|
Стр. 5
пробками. Перед употреблением 1 и 2 растворы смешивают в равных
объемах.
Ход исследования. Перед посевом в среду добавляют 20%
инактивированной сыворотки. Посевы выдерживают в термостате при
37°С до 5-7 дней.
После инкубации в каждую пробирку с культурой вносят реактив
Грисса по 0,1 мл.
Оценка результатов. Появление красного окрашивания через 30
секунд после добавления реактива Грисса свидетельствует о редукции
нитратов до нитритов - реакция положительная. Отсутствие
окрашивания свидетельствует о том, что реакция отрицательная или
произошло восстановление до последующих продуктов. Поэтому при
отсутствии окрашивания в пробирку добавляют на кончике скальпеля
порошок металлического цинка и результат оценивают: окраска не
проявляется - нитраты в среде отсутствуют, т.к. редуцированы
бактериями до нитритов и далее - до последующих продуктов
восстановления (реакция положительная); появляется красное
окрашивание - нитраты в среде редуцированы до нитритов, но не
бактериями, а цинком (реакция отрицательная).
2. Определение редукции нитритов
Принцип. Метод основан на способности микроорганизмов
восстанавливать соли азотной кислоты (нитриты) до аммиака,
гидроксиламина, окиси азота, двуокиси азота, молекулярного азота.
Ингредиенты:
бактопептон,
калий азотистокислый (KNO2),
сульфаниловая кислота,
альфа-нафтиламин,
уксусная кислота - 5 моль/л.
Приготовление нитритного бульона. Берут калий азотистокислый
(KNO2) - 0,2 г, добавляют бактопептона - 5,0 г, воды
дистиллированной - до 1000 мл, рН 7,4. Нитритный бульон разливают
в химически чистые пробирки с поплавками по 5 мл. Автоклавируют
при 0,5 атм. (115°С) в течение 20 минут.
Приготовление реактива Грисса (см. определение редукции
нитратов).
Ход исследования. Перед посевом в среду добавляют 20%
инактивированной сыворотки. Посевы выдерживают в термостате при
37°С в течение 5-7 дней. После инкубации в каждую пробирку с
культурой вносят реактив Грисса (по 0,1 мл смеси равных объемов
реактивов 1 и 2, которые смешивают непосредственно перед
употреблением).
Оценка результатов. Красное окрашивание - реакция
отрицательная; отсутствие красного окрашивания указывает на
восстановление нитритов - реакция положительная; наличие газа в
поплавке при отсутствии окрашивания, редукция нитритов до
газообразных компонентов - реакция слабоположительная.
3. Определение желатиназы (см. раздел 2.5.)
2.4. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ
МИКРОБОВ РОДА ГЕМОФИЛУС (Haemophilus)
Род гемофилус (Haemophilus) по международной классификации
бактерий (Берги, 1980) охватывает двадцать разнообразных видов
мелких неподвижных не образующих спор грамотрицательных палочек.
Наибольший удельный вес среди заболеваний человека, вызываемых
гемофилами, принадлежит палочке инфлюэнцы (Haemophilus
influenzae). Этот микроб, как потенциальный возбудитель,
выделяется от больных при острых, реже хронических, заболеваниях
верхних и нижних дыхательных путей (ринитах, синуситах,
фарингитах, трахеитах, эпиглосситах, бронхитах, пневмониях,
абсцессах, эмпиемах), гнойных менингитах, эндокардитах, сепсисе,
воспалениях суставов. H. aphrophilus выделяется при подострых
эндокардитах человека; H. aegyptius является причиной тяжелых
остро протекающих конъюнктивитов; H. parainfluenzae, H.
haemolyticus, H. parahaemolyticus - нормальные обитатели
респираторного тракта человека, но при определенных условиях
первые два вида могут вызывать эндокардиты, а после вирусных
инфекций - вторичные острые заболевания ротовой полости, глотки,
трахеи и бронхов. H. ducreyi вызывает мягкий шанкр - венерическое
заболевание с четко выраженной клинической картиной. Для
диагностики мягкого шанкра применяют в основном микроскопическое
исследование содержимого язвы. H. ducreyi - грамотрицательная
палочка с характерным расположением в мазках - в виде длинных
параллельных цепочек. Форма палочек напоминает восьмерку, челнок;
иногда наблюдается полиморфизм. Бактериологическое исследование
при мягком шанкре применяют очень редко, процент положительных
результатов невысок, биологические свойства микроба изучены
недостаточно.
Микробы рода гемофилов, особенно Н. influenzae, чаще являются
причиной заболеваний детей раннего и лиц пожилого возраста,
вторичных бактерийных инфекций у больных, ослабленных хроническими
соматическими, онкологическими заболеваниями.
При культивировании на искусственных питательных средах
гемофилы нуждаются в факторах X и V, источником которых является
свежая кровь человека и животных. По потребностям в указанных
факторах при росте на искусственных питательных средах различные
представители гемофилов дифференцируются внутри рода (см. табл.
9). Фактор крови Х - гемин, активизирует пероксидазы, чем
стимулирует рост гемофильных бактерий. Фактор крови V -
никотинамидадениндинуклеотид восстановленный (НАDН) содержится
преимущественно в эритроцитах, являясь составной частью витаминов
группы В, принимает участие в окислительно-восстановительных
процессах при росте клеток.
Наиболее физиологичными средами для гемофилов являются среды с
гретой кровью ("шоколадный" агар). Более пышный рост гемофилов на
средах с гретой кровью объясняется тем, что нагревание крови
способствует освобождению из эритроцитов факторов роста и
разрушению присутствующих в ней ингибиторов V фактора.
