|
Стр. 10
Наличие агглютинации свидетельствует о присутствии полных
антител, а последнее разведение, в котором она наблюдается - об их
титре.
Титр антител нативной (непрогретой) сыворотки относится к
агглютининам альфа (или бета), титр антител в прогретой сыворотке
- к иммунным антителам анти-А (или анти-В). В том случае, если
агглютинация наблюдается во всех пробирках, следует повторить
исследование, продолжив разведение сыворотки.
Отрицательный результат во всех пробирках с прогретой
сывороткой говорит об отсутствии иммунных антител полной формы.
IV. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕПОЛНЫХ ИЗОИММУННЫХ АНТИТЕЛ СИСТЕМЫ АВО
НЕПРЯМОЙ ПРОБОЙ КУМБСА
1. Подготовительная работа.
Стандартные эритроциты или смеси эритроцитов группы А(II) и
В(III) дважды отмывают изотоническим раствором NaCl, после чего на
дне пробирок остаются эритроциты, которые используют для
исследования.
2.Техника реакции.
При исследовании сыворотки группы А(II) или В (III) в штатив
устанавливают 6 пробирок, при исследовании сыворотки группы О(I) -
два ряда по 6 пробирок. Пробирки нумеруют. Штатив предварительно
накрывают листом бумаги, в котором накалывают отверстия для
установки пробирок. На бумаге делают обозначения, указав у каждой
пробирки ее номер и все другие сведения, как сказано выше для
реакции солевой агглютинации.
Во все пробирки, начиная с N 2, накапывают по три капли
изотонического раствора NaCl, а затем в пробирки N 1 и N 2 - по
три капли исследуемой, предварительно прогретой сыворотки и далее
приготавливают ее разведения, как это указано выше для метода
солевой агглютинации, но в объеме трех капель.
Во все пробирки пастеровской пипеткой добавляют по одной
маленькой капле (0,01 мл) эритроцитов противоположной группы,
смешивают сыворотку с эритроцитами и штатив помещают для инкубации
в термостат на 45 минут при 37° С. За это время иммунные антитела,
если они есть в сыворотке, фиксируются на эритроцитах.
После инкубации отмывают эритроциты, для чего в пробирки
доливают изотонический раствор NaCl, перемешивают их содержимое и
центрифугируют. Надосадочную жидкость удаляют. Такое отмывание
повторяют три раза.
После отмывания в каждую пробирку добавляют 3-5 капель
изотонического раствора NaCl для получения приблизительно 5%
взвеси эритроцитов и из каждой пробирки по одной капле такой
взвеси переносят на белую пластинку со смачиваемой поверхностью,
пронумеровав предварительно места на пластинке соответственно
номерам пробирок. К каждой капле прибавляют по одной капле
сыворотки для пробы Кумбса и перемешивают их стеклянной палочкой.
Далее в течение 10 минут наблюдают результат при периодическом
покачивании пластинки.
Результат оценивают по наличию или отсутствию агглютинации,
видимой простым глазом на белом фоне пластинки. Наступление
агглютинации обозначают на бумаге у каждой пробирки знаком плюс
(+) с указанием времени ее появления в секундах и минутах.
Отсутствие агглютинации обозначают знаком минус (-).
Наличие агглютинации свидетельствует о присутствии иммунных
антител анти-А или анти-В неполной формы, а последнее разведение,
в котором оно наблюдается - об их титре<*>.
--------------------------------
<*> - Контроль в отношении возможного ложно-положительного
результата за счет активных полных антител не требуется, т.к. в
данном случае непрямая проба Кумбса ставится как дополнение только
при отрицательном результате в солевой среде.
В том случае, если агглютинация наблюдается во всех пробирках,
следует повторить исследование, продолжив разведение сыворотки.
Отрицательный результат во всех пробирках свидетельствует об
отсутствии иммунных антител неполной формы в данной порции
исследуемой сыворотки.
3. Трактовка результатов.
