприкоснуться с мазком. Это может привести к переносу
микобактерий с одного мазка на другой, к загрязнению иммерсионного
масла и получению ложноположительного результата микроскопического
исследования;
- поворотом головки револьверного устройства установить
объектив с сильным увеличением (90x - 100x) непосредственно над
препаратом;
- глядя сбоку, под контролем глаза медленно вращать макровинт
грубой фокусировки и поднимать столик микроскопа до появления
мениска в момент соприкосновения фронтальной линзы объектива с
поверхностью капли масла;
- глядя в окуляр, с помощью винтов грубой и топкой регулировки
произвести настройку на резкость. Во время выполнения этой
манипуляции будьте особенно внимательны и смещайте винты на
небольшой ход, не допуская бесконтрольно полного оборота винтов.
В случае появления и поле зрения пузырьков воздуха операцию
настройки (момент соприкосновения фронтальной линзы объектива с
иммерсией) необходимо повторить, предварительно удалив масло с
объектива.
При микроскопическом исследовании мазка, окрашенного по
Ziehl-Neelsen, следует просматривать не менее 100 полей зрения,
чтобы дать количественную оценку препарату и обнаружить единичные
микобактерии. В том случае, если результат такого исследования
оказывается отрицательным, для подтверждения просматривают
дополнительно 200 полей зрения.
При значительном количестве кислотоустойчивых микобактерий
достаточно исследовать 20 - 50 полей зрения как при окраске по
Ziehl-Neelsen, так и при люминесцентной микроскопии (см.
таблицу 2).
При микроскопическом исследовании препарата необходимо быть
уверенным, что ни одно поле зрения препарата не просматривается
повторно, поэтому рекомендуется просматривать препарат всегда по
одной и той же схеме:
- либо 3 параллельных прохода по длине препарата;
- либо 9 параллельных проходов по ширине.
Просматривать препарат начинают с левого верхнего выбранного в
мазке поля зрения, постепенно передвигаясь либо вдоль продольной
оси препарата до конца мазка, либо смещаясь вниз и затем вновь
поднимаясь вверх и т.д., проходя все поля зрения до границы мазка.
При увеличении микроскопа 1000x, т.е. 100x для
масляно-иммерсионного объектива и 10x для окуляра, при
исследовании одной длины мазка (~ 20 мм) за один продольный проход
просматривается около 100 - 120 полей зрения (диаметр поля зрения
- 0,16 - 0,2 мм).
При люминесцентной микроскопии с использованием объектива 25x
и окуляра 10x площадь поля зрения примерно в 10 раз больше,
поэтому можно просматривать меньшее число полей зрения. Однако при
отрицательном результате или малом количестве выявляемых
микобактерий следует просматривать не менее 100 полей зрения.
По окончании микроскопического исследования каждого препарата
следует:
- освободить препарат от механических держателей - клемм или
препаратоводителя;
- снять препарат с предметного столика микроскопа;
- сверить идентификационный номер и записать результат
микроскопии на специальном листе бумаги, на котором перед началом
микроскопии написать в столбик порядковые номера препаратов,
подлежащих исследованию;
- затем, удерживая препарат за ребра стекла в участке, где
нанесен порядковый номер, положить препарат на покрытый
фильтровальной бумагой поднос (лоток) в вытяжной шкаф;
- для удаления иммерсионного масла накрыть препарат полоской
фильтровальной бумаги;
- смочить ее несколькими каплями ксилола или толуола;
- через 2 - 3 минуты фильтровальную бумагу удалить;
- очищенный от иммерсионного масла препарат поместить в
коробку для просмотренных стекол.
При большом количестве исследуемых препаратов рекомендуется
заранее подготовить 2 выстланных фильтровальной бумагой подноса
(лотка) - для положительных и отрицательных препаратов - и
удаление иммерсионного масла производить по окончании
микроскопического исследования одновременно со всех просмотренных
препаратов или части их.
В зависимости от результатов микроскопического исследования
просмотренный препарат поместить в коробку для положительных или
для отрицательных препаратов.
Перед тем как взять для исследования следующий препарат,
необходимо протереть иммерсионную линзу кусочком специальной ткани
или марлевым тампоном.
По окончании микроскопического исследования всей партии мазков
выполнить следующие процедуры:
- с помощью бумажной или марлевой салфетки протереть линзы
микроскопа спирто-эфирной смесью или спиртом;
- опустить предметный столик микроскопа, отдалив его от
объективов;
- уменьшить интенсивность освещения и выключить источник
освещения микроскопа;
- накрыть микроскоп полиэтиленовым или пластиковым пакетом;
- расставить все необходимое для микроскопии оборудование и
дополнительные материалы в установленном порядке;
- снять и удалить одноразовые перчатки;
- вымыть руки с мылом;
- перенести результаты микроскопического исследования в
лабораторный регистрационный журнал и на бланки ответов.