Ход микробиологического исследования
Первый день.
Выделение гемофильных микробов из материалов от больных и их
идентификацию следует проводить по этапам.
Бактериоскопический метод: мазки из исследуемого материала или
культуру, окрашенные по Граму, просматривают под микроскопом с
иммерсией. Обнаружение в мазках мелких палочек равномерно
окрашенных в бледно-красный цвет позволяет заподозрить наличие в
исследуемом материале гемофилов.
Культуральный метод: исследуемый материал засевают
бактериологической петлей на чашку с кровяным или шоколадным
агаром. Кровь, посеянную на жидкие питательные среды,
термостатируют при 37°С в атмосфере с 5%-10% СО2 полученной в
эксикаторе с зажженной свечой.
Второй день.
На агаре с нативной кровью (5%-10%) гемофилы растут в виде
чрезвычайно мелких полупрозрачных колоний (диаметр 0,5 мм и
менее), не имеющих характерных особенностей, их трудно
дифференцировать от колоний других видов бактерий.
На шоколадном агаре гемофилы растут в виде полупрозрачных,
сероватых, нежных, сочных колоний диаметром от 1 до 2 мм; в
зависимости от состояний популяции могут формировать три вида
колоний: крупные, круглые слизистые колонии (М-форма); круглые,
полупрозрачные голубоватые колонии размером до 1 мм (S-формы);
очень мелкие, менее 1 мм в диаметре, непрозрачные колонии
(R-форма). В мазках из М- и S-колоний, окрашенных по Граму, видны
мелкие грамотрицательные палочки; для R-форм характерен
полиморфизм, встречаются и нитевидные формы. При окраске тушью по
Гинсу у М- и S-форм вокруг клеток видна капсула, хорошо выраженная
у М-форм и небольшая у S-форм. При росте на шоколадном агаре
культура Н. influenzae обладает "мышиным" запахом, что является
одним из характерных признаков этой группы микробов.
Для накопления биомассы, необходимой при идентификации культур
по биохимическим тестам, после микроскопирования подозрительные
колонии отсевают штрихом в пробирки на шоколадный агар.
Одновременно проводят повторный высев подозрительных колоний
на питательный агар без крови и дрожжевых добавок. Посевы помещают
в термостат при 37°С на 18-24 часа.
Отсутствие роста культуры на питательном агаре без крови и
обнаружение в мазках из колоний, выросших на шоколадном агаре,
мелких грамотрицательных палочек с капсулой или без нее, является
первым этапом подтверждения выделения одного из видов гемофильных
микробов.
При росте на шоколадном агаре большого числа однотипных
колоний культуру можно изучить на наличие ферментов каталазы,
оксидазы, уреазы, бета-галактозидазы, образование индола, редукции
нитратов (таблица 9), определяют чувствительность к антибиотикам.
Таблица 9
Биохимические свойства видов рода Haemophilus
--------------T-----T------T-----T--------T------T------T------T-----T----T----¬
¦ ¦Фак- ¦Ката- ¦Окси-¦бета- ¦Уреаза¦Редук-¦Индол ¦Гемо-¦Глю-¦Лак-¦
¦ Виды ¦торы ¦лаза ¦даза ¦галакто-¦ ¦ция ¦ ¦лиз ¦коза¦тоза¦
¦ ¦роста¦ ¦ ¦зидаза ¦ ¦нитра-¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦тов ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-------------+-----+------+-----+--------+------+------+------+-----+----+----+
¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦ 7 ¦ 8 ¦ 9 ¦ 10 ¦ 11 ¦
+-------------+-----+------+-----+--------+------+------+------+-----+----+----+
¦Н. influenzae¦ XV ¦ ++ ¦ - ¦ - ¦ + ¦ + ¦+- <*>¦ - ¦ + ¦ - ¦
+-------------+-----+------+-----+--------+------+------+------+-----+----+----+
¦H. aegyptius ¦ XV ¦ + ¦ - ¦ + ¦ + ¦ + ¦ - ¦ - ¦ + ¦ - ¦
+-------------+-----+------+-----+--------+------+------+------+-----+----+----+
¦Н. parainflu-¦ V ¦ + ¦ - ¦ + ¦ - ¦ + ¦ - ¦ - ¦ + ¦ - ¦
¦ enzae ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-------------+-----+------+-----+--------+------+------+------+-----+----+----+
¦Н. haemolyti-¦ XV ¦ + ¦ - ¦ + ¦ - ¦ + ¦ - ¦ + ¦ + ¦ + ¦
¦ us ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-------------+-----+------+-----+--------+------+------+------+-----+----+----+
¦H. aphrophi- ¦ Х ¦+ <**>¦ - ¦ + ¦ - ¦ + ¦ - ¦ - ¦ + ¦ + ¦
¦ lus ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-------------+-----+------+-----+--------+------+------+------+-----+----+----+
¦H. ducreyi ¦ Х ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ + ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦
L-------------+-----+------+-----+--------+------+------+------+-----+----+-----
--------------------------------
<*> - Положительная реакция у капсульных штаммов.
<**> - Положительная реакция слабая.
Эти тесты позволяют подтвердить выделение гемофилов и дать
ориентировочный ответ о выделении Н. influenzae уже через 24 часа
после получения материала для бактериологического исследования.
Третий день. Из культур, выросших на шоколадном агаре, готовят
мазки и окрашивают по Граму и Гинсу. Культуру идентифицируют до
вида по тестам (см. табл. 9 и 10).
