|
Стр. 8
"Титрование сыворотки".
Если при наблюдении результата в каких-либо разведениях
сыворотки отмечается положительная реакция, следовательно, в
испытуемой сыворотке есть антитела. В этих случаях для дальнейшего
исследования сыворотки ее следует развести, при этом выбрать то
разведение, в котором наблюдалась наиболее выраженная
положительная реакция. В качестве разводителя при исследовании
применяют изотонический раствор NaCl. Исследование разведенной
сыворотки проводится как описано выше для каждого метода. При
установлении высоты титра учитывается общее разведение нативной
сыворотки, начиная с 1:2.
IX. СПЕЦИФИЧНОСТЬ АНТИТЕЛ
Сыворотки, давшие положительный результат со всеми образцами
резус-положительных эритроцитов, могут содержать как "чистые"
антитела анти-D, так и одновременно антитела к нескольким
антигенам: анти-С+D, анти-D+Е или анти-С+D+Е.
В некоторых случаях исследуемые сыворотки, содержащие
резус-антитела, могут вызвать агглютинацию избирательно - не всех
образцов резус-положительных эритроцитов. Это может быть связано с
тем, что в испытуемой сыворотке имеются антитела не анти-D
(наиболее часто встречающиеся), а анти-С или анти-Е.
Положительный результат может также наблюдаться и с
резус-отрицательными эритроцитами за счет других антигенов системы
резус - с, е или антигенов других систем.
Для выяснения специфичности резус-антител необходимо
специальное исследование сыворотки с набором стандартных
эритроцитов, включающих редкие группы ccDee, Ccddee, ccddEe, а
также резус-отрицательные образцы (ccddee), включающие как
содержащие, так и не содержащие антигены Келл (К) и Даффи (Fy). С
ними же проводится и титрование сыворотки.
X. ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ
1. Заключение о наличии в сыворотке резус-антител можно
сделать при положительном результате, полученном любым методом
исследования.
2. Заключение об отсутствии в сыворотке резус-антител можно
сделать только при отрицательном результате, полученном при
исследовании не менее чем двумя методами, одним из которых
является любой метод, выявляющий неполные резус-антитела, а
другим - реакция агглютинации в солевой среде, выявляющая полные
резус-антитела. При этом следует учитывать возможный феномен зоны.
"Инструкцию по исследованию сыворотки на наличие
резус-антител", утвержденную Министерством здравоохранения СССР 07
сентября 1990 года N 05-14/30, считать утратившей силу с момента
утверждения данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 12
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ИЗГОТОВЛЕНИЮ РЕДКИХ СЫВОРОТОК, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫХ
ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РАЗЛИЧНЫХ ИЗОАНТИГЕНОВ
ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА
1. Введение
Под редкими группами крови понимаются такие сочетания
групповых антигенов в эритроцитах человека, в которых: а)
отсутствует какой-либо из антигенов высокой частоты, б)
отсутствуют одновременно несколько антигенов, в том числе активных
и высокой частоты, в) содержатся различные редкие антигены, г)
имеются редкие сочетания антигенов разных систем.
Под редкими сыворотками подразумеваются сыворотки крови людей,
чаще с редкой группой крови, содержащие изоиммунные антитела,
редко возникающие у людей вследствие естественной сенсибилизации
при беременности. Причиной редкости такой сенсибилизации является
редкость или, наоборот, высокая частота антегенов, против которых
могут быть направлены антитела, а также низкая иммуногенная
активность некоторых антигенов.
К редким сывороткам относятся моноспецифические сыворотки,
содержащие антитела к какому-либо одному антигену системы резус-С,
Е, с, е, Сw, или к одному из антигенов других систем - Келл,
Даффи, Кидд, Левис, Лютеран, MNSs и другие.
К редким сывороткам относятся также полиспецифические
сыворотки, содержащие два или более вида антител, одними из
которых чаще всего бывают антитела анти-D, а другими - антитела
редкой специфичности. К таким редким полиспецифическим сывороткам
относятся сыворотки анти-С+D, анти-D+Е, анти-С+D+Е,
анти-D+анти-Fyа, анти-D+Келл и другие сочетания антител анти-D с
какими-либо редкими антителами, а также все сочетания только
редких антител, например, анти-С+е, анти-С+анти-Fya и т.д.
Трансфузионная терапия, проводимая лицам, принадлежащим к
редким группам, повышает возможность образования редких антител,
особенно, если кровь переливалась повторно, и реципиент имел в
прошлом беременности.
Реиммунизация соответствующим антигеном, проводимая лицам,
иммунизированным естественным путем при беременности или
вследствие трансфузий крови еще более повышает возможность
образования активных редких антител.
