|
Стр. 9
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ<*>
ПО ПРИМЕНЕНИЮ ЦОЛИКЛОНА АНТИ-Е МОНОКЛОНАЛЬНОГО
ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНА E СИСТЕМЫ РЕЗУС
НА ЭРИТРОЦИТАХ ЧЕЛОВЕКА
(ЦОЛИКЛОН АНТИ-E СУПЕР)
1. Назначение
Цоликлон анти-E Супер предназначен для выявления антигена E
системы резус на эритроцитах человека в реакции прямой
гемагглютинации и может применяться взамен или параллельно с
аллоиммунной анти-E сывороткой.
--------------------------------
<*> - Составители инструкции: профессор И.Л.Чертков, директор
ТОО "Гематолог" Г.Ю.Митерев, научные сотрудники Л.Н.Леменева,
Н.И.Оловникова, Е.В.Белкина.
2. Основные свойства
2.1. Моноклональные человеческие анти-Е антитела продуцируются
бессмертной гетерогибридомой клеточной линией. Цоликлон анти-Е
Супер изготавливается на основе культуральной жидкости,
кондиционированной клетками-продуцентами антител. Технология
производства реагента исключает возможность его контаминации
патогенными для человека вирусами.
2.2. Цоликлон анти-Е Супер содержит IgM антитела, которые
вызывают прямую агглютинацию Е+ эритроцитов. Реагент не содержит
антител других специфичностей и пригоден для выявления антигена Е
в эритроцитах любой группы.
3. Определение антигена Е
Цоликлон анти-Е Супер может быть использован в реакции
агглютинации на плоскости, в пробирках, в микроплате. Определение
антигена Е производится в нативной крови с консервантом, в крови
без консерванта, в том числе взятой из пальца.
3.1. Реакция агглютинации на плоскости
3.1.1. На пластинку нанести одну большую каплю реагента
(примерно 0,1 мл), одну маленькую каплю исследуемой крови или
эритроцитов (0,02-0,05 мл) и смешать.
3.1.2. Через 20-30 секунд после смешивания покачать пластинку.
3.1.3. Результат оценить визуально по наличию или отсутствию
агглютинации. Четкая реакция наступает через 30-60 секунд после
смешивания реагента с эритроцитами. Окончательный результат
реакции следует учитывать через пять минут. Наиболее крупная и
четкая агглютинация наблюдается при использовании эритроцитов в
высокой концентрации.
3.2. Реакция агглютинации в пробирках
3.2.1. Приготовить из отмытых исследуемых эритроцитов 5%
суспензию в физиологическом растворе.
3.2.2. Внести в круглодонную пробирку по одной капле Цоликлона
анти-Е и эритроцитарной взвеси, тщательно перемешать.
3.2.3. Оставить пробирку на тридцать минут при температуре 37°
С.
3.2.4. Центрифугировать пробирку при 1500-3000 оборотах в
минуту в течение тридцати секунд.
3.2.5. Осторожно встряхивая пробирку, разбить осадок.
3.2.6. Результат оценить визуально. При отрицательном
результате реакции осадок эритроцитов легко разбивается и образует
гомогенную непрозрачную суспензию. При положительном результате
осадок остается в виде одного или нескольких крупных агглютинатов
на фоне прозрачной жидкости.
4. Контроль специфичности
Для контроля специфичности при каждом исследовании (независимо
от применяемой методики) необходимо использовать стандартные Е+ и
Е- эритроциты.
5. Хранение
Срок хранения Цоликлона анти-Е Супер - один год при
температуре 2-8° С. Вскрытый флакон можно хранить при температуре
- 2-8° С в закрытом виде в течение одного месяца.
6. Рекламация
Основаниями для рекламации являются: отсутствие активности,
неспецифичность, нарушение целостности флакона, наличие хлопьев,
получение реагента с истекшим сроком годности или недостаточными
сведениями.
При составлении рекламации необходимо указать дату получения,
номер серии, претензии к реагенту. Необходимо приложить протокол с
результатами тестирования и 2-3 невскрытых флакона с Цоликлоном
данной серии.
Рекламацию следует направить на предприятие-изготовитель.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 15
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ<*>
ПО ПРЕДУПРЕЖДЕНИЮ ПОСТРАНСФУЗИОННЫХ ОСЛОЖНЕНИЙ,
ОБУСЛОВЛЕННЫХ ФАКТОРАМИ КЕLL И C(HR')
Наиболее выраженными антигенными свойствами среди минорных
антигенов эритроцитов обладают факторы Kell (K) и с. Фактор К
стоит на втором месте после антигена D в шкале трансфузионно
опасных антигенов эритроцитов. Третье место занимает фактор с.