В ходе вышеописанного исследования определяются три вида
антител:
- нормальные полные антитела - агглютинины альфа и бета
(термолабильные);
- иммунные полные антитела анти-А и анти-В (термостабильные);
- иммунные неполные антитела анти-А и анти-В
(термостабильные).
Общее заключение делается на основании сопоставления
результатов всех исследований:
а) наличие иммунных (термостабильных) антител полной или
неполной формы свидетельствует об имевшем место поступлении в
организм человека антигена, несовместимых полных (термолабильных)
антител альфа и бета и редко превышает такие показатели, как 1:8 -
для иммунных полных антител и 1:32 - для иммунных неполных
антител;
б) высокий титр нормальных полных антител - агглютининов альфа
и бета (альфа выше, чем 1:256 и бета выше, чем 1:128 при данном
методе исследования) даже при отсутствии иммунных термостабильных
антител в момент исследования, отражает состояние повышенной
сенсибилизации организма и позволяет сделать предположение о
бывшем в предшествующее время поступлении антигена, несовместимого
по системе АВО;
в) отсутствие иммунных термостабильных антител анти-А и анти-В
при титре нормальных антител альфа не выше, чем 1:256 и бета не
выше, чем 1:128 (при данном методе исследования) говорит об
отсутствии у человека изоиммунизации групповыми факторами системы
АВО к моменту данного исследования.
V. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕМОЛИЗИНОВ СИСТЕМЫ АВО
1. Оснащение,
- стандартные эритроциты группы О(I), А(II) и В(III);
- изотонический раствор NaCl;
- пробирки вместимостью 8-10 мл;
- маленькие пробирки высотой 4-5 см, диаметром 0,8-1,0 см;
- штативы;
- термостат 37° С;
- центрифуга.
2. Подготовительная работа.
Стандартные эритроциты групп О(I), А(II) и В(III), а также
эритроциты исследуемого лица дважды отмывают изотоническим
раствором NaCl путем центрифугирования и готовят из них 5% взвесь
в изотоническом растворе NaCl.
Сыворотку для исследования используют со сроком хранения не
более 48 часов при температуре 4-8° С.
В предварительно пронумерованных пяти пробирках вместимостью
8-10 мл готовят разведения исследуемой сыворотки в изотоническом
растворе NaCl, начиная от 1:2 до 1:32 в объемах 2-3 мл.
3. Техника реакции.
В штатив устанавливают по пять маленьких пробирок: три ряда
при исследовании сыворотки группы А(II) или В(III) или четыре ряда
- при исследовании сыворотки группы О(I). Пробирки нумеруют
одинаково во всех рядах соответственно нумерации пробирок с
исходными разведениями сыворотки.
Штатив предварительно накрывают листом бумаги, в котором
накалывают отверстия для установки пробирок. На бумаге надписывают
фамилию и группу крови лица, чья сыворотка исследуется, группу
крови стандартных эритроцитов и степень разведения помещенной в
пробирках сыворотки (1:2 - 1:32).
Исследуемую сыворотку из исходных разведений переносят
соответственно номерам по пять капель в маленькие пробирки так,
чтобы во всех первых номерах было разведение 1:2, во вторых - 1:4
и т.д. до 1:32.
Затем во все пробирки добавляют по 1 капле 5% взвеси
эритроцитов: в первый (контрольный) ряд пробирок вводят эритроциты
лица, сыворотка которого исследуется: во второй (также
контрольный) ряд - эритроциты группы О(I); в третий ряд вводят
эритроциты противоположной группы, т.е. группы В(III), если
исследуется сыворотка группы А(II), или группы А(II), если
исследуется сыворотка группы В(III). При исследовании сыворотки
группы О(I) в третий ряд вводят эритроциты группы А(II), а в
четвертый ряд - эритроциты группы В(III).
Содержимое пробирок тщательно перемешивают путем встряхивания
и штатив помещают на 45 минут при температуре 37 °С, затем
пробирки вынимают из термостата и рассматривают результат
невооруженным глазом в проходящем свете.
4. Трактовка результатов определения групповых гемолизинов
В ходе исследования определяется наличие или отсутствие
групповых гемолизинов анти-А и анти-В.
