|
Стр. 6
10% раствор желатина. (Желатин можно сохранять с консервантом
- сульфацилом натрия (альбуцид) - из расчета 100 мг альбуцида на
10 мл 10% раствора желатина).
Лупа с 2-4-кратным увеличением.
б) Предварительная обработка испытуемой крови и стандартных
эритроцитов. Кровь для исследования следует брать в количестве
5-8 мл в пробирку без стабилизатора. На пробирке надписать
фамилию, инициалы и группу крови лица, от которого взята кровь.
Обычно после свертывания крови на дне пробирки остается
небольшое количество свободных эритроцитов, которые следует
употреблять для исследования. Если этих эритроцитов недостаточно,
следует встряхнуть сверток для отделения большего количества
эритроцитов.
Допустимо хранить кровь в течение 2-3 суток при температуре
+4-8° С.
Можно брать кровь с изотоническим раствором лимоннокислого
натрия или другого стабилизатора (0,25 мл на 1 мл крови). В этом
случае эритроциты необходимо отмыть, для чего в пробирку долить
доверху изотонический раствор NaCl, содержимое ее перемешать и
центрифугировать. Отмытые эритроциты использовать для
исследования.
Непосредственно перед исследованием кровь может быть взята из
места укола пальца стеклянной палочкой и немедленно помещена в
пробирку с заранее введенной сывороткой антирезус, смешанной с
желатином 1:2.
в) Техника определения. В штатив устанавливают два ряда
пробирок по числу исследуемых образцов эритроцитов в каждом ряду и
по две пробирки для стандартных резус-положительных и
резус-отрицательных эритроцитов. На каждых двух пробирках
надписывают фамилию и инициалы лица, кровь которого будет
исследоваться. Пробирки нумеруют. В одинаково обозначенные
пробирки (в два ряда) вводят по 1 капле (0,05 мл) исследуемых
эритроцитов, а в контрольные - по одной капле (0,05 мл)
стандартных Rh+ и rh- эритроцитов.
Во все пробирки первого ряда добавляют по одной капле (0,05
мл) сыворотки антирезус.
Во все пробирки (в два ряда) добавляют по две капли (0,1 мл)
10% раствора желатина, предварительно подогретого до разжижения.
Второй ряд является контролем для исключения возможного
неспецифического склеивания исследуемых эритроцитов (прямая
желатиновая проба).
Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и штатив с
пробирками помещают в водяную баню при 46-48° С на 15 минут или в
суховоздушный термостат на 25-30 минут.
При извлечении пробирок из водяной бани или термостата
доливают в них 5-8 мл изотонического раствора NaCl и перемешивают
содержимое путем 1-2-кратного перевертывания пробирок.
г) Трактовка результатов. Пробирки просматривают на свет
невооруженным глазом или через лупу.
Результат трактуют по наличию или отсутствию агглютинации
эритроцитов.
При положительном результате агглютинаты легко различимы в
виде красных комочков в прозрачной, почти обесцвеченной жидкости.
При отрицательном результате в пробирке видна равномерно
окрашенная в светло-красный цвет, опалесцирующая жидкость.
Образцы эритроцитов, давшие агглютинацию с сывороткой анти-D,
являются резус-положительными (Rh+). Образцы эритроцитов, не
давшие агглютинации с сывороткой анти-D, - резус-отрицательными
(rh-). Однако результаты учитывают как истинные после проверки
контрольных образцов, подтверждающих специфичность и активность
сыворотки антирезус, т.е. при отсутствии агглютинации со
стандартными резус-отрицательными эритроцитами одноименной группы
и наличии агглютинации со стандартными резус-положительными
эритроцитами одноименной группы или группы О(I). В пробирках
второго (контрольного) ряда агглютинации быть не должно.
Наличие агглютинации в какой-либо пробирке контрольного ряда
(прямая желатиновая проба положительная) говорит о неспецифичности
реакции. При этих условиях положительный результат с сывороткой
антирезус не может быть учтен как истинный. В таких случаях
рекомендуется отмыть исследуемые эритроциты теплым изотоническим
раствором NaCl для элюирования с них аутоантител и повторить
исследование. При сомнительном результате для определения
резус-принадлежности следует применить метод агглютинации в
солевой среде с использованием сывороток антирезус, содержащих
полные антитела.
2. Определение резус-принадлежности при помощи стандартного
универсального реагента (в пробирках без подогрева).
Специальное оснащение.
стандартный универсальный реагент антирезус - анти-D;
33% раствор полиглюкина;
стандартные эритроциты Rh+ и rh- для контроля;
центрифужные или другие пробирки вместимостью 10 мл;
лупа с 2-4-кратным увеличением.
Предварительная обработка исследуемой крови не требуется.
Может быть использована кровь, взятая непосредственно перед
исследованием из места укола пальца, консервированная кровь и
осадок эритроцитов в пробирке, после образования свертка крови,
взятой без стабилизатора.