--------------------------------
<*> - Составители: С.И.Донсков, А.Г.Башлай, Т.М.Пискунова,
В.И.Червяков, И.С.Липатова.
Индекс сенсибилизации (процент лиц с повышенным риском
посттрансфузионного осложнения) к обоим указанным факторам
высокий.
Фактор К встречается примерно у 10% людей, поэтому почти
каждая десятая гемотрансфузия - это трансфузия К-положительной
крови К-отрицательному реципиенту, каждая десятая беременность -
это беременность К-отрицательной женщины К-положительным плодом.
С тем, чтобы избежать посттрансфузионных осложнений по фактору
К, необходимо выдавать в лечебные учреждения К-отрицательные
эритроциты. В кабинетах, отделениях и станциях переливания крови
следует производить определение К фактора у всех доноров в
обязательном порядке наряду с определением групповой- и
резус-принадлежности крови, после чего отбирать К-положительные
образцы, не допуская их выдачи для переливания К-отрицательным
больным.
К-положительным донорам целесообразно рекомендовать другой вид
донорства (плазмы, тромбоцитов, лейкоцитов и др.), но не
эритроцитов. Такие мероприятия позволят существенно снизить
индекс сенсибилизации населения к фактору К, что в свою очередь
будет способствовать предупреждению посттрансфузионных осложнений,
обусловленных этим фактором, сократит частоту гемолитической
болезни новорожденных.
Определение антигена К в эритроцитах производят с помощью
следующих методов:
1. Непрямая проба Кумбса.
2. Желатиновый метод в пробирках.
3. Экспресс-метод на плоскости.
Индекс сенсибилизации населения к фактору с так же достаточно
высок. Около 20% людей не содержат антигена С в эритроцитах.
Именно эти люди представляют группу повышенного риска развития
посттрансфузионного осложнения, поскольку им в 80% случаев
переливают эритроциты, содержащие фактор с. Число переливаний
с-положительных эритроцитов с-отрицательным реципиентам составляет
16 на 100 гемотрансфузий. Число беременностей с-положительным
плодом с-отрицательных женщин составляют также 16 на 100.
С тем, чтобы уменьшить индекс сенсибилизации населения и
избежать посттрансфузионных осложнений, обусловленных
несовместимостью по этому фактору, целесообразно у каждого
резус-положительного реципиента определять с-антиген и при его
отсутствии переливать реципиенту кровь доноров с-отрицательных
(гомозиготных по антигену С). На станциях и в отделениях
переливания крови необходимо иметь резервную группу таких доноров
или запас с-отрицательной эритроцитной массы.
Антиген с определяют теми же методами, что и антиген D.
Инструкция
по определению Келл-фактора экспресс-методом
Оснащение: специально приготовленные сыворотки анти-К
универсальные, физиологический раствор NaCl, пластинки (тарелки) с
гидрофильным покрытием, стеклянные палочки, песочные часы.
Для исследования используют свежие - не более 2-х дневного
хранения, неотмытые или отмытые эритроциты, взятые со дна пробирки
после отстаивания от сыворотки (третья фракция эритроцитов),
плазмы с консервантом или физиологического раствора. Используют
также цельную кровь, взятую из прокола пальца непосредственно
перед исследованием.
Техника определения: на плоскость помещают одну каплю (0,05
-0,06 мл)<*> сыворотки анти-К и каплю эритроцитов в количестве 1/3
от объема взятой сыворотки. Капли перемешивают стеклянной палочкой
и при плавном периодическом покачивании пластинки наблюдают за
ходом реакции в течение 5 минут.
--------------------------------
<*> - 1 мл сыворотки анти-К расходуется на 15-20 исследований.
Оценка результатов: при положительном результате агглютинация
эритроцитов появляется к 30 сек - 1 мин и в дальнейшем
усиливается, при отрицательном результате агглютинация
отсутствует. По истечении 3-4 минут в реагирующую смесь добавляют
1-2 капли физиологического раствора для снятия возможной
неспецифической агрегации эритроцитов и продолжают наблюдение до
истечения 5 минут, после чего регистрируют результат (см. рис.)<*>
--------------------------------
<*> - рисунок не приводится.
ВНИМАНИЕ! Во избежание ошибок рекомендуется использовать
осадок эритроцитов, максимально освобожденный от взвешивающей
среды.
Срок годности сывороток - четыре месяца.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 16
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ИММУНИЗАЦИИ ДОНОРОВ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ СЫВОРОТКИ
И ИММУНОГЛОБУЛИНА АНТИРЕЗУС
1. Выбор доноров для иммунизации
К иммунизации антигенами системы резус могут привлекаться
доноры-мужчины от 18 до 50 лет и женщины от 45 до 50 лет или
моложе, если у них уже наступила менопауза.