Лица, иммунизированные естественным путем при беременности или
вследствие гемотрансфузий, могут привлекаться в кадры доноров с
дополнительной реиммунизацией соответствующим антигеном.
Привлечение к донорству и реиммунизация для получения редких
сывороток проводятся так же, как это предусмотрено для сывороток
антирезус ("Инструкцией по иммунизации доноров для получения
сывороток и иммуноглобулина антирезус").
Реиммунизация допустима для повышения активности любых
антител, так как не вносит ничего качественно нового в
иммунологический статус иммунизируемого лица и следовательно, не
создает дополнительной опасности в случае необходимости
переливания крови.
Эффективной мерой получения некоторых редких сывороток
является искусственная иммунизация доноров-добровольцев.
Искусственная иммунизация ранее несенсибилизированных лиц
допустима только теми антигенами и при тех условиях, когда это не
может повлечь каких-либо осложнений для иммунизируемого лица в
смысле возможности неблагополучных исходов последующих
беременностей или несовместимости в случае переливания крови.
Исходя из сказанного, а также из того, что потребность в
редких сыворотках разной специфичности различна, для получения
таких сывороток рекомендуется дифференцированный подход и разные
способы.
2. Основное назначение редких сывороток в учреждениях
Службы крови
Моноспецифические сыворотки антирезус - анти-С, анти-Е,
анти-с, анти-е, анти-Cw, а также моноспецифические сыворотки
других систем применяются наряду с сыворотками анти-D при
фенотипировании крови доноров для создания панели стандартных
эритроцитов и кадров типированных доноров, в том числе доноров
редких групп, а также для установления фенотипа крови больных и
других лиц с целью выяснения причин и предупреждения
сенсибилизации и трансфузионных осложнений.
Полиспецифические сыворотки анти-С+D, анти-D+Е, анти-С+D+Е
применяются при обследовании доноров и при обработке их крови на
втором этапе исследования на резус-принадлежность. При этом
сыворотки анти-С+D и анти-D+Е должны быть использованы
одновременно или могут быть заменены одной сывороткой анти-С+D+Е
(см. "Инструкцию по определению резус-принадлежности").
Сыворотки, содержащие антитела анти-D и дополнительно антитела
других систем, например анти-Fya или анти-Келл, являющиеся главным
образом случайными находками, могут быть использованы при
исследовании крови резус-отрицательных лиц для определения у них
антигенов против которых направлены дополнительные антитела.
3. Источники и способы получения сыворотки
Для получения моноспецифических сывороток анти-С и анти-Е
необходимо выявление лиц, сенсибилизированных естественным путем,
и привлечение их к донорству с последующей реиммунизацией.
Допускается искусственная иммунизация этими антигенами доноров
добровольцев, которая требует длительных курсов, так как не
всегда бывает успешной, особенно для получения активных сывороток
анти-С.
Моноспецифические сыворотки анти-с и анти-е следует получать
только от лиц, сенсибилизированных естественным путем.
Рекомендуется привлечение таких лиц к донорству с последующей
реиммунизацией. Искусственная иммунизация антигеном с и антигеном
е недопустима, так как в этих случаях нужно было бы иммунизировать
резус-положительных лиц, то есть сделать их реципиентами, для
которых будет несовместимой вся резус-отрицательная и в
большинстве случаев резус-положительная кровь.
Моноспецифические сыворотки анти-Келл, анти-Даффи, анти-Кидд,
анти-S, анти-s, анти-Сw следует получать от лиц,
сенсибилизированных естественным путем. Поскольку такие антитела
возникают исключительно редко, чаще всего при беременности в
сочетании с многократными трансфузиями крови, то выявление таких
сенсибилизированных лиц, то есть первичный поиск редких антител
следует организовать с привлечением к этой работе отделений
переливания крови при больницах.
После выздоровления этих лиц желательно привлекать к донорству
с последующей реиммунизацией.
Искусственная иммунизация антигенами Келл, Даффи, Кидд, S, е,
Cw разрешается только для ограниченного числа доноров в институтах
переливания крови, а также в Центре изосерологических стандартов
при Нижегородской областной станции переливания крови и Станции
переливания крови Комитета здравоохранения г. Москвы.
Моноспецифические сыворотки анти-М, анти-N, анти-Р, анти-Левис
могут быть выявлены при массовых обследованиях крови доноров,
поскольку такие антитела иногда (очень редко) бывают у людей
врожденными. Также редко встречаются такие антитела у лиц,
сенсибилизированных естественным путем - беременностями и
трансфузиями крови. Таких лиц следует привлекать к донорству с
последующей реиммунизацией. Искусственная иммунизация этими
антигенами противопоказана.
Систематическое получение сывороток анти-М, анти-N, анти-Р и
анти-Левис производят путем иммунизации животных в учреждениях
судебной медицины.
