|
Стр. 5
Дополнение N 2
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ СТАНДАРТНОГО УНИВЕРСАЛЬНОГО РЕАГЕНТА
ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕЗУС-ПРИНАДЛЕЖНОСТИ В ПРОБИРКАХ БЕЗ
ПОДОГРЕВА
(Прилагается при выдаче реагента)
Стандартный универсальный реагент антирезус не содержит
групповых агглютининов аьфа и бета и поэтому может быть
использован для определения резус-антигена D в эритроцитах любой
группы системы АВО. Для контроля активности и специфичности
реагента антирезус необходимо одновременно с основным
исследованием ставить контроль, используя стандартные
резус-положительные и стандартные резус-отрицательные эритроциты.
Предварительной обработки исследуемой крови и стандартных
эритроцитов не требуется. Может быть использована кровь, взятая
непосредственно из места укола пальца, консервированная кровь и
осадок эритроцитов в пробирке, после образования свертка крови,
взятой без стабилизатора.
Допустимо хранить кровь в течение 2-3 суток при 4-8° С.
Техника реакции.
а) В штатив устанавливают 2 ряда пробирок по числу исследуемых
эритроцитов в каждом ряду и по 2 пробирки для контрольных
исследований. На пробирках надписывают фамилию и инициалы лица,
кровь которого исследуется.
б) Во все пробирки 1-го ряда вводят по 2 капли (0,1 мл)
стандартного универсального реагента антирезус.
Во все пробирки 2-го ряда вводят по 2 капли (0,1 мл)
изотонического раствора NaCl и по 1 капле (0,05 мл) 33% раствора
полиглюкина.
2-й ряд служит контролем для исключения возможной
неспецифической агглютинации исследуемых эритроцитов, например, за
счет аутоантител.
в) В каждую пару одинаково обозначенных пробирок вводят
согласно маркировке по 1 капле (0,05 мл) исследуемой крови
(эритроцитов) и стандартные резус-положительные (Rh+) и
резус-отрицательные (rh-) эритроциты.
г) Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и затем
медленно поворачивают по оси, наклоняя почти до горизонтального
положения так, чтобы содержимое растекалось по стенкам пробирки.
Такое размазывание крови по стенкам пробирки делает реакцию более
выраженной.
Как правило, агглютинация эритроцитов наступает уже в течение
первой минуты, но для образования устойчивости комплекса
антиген+антитело и четко выраженной реакции, а также ввиду
возможности замедленной реакции при слабовыраженной
агглютинабельности эритроцитов, контакт эритроцитов с реагентом
при поворачивании пробирок проводят не менее 3 минут.
Через 3 минуты в пробирки добавляют по 2-3 мл изотонического
раствора NaCl и перемешивают содержимое путем 2-3 - кратного
переворачивания пробирок (не встряхивать!).
Трактовка результатов.
Пробирки просматривают на свет невооруженным глазом или через
лупу. Результат трактуют по наличию или отсутствию агглютинации
эритроцитов.
При наличии агглютинации в виде крупных комочков или хлопьев
из склеенных эритроцитов на фоне просветленной жидкости
исследуемую кровь относят к резус-положительной (Rh+). При
отсутствии агглютинации (в пробирке сохраняется гомогенное
окрашивание) исследуемую кровь можно считать резус-отрицательной
(rh-).
Однако эти результаты можно учитывать как истинные только
после проверки контрольных образцов, т.е. при положительной
реакции со стандартными резус-положительными эритроцитами и
отрицательной - со стандартными резус-отрицательными эритроцитами,
а также после просмотра результатов во 2-м (контрольном) ряду. Во
всех пробирках контрольного ряда агглютинации быть не должно.
Наличие агглютинации эритроцитов во втором (контрольном) ряду
указывает на неспецифическое склеивание эритроцитов, например, за
счет аутоантител и, следовательно, положительный результат с
сывороткой антирезус не может быть учтен как истинный.
Для определения резус-принадлежности в таких случаях следует
применять другую активную сыворотку антирезус и сыворотку
антирезус с полными антителами или предварительно отмытые
эритроциты теплым изотоническим раствором NaCl для элюирования с
них аутоантител.
Примечания.
1. Изредка встречаются образцы эритроцитов, дающие
слабовыраженную реакцию. В этих случаях следует повторно
исследовать их несколькими сериями сывороток антирезус высокой
активности и параллельно сывороткой антирезус с полными антителами
в реакции солевой агглютинации.
2. При определении резус-принадлежности крови доноров
недостаточно разделения их на резус-положительных и
резус-отрицательных по реагенту анти-D, а необходимо дополнительно
исследовать сыворотками, содержащими антитела анти-С и анти-Е. В
число резус-отрицательных доноров зачисляются только лица, кровь
которых не содержит ни одного из этих антигенов, т.е. фенотипа
ccddee.
3. Определение антигенов системы резус С, Е, с, е производится
сыворотками, содержащими антитела соответствующей специфичности.