Допустимо хранить кровь в течение 2-3 суток при 4-8° С.
Техника реакции.
В штатив устанавливают два ряда пробирок по числу исследуемых
образцов эритроцитов в каждом ряду и по две пробирки для
стандартных резус-положительных и резус-отрицательных эритроцитов.
На пробирках надписывают фамилию и инициалы лица, кровь которого
исследуется.
Во все пробирки первого ряда вводят по 2 капли (0,1 мл)
стандартного универсального реагента антирезус.
Во все пробирки второго (контрольного) ряда вводят по 2 капли
(0,1 мл) изотонического раствора NaCl и по 1 капле (0,05 мл) 33%
раствора полиглюкина.
В каждую пару одинаково обозначенных пробирок вводят согласно
маркировке по 1 капле (0,05 мл) исследуемой крови. В пробирки,
предназначенные для контроля, вводят стандартные
резус-положительные и резус-отрицательные эритроциты.
Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и затем
медленно поворачивают по оси, наклоняя почти до горизонтального
положения так, чтобы содержимое растекалось по ее стенкам. Такое
растекание крови по стенкам пробирок делает реакцию более
выраженной. Как правило, агглютинация наступает уже в течение
первой минуты, но для образования устойчивого комплекса
антиген-антитело и четко выраженной реакции, а также в виду
возможности замедленной реакции при слабо выраженной
агглютинабельности эритроцитов, контакт эритроцитов с реагентом
при поворачивании пробирок проводят не менее 3 мин.
Через 3 минуты в пробирки добавляют по 2-3 мл изотонического
0,85% раствора NaCl и перемешивают содержимое 2-3-кратным
перевертыванием пробирок, не встряхивая.
Трактовка результатов.
Пробирки просматривают на свет невооруженным глазом или через
лупу. Результат трактуют по наличию или отсутствию агглютинации
эритроцитов.
При наличии агглютинации в виде крупных комочков или хлопьев
из склеенных эритроцитов на фоне просветленной жидкости
исследуемую кровь считают резус-положительной (Rh+). При
отсутствии агглютинации (в пробирке сохраняется гомогенное
окрашивание) исследуемую кровь следует считать резус-отрицательной
(rh-). Однако эти результаты следует учитывать как истинные только
после проверки контрольных образцов, т.е. при положительной
реакции со стандартными резус-положительными эритроцитами,
отрицательной - с резус-отрицательными, а также после просмотра
результатов во 2-ом контрольном ряду.
Во всех пробирках 2-го контрольного ряда агглютинации быть не
должно.
Наличие агглютинации в какой-либо пробирке контрольного ряда
указывает на неспецифическое склеивание эритроцитов и,
следовательно, не позволяет учесть результат исследования как
истинный.
В этом случае рекомендуется отмыть исследуемые эритроциты
теплым изотоническим раствором NaCl для элюирования с них
аутоантител и повторить исследование.
В сомнительных случаях для определения резус-принадлежности
следует применить метод агглютинации в солевой среде, используя
сыворотку с полными антителами.
3. Определение резус-принадлежности реакцией конглютинации в
сывороточной среде на плоскости с подогревом.
Специальное оснащение:
стандартные сыворотки антирезус анти-D с неполными антителами;
стандартные эритроциты Rh+ и rh- для контроля;
пластмассовые пластины;
водяная баня 46-48° С.
Предварительная обработка исследуемой крови и стандартных
эритроцитов.
Кровь для исследования берут в количестве 3-5 мл в обычные
пробирки без стабилизатора. На пробирке надписывают фамилию,
инициалы и группу крови лица, от которого берется кровь. Обычно
после свертывания крови на дне пробирки остается небольшое
количество эритроцитов, которые следует употреблять для реакции.
Если этих эритроцитов недостаточно, следует интенсивно встряхнуть
сверток для отделения большего количества эритроцитов.
Эритроциты используют для исследования в виде 5-10% взвеси в
собственной сыворотке. Взвесь готовят на глаз в этих же пробирках
путем встряхивания содержимого.
Допустимо хранить кровь в течение 2-3 суток при 4-8° С.
Техника определения.
На пластмассовую пластину у обозначений наносят по 1 большой
капле (0,1 мл) сыворотки антирезус в три ряда по горизонтали,
всего в 6 точек (3 - одной серии сывороток и 3 - другой). Кроме
того, в одну точку наносят большую каплю (0,1 мл) стандартной
сыворотки группы АВ (IV), не содержащей резус-антител (контроль на
неспецифическую агглютинацию).
К первой капле каждой серии сыворотки добавляют одну каплю
(0,05 мл) взвеси исследуемых эритроцитов, ко второй капле каждой
серии - 1 каплю (0,05 мл) контрольных резус-положительных,
одноименных с группой крови больного или группы О(I), и к третьей
капле каждой серии 1 каплю (0,05 мл) контрольных
резус-отрицательных эритроцитов, обязательно одноименных с группой
крови больного по системе АВО. В контрольную каплю с сывороткой
группы АВ (IV), не содержащей резус-антител, добавляют 1 каплю
(0,05 мл) исследуемых эритроцитов. Капли перемешивают стеклянной
палочкой и пластину опускают в водяную баню при 46-48° С на 10
минут.
