|
Стр. 4
+----------------+---------+-----------+ +----------------+---------+----------+
¦ Стандартные эритроциты ¦ ¦ Стандартные эритроциты ¦
+----------------T---------T-----------+ +----------T---------T----------------+
¦ О(I) ¦ А(II) ¦ В(III) ¦ ¦ О(I) ¦ А(II) ¦ В(III) ¦
¦ - ¦ + ¦ - ¦ ¦ - ¦ - ¦ - ¦
+----------------+---------+-----------+ +----------+---------+----------------+
¦Исследуемая кровь группы В(III) ¦ ¦Исследуемая кровь группы АВ(IV) ¦
L--------------------------------------- L--------------------------------------
Таблица 2. Оценка результатов определения групп крови
перекрестным методом при помощи изогемагглютинирующих сывороток
двух серий каждой группы и стандартных эритроцитов.
"Инструкцию по определению групп крови системы АВО при помощи
стандартных изогемагглютинирующих сывороток", утвержденную
Министерством здравоохранения СССР 07 сентября 1990 г. N 05-14/27,
считать утратившей силу с момента утверждения данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 4
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ<*>
ПО ПРИМЕНЕНИЮ ЦОЛИКЛОНОВ АНТИ-А, АНТИ-В И АНТИ-АВ
ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ЖИДКИХ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГРУПП КРОВИ
ЧЕЛОВЕКА СИСТЕМЫ АВО (АНТИТЕЛА МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ
АНТИ-А, АНТИ-В, АНТИ-АВ)
ТУ 9398-205-27575295-94
1. Назначение
Цоликлоны анти-А, анти-В и анти-АВ предназначены для
определения групп крови человека системы АВО в прямых реакциях
гемагглютинации и применяются взамен или параллельно с
поликлональными иммунными сыворотками.
2. Характеристика и основные свойства цоликлонов
анти-А, анти-В и анти-АВ
Моноклональные анти-А и анти-В антитела продуцируются двумя
мышиными гибридомами и принадлежат к иммуноглобулинам класса М.
Цоликлоны изготавливаются из асцитной жидкости мышей-носителей
анти-А и анти-В гибридом. Цоликлон анти-АВ представляет собой
смесь моноклональных анти-А и анти-В антител. Технология
изготовления реагента исключает возможность его контаминации
патогенными для человека вирусами.
--------------------------------
<*> - Составители инструкции: профессор И.Л.Чертков, директор
ТОО "Гематолог" Г.Ю.Митерев, научные сотрудники Л.Н.Леменева, Н.И.
Оловникова, Е.В.Белкина.
3. Техника определения групп крови человека
системы АВО с помощью цоликлонов
Определение производится в нативной крови, взятой в
консервант: в крови, взятой без консерванта, в том числе взятой из
пальца. Используется метод прямой гемагглютинации на плоскости: и
на пластине или планшете. Определение группы крови производится в
помещении с хорошим освещением при температуре 15-25° С.
3.1. Нанесите на планшет или пластину индивидуальными
пипетками Цоликлоны анти-А, анти-В и анти-АВ по одной большой
капле (0,1 мл) под соответствующими надписями.
3.2. Рядом с каплями антител нанесите по одной маленькой капле
исследуемой крови (0,01-0,03 мл).
3.3. Смешайте кровь с реагентом.
3.4. Наблюдайте за ходом реакции с Цоликлонами визуально при
легком покачивании пластины или планшета в течение трех минут.
Агглютинация эритроцитов с Цоликлонами обычно наступает в первые
3-6 секунд, но наблюдение следует вести три минуты ввиду более
позднего появления агглютинации с эритроцитами, содержащими слабые
разновидности антигенов А или В.
3.5.Результат реакции в каждой капле может быть положительным
или отрицательным. Положительный результат выражается в
агглютинации (склеивании) эритроцитов. Агглютинаты видны
невооруженным глазом в виде мелких красных агрегатов, быстро
сливающихся в крупные хлопья. При отрицательной реакции капля
остается равномерно окрашенной в красный цвет, агглютинаты в ней
не обнаруживаются.
3.6. Интерпретация результатов реакции агглютинации
исследуемой крови с Цоликлонами представлена в таблице.
----------------------------------T---------------------------¬
¦ Результат реакции<*> ¦ ¦
¦ с Цоликлоном: ¦ Исследуемая кровь ¦
+----------T---------T------------+ принадлежит к группе <**>¦
¦ анти-А ¦ анти-В ¦ анти-АВ ¦ ¦
+----------+---------+------------+---------------------------+
¦ - ¦ - ¦ - ¦ О(I) ¦
+----------+---------+------------+---------------------------+
¦ + ¦ - ¦ + ¦ А(II) ¦
+----------+---------+------------+---------------------------+
¦ - ¦ + ¦ + ¦ В(III) ¦
+----------+---------+------------+---------------------------+
¦ + ¦ + ¦ + ¦ АВ(IV) ¦
L----------+---------+------------+----------------------------
--------------------------------
<*> - Знаком плюс (+) обозначено наличие агглютинации,
знаком минус (-) - отсутствие агглютинации.