Эти антитела могут быть в сыворотке как в чистом виде, так и в
различных сочетаниях, в том числе и с анти-D.
Эти исследования производятся теми же методами, что и
определение резус-антигена D. В качестве контролей используются
эритроциты соответствующего фенотипа.
Подробности о технике реакции, оценке результатов, мерах
предупреждения возможных ошибок см. в "Инструкции по определению
резус-принадлежности крови".
Дополнение N 3
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ СТАНДАРТНОЙ СЫВОРОТКИ АНТИРЕЗУС
АНТИ-D ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕЗУС-ПРИНАДЛЕЖНОСТИ
РЕАКЦИЕЙ АГГЛЮТИНАЦИИ В СОЛЕВОЙ СРЕДЕ
(Прилагается при выдаче сыворотки)
Реакция агглютинации в солевой среде пригодна для работы с
сывороткой, содержащей полные резус-антитела.
Общие замечания.
Определение резус-фактора следует проводить двумя сериями
стандартных сывороток антирезус. В настоящей инструкции
описывается определение двумя сериями сыворотки с использованием
одной и той же методики-агглютинации в солевой среде.
При определении резус-принадлежности необходимо учитывать
групповую специфичность сыворотки по системе АВО.
Сыворотка группы АВ(IV) и специально приготовленная -
универсальная - предназначена для определения резус-принадлежности
крови любой группы по системе АВО.
Сывороткой группы О(I) определяют резус-принадлежность только
в эритроцитах группы О(I), сывороткой группы А(II) - в эритроцитах
группы О(I) и А(II) и сывороткой группы В(III) - в эритроцитах
группы О(I) и В(III).
При каждом исследовании или проводимой серии исследований
необходимо для проверки специфичности и активности сыворотки
антирезус ставить контроль. Для контроля применяют стандартные
резус-положительные эритроциты группы О(I) или той же группы, что
и исследуемая кровь, и стандартные резус-отрицательные эритроциты
обязательно той же группы, что и исследуемая кровь.
Предварительная обработка исследуемой крови и стандартных
эритроцитов.
Кровь для исследования берут в количестве 0,5-1 мл в обычные
пробирки, содержащие 0,25 мл (5 капель) изотонического раствора
лимоннокислого натрия или любого другого стабилизатора. На
пробирке надписывают фамилию, инициалы и группу крови лица, от
которого взята кровь. Эритроциты необходимо отмыть, для чего в
пробирки доливают доверху изотонический раствор NaCl, содержимое
их перемешивают и центрифугируют.
Можно брать кровь и без стабилизатора. При этом после
свертывания крови обычно в пробирке остается некоторое количество
свободных эритроцитов. Если этих эритроцитов недостаточно, следует
интенсивно встряхнуть сверток для отделения большего количества
эритроцитов. Полученные таким образом эритроциты отмывают, как
сказано выше.
Из отмытых эритроцитов приготавливают 2% взвесь, для чего одну
каплю эритроцитов переносят в соответственно обозначенную
пробирку, содержащую 49 капель изотонического раствора NaCl. Такую
взвесь употребляют для исследования.
Допустимо хранить кровь в течение 2-3 суток при 4-8° С.
Техника реакции.
а) в штатив устанавливают два ряда пробирок высотой 2-2,5 см с
внутренним диаметром 0,5-0,6 см и с гладким дном округлой формы в
каждом ряду по числу исследуемых эритроцитов и по две пробирки для
контрольных исследований. Предварительно штатив накрывают листом
бумаги, в котором слегка накалывают отверстия, сквозь которые
устанавливают пробирки. Против каждой пары пробирок на бумаге
надписывают фамилию и инициалы лица, кровь которого исследуется.
Можно использовать планшет для иммунологических реакций, имеющий
лунки с круглым дном;
б) во все пробирки (лунки) 1-го ряда вносят по одной капле
(0,05 мл) сыворотки антирезус одной серии, во все пробирки (лунки)
2-го ряда - по одной капле (0,05 мл) сыворотки антирезус другой
серии и в оба ряда добавляют по 1 капле изотонического раствора
NaCl;
в) в соответственно обозначенные пары пробирок (лунок)
добавляют по одной капле (0,05 мл) 2% взвеси исследуемых
эритроцитов, а в контрольные - по одной капле (0,05 мл) 2% взвеси
стандартных резус-положительных эритроцитов и по одной капле
взвеси стандартных резус-отрицательных эритроцитов;
г) содержимое пробирок (лунок) тщательно перемешивают
втряхиванием и помещают в термостат при 37° С на 1 час. (Можно
затем оставить планшет при комнатной температуре еще на 1-2 часа
до учета результатов).
За это время эритроциты оседают на дно, предварительно войдя в
контакт с сывороткой антирезус.
Трактовка результатов.
Пробирки (планшеты) рассматривают по продольной оси над
источником света, закрытым матовым стеклом.