Трактовка результатов.
Результаты исследований просматривают при легком покачивании
пластины и трактуют по наличию или отсутствию агглютинации
эритроцитов.
При положительном результате агглютинаты легко различимы на
почти обесцвеченном фоне жидкости.
При отрицательном результате капля остается равномерно
окрашенной в красный цвет.
Образцы эритроцитов, давшие агглютинацию с сывороткой анти-D,
являются резус-положительными (Rh+).
Образцы эритроцитов, не давшие агглютинацию с сывороткой
анти-D, являются резус-отрицательными (rh-). Однако эти
результаты учитывают как истинные только при совпадении их в обеих
сериях сыворотки антирезус и после проверки контрольных образцов
эритроцитов, подтверждающих специфичность и активность сыворотки
антирезус, т.е. при отсутствии агглютинации со стандартными
резус-отрицательными эритроцитами одноименной группы и наличии
агглютинации со стандартными резус-положительными эритроцитами
одноименной группы или группы О(I), а также при отрицательном
результате в контрольной капле с сывороткой группы АВ(IV), не
содержащей резус-антител. Наличие агглютинации в этой капле
говорит о неспецифическом склеивании эритроцитов и, следовательно,
положительный результат с сывороткой антирезус не может быть учтен
как истинный. В этих случаях резус-принадлежность следует
определять, применяя другие методы исследования.
4. Определение резус-принадлежности реакцией
агглютинации в солевой среде
Специальное оснащение.
стандартные сыворотки антирезус анти-D с полными антителами;
стандартные эритроциты Rh+ и rh- для контроля;
пробирки высотой 1,5-2,0 см и диаметром 0,5-0,6 см с гладким
дном округлой формы или планшеты для иммунологических реакций с
углублениями такой же конфигурации и объема;
лупа с 2-4-кратным увеличением;
термостат 37° С.
Предварительная обработка исследуемой крови и стандартных
эритроцитов.
Кровь для исследования берут в количестве 0,5-1 мл в обычные
пробирки, содержащие 0,25 мл (5 капель) изотонического раствора
лимоннокислого натрия или другого стабилизатора. На пробирке
надписывают фамилию, инициалы и группу крови лица, от которого
взята кровь. Эритроциты необходимо отмыть, для чего в пробирки
доливают доверху изотонический раствор NaCl, содержимое их
перемешивают и центрифугируют.
Можно брать кровь без стабилизатора. При этом после
свертывания крови обычно в пробирке остается некоторое количество
свободных эритроцитов. Если этих эритроцитов недостаточно, следует
интенсивно встряхнуть сверток для отделения большего количества
эритроцитов. Полученные таким образом эритроциты отмывают, как
сказано выше.
Из отмытых эритроцитов приготавливают 2% взвесь, для чего 1
каплю эритроцитов переносят в соответственно обозначенную
пробирку, содержащую 49 капель изотонического раствора NaCl.
2% взвесь эритроцитов употребляют для исследования.
Допустимо хранить кровь в течение 2-3 суток при 4-8° С.
Техника определения.
В штатив устанавливают два ряда пробирок по числу исследуемых
образцов эритроцитов в каждом ряду и две - для контролей.
Предварительно штатив накрывают листом бумаги. На нем слегка
накалывают отверстия, сквозь которые и устанавливают пробирки.
Против каждой пары пробирок на бумаге надписывают фамилию и
инициалы лица, кровь которого будет исследоваться.
Во все пробирки (лунка планшета) первого ряда вводят по 1
капле (0,05 мл) сыворотки антирезус одной серии, во все пробирки
(лунки) второго ряда - по 1 капле (0,05 мл) сыворотки антирезус
другой серии и во все пробирки (лунки) обоих рядов по 1 капле
изотонического раствора NaCl.
В соответственно обозначенные пары пробирок (лунок планшета)
добавляют по одной капле (0,05 мл) 2% взвеси испытуемых
эритроцитов, а в контрольные - по одной капле (0,05 мл) 2% взвеси
контрольных (стандартных) резус-положительных и
резус-отрицательных эритроцитов.
Содержимое тщательно перемешивают встряхиванием и помещают в
термостат при 37° С на 1 час. Можно затем оставить пробирки на
столе при комнатной температуре еще на 1,5-2 часа до учета
результата.
За это время эритроциты оседают на дно, предварительно войдя
в контакт с сывороткой антирезус.
Трактовка результатов.
Пробирки (планшеты) следует рассматривать по продольной оси
над источником света, закрытым матовым стеклом.