<**> - Окончательно АВО принадлежность устанавливается только
по результатам перекрестного определения: антигенов А и В на
эритроцитах и изогемагглютининов в сыворотке.
4. Контроль специфичности реакции агглютинации
В составе Цоликлонов нет высокомолекулярных добавок, способных
вызвать неспецифическую полиагглютинацию эритроцитов, поэтому не
требуется проведение контроля с растворителем. При положительном
результате реакции агглютинации со всеми тремя Цоликлонами
необходимо исключить спонтанную неспецифическую агглютинацию
исследуемых эритроцитов. Для этого смешайте на плоскости одну
каплю исследуемой крови (эритроцитов) с каплей физиологического
раствора. Кровь можно отнести к группе АВ(IV) только при
отсутствии агглютинации эритроцитов в физиологическом растворе.
5. Форма выпуска
Цоликлоны выпускаются в жидкой форме во флаконах объемом 5-10
мл. Цоликлон анти-А - красного цвета, анти-В - синего и анти-АВ -
бесцветный. В качестве консерванта применяется азид натрия в
конечной концентрации 0,1%.
6. Хранение
Срок хранения - два года при температуре 2-8° С. Вскрытый
флакон можно хранить при температуре 2-8° С в закрытом виде в
течение одного месяца.
7. Рекламация
Основаниями для рекламации являются: отсутствие активности,
неспецифичность, нарушение целостности флакона, наличие хлопьев,
получение реагента с истекшим сроком годности или недостаточными
сведениями.
При составлении рекламации необходимо указать дату получения,
номер серии, причины, по которым реагент признан негодным.
Необходимо также приложить протокол с результатами проверки
реагента. Вместе с рекламацией направляют 2-3 невскрытых флакона с
Цоликлоном данной серии.
Рекламацию следует направить на предприятие-изготовитель.
"Инструкцию по применению Цоликлонов анти-А, анти-В и анти-АВ
диагностических жидких для определения групп крови человека
системы АВО (антитела моноклональные анти-А, анти-В, анти-АВ)",
утвержденную Управлением научных исследований Минздравмедпрома
России 17 марта 1995 года, считать утратившей силу с момента
утверждения данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 5
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ИЗГОТОВЛЕНИЮ СТАНДАРТНЫХ СЫВОРОТОК
И РЕАГЕНТА АНТИРЕЗУС
Стандартные сыворотки антирезус служат для определения
резус-принадлежности крови людей и приготавливаются из крови лиц,
сенсибилизированных к резус-фактору, содержащих в крови активные
резус-антитела.
Источники получения сыворотки антирезус
Кровь (плазма) для изготовления сывороток антирезус может быть
получена: а) от женщин, сенсибилизированных к резус-фактору во
время беременности; б) от больных, перенесших трансфузионные
реакции или осложнения, которым производят кровопускание в
процессе их лечения (обменные трансфузии, плазмаферез) и от тех же
лиц после их излечения; в) от доноров, дающих кровь для
переливания больным, в тех (редких) случаях, когда у них
обнаружены в крови резус-антитела; г) от лиц, специально
иммунизированных антигеном резус. (см. Метод. рекоменд.
"Иммунизация доноров для получения сывороток и иммуноглобулина
антирезус").
Выявление женщин, сенсибилизированных к резус-антигену и
содержащих в крови резус-антитела
Наиболее часто сенсибилизация к резус-антигену происходит у
женщин во время беременности. Выявление таких лиц производится
персоналом женских консультаций и родильных домов. Кровь
резус-отрицательных женщин исследуют на наличие антител. При
выявлении резус-антител сведения о таких лицах передаются в
учреждения Службы крови.
Учет лиц, в крови которых содержатся резус-антитела
В тех случаях, когда устанавливается сенсибилизация к
резус-антигену, т.е. наличие в крови у женщин резус-антител, таких
женщин регистрируют и заводят на них карту "Учета изоиммунных
лиц". Карты заполняются персоналом родильных домов, в женских
консультациях и в учреждениях Службы крови.
Привлечение к донорству лиц, в крови которых содержатся
резус-антитела
У женщин, в крови которых содержатся резус-антитела, может
быть взята кровь для изготовления стандартной сыворотки.
Привлечение таких лиц к донорству требует особого подхода.