Реиммунизация может производиться лицам, ранее
сенсибилизированным к антигену резус вследствие резус-конфликтных
беременностей или введения им крови.
Иммунизацию и реиммунизацию проводят только после ознакомления
с сущностью данной процедуры привлекаемых для этого лиц и с их
согласия, данного в письменной форме.
Перед иммунизацией и реиммунизацией доноры и
сенсибилизированные лица, привлеченные к донорству, проходят
врачебное освидетельствование согласно "Инструкции по медицинскому
освидетельствованию доноров крови, плазмы, клеток крови",
утвержденной Министерством здравоохранения Российской Федерации 29
мая 1995 года.
Медицинское освидетельствование повторяется перед каждым
курсом иммунизации и реиммунизации. Наличие в анамнезе у женщины
выкидышей, мертворождений, гемолитической болезни у их
новорожденных и другой патологии, связанной с резус-конфликтом, не
является противопоказанием к иммунизации, реиммунизации и
последующему взятию крови и плазмы (плазмаферез). У этого
контингента лиц допускается также содержание гемоглобина не менее
120 г/л, количества эритроцитов - не менее 3,7 х 10 12/л,
лейкоцитов до 10х10 9/л, палочкоядерных нейтрофилов до 10%,
лимфоцитов до 45%.
У лиц, давших согласие на иммунизацию и реиммунизацию,
проводят исследования на антиген гепатита В, антитела к вирусу
иммунодефицита человека (ВИЧ) и на содержание
аланинаминотрасферазы. Эти исследования повторяют перед каждым
курсом иммунизации и реиммунизации.
К иммунизации допускаются лица, не содержащие в крови антигена
гепатита В, антител к гепатиту С, вирусу иммунодефицита человека
(ВИЧ) и с содержанием аланинаминотрансферазы в пределах нормы.
Эритроциты лиц, отобранных для иммунизации, и доноров, кровь
которых будет использована в качестве антигена, титруют по
антигенам системы резус: D, C, E, c, e и по возможности других
систем (Келл, Даффи и т.д.).
До иммунизации сыворотку крови этих лиц проверяют на наличие
различных резус-антител, а эритроциты - прямой пробой Кумбса.
Положительный результат прямой пробы Кумбса является
противопоказанием для иммунизации и реиммунизации, так же как и
вообще для зачисления в доноры. При наличии резус-антител
устанавливают специфичность и титр. Если эти показатели не дают
возможности изготовления из этой крови стандартной сыворотки или
иммуноглобулина антирезус, то для повышения активности антител
такому лицу можно проводить реиммунизацию.
После иммунизации и реиммунизации донору должна быть выдана
справка о том, какую кровь следует подбирать ему в случае
необходимости гемотрансфузии.
Справка должна быть напечатана на картоне или плотной бумаге,
отвечающей условиям длительного хранения, и помещена в прозрачный
влагоустойчивый конверт. В справке должны быть указаны следующие
сведения:
- город и название учреждения, производившего иммунизацию и
выдавшего справку,
- фамилия, имя, отчество донора,
- группа крови по системе АВО;
- резус-принадлежность (фенотип);
- чем иммунизировали (резус-антиген);
- при необходимости гемотрансфузий обязателен индивидуальный
подбор совместимой крови только от резус ........ лиц.
Справка должна быть подписана руководителем учреждения с
указанием даты и скреплена печатью.
2. Подготовка донора, кровь которого
используется в качестве антигена
Антигеном для резус-иммунизации служат эритроциты
консервированной крови активных доноров группы О(I) или
одноименной с кровью иммунизируемого лица.
Помимо полного обследования, предусмотренного для доноров,
дающих кровь для переливания больным, донор антигена должен быть
обследован два раза в год у врача-инфекциониста с целью исключения
латентно протекающего заболевания печени.
Для иммунизации применяется кровь, содержащая антиген, против
которого предполагается получить антитела. Этот антиген должен
отсутствовать у лица, которое иммунизируется этой кровью.
Рекомендуется для каждой группы лиц (в количестве до десяти
человек) использовать для иммунизации эритроциты одного и того же
донора.
Кровь, используемая в качестве антигена, заготавливается
стерильно в мелкой расфасовке на любом консервирующем растворе и
годна к употреблению семь дней. После вскрытия флакона путем
прокола пробки кровь должна быть использована сразу для
иммунизации одного или нескольких доноров. Оставлять кровь после
вскрытия флакона до прихода следующей группы доноров воспрещается.
Для иммунизации могут быть использованы также криоконсервированные
размороженные эритроциты со сроком хранения, предусмотренным для
этой среды.