Сыворотки двойной специфичности анти-С+D следует получать от
лиц, сенсибилизированных естественным путем с последующим
привлечением их к донорству и реиммунизации.
Сыворотки двойной и тройной специфичности - анти-D+Е и
анти-С+D+E могут быть получены почти исключительно путем
искусственной иммунизации доноров-добровольцев, так как такое
сочетание антител очень редко возникает при естественной
сенсибилизации.
Антитела специфичности анти-С+D, анти-D+E и анти-C+D+E иногда
образуются при искусственной иммунизации доноров-добровольцев
антигеном D. В этих случаях допустимо продолжение иммунизации с
использованием тех антигенов, против которых требуется повысить
титр антител.
Сыворотки анти-D в сочетании с антителами какой-либо другой
специфичности могут быть получены от лиц, сенсибилизированных
естественным путем при беременности и трансфузиях крови и при этом
на протяжении небольшого срока, так как редкие антитела у таких
сенсибилизированных лиц быстро ослабевают или исчезают из крови.
Искусственная иммунизация для получения таких сывороток
противопоказана.
4. Методы иммунизации и реиммунизации
Иммунизацию и реиммунизацию для получения сывороток анти-С и
анти-Е следует производить согласно инструкции "По иммунизации
доноров для получения сывороток и иммуноглобулина антирезус".
Реиммунизацию с целью получения антител другой специфичности
следует производить аналогично реиммунизации антигенами С и Е
с использованием эритроцитов соответствующего фенотипа. Возможны
некоторые изменения в дозах и сроках введения эритроцитов.
Иммунизацию антигенами системы Келл, Даффи, Кидд, антигенами
S, s, Cw следует производить аналогично иммунизации антигенами С и
Е. Возможны некоторые изменения в дозах и сроках введения
эритроцитов. Иммунизацию и реиммунизацию для получения сывороток
анти-С+D, анти-D+E и анти-С+D+E следует производить на фоне уже
имеющихся активных антител анти-D, вводя те антигены, против
которых имеются дополнительные антитела. Дозы введения антигена
аналогичны дозам при иммунизации антигенами С и Е. Длительность
курса зависит от срока появления антител.
Иммунизированным и реиммунизированным лицам выдается справка
по форме, предусмотренной действующей инструкций "По иммунизации
доноров для получения сывороток и иммуноглобулина антирезус" с
указанием антигена, которым проводилась иммунизация. Иммунизация
животных для получения сывороток анти-М и анти-N, анти-Р,
анти-Левис и обработка этих сывороток производится согласно ТУ и
лабораторным регламентам на эти сыворотки.
5. Методы и дозы взятия крови
У лиц, содержащих антитела, следует брать кровь для
последующего получения сыворотки или плазмы (методом
плазмафереза).
Дозы взятия крови и плазмы зависят от состояния здоровья таких
лиц и предусмотрены действующими инструкциями "О порядке сбора
крови, содержащей изоиммунные антитела, пригодные для изготовления
стандартных сывороток" и "По медицинскому освидетельствованию
доноров крови".
6. Показатели пригодности редких сывороток для
практического использования
Сыворотки должны быть прозрачными или слегка опалесцировать.
Допустим, красный оттенок цвета, а также желтое окрашивание
вследствие присутствия желчных пигментов.
Моноспецифические редкие сыворотки рекомендуются для
практического использования при титре полных или неполных антител
не ниже 1:16. Ввиду редкости и трудности получения таких
сывороток, при хорошем авидитете допускается использование их с
титром 1:4.
Сыворотки анти-С+D, анти-D+Е и анти-С+D+E должны иметь титры
антител анти-D не ниже: полных - 1:16, неполных - 1:32. Титр
антител анти-С и анти-Е как полных, так и неполных должен быть не
ниже 1:16.
Сыворотки, содержащие антитела анти-D и дополнительно антитела
к антигенам других систем, годны для использования в руках
специалистов серологических лабораторий учреждений Службы крови
при любом титре антител от 1:4 при хорошем их авидитете. Выдача
комбинированных сывороток в другие учреждения допустима лишь при
титре всех антител не ниже 1:16. Если в сыворотке, содержащей
редкие антитела одной специфичности, одновременно содержатся
другие антитела с низким титром и слабым авидитетом, то
сыворотка нуждается в абсорбции или может быть использована в
руках специалистов в институтах, на станциях переливания крови.
Выдаче в другие учреждения без абсорбции такая сыворотка не
подлежит.
7. Организация поиска и первичное исследование сывороток
Поскольку изоиммунные антитела возникают редко, для получения
сывороток редкой специфичности следует организовать работу по
выявлению сенсибилизированных лиц как среди резус-отрицательных,
так среди резус-положительных больных и доноров с привлечением к
этой работе лабораторий, в которых проводится определение
резус-принадлежности крови.
