|
Стр. 7
температуре, затем на водяную баню при температуре 40-45°С для
растворения. С помощью 10% раствора натрия двууглекислого
устанавливают рН 7,0. Стерилизуют при 0,5 атм. 20 мин.
Ход исследования. Исследуемую культуру петлей засевают уколом
в столбик питательной желатины. Инкубируют при температуре 22°С в
течение 30 дней с ежедневным наблюдением за ростом и наличием
эффекта разжижения.
3. ОБЩИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Окраска препаратов
Окраска метиленовым синим
Реактивы. 1% раствор метиленового синего (1 г метиленового
синего растворяют в 100 мл холодной дистиллированной воды,
фильтруют через бумажный фильтр).
Ход исследования. Материал наносят на чистые обезжиренные
предметные стекла, растирают его тонким равномерным слоем по
поверхности стекла, или на обезжиренное стекло наносят каплю воды,
в которой суспендируют культуру. Препарат высушивают на воздухе и
фиксируют погружением на 3 мин. в 96% этиловый спирт.
Фиксированный препарат высушивают, затем наносят 1% раствор
метиленового синего на 1-10 мин. (в зависимости от материала).
Тщательно смывают оставшийся краситель струей холодной воды,
высушивают. Смотрят с иммерсией: объектив х90 иммерсионный, окуляр
х7 или х10.
Оценка результатов. Препарат синего цвета. Ядра клеток
окрашены в синий цвет, протоплазма - в голубой цвет разной
интенсивности. Бактериальная флора прокрашивается в синий цвет
разной интенсивности.
Окраска по Граму
Принцип. В зависимости от химической структуры бактерии
обладают способностью удерживать краситель кристаллический
фиолетовый или обесцвечиваться в спирте.
Реактивы.
1. Карболовый раствор кристаллического фиолетового. Растирают
в ступке 1 г кристаллического фиолетового с 2 г фенола (карболовой
кислоты) до кашицеобразной консистенции, прибавляют небольшими
порциями 10 мл спирта и окончательно разводят 100 мл
дистиллированной воды, сливают во флаконы, оставляют на сутки,
затем фильтруют.
2. Раствор Люголя: йодистого калия 2 г растворяют в 300 мл
дистиллированной воды, в полученном растворе растворяют 1 г
кристаллического йода, фильтруют через бумажный фильтр.
3. Разведенный фуксин Циля. Растирают в ступке 1 г фуксина,
прибавляют, растирая, 5 г фенола (карболовой кислоты) и 10 мл
спирта 96%, затем при постоянном помешивании небольшими порциями
доливают 100 мл дистиллированной воды. Раствор краски фильтруют
через влажный бумажный фильтр. Фуксин Циля очень стойкий и может
храниться долгое время во флаконе темного стекла с притертой
пробкой. К 1 мл фуксина Циля добавляют 9 мл дистиллированной воды.
Раствор очень нестойкий, поэтому его готовят непосредственно перед
употреблением в необходимых количествах.
Ход исследования. На обезжиренное стекло наносят каплю воды, в
которой суспендируют культуру. Препарат высушивают и фиксируют над
пламенем горелки. На фиксированный мазок накладывают кусочек
фильтровальной бумаги и на нее наливают карболовый раствор
кристаллического фиолетового на 1/2-1 мин. Сливают краситель и, не
смывая, наливают раствор Люголя на ў 1 мин. до почернения мазка.
Сливают раствор Люголя и прополаскивают препарат в спирте 96% в
течение 1/2-1 мин., пока не перестанут стекать фиолетовые струйки
красителя. Затем препарат промывают струей водопроводной воды и
дополнительно докрашивают в течение 1/2-1 мин. водным раствором
фуксина Циля. Краситель сливают, препарат промывают и высушивают.
Микроскопируют с иммерсией: объектив х90 иммерсионный, окуляр
х7 или х10. Грамположительные микробы окрашиваются в
сине-фиолетовый цвет, грамотрицательные - в розовый и красный.