В ряде случаев при исследовании спинномозговой жидкости,
крови, особенно при отсутствии четких результатов при
бактериоскопии, культуру гемофилов необходимо отдифференцировать
от менингококков, нейссерий, пневмококков и др. (см. табл. 10).
Таблица 10
Основные дифференцирующие признаки Н. influenzae
от некоторых других микробов, возбудителей
бактериальных инфекций человека одной локализации
----------------T--------------T-------------------T-----T-----T--------T------¬
¦ Вид, род ¦Рост на агаре ¦ Морфология клеток ¦Ката-¦Окси-¦бета- ¦Уреаза¦
¦ +-----T--------+(окраска по Граму) ¦лаза ¦даза ¦галакто-¦ ¦
¦ ¦ без ¦с гретой¦ ¦ ¦ ¦зидаза ¦ ¦
¦ ¦крови¦кровью ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+---------------+-----+--------+-------------------+-----+-----+--------+------+
¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦ 7 ¦ 8 ¦
+---------------+-----+--------+-------------------+-----+-----+--------+------+
¦Н. influenzae ¦ - ¦ + <*> ¦Грамотрицательные ¦ + ¦ - ¦ - ¦ + ¦
¦ ¦ ¦ ¦мелкие палочки ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+---------------+-----+--------+-------------------+-----+-----+--------+------+
¦N. meningitidis¦ - ¦ + ¦Грамотрицательные ¦ + ¦ + ¦ - ¦ - ¦
¦ ¦ ¦ ¦бобовидные диплоко-¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦ ¦ ¦кокки ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+---------------+-----+--------+-------------------+-----+-----+--------+------+
¦Neisseria sp. ¦ + ¦ + ¦Грамотрицательные ¦ + ¦ + ¦ - ¦ - ¦
¦ ¦ ¦ ¦крупные кокки ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+---------------+-----+--------+-------------------+-----+-----+--------+------+
¦Branhamella ¦ + ¦ + ¦ - >> - ¦ + ¦ + ¦ - ¦ - ¦
+---------------+-----+--------+-------------------+-----+-----+--------+------+
¦Moraxella ¦ - ¦ + ¦Грамотрицательные ¦ + ¦ + ¦ - ¦ - ¦
¦ ¦ ¦ ¦кокко-бациллы ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+---------------+-----+--------+-------------------+-----+-----+--------+------+
¦Acinetobacter ¦ + ¦ + ¦ - >> - ¦ + ¦ - ¦ - ¦ +- ¦
+---------------+-----+--------+-------------------+-----+-----+--------+------+
¦S. pneumoniae ¦ - ¦ + <**> ¦Грамположительные ¦ - ¦ - ¦ + ¦ - ¦
¦ ¦ ¦ ¦диплококки ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
L---------------+-----+--------+-------------------+-----+-----+--------+-------
--------------------------------
<*> - Характерный "мышиный" запах.
<**> - Вокруг колоний цвет среды зеленеет.
Регистрируют результаты реакции на ферменты каталазу,
оксидазу, бета-галактозидазу и уреазу. Это позволяет уже на 3-й
день исследования, т.е. через 48 часов, определить вид микроба.
Четвертый день. Регистрируют результаты по дополнительным
биохимическим тестам. На основании комплекса изученных
биологических свойств проводят окончательную идентификацию
выделенных культур.
Выдается окончательный ответ о выделении того или иного вида
из рода Haemophilus.
Окраска по Гинсу
Принцип. Капсула микроба обнаруживается в виде неокрашенной
каймы вокруг окрашенного фуксином тела микроба на черном фоне.
Реактивы. Тушь, раствор "водного фуксина".
Для приготовления "водного фуксина" фуксин Циля разводят в 10
раз дистиллированной водой. Разведенный фуксин очень не стоек, его
готовят непосредственно перед окрашиванием препарата. (Фуксин Циля
- см. раздел 3.1.).
Ход исследования. Тушь разводят в 10 раз дистиллированной
водой. На предметное стекло наносят каплю туши, исследуемую
культуру тщательно перемешивают с тушью и, пользуясь покровным или
шлифованным стеклом, готовят тонкий мазок по типу мазков крови.
После подсушивания мазка на воздухе, фиксируют на пламени и
докрашивают "водным фуксином" (5-10 мин.). Бактерии окрашиваются в
красный цвет, капсулы остаются неокрашенными, они резко выделяются
на черно-коричневом фоне.
Питательные среды
1. Сухой питательный агар (см. раздел 3.2.).
2. Кровяной агар (см. раздел 3.2.).
3. Агар с гретой кровью (см. раздел 3.2.).
4. Среды Гисса (определение сахаролитических ферментов)
Ингредиенты:
индикатор Андреде,
пептон,
натрий хлористый,
углеводы (глюкоза, лактоза, сахароза, мальтоза, фруктоза).
Для приготовления индикатора Андреде берут кислого фуксина -
1,0 г, 1 моль/л едкого натра - 64 мл, дистиллированной воды - 400
мл.
Приготовление среды. К 100 мл дистиллированной воды прибавляют
1 г пептона, 0,5 г натрия хлористого, 2 мл индикатора Андреде,
нагревают до 80°С, рН 7,2. Затем среду кипятят 5 минут, фильтруют
и доливают до первоначального объема дистиллированной водой.
Добавляют 1 г одного из углеводов. Стерилизуют 3 дня текучим паром
по 30 минут или при 0,5 атм. 15 минут.
Ход исследования. В пробирки после посева культуры добавляют
2-3 капли инактивированной сыворотки лошади или крупного рогатого
скота для более активного расщепления углеводов. При расщеплении
углеводов среда из бесцветной становится красной.