Результат трактуют по наличию или отсутствию агглютинации
эритроцитов, что выражается в разной форме их осадка на дне.
При положительном результате осадок эритроцитов располагается
на дне неравномерным слоем. Видна шероховатость, губчатость или
зернистость его структуры. Края осадка никогда не бывают ровными,
они изогнуты, иногда завернуты внутрь. В некоторых случаях
эритроциты располагаются в виде волнистого венчика вокруг более
светлой центральной части.
При отрицательном результате осадок эритроцитов располагается
равномерным слоем без шероховатостей и неровностей, иногда с
небольшим просветлением в центре. Границы его представляют собой
правильно очерченный круг.
Диаметр осадка при отрицательном результате всегда меньше,
чем при положительном.
Образцы эритроцитов, давшие агглютинацию с сывороткой анти-D,
являются резус-положительными (Rh+), образцы эритроцитов, не
давшие агглютинации с сывороткой анти-D, - резус-отрицательными
(rh-).
Однако результаты учитывают как истинные при совпадении их в
обеих сериях сыворотки антирезус и после проверки контрольных
образцов, подтверждающих специфичность и активность сыворотки
антирезус, т.е. при отсутствии агглютинации со стандартными
резус-отрицательными эритроцитами одноименной группы и наличии
агглютинации со стандартными резус-положительными эритроцитами
одноименной группы или группы О(I).
Примечание. Полные антитела не выявляют слабый антиген Du.
Повторное использование сыворотки. После определения
резус-принадлежности из всех пробирок осторожно отсасывают
сыворотку (эритроциты остаются на дне) и собирают ее в пробирку.
Эту сыворотку можно повторно несколько раз применять для
определения резус-принадлежности, пока активность ее не иссякнет,
т.е. пока она будет давать четкую агглютинацию со стандартными
резус-положительными эритроцитами и отрицательную реакцию - со
стандартными резус-отрицательными эритроцитами.
IV. ОБЩИЕ ПРИМЕЧАНИЯ
1. При определении резус-принадлежности независимо от метода
определения результат учитывается как истинный после проверки
контрольных образцов, подтверждающих специфичность и активность
каждой серии сыворотки антирезус, т.е. при отсутствии агглютинации
со стандартными резус-отрицательными эритроцитами одноименной
группы и наличии агглютинации со стандартными резус-положительными
эритроцитами одноименной группы или группы О(I) и в других
контрольных пробах, применяемых для каждого метода.
2. Если при определении резус-принадлежности наблюдается
слабая или сомнительная реакция, то следует повторно исследовать
кровь данного лица другими сериями сывороток антирезус и другими
методами, включая метод агглютинации в солевой среде с
сыворотками, содержащими полные антитела.
Если при этом все серии сывороток, содержащих неполные
антитела, дадут также слабую или сомнительную реакцию, а с полными
антителами реакция будет отрицательная, это значит, что эритроциты
содержат слабую разновидность антигена резус, так называемый
антиген Du, частота которого около 1%. В этих случаях
резус-принадлежность крови больного или беременной женщины
указывают как резус-отрицательную (rh-), а резус-принадлежность
крови донора как резус-положительную (Rh+), не допуская таким
образом, переливания его крови резус-отрицательным реципиентам.
V. ИССЛЕДОВАНИЕ ДРУГИХ АНТИГЕНОВ СИСТЕМЫ РЕЗУС
При использовании сывороток, содержащих антитела анти-С,
анти-Е, анти-с, анти-е, анти-Сw в чистом виде, а также в сочетании
с анти-D, например D+C; D+E; D+C+E, применяются те же методы, что
и при использовании сыворотки антирезус анти-D. При этом
учитывается форма антител.
В качестве контролей используют эритроциты, содержащие и не
содержащие соответствующий антиген.
"Инструкцию по определению резус-принадлежности крови",
утвержденную Министерством здравоохранения СССР 07 сентября 1990
года N 05-14/29, считать утратившей силу с момента утверждения
данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 8
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ РЕЗУС-ПРИНАДЛЕЖНОСТИ КРОВИ
НА ПЛОСКОСТИ БЕЗ ПОДОГРЕВА И ПО ИЗГОТОВЛЕНИЮ
СТАНДАРТНОЙ СЫВОРОТКИ И РЕАКТИВА АНТИРЕЗУС,
ПРЕДНАЗНАЧЕННЫХ ДЛЯ ЭТОЙ ЦЕЛИ
Общие сведения
Методы определения резус-принадлежности на плоскости без
подогрева позволяют быстро проводить исследование без применения
особого лабораторного оборудования непосредственно у постели
больного, а также у доноров как в единичных случаях, так и при
массовых обследованиях.
Методы основаны на использовании сывороток антирезус,
изготовленных в сочетании с коллоидными растворами (альбумин,
полиглюкин), в присутствии которых неполные резус-антитела
приобретают способность агглютинировать резус-положительные
эритроциты на плоскости при комнатной температуре, аналогично
реакции по определению групп крови АВО.
