|
Стр. 3
I - очень скудный рост - рост только на жидких средах; на
плотной питательной среде рост
отсутствует.
II - скудный рост - на плотной питательной среде рост
до 10 колоний микроорганизмов
определенного вида.
III - умеренный рост - на плотной питательной среде рост
от 10 до 100 колоний.
IV - обильный рост - на плотной питательной среде рост
более 100 колоний.
I и II степени роста чаще всего свидетельствуют о загрязнении,
III и IV степени роста - об этиологической роли данного
микроорганизма.
1.10. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
МАТЕРИАЛОВ ПРИ АУТОПСИИ
Микробиологические исследования проводят в случае летального
исхода при гнойно-воспалительных заболеваниях, вызванных
условно-патогенными бактериями.
В зависимости от клинического диагноза и сделанных в процессе
вскрытия патологоанатомических находок материалом для
микробиологического исследования служат кусочки органов и тканей,
кровь, гной, экссудат и т.д. (таблица 2).
Взятие исследуемого материала
Основным условием для получения достоверных результатов и их
правильной интерпретации является раннее, не позднее 12 часов
после смерти больного, взятие материала, даже при хранении трупа
при пониженной температуре. Материал для микробиологического
исследования берет персонал морга (врач и его помощник) с
соблюдением правил асептики.
Пробы крови получают из левого желудочка сердца шприцем или
пастеровской пипеткой.
Непосредственно после взятия кровь в количестве 5-10 мл
засевают во флаконы с 50-100 мл "двойной среды" и "среды для
контроля стерильности". Край флаконов при посеве обжигают над
пламенем спиртовой горелки.
Пункцию и биопсию проводят после обработки исследуемого
участка 3% перекисью водорода и последующего удаления антисептика
стерильным физиологическим раствором. С соблюдением правил
асептики 2-3 кусочка органов или тканей, величиной по 0,5-1 куб.
см помещают для транспортировки в стерильные чашки Петри или в
пробирки.
Гной из вскрытых полостей, спинномозговую жидкость и т.д.
отсасывают шприцем и в количестве 1-5 мл помещают в стерильные
пробирки. Поверхностные секреты собирают на бактериологический
тампон.
Материал, взятый от трупа больного с гнойно-воспалительной
патологией, вызванной условно-патогенными бактериями, должен быть
доставлен в лабораторию в течение 1 часа. В направлении
дополнительно указывают дату и время смерти.
Микроскопия исследуемого материала
Из кусочков тканей, гноя и т.д. готовят мазки-отпечатки и
окрашивают по Граму. При микроскопии отмечают степень
обсемененности бактериями, морфологию и тинкториальные свойства
микроорганизмов. В зависимости от результатов бактериоскопии,
клинического диагноза и данных прижизненного микробиологического
обследования вносят коррективы в ход исследования (расширяют набор
питательных сред для первичного посева, учитывают вероятность
выделения роящихся протеев и т.д.).
Посев исследуемого материала
Питательные среды.
1. "Двойная среда". ¦ для посева крови
2. "Среда для контроля стерильности", ¦ (см. раздел 1.1.).
обогащенная. ¦
3. 5% кровяной агар (2 чашки). (см. раздел 3.2.).
Дополнительные среды:
4. Желточно-солевой агар. ¦ (см. раздел 3.2.).
5. Среда Эндо. ¦
6. ЦПХ-агар. (см. раздел 2.7.).
Перед микробиологическим исследованием с кусочков органов и
тканей стерильным инструментом удаляют поверхностный слой и
свежими срезами делают отпечатки (площадь 2 кв. см) на плотных
питательных средах.
Гной и экссудат наносят на среды пипеткой Пастера, а
поверхностные секреты - бактериологическим тампоном. Внесенный
материал рассеивают петлей по всей поверхности питательной среды.
Для подготовки к определению количества бактерий в ткани, а также
при посеве на жидкие среды кусочки предварительно измельчают.
Оценка результатов
При микробиологическом исследовании трупного материала от
больных с гнойно-воспалительной патологией следует помнить, что
возбудители гнойной инфекции являются условно-патогенными
бактериями, представителями нормальной микрофлоры человека,
населяющей все области, соприкасающиеся с внешней средой и
способной к активной инвазии в кровь, органы и ткани уже в
агональный период, в первые же часы после смерти людей и без
какой-либо инфекционной патологии. Поэтому, при интерпретации
результатов микробиологического исследования трупного материала
необходимо сопоставить полученные результаты с данными
прижизненного обследования, с клинической картиной болезни,
патологическими и гистологическими находками.