Первичное исследование сывороток лиц с подозрением на
сенсибилизацию производится в учреждениях Службы крови, включая
отделения переливания крови при больницах. Первичное исследование
сывороток лиц, подвергающихся искусственной иммунизации,
производится на станциях переливания крови, производящих
иммунизацию.
Первичное исследование проводится непрямой пробой Кумбса или
реакцией конглютинации с применением желатина для выявления
неполных антител и реакцией агглютинации в солевой среде для
выявления полных антител.
С целью сокращения объема работы при первичном исследовании
сывороток следует использовать эритроциты с содержанием возможно
большего числа антигенов в одном образце; удобнее всего фенотип
CcDEe, K+, Fyа+, Jk+.
В случае отсутствия типированных эритроцитов для выявления
антител следует приготовить смеси эритроцитов группы О(I) по 5-6
образцов и использовать 3-4 таких смеси в качестве стандартов,
считая каждую смесь за один образец.
Для изготовления стандартов можно использовать эритроциты из
осадка крови, взятой из вены со стабилизатором или из места укола
пальца.
При массовых исследованиях крови выявление изоиммунных антител
можно производить одновременно с определением
резус-принадлежности, подвергая испытанию сыворотку каждого
исследуемого лица. При этом допустимо предварительно исследовать
сыворотку методом конглютинации с желатином с помощью одного
"стандарта" эритроцитов. В качестве такого стандарта следует
использовать смесь 2-3 образцов резус-положительных эритроцитов
группы О(I), содержащих антигены D, C, E, c, e, Cw, Келл, Fy и
другие.
Кровь лиц, в сыворотке которых выявлены антитела, исследуется
далее в лабораториях институтов, станций переливания крови, где
устанавливается специфичность, активность и форма антител.
8. Исследование сывороток на специфичность, активность и
форму антител
Исследование сывороток начинается с проверки групповой
принадлежности по системе АВО. Затем сыворотка исследуется на
специфичность, активность и форму антител. Для исследования
применяется непрямая проба Кумбса, метод конглютинации с
применением желатина, реакция агглютинации в солевой среде.
Следует иметь в виду, что в одной и той же сыворотке могут
содержаться как полные, так и неполные антитела, причем их
специфичность может совпадать или быть различной. Так, например,
сыворотка может содержать неполные антитела анти-D, анти-С и
анти-Е и в то же время полные антитела анти-С и анти-Е или только
полные анти-Е. Титр полных и неполных антител также может быть
различен.
Широта исследований зависит от возможности станции переливания
крови. В тех случаях, когда станция не располагает всеми
указанными ниже стандартными типированными эритроцитами, для
дальнейшего исследования сыворотка должна передаваться в
республиканские станции или в институты переливания крови.
Для полного выявления антител, установления их специфичности,
формы и титра следует использовать панель типированных стандартных
эритроцитов. Для удобства в панели целесообразно использовать
эритроциты группы О(I).
В качестве образцов в панель можно включать эритроциты
типированных доноров, для чего берут у них кровь из вены в
изотонический раствор цитрата натрия или консервант. Эритроциты
перед употреблением отмывают двукратно изотоническим раствором
хлорида натрия. Срок хранения таких эритроцитов до отмывания - 2-3
дня, после отмывания - 1 день.
Если кровь взята у донора в стерильных условиях в контейнер с
консервантом, применяемым для консервирования крови, она может
храниться 1 месяц при +4-8° С. Перед использованием эритроциты
двукратно отмывают изотоническим раствором хлорида натрия. Срок
годности отмытых эритроцитов 1 день.
Более эффективно использование эритроцитов доноров редких
групп, сохраняемых в замороженном состоянии, лучше в малых объемах
- 2-5 мл. Для использования эритроциты отмывают специальными
растворами (см. действующие методические рекомендации "Методы
долгосрочного хранения в замороженном состоянии эритроцитов,
предназначенных для трансфузии"). После отмывания эритроциты
используются в тот же день.
В панели должны быть представлены стандартные эритроциты,
позволяющие выявлять и идентифицировать антитела в пределах
следующих систем: Rh-Hr, Даффи, Келл, Кидд, Левис, MNSs, Лютеран,
Р. В зависимости от возможности учреждения, эта панель может быть
расширена за счет увеличения образцов или уменьшения, но так,
чтобы по возможности были включены как положительные, так и
отрицательные образцы для каждого антигена.
Панель включает резус-положительные и резус-отрицательные
образцы эритроцитов разных фенотипов. Среди резус-положительных
содержащие пять антигенов системы резус-CcDEe. В этих же образцах
имеются в том или ином сочетании антигены всех других систем.