Результаты оценивают по соотношению количества сохранившихся
эритроцитов в осадке и степени гемолиза, т.е. интенсивности
окрашивания надосадочной жидкости:
- если эритроциты полностью сохранились в осадке, а
надосадочная жидкость прозрачна и бесцветна, это значит, групповые
гемолизины отсутствуют, что обозначают знаком минус (-),
- если осадок эритроцитов частично сохранился, а надосадочная
жидкость прозрачна и окрашена в красный цвет разной интенсивности
(иногда только небольшим слоем над осадком эритроцитов) - это
значит, что в исследуемой сыворотке содержатся групповые
гемолизины различной степени активности (обозначают знаками от
одного плюса (+) до трех плюсов (+++)),
- если осадок эритроцитов отсутствует, а вся жидкость окрашена
в ярко-красный цвет и прозрачна, это значит, что в исследуемой
сыворотке содержатся групповые гемолизины, что оценивается на
четыре плюса (++++).
Результаты учитываются как истинные, т.е. относящиеся к
гемолизинам анти-А и анти-В, только при отсутствии гемолиза в двух
контрольных рядах.
При наличии гемолиза не только с эритроцитами противоположной
группы, но и в контрольных рядах - исследование повторяют. При
подтверждении результатов реакции следует решать вопрос о природе
обнаруженных гемолизинов, с учетом характера заболевания и других
показателей.
Методические рекомендации "Определение иммунных антител
групповой системы АВО", утвержденные Министерством здравоохранения
СССР 27 ноября 1990 года N 10-11/135, считать утратившими силу с
момента утверждения данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 19
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ИЗГОТОВЛЕНИЮ КОНСЕРВИРОВАННЫХ СТАНДАРТНЫХ
ЭРИТРОЦИТОВ И ИХ ПРИМЕНЕНИЮ В
ИЗОСЕРОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
Стандартные эритроциты, содержащие определенные сочетания
аллоантигенов, предназначены для выявления антиэритроцитарных
антител в сыворотке исследуемой крови, при определении групп крови
АВО перекрестным способом, при определении резус-принадлежности
крови, а также для проведения контроля специфичности и активности
стандартных изогемагглютинирующих сывороток АВО, сывороток
антирезус; тест-сывороток и реактивов, предназначенных для
определения антигенов различных систем эритроцитов крови человека.
Стандартные эритроциты группы О(I) должны содержать в эритроцитах
клинически значимые антигены: D, C, Cw, c, E, e, K, k, Fy, Jk, M,
N, S, s, Le.
С целью увеличения срока годности стандартных эритроцитов
можно производить их консервирование специально изготовленными
консервирующими растворами.
I. ТРЕБОВАНИЯ, ПРЕДЪЯВЛЯЕМЫЕ К СТАНДАРТНЫМ ЭРИТРОЦИТАМ
Стандартные эритроциты для исследований по системе АВО должны
давать четкую, хорошо видимую агглютинацию при взаимодействии со
стандартными сыворотками соответствующей специфичности и не давать
агглютинации с сыворотками, не содержащими антител против данного
антигена эритроцитов.
Стандартные эритроциты группы А(II), предназначенные для
выявления агглютинина анти-А, должны иметь титр не ниже 1:64,
эритроциты группы В(III), предназначенные для выявления
агглютинина анти-В, также должны иметь титр не ниже 1:64.
Титр антигенов А и В устанавливается с помощью стандартных
изогемагглютинирующих сывороток группы Абета(II) (анти-В) и
Вальфа(III) (анти-А) или соответствующих моноклональных антител,
удовлетворяющих требованиям действующих инструкций.
Время наступления агглютинации эритроцитов А1 и В со
стандартными изогемагглютинирующими реактивами должно составлять
не более десяти секунд; эритроцитов подгруппы А3, В2 - не более
двух минут.
Стандартные эритроциты группы крови О(I) не должны давать
агглютинации со стандартными сыворотками групп крови Оальфа
бета(I), Абета(II), Вальфа(III) в течение двадцати минут.