Следует учитывать, что большинство из них перенесло тяжелую
психическую травму в связи с болезнью, а иногда и смертью ребенка.
Желательно рассказать женщине, что из ее крови будет приготовлена
сыворотка-реактив, которую необходимо использовать при лечении
детей с таким же заболеванием.
При согласии женщины дать кровь необходимо обследовать
состояние ее здоровья и установить возможность и дозы взятия
крови.
В дальнейшем, но не ранее, чем через полгода после родов и по
окончании периода лактации, желательно привлечение женщин,
иммунизированных во время беременности, к систематическому
донорству, а при падении титра антител - к реиммунизации, в
соответствии с "Методическими рекомендациями по иммунизации
доноров для получения сыворотки и иммуноглобулина антирезус".
Показатели пригодности крови для изготовления из нее
стандартной сыворотки антирезус
Показателем пригодности крови для приготовления из нее
стандартной сыворотки является ее активность, т.е. титр
резус-антител.
Ввиду возможного снижения титра антител при обработке
сыворотки следует привлекать к донорству лиц, в крови которых
содержатся антитела анти-D с титром, превышающим окончательные
требования, предъявляемые к стандартным сывороткам. Для полных
антител титр должен быть не ниже, чем 1:32, для неполных антител
при исследовании их в непрямой пробе Кумбса - не ниже, чем 1:128,
а при исследовании реакцией с применением желатина в пробирках или
реакцией в сывороточной среде на плоскости - не ниже 1:64.
Исходный титр резус-антител при изготовлении стандартного
универсального реагента должен быть не ниже 1:32.
Методы и дозы взятия крови
Взятие крови от лиц, сенсибилизированных к резус-антигену
предыдущими беременностями или трансфузиями крови, а также от
искусственно иммунизированных доноров, состояние здоровья которых
соответствует требованиям инструкции, предъявляемым к донорам,
дающим кровь для переливания больным, допускается в дозах,
предусмотренных этой инструкцией.
Плазму, содержащую резус-антитела, рекомендуется получать
также методом плазмафереза, однако только вне периода
беременности.
Оплата на усиление питания лицам, из крови которых
изготавливается сыворотка антирезус, при любом методе взятия крови
и последующего отделения сыворотки или плазмы, производится в
тройном размере.
Первичная обработка сыворотки и плазмы
При получении плазмы из крови донора методом плазмафереза
плазма не позже, чем через 2-3 дня, должна быть дефибринирована.
Для этого плазму переливают из пластикатного мешка во флакон,
добавляют в нее 20% раствор хлорида кальция из расчета 3 мл на 100
мл плазмы и содержимое флакона тщательно перемешивают. Через
несколько минут после этого, а затем еще раз через 30 минут флакон
с плазмой встряхивают для отделения свертка от стенок флакона и
оставляют на 2 часа при комнатной температуре, после чего помещают
в холодильник при температуре 4-8° С. На следующий день сыворотку
отсасывают от свертка в другой флакон и консервируют борной
кислотой из расчета 2-3 г на 100 мл сыворотки или азидом натрия -
1 г на 1 л.
Если кровь берут обычным путем в сухой флакон, то через
несколько минут после взятия крови, а затем еще раз через 30
минут флакон встряхивают для отделения свертка от стенок и
оставляют на 2 ч. при комнатной температуре, после чего помещают в
холодильник при температуре 4-8°С. На следующий день сыворотку
отсасывают от свертка в другой флакон и консервируют. При высоком
титре резус-антител можно получить дополнительное количество
сыворотки антирезус путем приготовления смывов со свертка. Для
этого сверток измельчают (разрезают на много частей) и заливают
его до половины объема изотоническим раствором NaСl или сывороткой
группы АВ(IV) с высокими конглютинирующими свойствами, стандартным
разводителем или альбумином.
Флакон со свертком, залитым жидкостью, плотно закрывают
пробкой и несколько раз переворачивают для того, чтобы лучше
вымыть из свертка сыворотку антирезус, а затем помещают в
холодильник при температуре 4-8° С. На следующий день
сыворотку-смыв сливают в другой сосуд и оставляют в холодильнике
до полного оседания эритроцитов, после чего переливают в другой
сосуд и полученный смыв исследуют на активность резус-антител.
Если титр соответствует требованиям, изложенным в пункте 11, смыв
соединяют с первоначально полученной сывороткой или обрабатывают
далее отдельно, предварительно добавляя в него борную кислоту из
расчета 2-3 г на 100 мл сыворотки или азид натрия - 1 г на 1 л.
Приготовление смыва можно повторить. Изотонический раствор NaCl
применяется для смывов в тех случаях, когда предполагается
последующее использование сыворотки антирезус реакцией
агглютинации в солевой среде (в маленьких пробирках) или реакцией
конглютинации с применением желатина или полиглюкина.