Биохимические методы исследования
1. Определение фермента уреазы
Принцип. Метод основан на способности микроорганизмов,
обладающих ферментом уреазой, расщеплять мочевину до аммиака, за
счет которого происходит изменение рН среды в щелочную сторону,
что определяется по изменению цвета индикатора.
Реактивы
Мочевина.
Калий фосфорнокислый однозамещенный (КН2РО4).
Калий фосфорнокислый двузамещенный (К2НРО4).
Натрий хлористый (NаCl).
Феноловый красный, 0,25% раствор.
Спирт 96%.
Приготовление растворов. Раствор А: 2 г мочевины растворяют в
2 мл 96% спирта и 4 мл дистиллированной воды. Раствор Б: 0,1 г
КН2РО4; 0,1 г К2НРО4; 0,5 г NаCl; 1 мл 0,25% раствора фенолового
красного; дистиллированной воды до 100 мл. Раствор автоклавируют
30 минут при 0,5 атм.
Ход исследования. Перед исследованием берут 1 часть раствора А
и 19 частей раствора Б, смешивают, разливают по 0,1 мл в
агглютинационные пробирки (стерильно) и вносят испытуемую культуру
в количестве 1-2 петель. Пробирки помещают в термостат при 37°С на
30 минут. При наличии у бактерий фермента уреазы среда приобретает
ярко-малиновое окрашивание. Длительность наблюдения за реакцией до
18-24 часов.
2. Определение бета-галактозидазы
Принцип. Метод основан на способности микроорганизмов,
обладающих ферментом бета-галактозидазой, гидролизовать ONPG
(о-нитрофенил-бета-D-галактопиранозид) - бесцветный субстрат,
освобождая о-нитрофенол - желтого цвета.
Реактивы
о-нитрофенил-бета-D-галактопиранозид (ONPG).
Для изготовления раствора 150,63 мг ONPG растворяют в 100 мл
стерильного физиологического раствора, рН 6,7, раствор бесцветный.
Раствор хранят в склянке из темного стекла в холодильнике не более
3 недель.
Ход исследования. В стерильные агглютинационные пробирки
разливают по 0,5 мл раствора ONPG и вносят одну полную петлю
испытуемой культуры. Инкубация при 37°С 2-4 часа. Положительная
реакция определяется по появлению ярко-желтого окрашивания за счет
о-нитрофенола.
3. Определение индолообразования
Принцип. Метод основан на способности микроорганизмов
расщеплять аминокислоту триптофан с образованием индола.
Реактивы
Пара-(диметиламино)-бензальдегид.
Ортофосфорная кислота, чда, хч, концентрированная.
Спирт 96%.
Для приготовления индикаторных бумажек берут
пара-(диметиламино)-бензальдегида - 5 г; ортофосфорной кислоты
концентрированной - 10 мл; спирта 96% - 50 мл.
Раствором смачивают фильтровальную бумагу, высушивают,
нарезают полосками, хранят в темной посуде.
Ход исследования. Пробирки с питательным бульоном засеивают
одной петлей культуры и добавляют 2-3 капли инактивированной
лошадиной сыворотки. Под пробку помещают индикаторную бумажку на
индол, пропитанную пара-(диметиламино)-бензальдегидом. При
образовании индола через 18-24 часа инкубации при 37°С желтая
бумажка приобретает розово-малиновый цвет.
4. Определение редукции нитратов (см. раздел 2.3.)
5. Тест на каталазу (см. раздел 3.3.)
6. Для определения ферментов оксидазы,
уреазы, бета-галактозидазы, образования индола,
ферментации углеводов - рекомендуется использовать
систему индикаторных бумажек (СИБ), (см. раздел 3.3.)
Определение потребностей в Х и V факторах крови <*>
Чашки Петри с простым агаром и агаром с 5% крови засевают:
одну половину - исследуемой культурой, другую - исследуемой
культурой в смеси с взвесью Staphylococcus aureus. Если
наблюдается рост на агаре с кровью, то исследуемый микроб требует
только Х фактора. Если рост наблюдается на кровяном агаре
совместно со стафилококком, то исследуемый микроб требует Х и V
факторов. Если наблюдается рост вместе со стафилококком на простом
агаре, то микробы требуют V фактора. Если наблюдается рост на
простом агаре на секторе без стафилококка, то исследуемая культура
не относится к гемофилам.
--------------------------------
<*> - Используется в качестве дополнительного метода.
2.5. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ
МИКРОБОВ РОДА КОРИНЕБАКТЕРИЯ (Corynebacterium)
Род коринебактерия (Corynebacterium) объединяет большое число
видов грамположительных неподвижных, не образующих спор палочек.
C. diphtheriae - вид, патогенный для человека, вызывает системное
бактериально-токсическое заболевание - дифтерию зева, носа,
трахеи, реже - глаз, ушей, половых органов, кожи. С. minutissimum
описана как возбудитель эритразмы, характерных кожных поражений
человека. Другие виды коринебактерий обычно выделяются со
слизистых и кожи здорового человека, но иногда являются причиной
инфекционно-воспалительных процессов.
В последние годы описаны случаи язвенно-некротических
заболеваний человека с поражениями зева, носа, трахеи, легких, при
которых выделялись некоторые виды коринебактерий. Так, С. ulcerans
могут вызывать дифтериеподобные заболевания с поражением слизистых
верхних дыхательных путей; С. pseudotuberculosis - абсцессы с
язвенно-некротическими очагами, язвенные лимфадениты; С. enzymicum
- очень редко тяжелую абсцедирующую бронхопневмонию; С. pyogenes,
С. haemolyticus - язвенно-некротические поражения в виде
фарингитов, тонзиллитов, гингивитов, стоматитов, уретритов.