Для иммунизации рекомендуется отбирать эритроциты с высокой
активностью соответствующих резус-антигенов. О ней судят по
быстроте наступления и характеру агглютинации эритроцитов с
антисывороткой соответствующей специфичности.
При иммунизации антигенами С и Е в течение курса рекомендуется
для каждого иммунизируемого лица применять эритроциты одного и
того же донора, преимущественно свежеконсервированные.
3. Условия иммунизации и реиммунизации
Инъекции антигена проводят в условиях соблюдения асептики, в
специально отведенном помещении, в котором не производится работа
с сыворотками. Помещение должно быть оборудовано бактерицидными
лампами и проточной холодной и горячей водой. Перед иммунизацией
проводят влажную обработку помещения с применением антисептиков.
Для иммунизации применяют шприцы одноразового пользования, а при
отсутствии - обычные шприцы, которые должны быть автоклавированы.
Перед началом и на 8-30 день после окончания каждого курса
иммунизации у донора необходимо взять кровь для исследования на
наличие, специфичность и активность антител.
Ниже приводятся схемы иммунизации и реиммунизации доноров
антигенами системы резус. Однако при необходимости в этих схемах
могут быть допущены некоторые отклонения в сроках введения
антигена - до пяти дней между инъекциями и до полутора месяцев
между курсами, и в дозах - в пределах+-5 мл.
При всех схемах иммунизации и реиммунизации кровь,
используемая в качестве какого-либо антигена резус, должна
быть отрицательной по фактору Келл.
4. Иммунизация доноров для получения антител анти-D
Для получения антител анти-D рекомендуется иммунизировать лиц
фенотипа ccddee, используя в качестве антигена эритроциты фенотипа
ccDee. Однако следует иметь в виду, что в процессе такой
иммунизации иногда, кроме антител анти-D, образуются антитела
анти-С. Для избежания этого можно привлекать к иммунизации лиц
фенотипа Ccddee, применяя в качестве антигена кровь фенотипа
ccDee, а также фенотипа CcDee.
Иммунизация лиц гомозиготных по антигену С, т.е. фенотипа
CCddee кровью вышеуказанных генотипов не разрешается ввиду
возможности образования у них антител анти-с.
Схема иммунизации
Первый курс состоит из трех внутривенных или внутримышечных
инъекций крови донора-антигена в количестве: первая - 10 мл крови,
последующие две инъекции - по 5 мл с интервалами между ними
три-четыре дня. Через четыре месяца проводят второй курс
иммунизации.
Второй курс состоит из трех внутривенных или внутримышечных
инъекций крови донора-антигена по 5 мл на каждую с интервалами по
три-четыре дня.
Третий и четвертый курсы: донорам, у которых за два курса не
выработалось антител, через шесть месяцев после второго курса
следует провести третий и четвертый курсы иммунизации, аналогичные
второму курсу.
Если после четвертого курса у донора не выработается антител,
через четыре месяца, и в дальнейшем с теми же интервалами, следует
провести сокращенные курсы по типу реиммунизации.
Если и после такой длительной иммунизации антитела не
образуются, донора от иммунизации отстраняют.
После выработки у донора активных антител для сохранения и
дальнейшего повышения их титра им необходимо периодически
проводить инъекции антигена - реиммунизацию.
5. Реиммунизация доноров для получения антител анти-D
Реиммунизация проводится лицам, у которых выработались
антитела-D вследствие проведенной иммунизации, бывших ранее
беременностей или переливания крови. Реиммунизация дает
возможность сохранить титр антитела в крови иммунизируемых лиц или
добиться его повышения. Подбор крови-антигена для реиммунизации
проводится так же, как и для иммунизации.
Реиммунизация проводится через четыре месяца после окончания
иммунизации и появления антител и затем повторяется каждые четыре
месяца. У лиц, иммунизированных беременностями или трансфузиями
крови, реиммунизацию можно начать также не ранее, чем через четыре
месяца, но только вне периода беременности и лактации.
Курс реиммунизации состоит из
двух-трехкратного внутривенного или внутримышечного введения крови
донора по 2-3 мл с интервалом два-три дня. Такие курсы повторяются
каждые четыре месяца.
6. Время появления антител
Время появления неполных резус-антител анти-D колеблется от
четырех месяцев до года и более лет от начала иммунизации. Титр
антител может быть от 1:2 до 1:1024 и выше. Стойкие высокие титры
анти-D у ранее не сенсибилизированных лиц обычно устанавливаются
не ранее, чем через полтора года.
Приведенные схемы иммунизации и реиммунизации обеспечивают
выработку неполных антител анти-D с титром не ниже 1:64 не менее,
чем у 70% иммунизируемых лиц.