После такой первичной обработки сыворотку хранят при 4-8 ° С
не менее 2-3 недель и затем приступают к дальнейшим исследованиям.
Исследование сыворотки
Исследование сыворотки следует производить через 2-3 недели
после ее заготовки и консервирования ввиду того, что в этот период
может происходить снижение титра антител. Исследование начинают с
проверки групповой принадлежности сыворотки по системе АВО.
Полученные результаты сверяют с паспортными записями на флаконе с
сывороткой. Следует учесть, что если исследуется смыв со свертка,
полученный сывороткой группы АВ(IV) или стандартным разводителем
группы АВ(IV), то может произойти нейтрализация групповых антител
альфа и бета. Если это будет установлено, то делают
соответствующие изменения в паспортных записях. Далее определяют в
сыворотке присутствие полных и неполных антител с помощью методов,
описанных в "Инструкции по исследованию сыворотки на наличие
резус-антител".
Для испытания применяется не менее трех образцов стандартных
эритроцитов одноименной с испытуемой сывороткой группы или группы
О(I), содержащих в том или ином сочетании три антигена резус: D, C
и E, а также два образца резус-отрицательных (ccddee) эритроцитов.
Положительный результат с резус-положительными эритроцитами и
отрицательный с резус-отрицательными подтверждает наличие в
сыворотке резус-антител. После этого сыворотку титруют тем же
методом, которым в ней были выявлены антитела. Например, если
сыворотка дала положительный результат в солевой среде, ее титруют
в солевой среде; если сыворотка дала положительный результат в
непрямой пробе Кумбса или в реакции с применением желатина, ее
титруют, используя эти методы; если сыворотка оказалась активной
при использовании обоих методов, она титруется также с помощью
двух методов (методы титрования см. в "Инструкции по исследованию
сыворотки на наличие резус-антител").
Сыворотку считают пригодной для дальнейшей обработки и
исследования, если в ней выявляют антитела любым методом и если
при этом антитела достаточно активны. Активность антител
определяется их титром, который на этом этапе исследования должен
быть для полных антител не ниже 1:16, а для неполных антител в
непрямой пробе Кумбса не ниже 1:64, реакциями с применением
желатина или полиглюкина, и в сывороточной среде на плоскости - не
ниже 1:32.
Сыворотки сохраняют в холодильнике при 4-8° С еще не менее 2
недель, после чего повторно титруют.
Примечание: в тех случаях, когда сыворотка антирезус
принадлежит к группе Оальфа бета(I), Абета(II) или Вальфа(III),
для удобства последующего использования ее рекомендуется
абсорбировать, т.е. удалить из нее групповые агглютинины, сделав
таким образом ее универсальной.
Если в сыворотке присутствуют слабые антитела анти-С или
анти-Е, их необходимо также удалить из сыворотки путем абсорбции.
После абсорбции (нейтрализации) сыворотку антирезус вновь
исследуют и титруют, как сказано выше.
Способы удаления или нейтрализации антител см. в Методических
рекомендациях "Удаление из сыворотки антирезус-D антител другой
специфичности".
Повторное титрование сыворотки
Повторное титрование сыворотки производят, используя метод,
который дал положительный результат при первом исследовании
сыворотки. Если титр антител сохранился или снизился не более чем
на одну ступень, но так, что все же остался не ниже цифр,
указанных в пункте 8, сыворотку можно подвергнуть стандартизации.
Стандартизация сыворотки антирезус
Стандартизация заключается в исследовании специфичности
антител и в определении пригодности ее для практического
использования. Для стандартизации сыворотку исследуют с помощью
того же метода, в котором оказались активными содержащиеся в
сыворотке антитела. Испытание ведется со стандартными эритроцитами
одноименной группы или группы О(I), содержащими различные антигены
резус, в том числе каждый из этих антигенов в отдельности: ссDee,
Ccddee и ccddEe, и резус-отрицательными - ccddee. В число
резус-отрицательных включают образцы эритроцитов, содержащих и не
содержащих факторов Даффи (Fy) и Келл (К). Если при стандартизации
сыворотка дает положительный результат со всеми образцами
резус-положительных эритроцитов, независимо от их антигенной
структуры, и отрицательный результат с эритроцитами Ссddee, ccddEe
и резус-отрицательными - ссddee, то значит в сыворотке содержатся
резус-антитела анти-D. Если в сыворотке таким образом выявлены
антитела специфичности анти-D, то ее титруют при использовании
того же метода.