С. xerosis - обитатель слизистой слезного канала, может быть
причиной длительно и вяло протекающих конъюнктивитов.
Для подтверждения этиологической значимости в патологическом
процессе С. xerosis необходимо провести повторное исследование
материала с количественным учетом числа выросших колоний. Для
С. pseudodiphtheriticum, которая обычно обитает на слизистых носа,
глотки, слухового канала и поверхности кожи, возможность вызывать
воспалительные процессы в местах обычного обитания не доказана.
Этот вид рассматривается как представитель нормальной микрофлоры
слизистых и кожи человека. При повторном выделении из крови,
спинномозговой жидкости и других, обычно стерильных субстратов,
все перечисленные виды коринебактерий следует оценивать как
потенциальных возбудителей, и при этом требуется проведение
терапевтических мероприятий. Следует обращать внимание на
выделение гемолитических (токсигенных) штаммов, которые при
первичном посеве формируют значительное количество колоний или
растут в виде чистой культуры. Такой выделенный вид коринебактерий
можно рассматривать как возбудитель воспалительного процесса или
дифтериеподобного заболевания.
Ход бактериологического исследования
Первый день. Все поступившие материалы засевают на 5% кровяной
агар штрихом, тщательно втирая их по секторам с целью получения
отдельных колоний. Посевы помещают в термостат при 37°С.
Одновременно с посевами из поступившего материала готовят 2-3
мазка, один из которых окрашивают по Граму. Мазки просматривают
под микроскопом с иммерсией. Обнаружение грамположительных палочек
с характерной морфологией и расположением позволяет заподозрить
наличие коринебактерий. Для уточнения проводят микроскопию мазков,
окрашенных щелочным раствором метиленового синего. Если в мазках
видны слегка изогнутые изящные палочки с булавовидными утолщениями
на концах, располагающиеся в виде войлока, пакета булавок, цифры
V, содержащие темно-окрашенные зерна на концах, то следует
заподозрить наличие С. diphtheriae, о чем срочно сообщить лечащему
врачу и далее вести исследование в соответствии с "Инструкцией по
бактериологическому исследованию на дифтерию" (Приказ МЗ СССР N
580 от 26 июня 1974 г.).
У других видов коринебактерий палочки более толстые, короткие,
обычно располагаются в виде частокола; реже встречаются
булавовидные утолщения и темно-окрашенные зерна, расположенные на
одном конце.
При микроскопии первичных мазков (особенно приготовленных из
гнойного отделяемого) можно наблюдать своеобразную морфологию
клеток, напоминающую по расположению коринеформные бактерии:
грамположительные длинные тонкие или короткие толстые палочки с
утолщениями на одном конце. В отличие от коринебактерий четко
видны или ветвящиеся формы, или раздвоение на концах палочек,
коккобациллярные клетки, располагающиеся парами или цепочками.
Такая морфология микробов характерна для микробов родов
Actinomyces, Bifidobacterium, Lactobacillus, Propionibacterium.
Эта группа грамположительных, не образующих спор палочек, включает
микроаэрофильные и облигатноанаэробные формы. Поэтому при посеве
материала на кровяной агар, рост культур этих микроорганизмов или
отсутствует, или может появиться на 3-5 сутки инкубации в виде
очень мелких сероватых крошковидных колоний (Actinomyces israelii,
Propionibacterium acne).
Второй день. Через 20-24 часа все посевы просматривают на
наличие роста культуры. На кровяном агаре можно наблюдать рост
колоний, которые, в зависимости от вида коринебактерий, имеют
некоторые особенности строения и своеобразную морфологию клеток.
1. Колонии, размером от 1 до 2-3 мм, чаще круглые,
непрозрачные, сероватые (S-форма) или шероховатые, крошковидные,
исчерченные, с неровным краем колонии (R-форма), и под ними зона
полного гемолиза эритроцитов.
В мазках из выросших колоний, окрашенных по Граму, видны
грамположительные прямые или слегка изогнутые полиморфные палочки,
располагающиеся кучками в виде рассыпанных булавок или римской
цифры V или буквы L. Палочки не ветвятся, клетки содержат
метахроматические зерна (С. diphtheriae, С. ulcerans,
С. pseudotuberculosis).
2. Колонии круглые, непрозрачные, маслянистые мелкие или
крупные, кремовые, бледно-желтые, оранжево-коричневые, гладкие без
зон гемолиза.
В мазках из крупных колоний равномерно окрашенные
грамположительные палочки расположены частоколом. Встречаются
редкие булавовидные и зернистые с одного конца формы (С. xerosis,
С. pseudodiphthericum). В мазках из мелких колоний видны
полиморфные грамположительные булавовидные, четкообразные палочки,
иногда коккоидные формы с маленькой краевой капсулой
(С. enzymicum).
3. Очень мелкие до 1 мм или крупные 1-2 мм колонии, гладкие,
круглые, непрозрачные, окруженные большой прозрачной зоной полного
гемолиза эритроцитов. В мазках из описанных колоний видны мелкие
грамположительные коккобациллы, которые расположены в виде
разреженных цепочек или пунктира, они напоминают стрептококки, но
это - дифтероидные формы коринебактерий (С. pyogenes,
С. haemolyticus).
Для выделения чистых культур и накопления биомассы описанные
колонии отсевают на 10% сывороточный агар.