7. Иммунизация доноров для получения антител анти-С и анти-Е
Для получения антител анти-С и анти-Е рекомендуются следующие
сочетания фенотипа крови иммунизируемого лица и эритроцитов,
применяемых для иммунизации:
-------------T----------------------T----------------------------¬
¦Планируемые ¦ Фенотип крови ¦ Фенотип эритроцитов, ¦
¦ антитела ¦ иммунизируемого лица ¦ применяемых для иммунизации¦
+------------+----------------------+-----------------T----------+
¦ ¦ ccddee ¦ Ccddee ¦ CCddee ¦
¦ +----------------------+-----------------+----------+
¦ анти-С ¦ ccDee ¦ Ccddee ¦ CCddee ¦
¦ ¦ ccDEe ¦ CcDee ¦ CCDee ¦
¦ ¦ ¦ CcDEe ¦ CCDEe ¦
+------------+----------------------+-----------------+----------+
¦ ¦ ccddee ¦ ccddEe ¦ ¦
¦ анти-Е ¦ Ccddee ¦ ¦ ¦
¦ +----------------------+-----------------+----------+
¦ ¦ CcDee ¦ ccddEe ¦ ccDEE ¦
¦ ¦ ¦ ccDEe ¦ CcDEE ¦
¦ ¦ ¦ CcDEe ¦ ¦
L------------+----------------------+-----------------+-----------
Для получения антител анти-С и анти-Е рекомендуется две схемы
иммунизации, из которых первая дает более благоприятный результат.
Первая схема иммунизации
Первый курс состоит из десяти внутривенных введений крови
донора антигена с перерывом по два дня. Первые пять инъекций - по
2 мл и последующие пять - по 1 мл. Затем следует перерыв в четыре
месяца.
Второй курс состоит из десяти внутривенных или внутримышечных
введений крови с интервалами по два дня. Первые пять инъекций - по
1 мл и последующие пять - по 0,5 мл.
Третий и дальнейшие курсы. Если по окончании второго курса у
донора не выработались антитела, выработались антитела с низким
титром или титр их впоследствии ослабел, то через четыре месяца
проводят третий курс иммунизации (реиммунизации), аналогичный
второму, и так повторяют каждые четыре месяца.
Вторая схема иммунизации
Первый курс состоит из шести внутривенных или внутримышечных
инъекций крови с интервалами по два - три дня. Первая инъекция -
10 мл и последующие пять - 5 мл. Через восемь - десять месяцев
проводится второй курс.
Второй курс состоит из трех внутривенных или внутримышечных
инъекций крови по 5 мл с интервалами по три-четыре дня.
Третий и дальнейшие курсы. Если по окончании второго курса у
донора не выработались антитела, выработались антитела с низким
титром или титр их впоследствии ослабел, то через четыре месяца
проводится третий курс иммунизации (реиммунизация), аналогичный
второму, и так повторяется каждые четыре месяца.
8. Время появления антител анти-С и анти-Е
Антитела анти-С и анти-Е появляются в сроки от 6 месяцев
(полные) до 2,5-3 лет (неполные) после начала иммунизации.
Антитела появляются у 10-15% иммунизируемых лиц с титром 1:1 - 1:8
для неполных антител и 1:2 - 1:32 для полных антител.
9. Заключение
Иммунизация и реиммунизация не оказывают отрицательного
влияния на состояние здоровья доноров.
В процессе иммунизации, а также после выработки антител при
взятии крови и плазмы (плазмаферез) у доноров могут наблюдаться
преходящие изменения периферической крови, например, увеличение
количества палочкоядерных нейтрофилов до 10%, моноцитов до 12%,
лимфоцитов до 45%, повышение содержания общего количества
лейкоцитов до 10х10 в степ. 9 /л, общего билирубина до 20,5
мкмоль/л, активности аланинаминотрансферазы до 1,36 мкмолей,
пировиноградной кислоты на 1 мл сыворотки за 1 час инкубации при
37° С. Эти сдвиги не являются противопоказаниями для продолжения
иммунизации и реиммунизации и взятия у доноров крови и плазмы
(плазмаферез).
Определение антител в сыворотке крови иммунизированных лиц,
обработка сывороток и их испытание производятся согласно
действующей "Инструкции по изготовлению сывороток антирезус".
Оплата изоиммунным донорам за каждую иммунизацию производится
по отдельному расчету согласно нормативным документам Министерства
здравоохранения и органов управления здравоохранения субъектов
Российской Федерации.