При правильной окраске препарат оранжево-красного цвета на
тонких участках, лилово-фиолетового на толстых. Высокое качество
окраски обеспечивается своевременным прекращением обесцвечивания
мазков. При недообесцвечивании мазков грамотрицательные бактерии
могут сохранять фиолетовую окраску, а в переобесцвеченных мазках
грамположительные микробы могут быть окрашены в оранжево-красный
цвет.
Окраска по Цилю-Нильсену
Принцип. Метод основан на способности микобактерий туберкулеза
после окрашивания их фуксином удерживать краситель даже после
длительного обесцвечивания в серной кислоте.
Реактивы.
1. 1% раствор основного фуксина. 1 г основного фуксина
растирают с 2-3 каплями глицерина, добавляют по капле 10 мл 96%
этилового спирта и 90 мл 5% раствора фенола. Раствор оставляют на
сутки, затем фильтруют через бумажный фильтр. Хранят в темном
месте при комнатной температуре в хорошо закрытой посуде.
2. 5% раствор фенола (карболовой кислоты).
3. 20% серная кислота.
4. Этиловый спирт 96%.
5. Соляная кислота, концентрированная.
6. 0,025% раствор метиленового синего, 0,25 г метиленового
синего на 1 л дистиллированной воды.
7. 3% солянокислый спирт. 3 мл концентрированной соляной
кислоты доводят до 100 мл этиловым спиртом.
8. Глицерин.
Ход исследования. Материал готовят путем растирания его между
двумя стеклами или на обезжиренное стекло наносят осадок
исследуемого материала. Препарат высушивают и фиксируют над
пламенем горелки.
Окрашивание мазка. На фиксированный препарат накладывают
полоску фильтровальной бумаги размером немного меньше предметного
стекла, но так, чтобы она закрывала мазок полностью. Наливают на
нее раствор карболового фуксина, и нагревают препарат над пламенем
горелки до появления паров. Остудив препарат, снимают пинцетом
бумажку и смывают остатки краски водой. Мазок обесцвечивают в 20%
серной кислоте или в 3% солянокислом спирте до слегка
розовато-сероватого цвета и тщательно промывают водой.
Обесцвеченный мазок подкрашивают в течение 30 секунд 0,025%
раствором метиленового синего. Микроскопируют с иммерсией.
Микобактерии туберкулеза окрашиваются в красный цвет, а другие
микробы и клеточные элементы - в голубой.
Окраска по Романовскому
Принцип. Окраска позволяет выявить ядерные элементы и
волютиновые гранулы бактериальной клетки за счет сродства к
основным краскам.
Реактивы.
1. Краситель Гимзы (готовый реактив).
2. Метиловый спирт или смесь Никифорова (смесь равных объемов
этилового спирта и эфира этилового).
3. Дистиллированная вода, рН 7,2.
Ход исследования. Препарат фиксируют метиловым спиртом (смесью
Никифорова) 5 мин. Высушивают на воздухе и окрашивают рабочим
раствором красителя Гимзы (2 капли на 1 мл дистиллированной воды,
имеющей рН 7,2), 20 мин. Промывают дистиллированной водой и после
просушивания микроскопируют.
При микроскопировании ядерные элементы имеют красно-фиолетовый
цвет, цитоплазма - слабо-розовый. В более молодых культурах
цитоплазма окрашивается в сине-фиолетовый цвет. У бактерийных
палочек ядра окрашены в темный красно-фиолетовый цвет, волютин - в
вишнево-красный.
3.2. КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ
(питательные среды)
Питательные среды, выпускаемые промышленностью
Питательный агар - изготовитель
Дагестанский
НИИПС (гор.
Махачкала)
Питательный бульон - >> -
Агар Эндо - >> -
Агар с эозин-метиленовым синим (ЭМС-агар) - >> -
Бакто-агар Плоскирева - >> -
Висмут-сульфит агар - >> -
Среда с индикатором ВР и одним из углеводов - >> -
(глюкозой, лактозой, мальтозой, сахарозой
или маннитом)
Тиамин-цистин глутаминовый агар - >> -
Среда для определения чувствительности - >> -
к антибиотикам (АГВ)
Агар цитратный Кристенсена - >> -
Агар цитратный Симмонса - >> -
Среда Рессаля - >> -
Агар ацетатный - изготовитель
МНИИВС им.