Таким образом, положительная реакция с этими образцами укажет на
наличие в сыворотке любых антител, но без уточнения их
специфичности.
Следующие резус-положительные образцы относятся к фенотипам
CCDEe, CcDEE, CcDee, CCDee, ссDEe и ccDEE. Часть их гомозиготна, а
часть гетерозиготна по антигенам С и Е. Эти образцы необходимы для
идентификации антител анти-с и анти-е.
Затем следуют образцы фенотипов ccDee, Ccddde и cccdEe. Эти
образцы дают возможность выявлять специфичность антител в системе
резус, причем очень ценным является образец с двойным содержанием
антигена С (фенотип ССdee). Этот образец дает возможность
идентифицировать антитела в очень редких сыворотках, например,
анти-D+анти-с.
Среди резус-положительных образцов в панели должны быть
разновидности с содержанием антигена Du и антигена Cw. Образец Du
служит для того, чтобы установить достаточно ли активны антитела
анти-D. Образец с содержанием антигена Cw служит для выявления
антител анти-Cw.
Панель включает резус-отрицательные образцы, положительная
реакция с которыми указывает на наличие антител по другим
системам. Эти образцы содержат разнообразные сочетания антигенов
других систем: положительные и отрицательные по антигенам Fya, Fyb
и Кидд.
Необходимы Келл-положительные образцы. Некоторые из них
чрезвычайно редкого фенотипа, не содержащие второго аллеля этой
системы, т.е. Челлано-отрицательные. Келл-положительные образцы
подразделяются также в зависимости от наличия или отсутствия в них
антигенов Даффи.
Исследование сыворотки с этими образцами позволяет выявить
специфичность в пределах этих систем и это очень важно, так как
антитела анти-Келл и анти-Даффи являются следующими по частоте
после антител антирезус.
Дальнейшее подразделение резус-отрицательных образцов включает
различия по системе Кидд и Левис с наиболее редкими фенотипами
этой системы - Jka-; Jkb-; Lea+; Leb-.
И, наконец, в панели представлены фенотипы по другим системам
MNSs, P, Лютеран, причем наибольшую ценность представляют различия
по этим системам внутри группы резус-отрицательных образцов.
Использование представленной панели стандартных эритроцитов
дает возможность выявлять и определять специфичность полных и
неполных антител всех серологических систем как в том случае,
когда эти антитела одной специфичности, так и в том, когда
антитела различаются и по специфичности, и по форме.
В практической работе исследование следует начинать следующим
порядком: сначала используются выборочно 10-12 образцов
эритроцитов, подобранных с таким расчетом, чтобы выявить
сенсибилизацию к любому из основных антигенов резус - D, C, E, c,
e, Cw. Среди резус-отрицательных включаются образцы также с
максимальным набором различных других антигенов.
Если сыворотка содержит резус-антитела какой-либо одной
специфичности или их сочетание, то агглютинация наступает также с
соответствующими образцами эритроцитов.
Если сыворотка агглютинирует резус-отрицательные образцы,
имеющие антигены Fy или Келл, то следует произвести дополнительные
исследования с включением образцов эритроцитов различного фенотипа
по этим антигенам. Если сыворотка агглютинирует
резус-отрицательные эритроциты независимо от антигенов Fy и Келл,
то панель для исследования следует еще более расширить с
включением образцов с различными сочетаниями по системам Кидд,
Левис, MNSs и т.д.
Если сыворотка агглютинирует все образцы, взятые для
первичного исследования, независимо от резус-принадлежности, то
проводятся дополнительные исследования с использованием
стандартов, гомозиготных по антигенам С и Е, т.е. не содержащих
антигена с и антигена е. Отсутствие агглютинации с этими образцами
свидетельствует о наличии соответствующих антител - анти-с и
анти-е. При наличии агглютинации с указанными фенотипами следует
иметь в виду другие, широко распространенные антигены, например,
Челлано и поэтому использовать Челлано-отрицательные стандарты. В
случае положительного результата и с этим стандартом следует
расширить панель с включением образцов одновременно отрицательных
по многим антигенам, так как в этих случаях можно предположить
наличие в сыворотке нескольких антител.
Титрование сыворотки. После выявления антител и установления
их специфичности и формы следует определить титр антител.
Титрование проводится отдельно для неполных и полных антител
непрямой пробой Кумбса, в методе конглютинации с желатином и
реакцией агглютинации в солевой среде, аналогично титрованию
сывороток антирезус (см. инструкцию "По исследованию сывороток на
наличие резус-антител"). Для титрования используются образцы
эритроцитов, содержащие антиген, против которого направлены
антитела. По возможности титрование проводится с гомозиготными и
гетерозиготными образцами. Для антител анти-с это является
обязательным, так как эти антитела обладают выраженным феноменом
дозы и будучи активными с гомозиготными образцами (сс) могут
оказаться неактивными и дать ложноотрицательный результат при
исследовании гетерозиготных образцов (Сс). При решении вопроса о
возможности практического использования таких сывороток
учитывается титр с гетерозиготным образцом и этот титр указывается
на этикетке.