Наиболее удобными для практики являются методы определения на
плоскости без подогрева при помощи сыворотки антирезус,
изготовленной в сочетании с альбумином и при помощи реактива
антирезус, изготовленного из сыворотки антирезус в сочетании с
сухим полиглюкином и альбумином.
1. Определение резус-принадлежности на плоскости
без подогрева при помощи сыворотки антирезус,
приготовленной с альбумином
(прилагается при выдаче сыворотки)
Оснащение:
а) специально приготовленная универсальная сыворотка антирезус
анти-D в комплекте с контрольной сывороткой;
б) белая пластинка со смачиваемой поверхностью;
в) изотонический раствор NaCl;
г) стеклянные палочки.
Для исследования используют кровь, полученную непосредственно
из места укола пальца или взятую заранее в пробирку со
стабилизатором, но не более 2 суток хранения при 4-8° С.
Техника реакции.
На пластинке надписывают фамилию и инициалы лица, кровь
которого исследуется, и, сделав соответствующие обозначения,
наносят на нее в две точки: слева по 2 капли сыворотки антирезус и
справа по 2 капли контрольной сыворотки. Рядом с этими каплями
наносят по 1 капле исследуемой крови. Кровь тщательно смешивают с
сывороткой стеклянной палочкой и размазывают на пластинке до
получения тонкого слоя. Затем пластинку периодически покачивают в
течение 4-5 минут и добавляют в обе смеси по 1 капле
изотонического раствора NaCl для снятия возможной неспецифической
агглютинации. Наблюдение за ходом реакции продолжают до истечения
5 минут, после чего учитывают результат.
Трактовка результата.
Если слева, то есть с сывороткой антирезус, произошла
агглютинация эритроцитов, а справа (контроль) ее нет - кровь
остается равномерно окрашенной, без признаков агглютинации, это
значит, что исследуемая кровь резус-положительная (Rh+).
Если в обеих каплях агглютинация отсутствует, это значит, что
исследуемая кровь резус-отрицательная (rh-).
При наличии агглютинации в контрольной капле, что может
произойти при некоторых заболеваниях, например, за счет
аутоантител, необходимо исследовать кровь повторно другими
методами, желательно в лабораторных условиях.
2. Определение резус-принадлежности при помощи
реактива антирезус, изготовленного с использованием
сухого полиглюкина
(прилагается при выдаче реактива)
Оснащение:
а) специально приготовленный реактив антирезус анти-D в
комплекте с контрольным реактивом;
б) белая пластинка со смачиваемой поверхностью;
в) изотонический раствор NaCl;
г) стеклянные палочки.
Для исследования используют кровь, полученную непосредственно
из места укола пальца или взятую заранее в пробирку со
стабилизатором не более, чем за 2 суток до исследования. Кровь
хранят при 4-8° С.
Техника реакции.
На пластинке надписывают фамилию и инициалы лица, кровь
которого исследуется, и, сделав соответствующие обозначения,
наносят на нее слева 1 каплю реактива антирезус и справа - 1 каплю
контрольного реактива, затем добавляют и к реактиву антирезус, и к
контрольному реактиву по 1 капле густой взвеси исследуемой крови.
Кровь тщательно смешивают с реактивом и размазывают по
пластинке стеклянной палочкой тонким слоем. Затем пластинку
периодически покачивают в течение 3-4 минут и добавляют в обе
смеси для исключения неспецифической агглютинации по 5-8 капель
изотонического раствора NaCl.
Наблюдение за ходом реакции продолжают до истечения 5 минут,
после чего учитывают результат.
Трактовка результата.
Если слева, т.е. с реактивом антирезус, произошла
агглютинация эритроцитов, а справа (в контроле) ее нет - это
значит, что исследуемая кровь резус-положительная (Rh+).
Если в обеих каплях агглютинация отсутствует, это значит, что
исследуемая кровь резус-отрицательная (rh-).
Однако результат учитывают как истинный только при отсутствии
агглютинации в контроле.
При наличии агглютинации в контроле, что может произойти при
некоторых заболеваниях, например, за счет аутоантител, кровь
необходимо исследовать повторно другими методами, желательно в
лабораторных условиях.
3. Изготовление универсальной сыворотки антирезус анти-D
в сочетании с альбумином для определения резус-принадлежности
на плоскости без подогрева
Сыворотка антирезус содержит неполные антитела анти-D.
Выпускается в комплекте с контрольной сывороткой, не содержащей
резус-антител. Сыворотка предназначена для определения
резус-антигена D.
Материалом для изготовления сыворотки антирезус в сочетании с
альбумином служит сыворотка крови людей группы АВ(IV) или
специально приготовленная - универсальная с титром неполных
резус-антител анти-D не ниже 1:64 - 1:128 в непрямой пробе Кумбса.