Таблица 2
Трупный материал, исследуемый при основных видах
гнойной патологии
----------T------------------------------------------------------¬
¦ ¦ Материал ¦
¦ +-----T------------------------T--------T--------T-----+
¦ Виды ¦ ¦ Кусочки ткани ¦Содержи-¦Спинно- ¦ ¦
¦патологии¦Кровь+-------T--------T-------+ мое ¦мозговая¦Экс- ¦
¦ ¦ ¦легкого¦мозговых¦прочих ¦гнойных ¦жидкость¦судат¦
¦ ¦ ¦ ¦оболочек¦органов¦полостей¦ ¦ ¦
+---------+-----+-------+--------+-------+--------+--------+-----+
¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦ 7 ¦ 8 ¦
+---------+-----+-------+--------+-------+--------+--------+-----+
¦Сепсис ¦ + ¦ + ¦ ¦ (+) ¦ + ¦ ¦ + ¦
+---------+-----+-------+--------+-------+--------+--------+-----+
¦Пневмония¦ ¦ + ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ + ¦
+---------+-----+-------+--------+-------+--------+--------+-----+
¦Перитонит¦ (+) ¦ ¦ ¦ ¦ + ¦ ¦ + ¦
+---------+-----+-------+--------+-------+--------+--------+-----+
¦Раневая ¦ (+) ¦ ¦ ¦ + ¦ + ¦ ¦ + ¦
¦инфекция ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+---------+-----+-------+--------+-------+--------+--------+-----+
¦Менингит ¦ ¦ (+) ¦ + ¦ ¦ ¦ + ¦ ¦
+---------+-----+-------+--------+-------+--------+--------+-----+
¦Инфекция ¦ ¦ ¦ ¦ + ¦ + ¦ ¦ + ¦
¦мочеполо-¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦вого ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦тракта ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
L---------+-----+-------+--------+-------+--------+--------+------
(+) - исследование не обязательно.
2. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ
СХЕМА ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ ДО СЕМЕЙСТВ И РОДОВ
Аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы Анаэробные микроорганизмы
___________________________________________________________________--------------- ------------------------------
___________________________________________________________________--------------- ------------------------------
палочки кокки палочки кокки
-----------T----------- -------T------- --------T---------- ----T----
¦ ¦ ¦ ¦
окраска по Граму окраска по Граму спорообразование ¦
---------------------------- --------------------- ---T----------T---- ¦
-- ¦ ¦ ¦
¦¦ + - + - ¦
--------------L-----------------------------------------¬ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ цитохром- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ оксидаза ¦ ¦ ¦ окраска окраска окраска
¦ ---------- ¦ ¦ ¦ по по по
+ - ¦ ¦ Граму Граму Граму
¦ ¦ ¦ ¦ ---T---- ----T---- ----T----
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
ферментация глюкозы ферментация глюкозы ¦ ¦ + - +
---------------------------- ---------------------------- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+ - + - - ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
----+---- --------+-------- ----+----- --+--- ---+---- -----+----- ----+---- ---+---- ----+---- ----+----
Семейство Род Род Семейство Род Род Семейство Род Род Семейство Семейство
Vibrio- Pseudo- Alcali- Enterobac- Haemo- Aciue- Micrococ- Neisseria Clostri- Bacteroi- Peptococ-
naceae monas genes teriaceae philus tobacter caceae Род dium daceae caceae
Род Род Род Семейство Branha-
Chromo- Mora- Flavobac- Streptococ- mella
bacterium xella terium caceae
2.1. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРОБОВ
РОДА СТАФИЛОКОККА (Staphylococcus)
В соответствии с рекомендациями "Краткого определителя
бактерий Берги" 1980 г., род Staphylococcus относится к семейству
Micrococcaceae, в которое входят также роды Micrococcus и
Planococcus. Общими чертами представителей этого семейства
являются: 1) морфология микробных клеток - все они
грамположительные микроорганизмы сферической формы, делящиеся
более чем в одной плоскости, 2) наличие фермента каталазы.
Согласно решению Международного подкомитета по таксономии
стафилококков и микрококков (Варшава, 1975 г.) род Staphylococcus
состоит из 3 видов: S. aureus, S. epidermidis, S. saprophyticus.
Представители двух последних видов относятся, к так называемым,
коагулазоотрицательным стафилококкам, которые долгое время
считались непатогенными. Сейчас эту точку зрения следует считать
опровергнутой. Доказано, что S. epidermidis может вызывать такие
заболевания как эндокардит, сепсис,конъюнктивит, инфекцию ран и
мочевыводящих путей, а S. saprophyticus - острый уретрит и цистит.
Целью первичной идентификации является установление
принадлежности выделенной культуры к семейству Micrococcaceae и
роду Staphylococcus.
Для установления принадлежности культур к семейству
микрококков (Micrococcaceae) используют тест на каталазу.
Отмечают способность представителей семейства микрококков,
имеющих фермент каталазу, расщеплять перекись водорода, образуя
воду и газообразный кислород.
В отличие от микрококков, представители родственного семейства
стрептококков каталазы не имеют.