Оплата изоиммунным донорам за дачу крови и плазмы
(плазмаферез) производится в двукратном размере по отношению к
неиммунным донорам крови, плазмы согласно нормативным документам
Министерства здравоохранения и органов управления здравоохранения
субъектов Российской Федерации.
С целью увеличения количества изоиммунных доноров крови,
плазмы разрешается дополнительная оплата изоиммунным донорам за
дачу крови или плазмы на усмотрение органов управления
здравоохранения субъектов Российской Федерации.
Изоиммунные доноры имеют право на внеочередное обслуживание в
лечебных учреждениях.
Методические рекомендации "Иммунизация доноров для получения
сыворотки и иммуноглобулина антирезус", утвержденные Министерством
здравоохранения СССР 27 ноября 1990 года N 10-11/138, считать
утратившими силу с момента утверждения данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 17
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ВЗЯТИЮ И УЧЕТУ КРОВИ, ПОЛУЧАЕМОЙ ОТ
ДОНОРОВ МАЛЫМИ ДОЗАМИ, ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ
СТАНДАРТНЫХ ЭРИТРОЦИТОВ
1. Каждое учреждение службы крови, а также лаборатории в
других лечебно-профилактических учреждениях, где производится
определение резус-принадлежности и изготовление сывороток
антирезус и других антисывороток должны иметь постоянных доноров,
у которых берется кровь для приготовления стандартных эритроцитов.
Стандартные эритроциты применяют в обязательном порядке при
определении группы крови АВО, резус-принадлежности, выявлении
антиэритроцитарных антител, а также как контроль при изготовлении
стандартных сывороток, предназначенных для определения группы
крови АВО, сывороток антирезус, различных тест-сывороток для
выявления антигенов эритроцитов.
1.1. При определении группы крови необходимо иметь контрольные
эритроциты трех групп: О, А (подгруппа А1) и В;
1.2. при приготовлении стандартных изогемагглютинирующих
сывороток следует использовать кровь доноров, указанных в пункте
1.1, и дополнительно иметь доноров подгруппы А2, А3, Ах, А2В, АВ2;
1.3. при определении резус-принадлежности необходимы
контрольные резус-положительные и резус-отрицательные эритроциты;
1.4. при изготовлении стандартных сывороток антирезус и при
выявлении резус-антител необходимо иметь контрольные эритроциты
доноров, указанных в пункте "в", и дополнительно подобрать доноров
групп О, А, В, АВ так, чтобы среди образцов крови было по одному
резус-положительному и одному резус-отрицательному образцу. Эти
доноры должны быть исследованы дополнительно и, в зависимости от
наличия у них различных антигенов резус, число доноров должно быть
пополнено за счет доноров группы О(I) так, чтобы в эритроцитах
доноров этой группы обязательно имелись антигены резус D, C, E, c,
e, Cw порознь или в различных сочетаниях, а также антигены систем
К - k, Fya - Fyb и других систем эритроцитов;
1.5. при изготовлении тест-сывороток различной специфичности
необходимо иметь контрольные эритроциты доноров, указанных в
пунктах 1.3. и 1.4. и типированных по антигенам различных
эритроцитарных систем: гомозиготные, гетерозиготные и
отрицательные по различным антигенам.
2. Кровь для приготовления стандартных эритроцитов берут у
доноров из пальца или из вены не чаще трех раз в неделю в
зависимости от потребности.
3. Каждый донор, у которого берут кровь малыми дозами для
приготовления стандартных эритроцитов, должен находиться на учете
отделения донорских кадров, где на него должен быть заведен
донорский журнал. Если лаборатория, для которой донор дает кровь
малыми дозами, не входит в состав учреждения Службы крови, донор
находится на учете непосредственно в этой лаборатории.
При зачислении в доноры (в дальнейшем каждые четыре месяца)
донор должен быть осмотрен врачом-терапевтом, у него проверяется
содержание гемоглобина и число эритроцитов. Взятие крови
допускается при условии содержания гемоглобина не ниже 12 г% (120
г/л) для женщин и 13 г% (130 г/л) - для мужчин.
4. В лабораториях, где у доноров берут кровь для приготовления
стандартных эритроцитов, должна быть заведена книга учета взятия
крови по следующей форме:
Фамилия ______________ имя _____________отчество _____________
Группа крови _________________________,
фенотип по различным системам эритроцитов ____________________
-------------T-------------T---------------T-----------------T------------------¬
¦ 1. Дата ¦1. Количество¦1. Расписка ¦1. Расписка лица,¦ 1. Расписка лица,¦
¦взятия крови¦ взятой крови¦донора, давшего¦ взявшего кровь ¦ использовавшего ¦
¦ ¦ ¦ кровь ¦ ¦ кровь для работы ¦
+------------+-------------+---------------+-----------------+------------------+
¦ 2. ¦2. ¦2. ¦2. ¦ 2. ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
L------------+-------------+---------------+-----------------+-------------------
5. Взятие крови количественно подытоживается за 1,5-2 месяца.