Стандартные резус-положительные эритроциты группы крови О(I),
содержащие антиген D, а также антигены С, Cw, c и E, e в различных
сочетаниях, предназначенные для выявления антител системы резус,
должны давать соответственно со стандартными сыворотками анти-D,
анти-С, анти-Сw, анти-с, анти-Е и анти-е четкую агглютинацию при
определении методом конглютинации с желатином, экспресс-методом
в пробирках или на плоскости без подогрева или непрямой пробе
Кумбса в зависимости от того, для какого метода исследования
предназначена данная стандартная сыворотка антирезус.
Стандартные резус-отрицательные эритроциты О(I) фенотипа
ccddee не должны давать агглютинации с реактивами антирезус,
содержащими антитела анти-D, анти-С, анти-Е во всех методах
исследования, для использования в которых предназначены указанные
реактивы антирезус.
Время наблюдения за отрицательной реакцией должно
соответствовать времени, установленному для каждой из этих
реакций.
II. ПРИГОТОВЛЕНИЕ КОНСЕРВИРОВАННЫХ СТАНДАРТНЫХ ЭРИТРОЦИТОВ
Приготовление стандартных эритроцитов производится в условиях
строгого соблюдения асептики и состоит из изготовления
консервирующего раствора, получения взвеси эритроцитов в
консервирующем растворе, розлива эритроцитов, маркировки продукции
и контрольных исследований.
1. Изготовление консервирующего раствора для стандартных
эритроцитов.
Консервирующей средой для приготовления стандартных
эритроцитов могут служить растворы следующего состава:
Консервант N 1:
сорбит 40,0 г
глюкоза 6,0 г
Na2HPO4х12H20 2,0 г
KH2PO4 0,9 г
левомицетин 0,06 г
этиловый спирт 96° 100 мл
вода бидистиллированная до 1000 мл
рН раствора 6,8-6,9
В случае необходимости доведения рН до требуемой величины
добавляется несколько кристаллов аскорбиновой кислоты или
Na2HPO4х12H20.
Консервант N 2:
аденин 0,03 г
инозин 0,06 г
лимонная кислота 1,5 г
глюкоза 3,0 г
Na3PO4 0,4 г
NaOH 1н 20 мл
вода дистиллированная до 100 мл
рН раствора 6,3-6,4
Консервирующие растворы (консерванты) представляют собой
прозрачную бесцветную жидкость без запаха. Стерилизация
консервантов производится путем фильтрования их через
соответствующие стерилизующие фильтры. Розлив производят в
стерильные флаконы емкостью 250 мл или 500 мл, которые немедленно
закрывают резиновыми пробками и завальцовывают металлическими
колпачками. Срок годности консервантов - шесть месяцев. В случае
помутнения консервирующего раствора или появления желтого
окрашивания применение его для работы недопустимо.
2. Получение взвеси эритроцитов в консерванте
Источником получения стандартных эритроцитов является
эритроцитная масса, получаемая после удаления плазмы из
консервированной крови доноров. Кровь берут от доноров, фенотип
эритроцитов которых заранее определен. Для получения стандартных
эритроцитов, содержащих антигены системы АВО, в качестве исходного
материала должна быть использована эритроцитная масса от одного
специально отобранного донора.
А для получения стандартных эритроцитов других систем можно
использовать смесь эритроцитов группы О(I) от нескольких (2-4)
доноров различного фенотипа таким образом, чтобы каждый из редких
антигенов: К, Сw, Е присутствовали в эритроцитах не менее чем у
двух доноров. Используется эритроцитная масса, полученная не
позднее 2-3 суток от момента заготовки крови.
В боксе через стерильную систему путем прокола переливают
эритроцитную массу во флакон с заготовленным консервантом так,
чтобы соотношение эритромассы и консервантов было 1:4. Содержимое
флакона острожно перемешивают и разливают той же системой в
стерильные флаконы по 5, 10 или 25 мл. Используют обычную систему
для взятия.