Если сыворотка при стандартизации дает положительный результат
с некоторыми образцами резус-положительных эритроцитов и с
эритроцитами Ссddee или ccddEe, но дает отрицательный результат с
эритроцитами ccDee и с резус-отрицательными - ccddee, то это
значит, что в сыворотке содержатся резус-антитела анти-С или
анти-Е.
Антитела анти-С и анти-Е также титруют, используя метод, при
помощи которого они были выявлены.
Если сыворотка при стандартизации дает положительный результат
одновременно со всеми образцами резус-положительных эритроцитов, а
также с эритроцитами Ссddee и ссddEe, но отрицательный результат
со всеми резус-отрицательными эритроцитами ccddee, то это значит,
что сыворотка содержит антитела соответственно к двум или трем
антигенам резус, т.е. анти-D+C анти-D+E или анти-D+C+E.
Каждое из антител титруют отдельно теми методами, при
использовании которых они оказались активными.
Следует отметить, что различные резус-антитела в одной и той
же сыворотке бывают полными и неполными и поэтому могут быть
соответственно активными в той или иной среде. В этих случаях их
титрование следует проводить, используя разные методы.
Если исследуемая сыворотка дала положительный результат
избирательно среди резус-отрицательных образцов, это значит, что в
ней содержатся другие антитела, например, анти-Даффи или
анти-Келл.
Исследование и обработку таких сывороток см. в "Инструкции по
изготовлению сывороток редких групп".
Окончательное заключение о пригодности сыворотки
Сыворотка считается стандартной и пригодной для практического
использования, если она содержит одно или несколько резус-антител
в любой форме (полные или неполные) с титром для анти-D: в солевой
среде не ниже 1:16; в непрямой пробе Кумбса - не ниже 1:64; для
реакции с применением желатина или полиглюкина
Ввиду редкости антител анти-С и анти-Е допускается
использование таких сывороток с более низким титром при условии
хорошо выраженного положительного результата. Сыворотки,
отвечающие этим требованиям, считаются стандартными сыворотками
данной специфичности.
Назначение сыворотки антирезус
Сыворотка антирезус, признанная стандартной, может быть
использована в зависимости от формы установленных в ней антител:
реакцией агглютинации в солевой среде, реакцией с применением
желатина, реакцией в сывороточной среде на плоскости.
Кроме того, сыворотка, содержащая неполные резус-антитела,
может быть использована для приготовления стандартного
универсального реагента антирезус с применением 33% раствора
полиглюкина. Для этого требуется ее дальнейшая обработка (см. п.
16).
Во всех случаях сыворотка и реагент, предназначенные для
практического использования, должны быть расфасованы и
паспортизированы.
Розлив и паспортизация стандартных сывороток антирезус
После стандартизации и заключения о пригодности сыворотки
фильтруют и разливают в ампулы или в маленькие флаконы по 2-5 мл,
в зависимости от потребности. На флаконы (ампулы) наклеиваются
этикетки с наименованием учреждения-изготовителя, номера серии,
обозначения группы крови по системе АВО, специфичности, формы
антител антирезус и срока годности.
Хранение и срок годности стандартной сыворотки антирезус
Расфасованные стандартные сыворотки антирезус хранят в
холодильнике при 4-8° С или в замороженном состоянии при -15° С и
ниже.
При хранении в замороженном состоянии сыворотка не изменяет
свойств в течение 2 лет.
При размораживании или хранении ее при 4-8° С срок годности
устанавливают 4 мес.
Активность резус-антител в большинстве случаев сохраняется и
дольше. Поэтому по истечении срока годности сыворотки могут быть
проверены (см. п. 10) и при сохранении их специфичности и титра
срок годности продлевают: для сыворотки, хранящейся в замороженном
состоянии - еще на 1 год, а для сыворотки, хранившейся при 4-8° С
- на 2 месяца.
-------------------------------¬-------------------------------¬
¦ Наименование учреждения- ¦¦ Наименование учреждения- ¦
¦ изготовителя ¦¦ изготовителя ¦
¦ ¦¦ ¦
¦ Сыворотка АНТИРЕЗУС ¦¦ Сыворотка АНТИРЕЗУС ¦
L-------------------------------L-------------------------------
-------------------------------¬-------------------------------¬
¦ анти- ..... неполные антителদ анти- ....... полные антитела¦
¦ для метода ..................¦¦ для метода ..................¦
¦ Группа крови ........ ¦¦ Группа крови ........ ¦
¦ Серия ........ ..... мл ¦¦ Серия ........ ..... мл ¦
¦ Годна до ......... ¦¦ Годна до ......... ¦
L-------------------------------L-------------------------------
Рисунок 1. Форма этикеток для стандартных сывороток антирезус.