Результат трактуют по наличию или отсутствию агглютинации
эритроцитов, что выражается в разной форме их осадка на дне.
При положительном результате осадок эритроцитов располагается
на дне неравномерным слоем. Видна шероховатость, губчатость или
зернистость его структуры. Края осадка никогда не бывают ровными,
они изогнуты, иногда завернуты внутрь. В некоторых случаях
эритроциты располагаются в виде волнистого венчика вокруг более
светлой центральной части.
При отрицательном результате осадок эритроцитов располагается
равномерным слоем без шероховатости и неровностей, иногда с
небольшим просветлением в центре. Границы его представляют собой
правильно очерченный круг.
Диаметр при отрицательном результате всегда меньше, чем при
положительном.
Образцы эритроцитов, давшие агглютинацию с сывороткой анти-D,
- резус-положительные (Rh+). Образцы эритроцитов, не давшие
агглютинации с сывороткой анти-D, - резус-отрицательные (rh-).
Однако результаты можно учитывать как истинные только при
совпадении их в обеих сериях сыворотки антирезус и после проверки
контрольных образцов, подтверждающих специфичность и активность
сыворотки антирезус, т.е. при отсутствии агглютинации со
стандартными резус-отрицательными эритроцитами одноименной группы
и наличии агглютинации со стандартными резус-положительными
эритроцитами одноименной группы или группы О(I).
Примечания.
1. Изредка встречаются образцы эритроцитов, дающие
слабовыраженную реакцию. В этих случаях следует повторно
исследовать их несколькими сериями сыворотки антирезус высокой
активности. Антиген крови Du в реакции солевой агглютинации не
выявляется.
2. При определении резус-принадлежности крови доноров
недостаточно разделения их только на резус-положительных и
резус-отрицательных по сыворотке анти-D, а необходимо
дополнительно исследовать сыворотками, содержащими антитела анти-С
и анти-Е.
В число резус-отрицательных доноров зачисляются только лица,
кровь которых не содержит ни одного из этих антигенов, т.е.
фенотипа ccddee.
3. Определение антигенов системы резус - С, Е, с и е
производится сыворотками, содержащими антитела соответствующей
специфичности. Эти антитела могут быть в сыворотке как в чистом
виде, так и в различных сочетаниях, в том числе и с анти-D.
Эти исследования производятся теми же методами, что и
определение резус-антигена D. В качестве контролей используются
эритроциты соответствующего фенотипа.
Подробности о технике реакции, оценке результатов, мерах
предупреждения возможных ошибок см. в "Инструкции по определению
резус-принадлежности крови".
"Инструкцию по изготовлению стандартных сывороток и реагента
антирезус", утвержденную Министерством здравоохранения СССР 07
сентября 1990 года N 05-14/28, считать утратившей силу с момента
утверждения данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 6
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ
ПО УДАЛЕНИЮ ИЗ СЫВОРОТКИ АНТИРЕЗУС
АНТИТЕЛ ДРУГОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ
Общие сведения
В практической работе по определению резус-принадлежности
крови наибольшее удобство представляет использование сывороток
антирезус группы крови АВ(IV), не содержащих групповых
агглютининов альфа и бета. Такие сыворотки являются
универсальными, так как позволяют определять резус-принадлежность
в крови любой группы по системе АВО.
Сыворотки антирезус, принадлежащие к группам О(I), А(II) и
В(III), также могут быть превращены в универсальные путем
абсорбции или нейтрализации в них групповых агглютининов альфа и
бета.
Помимо групповых агглютининов использованию сыворотки
антирезус мешают также имеющиеся в отдельных случаях изоиммунные
антитела другой специфичности, чаще всего анти-С и анти-Е. Если
эти антитела имеют низкий титр, они могут быть удалены при помощи
абсорбции или путем разведения сыворотки.
Использование универсальных сывороток антирезус упрощает
работу, повышает эффективность лабораторной службы и исключает
получение ошибочных результатов из-за несоответствия группы
сыворотки антирезус и исследуемых эритроцитов.
Для освобождения сыворотки антирезус от агглютининов альфа,
бета и от антител анти-С и анти-Е можно применять разные способы:
а) нейтрализацию групповых агглютининов альфа и бета
соответствующим групповым веществом, содержащимся в амниотической
жидкости (см. п. 1);
б) нейтрализацию групповых агглютининов альфа и бета
естественным групповым веществом А и В (субстанция Витебского)
(см. п. 2);
в) абсорбцию групповых агглютининов альфа и бета
резус-отрицательными эритроцитами, находящимися в свертках крови
после снятия с них сыворотки (см. п. 3);
г) нейтрализацию групповых агглютининов альфа и бета путем
разведения сыворотки (см. п. 4);
д) абсорбцию антител анти-С и анти-Е эритроцитами этой
специфичности (см. п. 5);
е) нейтрализацию антител анти-С и анти-Е путем разведения
сыворотки (см. п. 6).