Итог подписывается руководителем лаборатории или отдела, для нужд
которого бралась кровь.
6. Руководитель лаборатории или отдела на основании записи в
книге учета взятия крови дает донору справку, в которой должен
указать количество взятой крови и за какой период времени взята
кровь. Справку подписывает руководитель лаборатории или отдела.
7. Принимая во внимание многократность и характер процедуры
взятия крови у доноров, компенсацию за взятую у них кровь
устанавливают в тройном размере по сравнению с суммой компенсации,
установленной для доноров, дающих кровь для переливания больным.
8. На доноров, у которых берут кровь малыми дозами для
приготовления стандартных эритроцитов, распространяются все
льготы, как для доноров, дающих кровь для переливания больным,
согласно нормативным документам Министерства здравоохранения и
органов управления здравоохранения субъектов Федерации. Выходной
день предоставляется донору за суммарное взятие крови в количестве
не менее 100 мл.
"Инструкцию по взятию и учету крови, получаемой от доноров
малыми дозами, для приготовления стандартных эритроцитов",
утвержденную Министерством здравоохранения СССР 14 октября 1976
года N 06-14/1, считать утратившей силу с момента утверждения
данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 18
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ИММУННЫХ АНТИТЕЛ
ГРУППОВОЙ СИСТЕМЫ АВО
I. ВВЕДЕНИЕ
Антитела системы АВО - альфа и бета являются нормальными
(естественными) у человека. Они относятся к полным антителам -
агглютининам, хорошо реагируют в солевой среде, лучше выявляются
при комнатной температуре и хуже при температуре 37° С. Добавление
в реакцию коллоидных веществ не усиливает активности этих антител,
непрямой пробой Кумбса их не выявляют.
Нормальные антитела альфа и бета легко абсорбируются из
сыворотки при добавлении групповой субстанции Витебского. Они
чувствительны к воздействию высокой температуры: прогревания при
70° С в течение десяти минут достаточно, чтобы эти антитела
полностью потеряли активность.
Кроме нормальных (естественных) антител альфа и бета у
человека могут появиться еще иммунные антитела этой системы,
которые в отличие от нормальных были обозначены символами анти-А и
анти-В.
Иммунные антитела не присутствуют регулярно в крови людей, но
могут возникнуть вследствие изоиммунизации при парентеральном
поступлении в организм несовместимого в групповом отношении
антигена, при иногруппной беременности, при ошибочном переливании
крови, несовместимой по системе АВО, а также при проведении
некоторых прививок и иммунизации.
При иногруппной беременности, послужившей причиной
гемолитической болезни плода, иммунные антитела анти-А или анти-В
почти всегда присутствуют в крови матери к моменту рождения
больного ребенка. При этом им обычно сопутствует высокий титр
нормальных антител альфа и бета.
При ошибочном переливании несовместимой крови иммунные
антитела анти-А или анти-В появляются обычно на пятый-седьмой
день, достигая максимума к пятнадцатому-двадцать пятому дню с
последующим падением их титра.
В крови у таких больных одновременно повышается титр
нормальных антител альфа и бета на 3-8 ступеней также с
последующим снижением после 25-30 дня.
Иммунные антитела анти-А и анти-В могут быть как в полной, так
и неполной форме. Они активны при 37° С, могут иметь несколько
более высокий титр при проведении реакции в коллоидной среде по
сравнению с солевой и выявляться в непрямой пробе Кумбса. Иммунные
антитела не абсорбируются при добавлении групповоспецифической
субстанции Витебского. Они стойки к температурному воздействию и
сохраняют активность при прогревании сыворотки в течение 10 минут
при температуре 70° С, т.е. при условиях, при которых нормальные
антитела альфа и бета полностью инактивируются. Выявление
изоиммунных антител может служить ценным диагностическим
признаком, в частности, при решении вопроса о причинах
гемотрансфузионных осложнений и гемолитической болезни
новорожденных. Эти исследования рекомендуются для использования в
практике. Наиболее демонстративным отличием нормальных антител
альфа и бета от иммунных антител анти-А и анти-В является их
поведение при воздействии высокой температуры. На этих различиях и
основано применение разных методов для выявления нормальных
антител альфа и бета и изоиммунных антител анти-А и анти-В (см.
разделы II-V). Активность иммунных антител проявляется в виде
способности вызывать агглютинацию эритроцитов при проведении
реакции в солевой среде или, как конечный результат, в непрямой
пробе Кумбса.