XII. ПРИЧИНЫ ОШИБОК ПРИ МИКРОСКОПИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
12.1. Ошибки при выполнении лабораторных процедур
12.1.1. Ложноположительные результаты могут быть обусловлены
следующими причинами:
- плохая обработка многоразовых флаконов для сбора материала,
в которых могут оставаться микобактерии;
- повторное использование предметных стекол после
положительного предыдущего мазка;
- использование для приготовления мазка загрязненных
бациллярным материалом бактериологических петель, пипеток или
деревянных палочек;
- применение предметных стекол с царапинами и другими
дефектами, в результате чего появляются артефакты, которые
ошибочно могут быть приняты за микобактерии; красная краска может
иногда задерживаться на царапинах и создавать у начинающего
исследователя ошибочное представление о том, что он видит
кислотоустойчивую микобактерию. Такие царапины нередко образуют
параллельные ряды. Обычно они более грубые и больше по размерам,
чем микобактерии. Их несложно идентифицировать, так как они
находятся на стекле в более глубокой плоскости (под мазком) и
исчезают, если установить фокус на клетки (лейкоциты,
эпителиальные клетки);
- использование плохо профильтрованного или длительно
сохранявшегося раствора фуксина, содержащего кристаллы;
- наличие микобактерий в иммерсионном масле, если иммерсионные
линзы не были очищены после положительных препаратов или
иммерсионное масло загрязнено микобактериями, если пипетка,
которой оно наносится на мазок, случайно соприкасалась с
положительным мазком;
- недостаточное обесцвечивание мазка, что может привести к
сохранению красной окраски на некоторых некислотоустойчивых
бактериях;
- волокна шерсти, хлопка, фильтровальной бумаги; обычно они
встречаются как единичные находки, чаще всего в одном поле зрения;
- пыльца некоторых видов сосны, которая может обнаруживаться в
виде редко встречающихся в препарате коротких кокковидных палочек.
12.1.2. Ложноотрицательные результаты могут быть обусловлены
следующими причинами:
- плохим качеством или недостаточным количеством исследуемого
материала;
- исследованием слюны вместо мокроты;
- неудачным выбором частиц мокроты для приготовления мазка;
- нарушением условий хранения, транспортировки, консервации
материала (высокая температура и низкая влажность, а также
воздействие на материал прямого солнечного света или
ультрафиолетового излучения, под влиянием которых содержащиеся в
материале микобактерии могут утратить присущую им
кислотоустойчивость);
- приготовлением слишком тонкого или толстого мазка, плохой
его фиксацией над пламенем горелки или несоблюдением режимов
окрашивания (неправильная экспозиция при окраске);
- нарушением методики просмотра мазка (малое число
просмотренных полей зрения);
- плохим качеством красителей и реагентов;
- при повторном просмотре мазков (реанализ) ложноотрицательный
результат может быть обусловлен тем, что после первичного
просмотра с препарата не было удалено иммерсионное масло (при
длительном воздействии оно обесцвечивает окраску) или препарат
тщательно протирали при удалении иммерсионного масла, что вызвало
повреждение мазка;
- хранение окрашенных мазков в месте, доступном прямым
солнечным лучам или ультрафиолетовому свету, парам кислот.
Мазки, окрашенные флюорохромами, при длительном хранении могут
утрачивать флюоресценцию.
12.1.3. Операторские ошибки (ложноположительные или
ложноотрицательные):
- неправильная маркировка флаконов с диагностическим
материалом;
- отсутствие маркировки на стекле или повреждение ее в
процессе окраски или обесцвечивания;
- неправильная регистрация результатов.
Таблица 1
ВОЗМОЖНЫЕ ПРИЧИНЫ НЕИСПРАВНОСТЕЙ
ПРИ МИКРОСКОПИИ И СПОСОБЫ ИХ УСТРАНЕНИЯ
----------------------T---------------------T--------------------¬
¦ Неисправность ¦ Возможная причина ¦ Способ устранения ¦
+---------------------+---------------------+--------------------+
¦Тусклое поле зрения ¦Низкое положение ¦Поднять конденсор ¦
¦ ¦конденсора ¦ ¦
¦ ¦Закрытая диафрагма ¦Открыть диафрагму ¦
¦ ¦конденсора ¦ ¦
+---------------------+---------------------+--------------------+
¦Темные объекты в поле¦Грязный окуляр ¦Протереть окуляр ¦
¦зрения, смещающиеся ¦Линзы микроскопа ¦Необходим ремонт ¦
¦при повороте окуляра ¦контаминированы ¦окуляра ¦
¦ ¦грибами ¦ ¦
¦ ¦На линзах окуляра ¦Заменить окуляр ¦
¦ ¦имеются царапины ¦ ¦
+---------------------+---------------------+--------------------+
¦Недостаточно четкое ¦Возможно, перевернут ¦Перевернуть ¦
¦изображение ¦препарат (мазок ¦предметное стекло ¦
¦ ¦находится снизу ¦Передвинуть 100x ¦
¦ ¦стекла) ¦объектив ¦
¦ ¦Пузырек воздуха в ¦Заменить масло ¦
¦ ¦масле ¦ ¦
¦ ¦Плохое качество масла¦ ¦
|