1. Нейтрализация групповых агглютининов альфа и бета при помощи
амниотической жидкости<*>
Амниотическая жидкость содержит растворенную групповую
субстанцию, соответствующую группе крови плода. Она может быть
использована как в нативном виде, так и предварительно высушенная
и затем растворенная дистиллированной водой (получение и обработку
амниотической жидкости см. п. 8).
--------------------------------
<*> - Амниотическая жидкость нейтрализует альфа и бета
антитела, относящиеся к классу lgМ, неполные альфа и бета
антитела, относящиеся к классу lgG, при этом не нейтрализуются.
Для нейтрализации агглютининов альфа и бета в сыворотке
антирезус группы Оальфа бета(I) используют амниотическую жидкость
группы АВ(IV) или смесь образцов амниотической жидкости групп
А(II) и В(III). Для нейтрализации агглютининов бета в сыворотке
группы Абета(II) используют амниотическую жидкость группы В(III).
Для нейтрализации агглютининов альфа в сыворотке антирезус группы
Вальфа(III) используют амниотическую жидкость группы А(II).
Для полного истощения групповых агглютининов в исходной
сыворотке антирезус проводят подбор оптимального соотношения
амниотической жидкости и нейтрализуемой сыворотки антирезус, для
чего:
- в штатив устанавливают пять пробирок с обозначениями 1:2,
1:3, 1:4, 1:5, 1:6, во все пробирки вносят по 2 капли
амниотической жидкости - нативной или растворенной после
высушивания;
- в первую пробирку добавляют 4 капли нейтрализуемой
сыворотки, во вторую 6 капель, в третью - 8 капель, в четвертую -
10 капель, в пятую - 12 капель;
- содержимое пробирок перемешивают и оставляют на 10 минут при
комнатной температуре;
- после 10-минутной экспозиции смесь из каждой пробирки
контролируют на плоскости на полноту нейтрализации со
стандартными резус-отрицательными эритроцитами, содержащими
антиген, соответствующий нейтрализуемым агглютининам;
- последнее разведение, в котором отсутствует агглютинация
(время наблюдения 5 минут), принимается за оптимальное соотношение
амниотической жидкости и нейтрализуемой сыворотки;
- если агглютинация отсутствует во всех разведениях, готовят
разведения 1:7, 1:8, 1:9 и продолжают исследование, как сказано
выше;
- после того, как выбрано оптимальное соотношение, к основному
объему сыворотки антирезус добавляют соответствующее количество
амниотической жидкости и перемешивают их. Через 10-20 минут после
перемешивания вновь проверяют сыворотку на полноту абсорбции на
плоскости с 6-8 образцами резус-отрицательных эритроцитов группы
А(II) и В(III);
- далее сыворотку исследуют и обрабатывают в соответствии с
"Инструкцией по изготовлению стандартных сывороток и реагента
антирезус".
Примечание:
В целях упрощения получения универсальных сывороток из
сывороток антирезус группы Абета(II) и Вальфа(III) их можно
предварительно смешивать, что позволяет нейтрализовать
одномоментно агглютинины альфа и бета амниотической жидкостью
группы АВ(IV) или смесью амниотической жидкости группы А(II) и
группы В(III). Предварительное смешивание сыворотки
противоположных групп целесообразно еще и потому, что при этом
происходит частичная взаимная нейтрализация групповых
агглютининов, что снижает количество амниотической жидкости,
необходимое для полной нейтрализации, а, следовательно, снижается
степень разведения абсорбируемой сыворотки.
Использование высушенной амниотической жидкости
При низком титре сыворотки антирезус, ограничивающем ее
разведение, для нейтрализации агглютининов целесообразно
использовать сухой порошок. К нейтрализации приступают так же - с
определения оптимального соотношения сыворотки антирезус и сухого
порошка, полученного из амниотической жидкости, для чего:
- в штатив устанавливают четыре пронумерованные пробирки, в
которые вносят по 0,5 мл сыворотки антирезус;
- в первую пробирку добавляют 2 мг высушенной амниотической
жидкости, во вторую - 4 мг, в третью - 8 мг и в четвертую - 16 мг.
Содержимое пробирок перемешивают до полного растворения порошка и
оставляют при комнатной температуре;
- через 10 минут проводят испытание на плоскости на полноту
нейтрализации с эритроцитами групп А(II) и В(III) и выбирают
оптимальное соотношение ингредиентов;
- выбранное соотношение используют для изготовления основного
объема сыворотки;
- далее сыворотку исследуют и обрабатывают в соответствии с
"Инструкцией по изготовлению сывороток и реагента антирезус".