Сыворотка должна быть предварительно исследована и признана
годной, как стандартная сыворотка антирезус в соответствии с
"Инструкцией по изготовлению стандартных сывороток и реагента
антирезус".
Материалом для изготовления контрольной сыворотки служит
сыворотка крови людей группы АВ(IV), т.е. не содержащая как
резус-антител, так и групповых агглютининов альфа и бета.
Контрольная сыворотка должна соответствовать требованиям,
предъявляемым к стандартным изогемагглютинирующим сывороткам
системы АВО.
При изготовлении сывороток антирезус в сочетании с альбумином
необходимы:
- альбумин 20-30% раствор, полученный из плазмы крови
человека;
- образцы резус-положительной и резус-отрицательной крови,
взятой на гепарине;
- гепарин;
- изотонический раствор NaCl.
Работу по изготовлению сыворотки начинают с подбора
оптимального соотношения сыворотки антирезус и альбумина. Подбор
можно вести двумя способами:
а) используя одну и ту же сыворотку антирезус, испытывая с ней
разные образцы (серии) альбумина, и выбирая таким образом образец
альбумина с высокой конглютинационной активностью;
б) используя один и тот же образец (серию) альбумина,
испытывая его с разными образцами сыворотки антирезус.
Выбор альбумина с высокой конглютинационной активностью.
Сыворотку антирезус с титром неполных антител 1:64 - 1:128
разводят в пробирках в 2-4 раза отдельно различными образцами
раствора альбумина.
Разные смеси сыворотки антирезус с альбумином исследуют на
пластинке с 5-6 образцами (Rh+) и с 5-6 образцами крови ccddee, а
также с кровью фенотипа Ccddee и ccddEe.
Сыворотку антирезус, смешанную с альбумином, переносят в 2
точки по 2 капли (0,1 мл) на пластинку, добавляют к ней по 1 капле
(0,05 мл) резус-положительной и резус-отрицательной крови. Капли
перемешивают и размазывают по пластинке до получения тонкого слоя.
Наблюдение ведут до истечения 5 минут при покачивании пластинки.
Учет и оценка результата.
Результат учитывают по скорости наступления и величине
агглютинатов резус-положительных эритроцитов и отсутствии
агглютинации с резус-отрицательными эритроцитами. На основании
этого отбирают образцы альбумина наиболее пригодные для
использования.
Для последующего использования применяют образцы альбумина,
при испытании которых агглютинация резус-положительных эритроцитов
появляется в течение первых 20-30 секунд, а неспецифическая
аггрегация резус-отрицательных эритроцитов отсутствует до
истечения 10 минут.
Подбор сыворотки антирезус с высокой конглютинационной
активностью в альбуминовой среде
Несколько различных образцов сыворотки антирезус наносят
отдельно в 2 точки по 1 капле (0,05 мл) на пластинку и добавляют к
ним по капле (0,05 мл) 20-30% альбумина.
Сыворотку тщательно смешивают с альбумином и добавляют к ней
по 1 капле (0,05 мл) резус-положительной и резус-отрицательной
крови. Капли перемешивают с эритроцитами на плоскости до получения
тонкого слоя. Наблюдение ведут до 5 минут при покачивании
пластинки.
Так поступают отдельно для каждого испытуемого образца
сыворотки, испытывая их с 5-6 образцами Rh+ крови и с 5-6
образцами ccddee, а также с кровью фенотипа Сcddee и ccddEe.
Учет и оценка результата.
Результат учитывают по скорости наступления агглютинации и ее
выраженности с резус-положительными эритроцитами и по отсутствию
с резус-отрицательными эритроцитами ccddee и эритроцитами генотипа
Ccddee и ccddEe.
Для последующего использования выбирают сыворотки антирезус
анти-D, при испытании которых четко выраженная агглютинация
резус-положительных эритроцитов наступает в течение первых 20-30
секунд, а неспецифическая агглютинация резус-отрицательных
эритроцитов и эритроцитов фенотипа Ccddee и ccddEe отсутствует до
истечения 10 минут.
Подбор оптимального соотношения сыворотки антирезус и
альбумина.
После выбора, альбумина с наиболее высокой конглютинирующей
способностью или, наоборот, выбора сыворотки антирезус с высокой
агглютинирующей активностью в альбуминовой среде, приступают к
подбору оптимального их соотношения, для чего:
в штатив устанавливают 5 пронумерованных пробирок;
в первую пробирку вносят 2 капли (0,1 мл) выбранной серии
альбумина, во вторую пробирку - 4 капли, в третью - 6, в четвертую
- 8 и в пятую - 10 капель;
в каждую пробирку добавляют по 2 капли (0,1 мл) сыворотки
антирезус и содержимое тщательно перемешивают;
из каждой пробирки переносят в 2 точки по 1 капле (0,05 мл) на
пластинку, образуя таким образом 2 ряда сыворотки с альбумином;
во все капли 1-го ряда вносят по 1 капле (0,05 мл) свежей
резус-положительной крови, во 2-ой ряд - резус-отрицательной крови
(кровь предварительно берут с гепарином - 1 капля на 10 мл крови).