Если на чашках с кровяным агаром обнаружен рост однотипных
колоний с идентичной морфологией клеток, то культуру, снятую
петлей с питательной среды, исследуют для выявления наличия
ферментов уреазы, желатиназы и способность утилизировать углеводы
(см. таблицу 11).
Третий день. Из культур, выросших на сывороточном агаре,
делают мазки, окрашивают по Граму для подтверждения наличия
грамположительных палочек, характерных по морфологии и
расположению для коринебактерий. Культуру используют для
идентификации по тестам, представленным в таблице 11. При
необходимости культуру используют для оценки чувствительности к
антибиотикам.
Регистрируют результаты изучения биохимических свойств штаммов
из однотипных колоний с кровяного агара. Если свойства культуры
соответствуют одному из видов коринебактерий, то исследования
заканчивают и дают ответ о выделении соответствующего вида.
(Таблица 11).
Наблюдение за посевами крови, которые выдерживают в
термостате, ведут ежедневно. При выявлении роста и обнаружении в
мазках, окрашенных по Граму, клеток, характерных для
коринебактерий, делают высев на 10% сывороточный агар.
Идентификацию выделенных культур проводят по этапам, описанным
выше.
Четвертый день. Проводят учет результатов по биохимическим
тестам для идентификации выделенных культур. В соответствии с
данными таблицы 11 дают ответ о выделенном из исследуемого
материала виде коринебактерий. Для потенциальных возбудителей
заболевания указывают чувствительность культур к антибиотикам.
Таблица 11
Биохимические свойства микробов рода Corynebacterium
----------------------T-----T-------T------T----------T--------T--------T-----T-----T-----T-----T-------------T--------¬
¦ Виды ¦Гемо-¦Катала-¦Уреа- ¦Желатина- ¦Цистина-¦Редукция¦Глю- ¦Лак- ¦Маль-¦Саха-¦Расщепление ¦Экзоток-¦
¦ ¦лиз ¦за <*> ¦за <*>¦за <*> ¦за <**> ¦нитратов¦коза ¦тоза ¦тоза ¦роза ¦крахмала <**>¦син <**>¦
+---------------------+-----+-------+------+----------+--------+--------+-----+-----+-----+-----+-------------+--------+
¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦ 7 ¦ 8 ¦ 9 ¦ 10 ¦ 11 ¦ 12 ¦ 13 ¦
+---------------------+-----+-------+------+----------+--------+--------+-----+-----+-----+-----+-------------+--------+
¦C. diphtheriae ¦ d ¦ + ¦ - ¦ - ¦ + ¦ + ¦ + ¦ - ¦ + ¦ - ¦ d ¦ + ¦
+---------------------+-----+-------+------+----------+--------+--------+-----+-----+-----+-----+-------------+--------+
¦С. pseudodiphthericum¦ - ¦ + ¦ + ¦ - ¦ - ¦ + ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦
+---------------------+-----+-------+------+----------+--------+--------+-----+-----+-----+-----+-------------+--------+
¦С. xerosis ¦ - ¦ + ¦ - ¦ - ¦ - ¦ + ¦ + ¦ - ¦ + ¦ + ¦ - ¦ - ¦
+---------------------+-----+-------+------+----------+--------+--------+-----+-----+-----+-----+-------------+--------+
¦С. pseudotuberculosis¦ + ¦ + ¦ d ¦ d ¦ - ¦ d ¦ + ¦ d ¦ + ¦ d ¦ - ¦ + ¦
+---------------------+-----+-------+------+----------+--------+--------+-----+-----+-----+-----+-------------+--------+
¦С. enzymicum ¦ - ¦ + ¦ ... ¦ - ¦ - ¦ (+) ¦ + ¦ + ¦ + ¦ + ¦ - ¦ - ¦
+---------------------+-----+-------+------+----------+--------+--------+-----+-----+-----+-----+-------------+--------+
¦С. ulcerans ¦ + ¦ + ¦ + ¦ + ¦ - ¦ - ¦ + ¦ - ¦ d ¦ - ¦ - ¦ + ¦
+---------------------+-----+-------+------+----------+--------+--------+-----+-----+-----+-----+-------------+--------+
¦С. pyogenes ¦ ++ ¦ - ¦ - ¦+ - <****>¦ - ¦ - ¦ + ¦ + ¦ + ¦ - ¦ + - <****> ¦ + ¦
+---------------------+-----+-------+------+----------+--------+--------+-----+-----+-----+-----+-------------+--------+
¦С. haemolyticum ¦ ++ ¦ (+) ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ + ¦ + ¦ + ¦ ... ¦ - ¦ ... ¦
+---------------------+-----+-------+------+----------+--------+--------+-----+-----+-----+-----+-------------+--------+
¦Неопределенная груп-¦ - ¦ + ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ + ¦ - ¦- (+)¦ - ¦ - ¦ - ¦
¦па <***> ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+---------------------+-----+-------+------+----------+--------+--------+-----+-----+-----+-----+-------------+--------+
¦C. minutissimum ¦ - ¦ + ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ + ¦ - ¦ + ¦ - ¦ - ¦ - ¦
L---------------------+-----+-------+------+----------+--------+--------+-----+-----+-----+-----+-------------+---------
--------------------------------
<*> - Тесты, обязательные при идентификации возбудителя дифтерии.
<**> - Тесты на цистиназу, расщепление крахмала и определение экзотоксина проводятся в соответствии с Приказом
Министерства здравоохранения СССР N 580 от 26 июня 1974 г.
<***> - Выделяют из крови ослабленных больных.
<****> - +-: + мелкие колонии; - крупные колонии.