Описанное в настоящем разделе исследование сыворотки дает
возможность решить вопрос о специфичности антител, содержащихся в
сыворотке, а также об их форме и активности (титре). Далее каждая
сыворотка, имеющаяся в достаточном количестве, для дальнейшего ее
использования должна быть обработана и расфасована, как указано в
пункте 10. Расфасованные сыворотки хранятся в течение 3 недель,
после чего проводится их стандартизация.
9. Стандартизация сыворотки
Стандартизация редких сывороток производится на областных
станциях переливания крови, располагающих необходимыми
стандартами, или на станциях и в институтах переливания крови. При
стандартизации производятся исследования, предусмотренные в
параграфе 8. Результаты сопоставляются с данными, указанными на
этикетке, оценивается внешний вид сыворотки, качество укупорки
флаконов, ампул и правильность оформления этикеток.
При стандартизации окончательно решается вопрос о том, какой
специфичности, формы и титра антитела содержатся в данной
сыворотке и для определения какого (каких) антигенов и в какой
именно реакции пригодна данная сыворотка.
Если качество сыворотки отвечает требованиям, изложенным в
пункте 6, титр в ней сохранился или снизился, но не стал ниже
требуемого и при этом правильно оформлены этикетки и наставление
по использованию, то учреждение, проводившее стандартизацию, дает
заключение о возможности использования данной сыворотки как
стандартного реактива. Это заключение сообщается в учреждение,
представившее сыворотку для стандартизации.
В случае несоответствия сыворотки необходимым требованиям в
учреждение, изготовившее сыворотку, также сообщаются результаты с
указанием причин непригодности сыворотки или неправильности,
имеющейся в ее паспортизации. При этом даются рекомендации по
возможному устранению отмеченных недостатков.
В случае затруднений проведения стандартизации (наличие
каких-либо неизвестных антител и т.п.) редкие сыворотки
могут направляться в Центр по изучению и стандартизации групп
крови в ГНЦ РАМН.
Центр по изучению и стандартизации групп крови производит
также выборочный контроль редких сывороток, изготавливаемых в
учреждениях Службы крови страны.
10. Обработка и расфасовка сыворотки
После того, как у сенсибилизированного лица при первичном
исследовании его сыворотки выявлены редкие антитела, от него
получают сыворотку или плазму (методом плазмафереза). Сыворотку
консервируют борной кислотой из расчета 2 грамма на 100 мл
сыворотки или азида натрия 1 г на 1000 мл. К плазме для удаления
фибрина добавляют 10% раствор хлорида кальция из расчета 6 мл на
100 мл плазмы и после ретракции сгустка отсасывают сыворотку в
другой флакон и так же консервируют.
На флаконы с сывороткой наклеивают этикетки с указанием
фамилии, и.о. донора, групповой принадлежности по системе АВО и
характеристики изоиммунных антител с теми подробностями, которые
удалось выявить при первичном исследовании. Через два-три дня
(можно несколько позже) сыворотку вновь исследуют на наличие,
специфичность, форму и титр антител, как указано в пункте 8.
Результат исследования записывают на этикетке сосуда с сывороткой
и регистрируют в журнале.
Если в сыворотке выявлены активные редкие антитела и имеется
возможность получить от сенсибилизированного лица еще некоторое
количество сыворотки, эту новую порцию исследуют так же, как
сказано выше. Флаконы с сывороткой хранят при +4-8° С.
Если показатели специфичности и активности (титра) антител и
внешний вид сыворотки отвечают требованиям, указанным в пункте 6,
сыворотку можно считать пригодной для практического использования
и разлить в ампулы или маленькие флаконы по 1, 2, 3 или 5 мл в
зависимости от предполагаемых объемов использования. Чем большая
редкость антител, тем меньшие объемы рекомендуются для расфасовки
сыворотки.
Ампулы запаивают, флаконы плотно укупоривают и этикетируют.
Через три недели после розлива в сыворотке вновь исследуется
специфичность, форма и активность антител, проверяется
правильность паспортизации и решается вопрос о возможности
использования этой сыворотки и методе, рекомендуемом для
практической работы.
Для удаления антител системы АВО сыворотки рекомендуется
абсорбировать. Абсорбция проводится эритроцитами соответствующей
групповой принадлежности с отсутствием в них антигена, против
которого в сыворотке имеются изоиммунные антитела. Абсорбция или
нейтрализация антител альфа и бета проводится после исследования
сыворотки на наличие, специфичность, активность и форму антител до
ее расфасовки.