Мечникова
(гор. Петро-
во-Дальнее).
Агар элективный солевой для стафилококков - >> -
"Среда для контроля стерильности" - >> -
Среда Клиглера - >> -
Питательные среды, приготовляемые
в бактериологических лабораториях
Кровяной агар. Приготовление среды. В качестве основы
используют сухой питательный агар. По прописи, указанной на
этикетке, готовят 2% агар, рН 7,4-7,6. К расплавленному и
охлажденному до 45°С агару, соблюдая правила асептики, добавляют
5% (5 мл крови на 100 мл питательной среды) дефибринированной
бараньей, лошадиной или кроличьей крови, цитратной или
дефибринированной крови человека без антибактериальных препаратов.
Смесь тщательно перемешивают, чтобы не образовалось пены,
и разливают в стерильные чашки Петри, предварительно подогретые в
термостате, слоем 3-4 мм. Слой агара должен быть равномерно
окрашен в красный цвет. Хранят не более двух недель в целлофановых
мешках при 4°-6°С.
Агар с гретой кровью (шоколадный агар)
Принцип. Прогревание крови способствует освобождению из
эритроцитов факторов роста X (гемин) и V
(никотинамидадениндинуклеотид), необходимых для культивирования
гемофилов.
Приготовление. 1. К 100 мл расплавленного и охлажденного до
80°С питательного агара, рН 7,4, добавляют 10 мл дефибринированной
крови лошади или человека (без консервантов), тщательно
перемешивают, после чего помещают в водяную баню и, постоянно
встряхивая, держат при температуре 70°С-80°С до тех пор, пока цвет
агара не станет шоколадным (25-30 мин.).
2. 5 мл дефибринированной крови кролика и 100 мл питательного
агара тщательно взбалтывают и ставят на 2-3 минуты в водяную баню
при 80°С. Затем добавляют еще 5 мл крови и вновь ставят в водяную
баню на 2-3 минуты. При приготовлении шоколадного агара следует
обратить внимание на правильный прогрев, при слишком слабом
прогреве агар будет иметь коричнево-красный цвет, при слишком
сильном - темно-коричневый. Шоколадный агар должен иметь
светло-коричневую окраску. Среду разливают в чашки Петри. Хранят
не более двух недель в целлофановых мешках при 4°-6°С.
Сахарный бульон
Приготовление среды. К 100 мл питательного бульона, рН
7,2-7,4, прибавляют 1 г глюкозы. Стерилизуют текучим паром 3 дня
подряд по 30 минут или при 0,5 атм. 30 минут.
Сывороточный бульон
Приготовление среды. К 80 мл стерильного питательного бульона,
рН 7,2-7,4, стерильно добавляют 20 мл лошадиной или бычьей
сыворотки. Среду разливают в пробирки по 5 мл, выдерживают 2 суток
в термостате для контроля стерильности, а затем хранят в
холодильнике.
Сывороточный агар
Приготовление среды. В качестве основы используют 1,5% агар,
рН 7,4, тиамин-цистин-глутаминовый; для коринебактерий -
питательный агар, рН 7,6. К 90 мл расплавленного и остуженного до
температуры 50°С агара добавляют 10 мл инактивированной при
температуре 56°С в течение 30 минут сыворотки, консервированной
хлороформом, или без консерванта. После перемешивания среду
разливают в чашки. Среда годна к употреблению только в течение 48
часов при хранении ее в холодильнике. Перед посевом чашки,
хранившиеся в холодильнике, должны быть подогреты до температуры
37°С.
Среда Тароцци
Приготовление среды. Нежирное мясо или печень (можно плаценту)
нарезают мелкими кусочками и заливают трехкратным количеством
питательного бульона, рН 7,4-7,6. Кипятят 30 минут. Затем бульон
фильтруют, а кусочки мяса или печени промывают на сите
водопроводной водой и просушивают фильтровальной бумагой.
Распределяют во флаконы по 15-20 г (8-10 кусочков) и в пробирки по
2-3 кусочка печени или мяса и заливают по 300 мл бульона во
флаконы и по 5-6 мл в пробирки. Стерилизуют 30 мин. при 1 атм.