... - Нет данных.
(+) - Слабая положительная реакция.
d - Реакция, вариабельная у разных штаммов.
Окраска щелочным раствором метиленового синего
по Леффлеру
Реактивы
Дистиллированная вода - 99 мл
1% раствор едкого калия (КОН) - 1 мл
Метиленовый синий - 3 г
Спирт 96% - 30 мл
Для приготовления раствора 3 г метиленового синего растворяют
в 30 мл спирта 96%, смешивают с 1 мл 1% раствора КОН и добавляют
99 мл дистиллированной воды.
Ход исследования. Исследуемый материал наносят на чистые
обезжиренные предметные стекла, растирают его тонким равномерным
слоем по поверхности стекла, высушивают на воздухе. Препарат
фиксируют 3 мин. в 96% спирте, высушивают, затем наносят каплю
щелочного раствора метиленового синего и окрашивают в течение 3-10
минут, смывают оставшийся краситель струей холодной воды и
высушивают.
Питательные среды
1. Питательный агар (см. раздел 3.2.).
2. Кровяной агар (см. раздел 3.2.).
3. Сывороточный агар (см. раздел 3.2.).
4. Среды Гисса (см. раздел 2.4.).
Биохимические методы
1. Определение каталазы (см. раздел 3.3.).
2. Определение уреазы (см. раздел 2.4.).
3. Редукция нитратов (см. раздел 2.3.).
4. Определение желатиназы по методу Ле-Минора
Принцип. Метод основан на способности протеолитического
фермента желатиназы гидролизовать желатину до водорастворимых
соединений.
Реактивы
Засвеченная и проявленная фото- и кинопленки.
Калий фосфорнокислый однозамещенный 1/15 моль/л.
Натрий фосфорнокислый двузамещенный 1/15 моль/л (высушенный на
воздухе в течение 12-14 дней).
Приготовление растворов:
Раствор А. Растворяют 9,078 г КН2РО4 в 1 л дистиллированной
воды.
Раствор Б. Растворяют 11,876 г Na2НРО4 в 1 л дистиллированной
воды.
Для получения фосфатного буфера, 1/15 моль/л, рН 7,1 берут
33,4 мл раствора А и 66,6 мл раствора Б и смешивают.
Ход исследований
Используют фото- и кинопленку, предварительно засвеченную,
проявленную и фиксированную. Пленку нарезают на квадраты размером
5х5 мм, стерилизуют в чашках Петри в автоклаве при 0,5 атм.
(115°С) 30 минут (для предупреждения слипания пленок их помещают
между прокладками фильтровальной бумаги). Стерильную пленку
помещают в пробирки со взвесью 18-20 часовой агаровой культуры
микробов в 1/15 моль/л растворе фосфатного буфера рН 7,1.
Просветление 3/4 или всей поверхности пленки считается
положительным результатом. Срок наблюдений - 1-5 дней.
2.6. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ
МИКРОБОВ СЕМЕЙСТВА ЭНТЕРОБАКТЕРИЕВЫХ
(Enterobacteriaceae)
Семейство кишечных энтеробактерий (Enterobacteriaceae)
объединяет грамотрицательные анаэробные и факультативно анаэробные
бактерии, не образующие спор, капсульные и бескапсульные,
подвижные или неподвижные, хорошо растущие на обычных питательных
средах.
Облигатным признаком его представителей является ферментация
глюкозы с образованием кислых или кислых и газообразных продуктов.
Отношение к другим углеводам может у энтеробактерий варьировать.
Для энтеробактерий характерна способность восстанавливать
нитраты, проявлять каталазную активность. Энтеробактерии не имеют
фермента цитохромоксидазы.
Для дифференциации энтеробактерий от других семейств
грамотрицательных бактерий основными тестами являются: тест на
цитохромоксидазу, восстановление нитратов в нитриты, тест на
каталазную активность и OF-тест (окислительно-ферментативный тест
Хью-Лейфсона) для определения биохимических реакций с углеводами.
Наибольшее признание нашла в настоящее время классификация
семейства Enterobacteriaceae, представленная в "Кратком
определителе бактерий Берги", М., 1980 г. (см. таблицу 12).