Смесь перемешивают и ведут наблюдение в течение 3 минут при
покачивании пластинки.
Учет и оценка результатов.
Четкая агглютинация Rh+ эритроцитов и отсутствие агглютинации
rh- эритроцитов ccddee и эритроцитов фенотипа Ccddee и ccddEe
указывает на оптимальное соотношение данного образца сыворотки
антирезус и альбумина.
Приготовление основного объема (серии) сыворотки антирезус
анти-D в сочетании с альбумином
Для приготовления полного объема (серии) стандартной сыворотки
используют выбранные оптимальные соотношения сыворотки и
альбумина. И сыворотку и альбумин используют тех же серий, которые
применялись для установления оптимального их соотношения.
К изготовленному полному объему смеси сыворотки с альбумином
добавляют гепарин из расчета - 1 капля на 20 мл сыворотки.
Приготовленную таким образом сыворотку проверяют на пластинках
с 5-6 образцами резус-положительных эритроцитов и с 5-6 образцами
резус-отрицательных ccddee, а также с эритроцитами фенотипа Сcddee
и ccddEe.
При наличии четко выраженной агглютинации с
резус-положительной кровью, наступающей через 30-40 сек, и
отрицательной реакции с резус-отрицательной кровью ccddee и кровью
фенотипа Ccddee и ccddEe, сыворотку антирезус в сочетании с
альбумином считают пригодной в качестве стандартной сыворотки
анти-D для определения резус-принадлежности на плоскости без
подогрева.
Исследование проводят с одновременным параллельным
использованием контрольной сыворотки.
Изготовление контрольной сыворотки.
Для изготовления контрольной сыворотки используют
изогемагглютинирующую сыворотку группы АВ(IV) и добавляют к ней
альбумин того же образца (серии) и в том же количестве и в
соотношении, которые были использованы для приготовления данной
серии сыворотки антирезус.
Контрольную сыворотку испытывают аналогично тому, как описано
выше для сыворотки антирезус. Контрольная сыворотка не должна
вызывать агглютинацию эритроцитов.
Консервирование сыворотки.
Сыворотку антирезус и контрольную сыворотку консервируют
борной кислотой из расчета 2 г. на 100 мл сыворотки.
Розлив и паспортизация сыворотки антирезус и
контрольной сыворотки
Сыворотку антирезус разливают по 1-2 мл в ампулы, которые
запаивают, или во флаконы, которые плотно укупоривают резиновыми
пробками. На ампулы, флаконы наклеивают этикетки с указанием
учреждения, изготовившего сыворотку, специфичности сыворотки,
метода, для которого она предназначена, количества, номера серии
и срока годности.
Контрольную сыворотку разливают, в таких же объемах и в том же
количестве ампул (флаконов) и так же наклеивают этикетки. Номер
серии контрольной сыворотки повторяет номер серии основной
сыворотки антирезус.
Хранение, срок годности и контроль.
Сыворотки антирезус, изготовленные в сочетании с альбумином и
контрольные сыворотки хранят при 4-8° С.
Срок годности - 4 месяца.
По истечении срока годности, но при сохранении активности и
специфичности сывороток, срок годности может быть продлен еще на 1
месяц.
Выдача сыворотки антирезус.
Сыворотка антирезус выдается в комплекте с контрольной
сывороткой.
К каждому комплекту прилагают инструкцию по использованию.
--------------------------¬ --------------------------¬
¦ Наименование учреждения-¦ ¦ Наименование учреждения-¦
¦ изготовителя ¦ ¦ изготовителя ¦
+-------------------------+ +-------------------------+
¦ Сыворотка антирезус-D ¦ ¦ Контрольная сыворотка ¦
¦ для метода на плоскости ¦ ¦ для метода на плоскости ¦
¦ без подогрева ¦ ¦ без подогрева ¦
¦ Для всех групп крови ¦ ¦ Для всех групп крови ¦
¦ системы АВО ¦ ¦ системы АВО ¦
¦ Серия ______ мл ______ ¦ ¦ Серия ______ мл ______ ¦
¦ Годна до __________ ¦ ¦ Годна до __________ ¦
L-------------------------- L--------------------------
Формы этикеток для сыворотки антирезус и контрольной
сыворотки.
4. Изготовление реактива антирезус с использованием
сухого полиглюкина для определения резус принадлежности
на плоскости без подогрева
Реактив содержит неполные активные антитела антирезус анти-D,
представляет собой вязкий опалесцирующий мутноватый раствор. При
хранении может выпадать осадок. Выпускается в комплекте с
контрольным реактивом, не содержащим резус-антител.