Желточно-солевой агар
Приготовление среды. В качестве основы используют элективный
солевой агар для стафилококков. По прописи, указанной на этикетке,
готовят 1,8-2% агар, рН 7,2-7,4. К расплавленному и охлажденному
до 45°-50°С агару, соблюдая правила асептики, добавляют 20%
желточной взвеси (асептически извлеченный из яйца желток
взбалтывают с 200 мл изотонического раствора хлорида натрия).
Смешивают тщательно агар с желточной взвесью, разливают по 20 мл в
чашки Петри. Хранят в холодильнике в течение двух недель.
Среда Хью-Лейфсона
Принцип. Среда позволяет уловить изменения рН даже при слабом
окислении углеводов, что достигается заменой аминокислот
питательной среды пептоном. В этой среде отсутствуют щелочные
продукты расщепления аминокислот, которые могут нейтрализовать
кислые продукты при утилизации углеводов.
Ингредиенты
Пептон - 2,0 г
Натрий хлористый - 5,0 г
Калий фосфорнокислый двузамещенный (К2НРО4) - 0,3 г
Глюкоза - 10,0 г
Агар - 3,0 г
Бромтимоловый синий - 0,03 г
Дистиллированная вода - 1000,0 мл
Приготовление среды. К воде прибавляют пептон, натрий
хлористый и агар. Смесь подогревают до расплавления агара. Затем
добавляют калий фосфорнокислый двузамещенный и глюкозу. Продолжают
кипятить 2-3 минуты. Смесь подщелачивают 20% раствором едкого
натра до рН 7,4-7,5, доводят объем среды до первоначального и
добавляют 3 мл 1% водного раствора бромтимолового синего. Среду
фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают по 10-15 мл в
стерильные пробирки. Стерилизуют при 0,5 атм. 20 минут. Цвет среды
до стерилизации - синий, после автоклавирования -
травянисто-зеленый, рН 7,1-7,2. При кислом рН среда желтеет.
Среда Сабуро
Приготовление. На 1 л дистиллированной воды 10,0 г пептона,
18,0 г агар-агара. Нагревают до расплавления агара, добавляют 40,0
г глюкозы, рН 5,8, стерилизуют при 0,5 атм. (116°С) 30 минут.
Селенитовый бульон
Среда обогащения - для накопления сальмонелл и шигелл.
Ингредиенты
Натрий селенистокислый кислый (NаНSеО3) - 4 г
Пептон (чешский "Спофа" или венгерский "Рихтер") - 5 г
Натрий фосфорнокислый двузамещенный (Na2НРО4) - 7 г
Натрий фосфорнокислый однозамещенный (NаН2РО4) - 3 г
Лактоза - 4 г
Приготовление. 1. Основной питательный раствор включает
пептона - 5 г, натрия фосфорнокислого двузамещенного - 7 г,
натрия фосфорнокислого однозамещенного - 3 г, лактозы - 4 г,
дистиллированной воды - 1000 мл, рН раствора 6,9-7,1. Стерилизуют
текучим паром два дня подряд по 30 мин. Срок хранения при 4-6°С в
течение 1-2 месяцев.
2. 10% раствор кислого селенистокислого натрия готовят на
стерильной дистиллированной воде extempore. Раствор селенита
стерилизации не подлежит.
Для получения готовой среды (extempore) 2 мл 10% раствора
кислого селенистокислого натрия добавляют к 50 мл основного
раствора. Приготовленную среду по 5 мл асептически разливают в
стерильные пробирки с хорошо подогнанными пробками. Стерилизацию
готовой среды не производят.
3.3. БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Готовые наборы, выпускаемые промышленностью
1. Системы индикаторные бумажные (СИБ) для ускоренной
идентификации вибрионов. (12 наименований: глюкоза, лактоза,
сахароза, арабиноза, маннит, инозит, лизин, орнитин, аргинин,
оксидаза, уреаза, индол). Набор N 50 и 100.
2. Системы индикаторные бумажные (СИБ) для межродовой
дифференциации энтеробактерий (9 наименований: лактоза,
бета-галактозидаза, цитрат натрия, индол, мочевина, фенил-аланин,
сероводород, лизин, малонат натрия). Набор N 50 и 100.