2. Нейтрализация групповых агглютининов альфа и бета
естественными групповыми веществами специфичности А и В
(субстанция Витебского)
Групповые специфические вещества А и В являются
высокомолекулярными полисахаридами, приготавливаются в
производственных условиях из слизистой оболочки свиных и лошадиных
желудков путем их ферментативного переваривания с последующим
осаждением и очисткой органическими растворителями. Количество
группового специфического вещества, необходимого для нейтрализации
антител в сыворотке, зависит от активности вещества. Для
нейтрализации групповых агглютининов к сыворотке антирезус
добавляют групповое специфическое вещество из расчета:
- к 1000 мл сыворотки антирезус группы О(I) - 0,1 г группового
вещества А и 0,1 г - группового вещества В;
- к 1000 мл сыворотки антирезус группы А(II) - 0,1 г
группового вещества В;
к 1000 мл сыворотки антирезус группы В(III)- 0,1 г группового
вещества А.
Для растворения группового вещества необходимое его количество
сначала растирается стеклянной палочкой в пробирке или на часовом
стекле с небольшим количеством (1 мл) сыворотки антирезус,
подогретой до 37° С, затем это групповое вещество переносят в
общее количество сыворотки антирезус, тщательно многократно смывая
его сывороткой со стекла. Сыворотку антирезус перемешивают с
групповым веществом и помещают в термостат на 3 часа, перемешивая
каждые 30 минут.
После этого сыворотку помещают в холодильник при 4° С не
менее, чем на трое суток, а затем исследуют на пластинке на
содержание групповых агглютининов с 6-8 образцами
резус-отрицательной крови группы А(II) и В(III).
Отсутствие агглютинации означает, что групповые агглютинины
полностью нейтрализованы. Наличие агглютинации означает неполную
нейтрализацию групповых агглютининов. В случае неполной
нейтрализации групповых агглютининов к сыворотке вновь добавляют
такое же или большее (до 0,5 г) количество группового вещества и
вся процедура повторяется.
При полной нейтрализации групповых агглютининов сыворотку
исследуют и обрабатывают далее в соответствии с "Инструкцией по
изготовлению стандартных сывороток и реагента антирезус".
3. Абсорбция групповых агглютининов резус-отрицательными
эритроцитами на свертках крови группы АВ(IV)
Неотмытые свертки крови группы АВ(IV), оставшиеся после
отсасывания сыворотки антирезус, допустимо хранить при 4-8° С в
течение 1-2 суток.
Для абсорбции охлажденный сверток измельчают при помощи
стеклянной палочки и добавляют к нему также охлажденную сыворотку
антирезус в количестве 1/6-1/3 объема по отношению к объему,
занимаемому измельченным свертком (к 300 мл свертка приливают
50-100 мл абсорбируемой сыворотки, в зависимости от активности
групповых антител). Сыворотку, тщательно смешанную со свертком,
оставляют на 18-20 часов при 4-8° С, после чего отделяют от
свертка путем центрифугирования.
Далее сыворотку проверяют на плоскости с 6-8 образцами резус-
отрицательных эритроцитов и в случае полной абсорбции групповых
агглютининов обрабатывают и исследуют далее в соответствии с
"Инструкцией по изготовлению сывороток и реагента антирезус".
4. Нейтрализация групповых агглютининов альфа и бета
при помощи разведения сыворотки
Для нейтрализации сыворотку антирезус разводят изотоническим
раствором NaCl специально подобранной сывороткой группы АВ(IV) или
стандартным разводителем.
Нейтрализация групповых антител при помощи разведения возможна
только лишь при большом различии титра групповых и резус-антител.
Например, если титр групповых антител 1:8, сыворотку следует
развести не менее, чем в 16 раз, что возможно только в том случае,
если титр резус-антител в ней после разведения сохранится не ниже
требований, предъявляемых к стандартной сыворотке антирезус.
В процессе работы в начале следует приготовить пробные
разведения сыворотки антирезус и исследовать титр резус-антител, а
также степень нейтрализации групповых антител с 6-8 образцами
резус-отрицательных эритроцитов группы А(II) и В(III).
При сохранении достаточного титра резус-антител и полноте
абсорбции групповых антител разводят основной объем сыворотки
антирезус и далее исследуют ее и обрабатывают в соответствии с
"Инструкцией по изготовлению сывороток и реагента антирезус".
5. Удаление из сыворотки антирезус сопутствующих антител
анти-С и анти-Е
Если на какой-либо стадии обработки сыворотки антирезус-D
выяснится, что в ней содержатся еще и другие антитела антирезус,
последние могут быть удалены путем абсорбции или разведения
сыворотки.
Абсорбция производится трижды отмытыми эритроцитами, взятыми
приблизительно в половинном объеме по отношению к сыворотке. Если
в сыворотке имеется примесь антител анти-С, то для абсорбции
применяются эритроциты фенотипа Ccddee, а если имеется примесь
анти-Е, то эритроциты фенотипа ccddEe. Абсорбция проводится в
течение 2-3 час. при температуре 37° С при помешивании с
последующей проверкой сыворотки на специфичность и активность.
Если сопутствующие антитела не удалились, сорбцию можно повторить.