После абсорбции и еще через три недели сыворотку исследуют на
наличие в ней групповых антител, а также специфичность, форму и
титр изоиммунных антител. Если групповые антитела альфа и бета
исчезли, а показатели изоиммунных антител отвечают требованиям,
указанным в пункте 6, сыворотку можно расфасовать.
11. Паспортизация сыворотки
На ампулы (флаконы) с расфасованной сывороткой наклеивают
этикетки, на которых указывают: название учреждения и город, где
изготовлена сыворотка, номер серии (или символ, избранный для ее
обозначения), например, сокращенная фамилия донора,
специфичность антиэритроцитарных антител, их форму. Указывается
также групповая принадлежность по системе АВО. Для сыворотки
группы АВ(IV) или, специально абсорбированной, вместо символа,
обозначающего групповую принадлежность, пишутся слова "для всех
групп крови". На этикетках наносятся по диагонали цветные полосы:
для группы А(II) - две синие, для группы B(III) - три красные, для
сыворотки с символом "для всех групп крови" - четыре желтые.
На этикетках указывается количество, срок годности и условия
хранения.
ПРИМЕРЫ НАСТАВЛЕНИЙ
ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ РЕДКИХ СЫВОРОТОК
------------------------------------------------------------------¬
¦ СТАНЦИЯ ПЕРЕЛИВАНИЯ КРОВИ КЗ г. МОСКВЫ ¦
+-----------------------------------------------------------------+
¦ Стандартная сыворотка для определения ¦
¦ антигенов эритроцитов ¦
¦ методом конглютинации с желатином в пробирках ¦
¦ ¦
¦ Метод использования: ¦
¦ ¦
¦1. В пробирку к одной капле сыворотки (0,05 мл) добавить одну¦
¦ каплю испытуемых эритроцитов (0,05 мл) и 2 капли желатина (0,1¦
¦ мл). Содержимое перемешать путем встряхивания. ¦
¦ ¦
¦2. Инкубировать в термостате при +48 - +50° С в течение 30 минут¦
¦ или в водяной бане при +48 - +50° С в течение 15 минут. ¦
¦ ¦
¦3. После прогревания в пробирку долить 8-10 мл физиологического¦
¦ раствора, содержимое перемешать путем перевертывания пробирки.¦
¦ ¦
¦4. Учесть результат реакции. ¦
¦ ¦
¦ Во всех сомнительных случаях результат оценить путем микроско-¦
¦ пирования. ¦
¦ ¦
¦ Серия 85 анти- Е для всех групп крови ¦
¦ ------- ---- ----- ¦
L------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------¬
¦ СТАНЦИЯ ПЕРЕЛИВАНИЯ КРОВИ КЗ г. МОСКВЫ ¦
+-----------------------------------------------------------------+
¦ Стандартная сыворотка для определения ¦
¦ антигенов эритроцитов ¦
¦ в методе солевой агглютинации ¦
¦ (в маленьких пробирках или на планшетах) ¦
¦ ¦
¦ Метод использования: ¦
¦ ¦
¦1. Приготовить 2% взвесь эритроцитов дважды отмытых изотоническим¦
¦ раствором хлорида натрия. ¦
¦ ¦
¦2. К одной капле тест-сыворотки добавить одну каплю исследуемой¦
¦ взвеси эритроцитов. ¦
¦ ¦
¦3. Инкубировать пробирки (планшеты) 1 час при температуре 37° С. ¦
¦ ¦
¦4. Учесть результаты реакции с помощью лупы. ¦
¦ ¦
¦ Серия 52 анти- С для всех групп крови ¦
¦ ------ ---- ----- ¦
L------------------------------------------------------------------
12. Хранение и выдача сыворотки
Расфасованные редкие сыворотки хранят или в замороженном
состоянии при температуре не выше -15° С или при +4- 8°С.
Редкие сыворотки после стандартизации используются для нужд
учреждений, в которых они изготовлены и могут выдаваться в другие
учреждения Службы крови.
При выдаче сыворотки к ней прилагают наставление по
использованию, в котором указывают, в каком методе для каждого из
антител следует использовать данную сыворотку.
При хранении сыворотка контролируется один раз в месяц или (в
целях экономии сыворотки) непосредственно перед выдачей. Срок
годности редких сывороток при хранении в замороженном состоянии -
один год, при хранении в условиях +4-8° С - четыре месяца. По
истечении срока годности сыворотку проверяют и, если титр не
снизился или снизился не более чем на два разведения и при этом
сохранился не ниже требований, указанных в пункте 6, срок
продляют еще на два месяца. Если через два месяца титр также
сохранился - срок снова продляется.