На этикетках группы А(II), В(III) и АВ(IV) наносят по
диагонали цветные полосы:
для сыворотки группы А(II) - синие;
для сыворотки группы В(III) - красные;
для группы АВ(IV) и специально приготовленной - универсальной
- желтые.
Выдача стандартной сыворотки антирезус
При выдаче стандартной сыворотки антирезус к ней необходимо
приложить инструкцию по использованию. Для сыворотки антирезус это
особенно важно, так как сыворотки, содержащие антитела, разные по
форме (полные и неполные) и приготовленные для разных методов
исследования, активны только при применении определенного метода и
будут неактивными или неспецифическими при неправильном их
использовании. Инструкции по использованию для каждого метода см.
дополнения 1, 2, 3.
Изготовление стандартного универсального реагента антирезус
для определения резус-принадлежности в пробирках без
подогрева
Стандартный универсальный реагент антирезус пригоден для
определения резус-фактора крови, независимо от ее групповой
принадлежности по системе АВО. Реагент готовят из сывороток,
содержащих неполные резус-антитела, предварительно обработанных,
исследованных и признанных пригодными как стандартные (см. п.п.
6-11).
Для изготовления реагента отбирают сыворотки группы АВ(IV)
или другой группы, но освобожденные от групповых агглютининов
альфа и бета путем удаления или нейтрализации (см. Методические
рекомендации "Удаление из сыворотки антирезус-D антител другой
специфичности").
Для изготовления реагента пригодны сыворотки антирезус с
титром не ниже, чем 1:32. Если исходные сыворотки имеют более
высокий титр, допускается их разведение до титра 1:32
изотоническим раствором NaCl, сывороткой группы АВ(IV) или
стандартным универсальным разводителем (см. Методические
рекомендации "Приготовление сыворотки-разводителя и стандартного
разводителя").
Титрование сывороток производят с применением 33% раствора
полиглюкина.
В штатив устанавливают 10 пробирок с обозначением 1:2, 1:4 и
т.д. до 1:1024. Во все пробирки вводят по 2 капли изотонического
раствора NaCl.
Затем в первую пробирку вводят той же пипеткой 2 капли
исследуемой сыворотки антирезус, из первой пробирки, после
перемешивания содержимого, переносят 2 капли во вторую, из третьей
- в четвертую и т.д. до последней, из которой 2 капли удаляют.
Затем во все пробирки добавляют по 1 капле резус -
положительных эритроцитов или их смеси и по 1 капле 33% раствора
полиглюкина.
Примечание: смесь эритроцитов готовят из крови 4-6 доноров
группы О(I) резус-положительной, взятой не более, чем за 2-3 дня.
Пробирки встряхивают для перемешивания содержимого, затем
наклоняют почти до горизонтали и в таком положении медленно
поворачивают по оси так, чтобы содержимое растеклось по стенкам
пробирки. Такой контакт сыворотки с эритроцитами при поворачивании
пробирок продолжают 3 минуты.
Через 3-5 минут во все пробирки добавляют по 2-3 мл
изотонического раствора NaCl и перемешивают содержимое путем 1-2
кратного переворачивания пробирок (не встряхивать!).
Результат наблюдают в проходящем свете невооруженным глазом
или через лупу.
Оценку результата производят по наличию или отсутствию
агглютинации эритроцитов в виде комочков или хлопьев на фоне
полностью или частично обесцвеченной жидкости.
Последнее разведение, в котором имеется агглютинация
эритроцитов, принимают за титр исследуемой сыворотки.
Установив, что титр резус-антител в данном методе не ниже
1:32, переходят к дальнейшему исследованию, для чего готовят
пробный образец реагента.
Изготовление пробного образца реагента антирезус
К 2 объемам сыворотки антирезус с неполными антителами
добавляют 1 объем 33% раствора полиглюкина, тщательно перемешивают
и далее проводят исследование в отношении специфичности и
активности.
Исследование на специфичность и активность
Пробный образец реагента исследуют с 2-3 образцами
резус-положительных эритроцитов, а также с резус-отрицательными
ccddee группы О(I), А(II) и В(III). Кроме того, в исследование
включают эритроциты генотипа Ccddee и ccddEe. Среди
резус-отрицательных должны быть образцы, положительные и
отрицательные по факторам Даффи (Fy) и Келл (К).
Для исследования устанавливают ряд пробирок по числу образцов
эритроцитов, пробирки маркируют. На дно пробирок помещают по 2
капли исследуемого реагента и затем, в соответствии с маркировкой,
в пробирки вводят по 1 капле эритроцитов. Содержимое пробирок
тщательно перемешивают, затем пробирки наклоняют почти до
горизонтального положения, медленно поворачивают и т.д., как
сказано выше.
Трактовка результата
Результат учитывают по отсутствию или наличию агглютинации
эритроцитов и скорости ее наступления в каждой пробирке.