Разведение сыворотки антирезус для удаления сопутствующих
антител можно проводить при титре антител анти-D не ниже, чем
1:128 - 1:256 и титре сопутствующих антител не выше 1:2.
Сыворотку антирезус разводят изотоническим раствором NaCl,
сывороткой - разводителем или стандартным разводителем.
В начале следует сделать пробные порции, которые исследовать
на полноту нейтрализации сопутствующих антител и на сохранность
достаточного титра резус-антител-D. При положительном результате
разводят основной объем сыворотки. Как после абсорбции, так и
после разведения основного объема сыворотки ее вновь обрабатывают
и исследуют далее в соответствии с "Инструкцией по изготовлению
стандартных сывороток и реагента антирезус".
6. Получение и обработка амниотической жидкости для
использования ее при изготовлении сывороток антирезус
Амниотическую жидкость собирают в родильных домах от каждой
роженицы отдельно в чистые флаконы. От одной роженицы может быть
получено от 100 до 1500 мл. На этикетке флакона указывают фамилию
роженицы, дату взятия, количество и по возможности группу крови
новорожденного.
Групповая принадлежность амниотической жидкости соответствует
группе крови новорожденного.
Оплата за сбор амниотической жидкости производится
учреждениями службы крови аналогично оплате за ретроплацентарную
кровь из средств на заготовку крови.
Подготовка амниотической жидкости к использованию
Групповую принадлежность амниотической жидкости устанавливают
путем определения групповой принадлежности крови новорожденного
или методом истощения агглютининов альфа и бета в
гемагглютинирующей сыворотке группы О(I). Для этого в пробирке
смешивают равные объемы (по 1 мл) стандартной гемагглютинирующей
сыворотки с титром 1:32 и испытуемой амниотической жидкости. Смесь
перемешивают и оставляют на 10 мин. при комнатной температуре.
Затем смесь сыворотки и амниотической жидкости исследуют на
плоскости со стандартными эритроцитами группы А(II) и В(III).
Соотношение эритроцитов и смеси должно соответствовать примерно
1:10, экспозиция 5-7 минут.
Трактовка результатов
- Наличие агглютинации в каплях с эритроцитами группы А(II) и
группы В(III) указывает на отсутствие в амниотической жидкости
групповых антигенов А и В, т.е. на принадлежность ее к группе
О(I). Такая амниотическая жидкость не пригодна для нейтрализации
групповых агглютининов.
- Отсутствие агглютинации в капле с эритроцитами группы А(II)
и наличие агглютинации в капле с эритроцитами группы В(III)
указывает на принадлежность амниотической жидкости к группе А(II).
- Отсутствие агглютинации в капле с эритроцитами группы В(III)
и наличие ее с эритроцитами группы А(II) указывает на
принадлежность амниотической жидкости к группе В(III).
- Отсутствие агглютинации в каплях как с эритроцитами группы
А(II), так и группы В(III) указывает на принадлежность
амниотической жидкости к группе АВ(IV).
Групповую принадлежность записывают на этикетке, которую
наклеивают на флаконе с амниотической жидкостью.
Контроль амниотической жидкости на специфичность
Следует учитывать возможность попадания в амниотическую
жидкость крови роженицы, в связи с чем необходимо исследовать
каждый образец амниотической жидкости на наличие групповых
агглютининов.
Исследование амниотической жидкости с эритроцитами группы
А(II) и В(III) проводится аналогично определению групповой
принадлежности крови.
Наличие агглютинации означает наличие в амниотической жидкости
групповых агглютининов крови роженицы. Такой образец непригоден
для работы.
Фильтрация и консервирование амниотической жидкости
После определения групповой принадлежности и контроля на
специфичность амниотическую жидкость фильтруют через обычный
бумажный фильтр или под вакуумом через фарфоровую воронку Бюхнера,
в которую помещают измельченную фильтровальную бумагу толщиной
5-7 мм. После фильтрования амниотическая жидкость становится
прозрачной.
Консервирование производится борной кислотой из расчета 2 гр
на 100 мл или азидом натрия 1 г на 1000 мл.
Срок хранения амниотической жидкости 12 месяцев при 4-8° С.
Высушивание амниотической жидкости
С целью удлинения срока годности амниотическую жидкость
высушивают по 150-200 мл во флаконах емкостью 250-500 мл. На
флаконы наклеивают этикетки с указанием группы амниотической
жидкости по системе АВО, ее исходного количества и даты
высушивания.
Высушенную амниотическую жидкость хранят при комнатной
температуре. Срок годности 5 лет. Высушенную амниотическую
жидкость перед употреблением разводят дистиллированной водой до
исходного объема. После растворения используют аналогично
нативной.