"Временную инструкцию по изготовлению сывороток редких групп,
предназначенных для определения различных изоантигенов эритроцитов
человека", утвержденную Министерством здравоохранения СССР 26
марта 1979 года N 06-14/3, считать утратившей силу с момента
утверждения данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 13
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ<*>
ПО ПРИМЕНЕНИЮ ЦОЛИКЛОНА АНТИ-С МОНОКЛОНАЛЬНОГО
ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНА С СИСТЕМЫ РЕЗУС
НА ЭРИТРОЦИТАХ ЧЕЛОВЕКА
(ЦОЛИКЛОН АНТИ-С СУПЕР)
ТУ 9398-207-27575295-94
1. Назначение
Цоликлон анти-С Супер предназначен для выявления антигена С
системы резус на эритроцитах человека в реакции прямой
гемагглютинации и может применяться взамен или параллельно с
аллоиммунной анти-С сывороткой.
--------------------------------
<*> - Составители инструкции: профессор И.Л.Чертков, директор
ТОО "Гематолог" Г.Ю.Митерев, научные сотрудники Л.Н.Леменева,
Н.И.Оловникова, Е.В.Белкина.
2. Основные свойства
2.1. Моноклональные человеческие анти-С антитела продуцируются
бессмертной гетерогибридомой клеточной линией. Цоликлон анти-С
Супер изготавливается на основе культуральной жидкости,
кондиционированной клетками-продуцентами антител. Технология
производства реагента исключает возможность его контаминации
патогенными для человека вирусами.
2.2. Цоликлон анти-С Супер содержит IgM антитела, которые
вызывают прямую агглютинацию С+ эритроцитов. Реагент не содержит
антител других специфичностей и пригоден для выявления антигена С
в эритроцитах любой группы.
3. Определение антигена С
Цоликлон анти-С Супер может быть использован в реакции
агглютинации на плоскости, в пробирках, в микроплате. Определение
антигена С производится в нативной крови с консервантом, в крови
без консерванта, в том числе взятой из пальца.
3.1. Реакция агглютинации на плоскости
3.1.1. На предварительно подогретую (35-40° С) пластинку
нанести одну большую каплю реагента (примерно 0,1 мл), одну
маленькую каплю исследуемой крови или эритроцитов (0,02-0,05 мл) и
смешать.
3.1.2. Через 20-30 секунд после смешивания покачать пластинку.
3.1.3. Результат оценить визуально по наличию или отсутствию
агглютинации. Четкая реакция наступает через 30-60 секунд после
смешивания реагента с эритроцитами. Окончательный результат
реакции следует учитывать через пять минут. Наиболее крупная и
четкая агглютинация наблюдается при использовании эритроцитов в
высокой концентрации.
3.2. Реакция агглютинации в пробирках
3.2.1. Приготовить из отмытых исследуемых эритроцитов 5%
суспензию в физиологическом растворе.
3.2.2. Внести в круглодонную пробирку по одной капле Цоликлона
анти-С и эритроцитарной взвеси, тщательно перемешать.
3.2.3. Оставить пробирку на тридцать минут при температуре 37°
С.
3.2.4. Центрифугировать пробирку при 1500-3000 оборотах в
минуту в течение тридцати секунд.
3.2.5. Осторожно встряхивая пробирку, разбить осадок.
3.2.6. Результат оценить визуально. При отрицательном
результате реакции осадок эритроцитов легко разбивается и образует
гомогенную непрозрачную суспензию. При положительном результате
осадок остается в виде одного или нескольких крупных агглютинатов
на фоне прозрачной жидкости.
4. Контроль специфичности
Для контроля специфичности при каждом исследовании (независимо
от применяемой методики) необходимо использовать стандартные С+ и
С- эритроциты.
5. Хранение
Срок хранения Цоликлона анти-С Супер - один год при
температуре 2-8° С. Вскрытый флакон можно хранить при температуре
- 2-8° С в закрытом виде в течение одного месяца.
6. Рекламация
Основаниями для рекламации являются: отсутствие активности,
неспецифичность, нарушение целостности флакона, наличие хлопьев,
получение реагента с истекшим сроком годности или недостаточными
сведениями.
При составлении рекламации необходимо указать дату получения,
номер серии, претензии к реагенту. Необходимо приложить протокол с
результатами тестирования и 2-3 невскрытых флакона с Цоликлоном
данной серии.
Рекламацию следует направить на предприятие-изготовитель.
"Инструкцию по применению Цоликлона анти-rh' (С)
моноклонального для определения антигена С системы резус на
эритроцитах человека (Цоликлон анти-С Супер)", утвержденную
Управлением научных исследований Минздравмедпрома России 17 марта
1995 года, считать утратившей силу с момента утверждения данной
инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 14
УТВЕРЖДЕНО
|