Флаконы (по 5, 10 или 25 мл) закрывают резиновыми пробками,
завальцовывают металлическими колпачками, немедленно маркируют
(см. п. 3) и помещают в рефрижератор при температуре +4° С.
3. Маркировка
На флаконы со стандартными эритроцитами наклеивают этикетки с
указанием: учреждения, изготовившего эритроциты, группы крови по
системе АВО, антигенного состава эритроцитов, срока годности.
Наставление по применению стандартных эритроцитов прилагается при
выдаче (см. п. IV).
4. Контроль
Контроль специфичности и активности стандартных эритроцитов
производится после их расфасовки и маркировки в
изоиммуннологической лаборатории станции переливания крови.
5. Хранение и сроки годности
Стандартные консервированные эритроциты хранят при +4° С. Срок
годности консервированных стандартных эритроцитов - два месяца.
При использовании в качестве стандартных эритроцитов цельной
консервированной крови, а также эритроцитной массы в комбинации с
другими гемоконсервантами, срок хранения стандартов 1-4 недели.
III. ТРАНСПОРТИРОВКА СТАНДАРТНЫХ ЭРИТРОЦИТОВ
Транспортировка стандартных эритроцитов производится
аналогично транспортировке консервированной крови в изотермической
таре.
IV. НАСТАВЛЕНИЕ ПО ПРИМЕНЕНИЮ
КОНСЕРВИРОВАННЫХ СТАНДАРТНЫХ ЭРИТРОЦИТОВ
(прилагается при выдаче)
Консервированные стандартные эритроциты используют в
постановках реакций в различных методиках в соответствии с
действующими инструкциями по изосерологии.
1. Стандартные эритроциты группы О(I) с содержанием в
эритроцитах клинически значимых антигенов D, C, Cw, c, E, e, K, k,
Fy, Jk, M, N, S, s, Le предназначены для выявления соответствующих
изоиммунных противоэритроцитарных антител в сыворотке крови
доноров, больных и беременных с помощью реакции конглютинации в
желатине, непрямой пробе Кумбса, реакции агглютинации в солевой
среде в пробирках или на плоскости.
Для желатинового метода используют осадок стандартных
эритроцитов или 10% их взвесь в желатине для чего к одной части
осадка эритроцитов добавляют девять частей 10% раствора желатина,
стандартизованного для серологических исследований. В реакции
используют по две капли (0,1 мл) взвеси. Взвесь стандартных
эритроцитов в желатине используют в течение рабочего дня, на
следующий день готовят новую порцию. В непрямой пробе Кумбса и
реакции агглютинации в солевой среде используют стандартные
эритроциты, отмытые не менее двух раз физиологическим раствором
хлористого натрия.
2. Стандартные эритроциты группы О(I), А1(II), А2(II), В(III)
предназначены для выявления изогемагглютининов альфа и бета в
сыворотке или плазме крови при определении групповой
принадлежности крови перекрестным методом, а также для выявления
неполных изоиммунных альфа и бета антител в сыворотке крови
доноров, больных и беременных с помощью реакции конглютинации в
желатине и непрямой пробе Кумбса. Для перекрестного метода и
реакции конглютинации в желатине применяют неотмытые стандартные
эритроциты взятые непосредственно из осадка со дна флакона. Для
желатинового метода используют осадок стандартных эритроцитов или
10% их взвесь в желатине для чего к одной части осадка эритроцитов
добавляют девять частей 10% раствора желатина, стандартизованного
для серологических исследований. В реакции используют по две капли
(0,1 мл) взвеси. Взвесь стандартных эритроцитов в желатине
используют в течение рабочего дня, на следующий день готовят новую
порцию. В непрямой пробе Кумбса и реакции агглютинации в солевой
среде используют стандартные эритроциты, отмытые не менее двух раз
физиологическим раствором хлористого натрия.
3. Срок годности консервированных стандартных эритроцитов -
два месяца.
Стандартные эритроциты из разгерметизированного флакона
пригодны для использования в течение недели.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
|