Методические рекомендации "Удаление из сыворотки антирезус
антител другой специфичности", утвержденные Министерством
здравоохранения СССР 27 ноября 1990 года N 10-11/136, считать
утратившими силу с момента утверждения данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 7
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ РЕЗУС-ПРИНАДЛЕЖНОСТИ КРОВИ
I. ВВЕДЕНИЕ
Определение резус-принадлежности заключается в выявлении в
эритроцитах людей антигена D системы Резус.
В систему Резус входят шесть антигенов: D, d, C, c, E, e,
которые определяют с помощью соответствующих антисывороток.
Антиген d серологически не выявляется. Существуют также
разновидности антигенов резус: Du, Cw, cv, cx и другие.
Антигены системы Резус встречаются со следующей частотой:
D - 85%
C - 70% c - 80%
E - 30% e - 97,5%
Антигены системы Резус обладают способностью вызывать
образование изоиммунных антител.
Наиболее активным в этом отношении является антиген D, который
и подразумевается под термином резус-фактор. Именно по наличию
или отсутствию антигена D все люди делятся на резус-положительных
и резус-отрицательных.
Различные сочетания антигенов резус в крови отдельных людей
составляют 28 групп системы Резус (Табл. 1). В четырнадцати из них
содержится антиген D - они являются резус-положительными, а другие
четырнадцать не содержат антигена D (нижняя часть таблицы) - их
относят к резус-отрицательным.
Таблица 1
СИСТЕМА РЕЗУС
------T------------------------------------------------------------¬
¦ N ¦ Резус-положительные ¦
¦ +----------------------T-------------T----------T------------+
¦ п/п ¦ Фенотип ¦ Частота в % ¦ Генотип ¦Частота в % ¦
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
¦ 1-2 ¦ CCDEE CwCDEe ¦ 0,00 ¦ ¦ ¦
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
¦ 3 ¦ ССDEe ¦ 0,07 ¦ CDE/CDe ¦ ¦
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
¦ 4 ¦ CcDEE ¦ 0,035 ¦ CDE/cdЕ ¦ 0,006 ¦
¦ ¦ ¦ ¦ cDE/CdE ¦ 0,029 ¦
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
¦ 5 ¦ CcDEe ¦ 13,69 ¦ CDe/cDE ¦ 12,24 ¦
¦ ¦ ¦ ¦ CDE/cDe ¦ 0,01 ¦
¦ ¦ ¦ ¦ CDe/cdE ¦ 0,97 ¦
¦ ¦ ¦ ¦ cDE/Cde ¦ 0,27 ¦
¦ ¦ ¦ ¦ CDE/cde ¦ 0,19 ¦
¦ ¦ ¦ ¦ cDE/cdE ¦ 0,006 ¦
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
¦ 6 ¦ CwcDEe ¦ 1,23 ¦ ¦ ¦
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
¦ 7 ¦ ccDEe ¦ 11,82 ¦ cDE/cde ¦ 10,04 ¦
¦ ¦ ¦ ¦ cDE/cDe ¦ 0,72 ¦
¦ ¦ ¦ ¦ cDe/cdE ¦ 0,06 ¦
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
¦ 8 ¦ ccDEE ¦ 2,49 ¦ cDE/cDE ¦ 2,16 ¦
¦ ¦ ¦ ¦ cDE/cdE ¦ 0,33 ¦
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
¦ 9 ¦ CcDee ¦ 31,93 ¦ Cde/cde ¦ 29,90 ¦
¦ ¦ ¦ ¦ CDe/cDe ¦ 1,98 ¦
¦ ¦ ¦ ¦ cDe/Cde ¦ 0,05 ¦
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
¦ 10 ¦ CwcDee ¦ 2,38 ¦ ¦ ¦
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
¦ 11 ¦ CCDee ¦ 16,81 ¦ CDe/Cde ¦ 16,01 ¦
¦ ¦ ¦ ¦ CDe/Cde ¦ 0,80 ¦
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
¦ 12 ¦ CwCDee ¦ 2,60 ¦ ¦ ¦
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
¦ 13 ¦ CwCwDe ¦ 0,00 ¦ ¦ ¦
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
¦ 14 ¦ ccDee ¦ 2,21 ¦ сDe/cde ¦ 2,10 ¦
¦ ¦ ¦ ¦ cDe/cDe ¦ 0,11 ¦
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
¦ Резус-отрицательные ¦
+-----T----------------------T-------------T----------T------------+
¦ 15 ¦ ccddee ¦ 12,71 ¦ cde/cde ¦ ¦
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
¦ 16 ¦ Ccddee ¦ 1,54 ¦ Cde/cde ¦ ¦
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
¦ 17 ¦ CCddee ¦ 0,03 ¦ Cde/Cde ¦ ¦
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
¦ 18 ¦ Cwcddee ¦ 0,035 ¦ Cwde/cde ¦ ¦
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
¦ 19 ¦ ccddEe ¦ 0,070 ¦ cde/cdE ¦ ¦
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
¦ 20 ¦ CcddEe ¦ 0,35 ¦ Cde/cdE ¦ ¦
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
¦21-28¦ CwCddee CwCwddee ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦ ccddEE CcddEE ¦ 0,00 ¦ ¦ ¦
¦ ¦ CCddEE CCddEe ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦ CcddEe CwCddEe ¦ ¦ ¦ ¦
L-----+----------------------+-------------+----------+-------------
II. ОБЩИЕ ЗАМЕЧАНИЯ
1. Определение резус-принадлежности.