Специфичность оценивают по отсутствию агглютинации с
D-отрицательными эритроцитами различного фенотипа в каждой
отдельной пробирке.
Если агглютинация произошла во всех пробирках с
резус-положительными образцами, а со всеми резус-отрицательными
образцами и образцами Ссddee и ссddEe - реакция отрицательная,
пробный образец считают специфическим.
Активность пробного образца можно оценивать одновременно с
оценкой специфичности.
Если агглютинация резус-положительных эритроцитов проявилась
при поворачивании наклоненной пробирки в течение 1-й минуты и
через 3 минуты после добавления изотонического раствора NaCl
агглютинаты образуют крупные хлопья на фоне полностью
просветленной жидкости и при этом титр антител, определенный на
предыдущем этапе исследования, не ниже 1:32, реагент считают
пригодным для практического использования.
Изготовление полного объема (серии)
стандартного универсального реагента антирезус
После заключения о пригодности пробного образца можно готовить
стандартный универсальный реагент в полном объеме, исходя из
потребности. Изготовленный реагент вновь контролируют теми же
методами, т.е. титруют и исследуют на специфичность и активность и
делают заключение о его пригодности.
После этого реагент фильтруют, разливают по 2-5 мл во флаконы
или ампулы, которые тщательно закупоривают (запаивают) и
наклеивают на них этикетки с указанием учреждения, изготовившего
реагент, название реагента, специфичности, номера серии и срока
годности.
-------------------------------------¬
¦ Наименование ¦
¦ учреждения-изготовителя ¦
+------------------------------------+
¦ Универсальный реагент антирезус ¦
¦ анти- ................. ¦
¦для метода в пробирках без подогрева¦
¦ Серия ......... .......... мл ¦
¦ Годен до .............. ¦
L-------------------------------------
Рисунок 2. Форма этикетки для стандартного универсального
реагента антирезус.
Хранение и срок годности
Реагент хранят в холодильнике при 4-8° С.
Срок годности - 6 месяцев. Активность и специфичность реагента
контролируют 1 раз в месяц в лаборатории, его изготовившей.
Выдача стандартного универсального реагента антирезус
Реагент антирезус выдается в другие учреждения в комплекте с
33% раствором полиглюкина и с инструкцией по использованию (см.
дополнение 2).
Регистрация работы по изготовлению сыворотки и реагента
антирезус
Все этапы работы по изготовлению сывороток, предназначенных
для разных методов определения резус-принадлежности, а также
реагента антирезус, регистрируются в "Журнале регистрации
материала, поступившего для изготовления стандартной сыворотки
антирезус" и в "Журнале регистрации изготовленной стандартной
сыворотки антирезус".
Дополнение N 1
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ СТАНДАРТНОЙ СЫВОРОТКИ АНТИРЕЗУС ДЛЯ
ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕЗУС-ПРИНАДЛЕЖНОСТИ РЕАКЦИЕЙ
С ПРИМЕНЕНИЕМ ЖЕЛАТИНА
(Прилагается при выдаче сыворотки)
Реакция с применением желатина пригодна для работы с
сыворотками, содержащими неполные резус-антитела.
Общие замечания.
При определении резус-принадлежности необходимо учитывать
групповую специфичность сыворотки антирезус по системе АВО.
Сывороткой антирезус или группы АВ(IV) специально
приготовленной- универсальной определяют резус-принадлежность в
эритроцитах любой группы по системе АВО. Сывороткой антирезус
группы О(I) определяют резус-принадлежность только в эритроцитах
группы О(I), сывороткой группы А(II) - в эритроцитах группы О(I) и
А(II) и сывороткой антирезус группы В(III) - в эритроцитах группы
О(I) и В(III).
При каждом исследовании или проводимой серии исследований
необходимо для проверки специфичности и активности сыворотки
антирезус ставить контроль. Для контроля применяют стандартные
резус-положительные эритроциты группы О(I) или той же группы, что
и исследуемая кровь, и стандартные резус-отрицательные эритроциты
обязательно той же группы, что и исследуемая кровь.
Предварительная обработка исследуемой крови и стандартных
эритроцитов.
Кровь для исследования берут в количестве 5 мл в обычную
пробирку без стабилизатора. На пробирке надписывают фамилию,
инициалы и группу крови лица, от которого взята кровь.
Обычно после свертывания крови на дне пробирки остается
небольшое количество свободных эритроцитов, которые и следует
употреблять для исследования. Если этих эритроцитов недостаточно,
следует встряхнуть сверток для отделения большего количества
эритроцитов.