Кроме этих антител, вследствие иммунизации, вызванной теми же
причинами, могут одновременно образовываться гемолизины, которым
свойственна также групповая специфичность (Методы определения
групповых гемолизинов см. в разделах II, VI).
II. ОСНАЩЕНИЕ
При определении антител альфа, бета и иммунных антител анти-А,
анти-В необходимо следующее оснащение:
- стандартные эритроциты группы А(II) и В(III) или смесь
эритроцитов от 5-6 доноров отдельно каждой группы;
- стандартная сыворотка для пробы Кумбса;
- изотонический раствор NaCl;
- пробирки центрифужные;
- пробирки маленькие высотой 2-2,5 см с внутренним диаметром
5-6 мм и с гладким дном округлой формы;
- пробирки высотой 4-10 см для пробы Кумбса;
- белые пластинки со смачиваемой поверхностью;
- штативы;
- термостат 37° С;
- центрифуга;
- водяная баня 70° С.
III. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛНЫХ ИММУННЫХ АНТИТЕЛ СИСТЕМЫ АВО
РЕАКЦИЕЙ СОЛЕВОЙ АГГЛЮТИНАЦИИ
1. Подготовительная работа.
Стандартные эритроциты или смеси эритроцитов группы А(II) и
В(III) дважды отмывают изотоническим раствором NaCl путем
центрифугирования, после чего на дне пробирки остается
эритроцитная масса, из которой приготавливают 2-3% взвеси и
отдельно каждой группы.
Исследуемую сыворотку в количестве 0,5-1 мл разводят в четыре
раза изотоническим раствором NaCl во избежание коагуляции при
нагревании, затем разливают поровну в две пробирки, одну из
которых прогревают в течение 10 минут при 70° С, точно соблюдая
температуру и время. Таким образом, получится две порции сыворотки
- нативной и прогретой, каждая из которых разведена 1:4.
Определение антител начинается реакцией агглютинации в солевой
среде в маленьких пробирках. Если в этом методе полных иммунных
антител не обнаружено, исследование далее дополняют непрямой
пробой Кумбса.
2. Техника реакции.
При исследовании сыворотки группы А(II) или В(III) в штатив
устанавливают в ряд 12 маленьких пробирок. При исследовании
сыворотки группы О(I) - два ряда по 12 пробирок. Штатив
предварительно накрывают листом бумаги, в котором накалывают
отверстия для установки пробирок. На бумаге надписывают фамилию и
группу крови лица, чья сыворотка исследуется, группу крови
стандартных эритроцитов и у каждой пробирки - степень разведения
помещенной в нее сыворотки (1:4, 1:8, 1:16 и т.д. до 100).
Во все пробирки каждого ряда, начиная со второй, накапывают по
две капли изотонического раствора NaCl. Затем в первую и во вторую
пробирки (каждого ряда) накапывают по две капли приготовленной
непрогретой сыворотки, разведенной в четыре раза.
Во второй пробирке каждого ряда сыворотку смешивают с
изотоническим раствором NaCl и две капли этой смеси переносят в
третью пробирку, из третьей, также после перемешивания - в
четвертую и т.д. до последней, из которой две капли удаляют. В
результате в пробирках получается разведение сыворотки от 1:4 до
100.
В другом штативе также приготавливают разведения
предварительно прогретой сыворотки (при этом в штатив обычно
достаточно поместить по шесть пробирок - разведение сыворотки от
1:4 до 1:128).
После приготовления разведений сыворотки во все пробирки
добавляют по одной капле 2-3% взвеси стандартных эритроцитов
противоположной группы: при исследовании сыворотки группы В(III) -
эритроциты группы А(II), при исследовании сыворотки группы А(II) -
эритроциты группы В(III) и при исследовании сыворотки группы О(I)
в один ряд пробирок добавляют эритроциты группы А(II), в другой
ряд - эритроциты группы В(III).
Содержимое пробирок тщательно перемешивают, после чего штативы
оставляют в покое на 1 час: с нативной сывороткой при комнатной
температуре, с прогретой - при 37° С.
3. Трактовка результатов.
Результат оценивают по форме осадка эритроцитов на дне
пробирки, просматривая его через лупу с 6-8-кратным увеличением
над источником света.
При наличии агглютинации осадок располагается в виде комочков
неравномерным слоем с изогнутыми, иногда завернутыми внутрь
краями. При отсутствии агглютинации осадок эритроцитов
располагается равномерным слоем в центре дна пробирки в виде
правильно очерченного круга. Результаты отмечают на бумаге у
каждой пробирки знаком плюс (+) или минус (-).
Наличие агглютинации свидетельствует о присутствии полных
|