Определение резус-принадлежности производится специалистом,
имеющим специальную подготовку.
Определение резус-принадлежности реципиентов производится
стандартной сывороткой анти-D, что дает возможность разделить их
на резус-положительных (Rh+) и резус-отрицательных (rh-).
В отличие от реципиентов определение резус-принадлежности
крови доноров производится в два этапа: сначала кровь доноров
исследуется стандартной сывороткой анти-D, а затем кровь доноров,
давшую отрицательную реакцию с сывороткой анти-D, исследуют
дополнительно стандартными сыворотками антирезус, содержащими
антитела анти-С и анти-Е. Антитела анти-С и анти-Е могут быть в
сыворотке как в чистом виде, так и в сочетании с антителами
анти-D, например: анти-D+C, анти-D+E или анти-D+C+E.
В число резус-отрицательных доноров зачисляются только лица,
кровь которых дает отрицательную реакцию со всеми сыворотками,
т.е. не содержит ни одного из этих трех антигенов резус D, C, E.
Иногда такие дополнительные исследования требуется проводить и
у других лиц - у больных с подозрением на изосенсибилизацию и у
беременных женщин.
Результат определения резус-принадлежности крови доноров
записывается в специальных листах или журнале и на лицевом листе
донорского журнала (карточке) с указанием даты и за подписью лиц,
производивших определение.
Результат определения резус-принадлежности крови больных и
других лиц записывается в специальный журнал и на бланке с
указанием даты и за подписью лиц, производивших определение. Этот
бланк вклеивается в историю болезни и, кроме того, результат,
указанный на этом бланке, записывается лечащим врачом в правом
верхнем углу лицевого листа истории болезни и скрепляется его
подписью с указанием даты.
2. Учет групповой принадлежности сыворотки антирезус.
Сыворотки антирезус изготавливаются обычно в виде
"универсальных", т.е. лишенных групповых антител анти-А и анти-В.
Такие сыворотки пригодны для определения резус-принадлежности
крови людей любой группы по системе АВО.
Однако, если изготовляются сыворотки антирезус различных групп
по системе АВО, то в этих случаях при определении
резус-принадлежности необходимо учитывать групповую специфичность
сыворотки. Сывороткой антирезус группы О(I) определяется
резус-принадлежность только в эритроцитах группы О(I); сывороткой
антирезус группы А(II)- только в эритроцитах групп О(I) и А(II);
сывороткой антирезус группы В(III) - только в эритроцитах групп
О(I) и В(III); сывороткой антирезус группы АВ(IV) и специально
приготовленной "универсальной" резус-принадлежность определяется в
эритроцитах группы АВ(IV) и любой другой группы крови.
3. Контрольные исследования.
При каждом исследовании или проводимой серии исследований
необходимо для проверки специфичности и активности сыворотки
антирезус ставить контроль. Для контроля применяются стандартные
резус-положительные эритроциты группы О(I) или той же группы, что
и исследуемая кровь, и стандартные резус-отрицательные эритроциты.
О стандартных эритроцитах см. "Инструкцию по взятию и учету
крови, получаемой от доноров малыми дозами для приготовления
стандартных эритроцитов".
4. Особенности стандартных сывороток антирезус.
Стандартные сыворотки для определения резус-принадлежности
могут содержать резус-антитела, разные по форме - полные и
неполные (см. "Инструкцию по исследованию сыворотки на наличие
резус-антител"). Каждые из этих антител активны только в особых
условиях, поэтому методика определения резус-принадлежности
зависит от того, какие резус-антитела находятся в стандартной
сыворотке.
Метод использования каждой стандартной сыворотки антирезус
указывается в сопроводительной инструкции.
III. РАЗЛИЧНЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕЗУС-ПРИНАДЛЕЖНОСТИ
Метод определения резус-принадлежности зависит от формы
антител в стандартной сыворотке и способа ее изготовления.
При выдаче сыворотки антирезус к ней придается краткая
сопроводительная инструкция с описанием того метода, для которого
предназначена данная серия выдаваемой сыворотки.
1. Определение резус-принадлежности реакцией конглютинации с
применением желатина в пробирке с подогревом 46-48° С.
а) Специальное оснащение.
Стандартная сыворотка антирезус анти-D с неполными антителами.
Стандартные эритроциты Rh+ и rh- для контроля.
Центрифужные или другие пробирки вместимостью 10 мл.
Водяная баня 46-48° С. Суховоздушный термостат 46-48° С.
10% раствор желатина. (Желатин можно сохранять с консервантом
|