Можно брать кровь с изотоническим раствором лимоннокислого
натрия (0,25 мл на 1 мл крови) или другим стабилизатором. В этом
случае эритроциты необходимо отмыть, для чего в пробирку долить
доверху изотонический раствор NaCl, содержимое ее перемешать и
центрифугировать. Отмытые эритроциты используют для исследования.
Допустимо хранить кровь в течение 2-3 суток при 4-8° С.
Техника реакции.
а) В штатив устанавливают два ряда центрифужных пробирок
объемом не менее 10 мл по количеству исследуемых образцов
эритроцитов и по две пробирки для стандартных резус-положительных
и резус-отрицательных эритроцитов. На двух пробирках каждого ряда
надписывают фамилию и инициалы лица, кровь которого будет
исследоваться.
б) В одинаково обозначенные пробирки вводят согласно
маркировке по одной капле (0,05 мл) исследуемых эритроцитов, в
контрольные пробирки - по одной капле (0,05 мл) стандартных
резус-положительных эритроцитов и по 1 капле (0,05 мл) стандартных
резус-отрицательных эритроцитов.
в) Во все пробирки добавляют по две капли (0,1 мл) 10%
раствора желатина, предварительно подогретого до разжижения в
теплой воде (46-48° С). Перед употреблением желатин следует
просмотреть. При помутнении или появлении хлопьев, а также при
потере свойств застудневать при 4-8° С желатин непригоден.
г) Во все пробирки 1-го ряда добавляют по одной капле (0,05
мл) сыворотки антирезус.
2-ой ряд служит контролем для исключения возможной
неспецифической агглютинации исследуемых эритроцитов, например за
счет аутоантител.
д) Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и штатив с
пробирками помещают в водяную баню при 46-48° С на 15 минут или в
суховоздушный термостат при той же температуре на 30-45 минут.
е) По извлечении пробирок из водяной бани или термостата в них
доливают 8-10 мл изотонического раствора NaCl и перемешивают
содержимое путем 1-2-кратного перевертывания пробирок.
Трактовка результатов.
Пробирки просматривают на свет невооруженным глазом или через
лупу.
Результат трактуют по наличию или отсутствию агглютинации
эритроцитов.
При положительном результате агглютинаты легко различимы в
виде красных комочков на прозрачном, почти обесцвеченном, фоне
жидкости.
При отрицательном результате в пробирке видна равномерно
окрашенная слегка опалесцирующая жидкость.
Образцы эритроцитов, давшие агглютинацию с сывороткой анти-D,
считают резус-положительными (Rh+), образы эритроцитов, не давшие
агглютинации с сывороткой анти-D - резус-отрицательными (rh-).
Однако эти результаты следует учитывать как истинные только после
проверки контрольных образцов, подтверждающих специфичность и
активность сыворотки антирезус, т.е. при отсутствии агглютинации
со стандартными резус-отрицательными эритроцитами одноименной
группы и наличии агглютинации со стандартными резус-положительными
эритроцитами одноименной группы или группы О(I), а также после
просмотра результатов во втором ряду. В пробирках второго
(контрольного) ряда агглютинации быть не должно. Наличие
агглютинации во втором (контрольном) ряду указывает на
неспецифическое склеивание эритроцитов, напр., из-за аутоантител
и, следовательно, положительный результат с сывороткой на
антирезус не может быть учтен как истинный.
Для определения резус-принадлежности в таких случаях следует
применить сыворотку антирезус с полными антителами в реакции
солевой агглютинации или предварительно отмыть эритроциты теплым
изотоническим раствором NaCl, для элюирования с них аутоантител.
Примечания.
1. Изредка встречаются образцы эритроцитов, дающие слабо
выраженную реакцию. В этих случаях следует повторно исследовать их
несколькими сериями сыворотки антирезус высокой активности, и, по
возможности, сывороткой с полными антителами.
2. При определении резус-принадлежности крови доноров
недостаточно разделения их только на резус-положительных и
резус-отрицательных по сыворотке анти-D, а необходимо
дополнительное исследование сыворотками, содержащими антитела
анти-С и анти-Е. В число резус-отрицательных доноров зачисляются
только лица, кровь которых не содержит ни одного из этих
антигенов, т.е. фенотипа ccddee.
3. Определение антигенов системы резус С, Е, с, е и Сw
производится сыворотками, содержащими антитела соответствующей
специфичности. Эти антитела могут быть в сыворотке как в чистом
виде, так и в различных сочетаниях, в том числе с анти-D.
Эти исследования производятся теми же методами, что и
определение резус-антигена D. В качестве контролей используются
эритроциты соответствующего фенотипа. Подробности о технике
реакции, оценке результатов, мерах предупреждения возможных ошибок
см. в "Инструкции по определению резус-принадлежности крови".
Дополнение N 2
|