Таблица 12
Классификационная схема семейства Enterobacteriaceae
("Краткий определитель бактерий Берги", М., 1980)
-----------------T---------------T-------------------------------¬
¦ Триба ¦ Род ¦ Вид (подрод) ¦
+----------------+---------------+-------------------------------+
¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦
+----------------+---------------+-------------------------------+
¦I. Escherichieae¦1. Eccherichia ¦1. E. coli ¦
¦ +---------------+-------------------------------+
¦ ¦2. Edwardsiella¦1. E. tarda ¦
¦ +---------------+-------------------------------+
¦ ¦3. Citrobacter ¦1. С. freundii ¦
¦ ¦ ¦2. С. intermedius ¦
¦ +---------------+-------------------------------+
¦ ¦4. Salmonella ¦1. Подрод I (S. choleraesuis,¦
¦ ¦ ¦S. hirschfeldii <*>, S. typhi,¦
¦ ¦ ¦S. paratyphi A, S. schotmuelle-¦
¦ ¦ ¦ri <**>, S. typhimurium, S. en-¦
¦ ¦ ¦teritidis, S. gallinarum) ¦
¦ ¦ ¦2. Подрод II (S. salamae) ¦
¦ ¦ ¦3. Подрод III (S. arizonnae) ¦
¦ ¦ ¦4. Подрод IV (S. houtenae) ¦
¦ +---------------+-------------------------------+
¦ ¦5. Shigella ¦1. Sh. dysenteriae ¦
¦ ¦ ¦2. Sh. flexneri ¦
¦ ¦ ¦3. Sh. boydii ¦
¦ ¦ ¦4. Sh. sonnei ¦
+----------------+---------------+-------------------------------+
¦II. Klebsiella ¦1. Klebsielleae¦1. K. pneumoniae ¦
¦ ¦ ¦2. K. rhinoscleromatis ¦
¦ ¦ ¦3. K. ozaenae ¦
¦ +---------------+-------------------------------+
¦ ¦2. Enterobacter¦1. E. cloacae ¦
¦ ¦ ¦2. E. aerogenes ¦
¦ +---------------+-------------------------------+
¦ ¦3. Hafnia ¦1. H. alvei ¦
¦ +---------------+-------------------------------+
¦ ¦4. Serratia ¦1. S. marcescenc ¦
+----------------+---------------+-------------------------------+
¦III. Proteae ¦1. Proteus ¦1. P. vulgaris ¦
¦ ¦ ¦2. P. mirabilis ¦
¦ ¦ ¦3. P. morganii ¦
¦ ¦ ¦4. P. rettgeri ¦
¦ ¦ ¦5. P. inсonstans A B ¦
+----------------+---------------+-------------------------------+
¦IV. Yersinieae ¦1. Yersinia ¦1. Y. pestis ¦
¦ ¦ ¦2. Y. pseudotuberculosis ¦
¦ ¦ ¦3. Y. enterocolitica ¦
+----------------+---------------+-------------------------------+
¦ ¦ ¦ Группы ¦
¦V. Erwinieae ¦1. Erwinia ¦1. Amylovora (вкл. 6 видов) ¦
¦ ¦ ¦2. Herbicola (вкл. 3 вида) ¦
¦ ¦ ¦3. Carotovora (вкл. 4 вида) ¦
L----------------+---------------+--------------------------------
--------------------------------
<*> - S. hirschfeldii соответствует S. paratyphi С.
<**> - S. schottmuelleri соответствует S. paratyphi B.
В отличие от прежних представлений теперь считают, что
практически любой представитель семейства энтеробактерий может
быть причастен, при определенных обстоятельствах, к возникновению
инфекционного процесса различной локализации.
Ход микробиологического исследования
Первый день.
Идентификация энтеробактерий начинается с изучения их колоний
на пластинчатых средах. Для целей клинической микробиологии это, в
первую очередь, среды Эндо или ЭМС-агар (с эозин-метиленовым
синим), обладающие дифференциально-диагностическими свойствами.
При исследовании кишечного содержимого могут быть использованы
дополнительно среды Плоскирева, висмут-сульфитный агар,
слабощелочной и кровяной агар.
На среде Эндо колонии представителей семейства
Enterobacteriaceae обычно выпуклые с правильными очертаниями
(круга), более или менее опалесцирующие, иногда слизистые. Они
могут быть окрашены в красный цвет с наличием металлического
блеска или без него (лактозоположительные энтеробактерии),
бесцветными (лактозоотрицательные), могут приобретать розоватый
или сероватый оттенок с более или менее выраженным темным центром,
особенно у более крупных колоний.
Диаметр и окраска колоний могут варьировать не только в
зависимости от родовой принадлежности, но и от массивности роста.
В среднем диаметр колоний составляет 1-2 мм, мелкие бесцветные
колонии-росинки - характерны в 1 сутки роста для иерсиний
(Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis) <*>.
--------------------------------
<*> - Такие чашки необходимо дополнительно инкубировать при
комнатной температуре еще 18-20 часов.
P. vulgaris и P. mirabilis обычно дают вуалеобразный рост
("роение"), а представители родов Klebsiella и Enterobacter чаще
образуют сочные слизистые розовые колонии диаметром 2-3 мм.
Шигеллы, сальмонеллы, гафнии, нероящиеся представители рода
протеев обычно образуют более "нежные" колонии небольших размеров.
Часть штаммов серраций дает розово-красные, с фуксиновым оттенком
пигментированные колонии.
Намеченные для дальнейшего изучения колонии снимают
бактериологической петлей (или иглой) и засевают штрихом по косяку
и уколом в столбик комбинированной среды для первичной
идентификации. Наиболее принятыми в отечественных лабораториях
являются среды Клиглера, Олькеницкого и их модификации. Эти
двух(лактоза, глюкоза) и трех- (лактоза, глюкоза, сахароза)
сахарные среды, включающие для выявления образования сероводорода:
аммоний - железо (II) - сульфат (соль Мора), натрий тиосульфат
(гипосульфит) и мочевину, позволяют после 18-20-часовой инкубации
их при 37°С составить предварительное заключение о возможной
родовой принадлежности выделенных культур и определить набор
необходимых тестов для идентификации рода и вида.
Для иерсиний дополнительная и параллельная инкубация посевов
при комнатной температуре обеспечивает более четкое проявление
биохимических реакций.
Второй день.
Учет результатов посева в среду для первичной идентификации.
Микроскопия окрашенных по Граму мазков.
Микробы семейства Enterobacteriaceae дают на поверхности
скошенной части среды Клиглера, Олькеницкого (или модификации)
влажный, однородный, опалесцирующий рост без пигментообразования
(за исключением представителей рода Serratia).
Ферментация глюкозы - облигатное свойство всех энтеробактерий
- проявляется в изменении окраски столбика среды (цвет зависит от
используемого в среде индикатора, а также интенсивности
кислотообразования).
При наличии в составе среды мочевины (среда Олькеницкого и ее
|