3. Системы индикаторные бумажные (СИБ) для полной
идентификации энтеробактерий до вида (25 наименований: глюкоза,
лактоза, сахароза, арабиноза, маннит, инозит, рамноза, ксилоза,
мальтоза, сорбит, адонит, салицин, дульцит, индол, уреаза,
оксидаза, бета-галактозидаза, лизин, орнитин, сероводород,
фенил-аланин, утилизация малоната натрия, цитрата натрия,
желатиназа). Набор N 25 и 100.
Тест на каталазу
Принцип. Метод основан на способности микроорганизмов, имеющих
фермент каталазу, расщеплять перекись водорода, образуя воду и
газообразный кислород.
Реактивы. 3-10% раствор перекиси водорода.
Ход исследования. На предметное стекло наносят каплю 10%
перекиси водорода, в нее вносят стеклянной палочкой культуру и
растирают круговыми движениями. При положительной реакции
происходит пенообразование.
Цитохромоксидазный тест
Принцип. Метод основан на способности микроорганизмов,
образующих фермент цитохромоксидазу, изменять цвет реактива из
бесцветного в синий.
Реактивы.
1. 1% водный раствор диметил-пара-фенилендиамин гидрохлорид.
2. 1% спиртовой раствор альфа-нафтола.
Ход исследования. Приготовить смесь, состоящую из 3-х частей
1% водного раствора диметил-пара-фенилендиамина гидрохлорида и 2-х
частей 1% спиртового раствора альфа-нафтола.
Приготовленную смесь нанести каплями на выросшие на чашке
колонии. Микроорганизмы, образующие фермент цитохромоксидазу, в
течение 20-30 секунд окрашиваются в темно-синий цвет.
Суточную агаровую культуру наносят в виде штриха платиновой
петлей или стеклянной палочкой на диски или полоски фильтровальной
бумаги (длиной 3 мм), пропитанные указанным реактивом. При
положительной реакции появляется синее окрашивание в течение 30
секунд.
Начальник
Главного управления
лечебно-профилактической помощи
А.М.МОСКВИЧЕВ
Приложение N 2
к приказу Министерства
здравоохранения СССР
от 22 апреля 1985 г. N 535
ЗАДАНИЕ
НА РАЗРАБОТКУ СУХИХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД, ТЕСТ-НАБОРОВ,
АГГЛЮТИНИРУЮЩИХ СЫВОРОТОК ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ,
ВЫЗВАННЫХ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫМИ МИКРООРГАНИЗМАМИ
1. Питательные среды.
1.1. Селективный агар для выделения условно-патогенных
возбудителей раневой инфекции.
1.2. Селективная среда для выделения пневмококков.
1.3. Селективная среда для выделения стрептококков.
1.4. Селективная среда для выделения синегнойной палочки.
1.5. Расширенный набор сухих питательных сред для
идентификации энтеробактерий.
1.5.1. Малонат агар.
1.5.2. Фенилаланин агар.
1.5.3. Среда Кларка.
1.6. Сухая среда для выделения гемокультур и культивирования
стрептококков.
1.7. Среда для выделения и культивирования анаэробов
(клостридий).
1.8. Среда для выделения неспорообразующих анаэробов
(бактероидов).
2. Тест-системы идентификации по типу систем индикаторных
бумажных (СИБ).
2.1. Семейство стрептококковых (Streptococcaceae).
2.2. Неферментирующие бактерии.
3. Диагностические сыворотки.
3.1. Агглютинирующие сыворотки.
3.1.1. Для идентификации бактерий рода гемофилус
(Haemophilus).
3.1.2. Для идентификации бактерий рода клебсиелла
(Klebsiella).
3.1.3. Для идентификации бактерий рода провиденция
(Providenciae).
3.1.4. Для идентификации бактерий рода стрептококков
S. pneumoniae.
3.2. Преципитирующие сыворотки.
3.2.1. Сыворотки стафилококковые энтеротоксические.
Начальник
Главного управления
по производству бактерийных
и вирусных препаратов
Г.А.ХЛЯБИЧ
Начальник
Главного управления
лечебно-профилактической помощи
А.М.МОСКВИЧЕВ
|