Материалом для изготовления реактива антирезус служат нативные
сыворотки крови людей группы АВ(IV) или специально приготовленные
- универсальные с титром неполных резус-антител не ниже 1:64 -
1:128 в непрямой пробе Кумбса. Сыворотка должна быть
предварительно исследована и признана годной, как стандартная
сыворотка антирезус.
Материалом для изготовления контрольной сыворотки служит
сыворотка крови людей группы АВ(IV), т.е. не содержащая как
резус-антител, так и групповых антител альфа и бета. Контрольная
сыворотка должна соответствовать требованиям, предъявляемым к
стандартным изогемагглютинирующим сывороткам системы АВО.
При изготовлении реактива антирезус необходимы:
- полиглюкин, высушенный лиофильным способом;
- альбумин-2,5% раствор;
- изотонический раствор NaCl;
- образцы резус-положительной и резус-отрицательной крови.
Примечания:
1. Полиглюкин высушивают лиофильным способом на сублимационном
аппарате по регламенту, установленному для сушки плазмы. Сушку
ведут во флаконах емкостью 250-500 мл.
2. 2,5% раствор альбумина получают из готового 10%-20%
раствора альбумина путем разведения его изотоническим раствором
NaCl.
Изготовление реактива антирезус.
Сыворотку, содержащую антитела анти-D с титром не ниже чем
1:64 - 1:128<*> переносят во флакон с предварительно высушенным
полиглюкином в объеме, равном количеству жидкого полиглюкина,
высушенного в данном флаконе. В результате конечная концентрация
полиглюкина составит 6%.
---------------------------------
<*> - Примечание: сыворотку антирезус с более высоким титром
можно развести до этого значения сывороткой группы АВ(IV),
стандартным разводителем или 2,5% раствором альбумина в
изотоническом растворе NaCl.
Содержимое флакона тщательно перемешивают путем встряхивания
до полного растворения порошка полиглюкина.
Изготовление контрольного реактива.
Для изготовления контрольного реактива в другой такой же
флакон с высушенным полиглюкином той же серии добавляют
стандартный разводитель или 2,5% раствор альбумина так же до
исходного объема полиглюкина. Содержимое тщательно перемешивают до
полного растворения порошка полиглюкина.
Исследование качества изготовленных реактивов.
Исследование реактивов производят непосредственно после их
изготовления с резус-положительными и резус-отрицательными
эритроцитами и оценивают по характеру агглютинации и специфичности
реакции:
на пластинку помещают два ряда, слева - по две капли (0,1 мл)
реактива антирезус и справа - по две капли (0,1 мл) контрольного
реактива;
в первый ряд добавляют по одной капле (0,05 мл)
резус-положительных эритроцитов, во второй ряд также по одной
капле резус-отрицательных эритроцитов. Содержимое капель
перемешивают, затем размазывают до получения тонкого слоя и
оставляют на три минуты периодически покачивая пластинку;
через три минуты во все капли добавляют по 5-6 капель
изотонического раствора NaCl, перемешивают и через две минуты
учитывают результат.
Реактивы исследуют не менее чем с 20 образцами
резус-положительных и с 30 образцами резус-отрицательных
эритроцитов групп А(II), АВ(IV) и В(III), включая эритроциты
Ccddee и ссddEe.
Учет и оценка результатов.
Результат учитывают по скорости наступления агглютинации и ее
выраженности с резус-положительными эритроцитами и отсутствием ее
с резус-отрицательными эритроцитами (ccddee) и эритроцитами
фенотипа Ccddee и rccddEe.
Показателем пригодности реактива для последующего
использования является наличие крупнозернистой агглютинации
резус-положительных эритроцитов со скоростью наступления до 1
минуты и отсутствие ее с резус-отрицательными эритроцитами
(ccddee) и эритроцитами фенотипа CcddEe и ссddEe.
Контрольный реагент исследуется так же как описано выше для
реагента антирезус. Агглютинация с контрольным реагентом должна
отсутствовать со всеми образцами эритроцитов.
Консервирование реактивов.
Реактив антирезус и контрольный реактив консервируют борной
кислотой из расчета 2 г. на 100 мл реагента.
Розлив и паспортизация.
Реагент антирезус разливают во флаконы или ампулы. Ампулы
запаивают, флаконы плотно укупоривают резиновыми пробками и
завальцовывают или парафинируют.
На ампулы, флаконы наклеивают этикетки с указанием учреждения,
изготовившего реактив, специфичности реактива, метода для которого
он предназначен, количества,номера серии и срока годности.
Контрольный реактив разливают в таких же объемах и в том же
количестве ампул (флаконов), и также наклеивают этикетки с
соответствующим текстом. Номер серии контрольного реактива
повторяет номер серии основного реактива антирезус.
--------------------------¬ --------------------------¬
¦ Наименование учреждения-¦ ¦ Наименование учреждения-¦
¦ изготовителя ¦ ¦ изготовителя ¦
+-------------------------+ +-------------------------+
¦ Реактив антирезус-D ¦ ¦ Контрольный реактив ¦
|