Установление принадлежности культуры
к роду Staphylococcus
На этом этапе исследования применяются методы, позволяющие
дифференцировать стафилококки от микрококков. К их числу относятся
культуральный, бактериоскопический и биохимический методы, из
которых последний является главным.
Культуральный метод
Основным отличием стафилококков от микрококков является
окраска колоний на плотной среде. Для стафилококков характерны
золотистые (от палевых до ярко-золотистых) или белые колонии. У
микрококков колонии окрашены, как правило, в желтый (с различными
оттенками - от желто-зеленого до оранжевого) или розовый (вплоть
до красного) цвета. Дополнительным тестом может служить характер
роста на плотной кровяной (5% дефибринированной крови барана или
кролика) среде. Подавляющее большинство штаммов S. aureus и
некоторые штаммы S. epidermidis растворяют эритроциты, образуя
прозрачную зону гемолиза вокруг колоний. Микрококки
гемолитическими свойствами не обладают.
Бактериоскопический метод
В мазках, окрашенных по Граму, стафилококки располагаются по
одиночке, парами или в виде скоплений (гроздей) неправильной
формы. Для микрококков, помимо указанных вариантов, характерно
также образование тетрад и пакетов. Размеры микробных клеток у
микрококков, как правило, больше (диаметр 0,5-3,5 мкм), чем у
стафилококков (диаметр 0,5-1,5 мкм).
Определение ферментации глюкозы в анаэробных условиях
Стафилококки являются факультативными анаэробами, микрококки -
облигатными аэробами. В связи с этим стафилококки способны расти и
ферментировать глюкозу в анаэробных условиях, микрококки лишены
этой способности.
Принцип. При ферментации глюкозы в анаэробных условиях
образуется молочная кислота, в связи с чем среда закисляется и рН
ее снижается. Закисление среды выявляется по изменению окраски
индикатора, добавленного в среду.
Ингредиенты. Полужидкие среды (0,3% агар), содержащие 1%
глюкозы - это готовая среда с индикатором ВР или среда
Хью-Лейфсона с индикатором бромтимоловым синим. Последняя среда
является более чувствительной, т.к. изменение ее окраски
происходит при более высоких значениях рН, поэтому она позволяет
выявить ферментацию глюкозы слабо активными штаммами вида S.
saprophyticus. В связи с этим, если какой-либо штамм дал
отрицательный результат на среде ВР, его следует повторно
исследовать на среде Хью-Лейфсона.
Готовую среду разливают по 5 мл в пробирки и подвергают
дробной стерилизации. Непосредственно перед посевом пробирки со
средой помещают на 15 минут в кипящую водяную баню для удаления
кислорода, а затем быстро охлаждают в ледяной бане.
Ход исследования.
Суточную агаровую культуру исследуемого штамма с помощью
бактериологической петли сеют в столбик среды уколом до дна
пробирки, а затем на поверхность агара наливают 1,5 мл стерильного
вазелинового масла для создания анаэробных условий. Посев
инкубируют при 37°С в течение 5 суток, ежедневно регистрируя
результаты. Реакция считается положительной, если происходит
желтое окрашивание столбика среды, занимающее не менее 2/3 его
высоты. Длительные сроки учета реакции представляют известные
неудобства, поэтому на практике дальнейшую идентификацию
стафилококков проводят, обычно не дожидаясь результатов анаэробной
ферментации глюкозы. В этой связи результаты указанного теста как
бы дополняют результаты других тестов, полученных на следующих
этапах идентификации.
Видовая идентификация стафилококков
Первым этапом исследования является дифференциация штаммов S.
aureus от представителей двух коагулазотрицательных видов
стафилококка. Если установлено, что штамм не относится к виду S.
aureus проводят его идентификацию для выяснения принадлежности
культуры к видам S. epidermidis или S. saprophyticus.
Идентификация S. aureus
Ориентировочные данные о принадлежности культуры к виду можно
получить при изучении характера колоний, выросших после посева
исходного материала на элективную среду стафилококков -
молочно-желточный солевой агар (МЖСА).
Среда для определения лецитоветиллазы (лецитиназа)
Принцип. Хлористый натрий является элективным фактором, т.к.
подавляет рост большинства представителей другой микрофлоры,
главным образом, грамотрицательной. Одним из компонентов яичного
желтка является лецитовителлин.
Лецитовителлин является субстратом для фермента
лецитовителлазы (лецитиназы), относящегося к группе липаз и
продуцируемого некоторыми стафилококками. При расщеплении
лецитовителлина вокруг лецитиназоположительной колонии на
поверхности среды образуется радужный венчик. Добавление в среду
молока путем сложных химических процессов стимулирует образование
стафилококками золотистого или лимонно-желтого пигмента,
относящегося к группе каротиноидов.
Ингредиенты. Основой среды является 1,8% питательный агар,
содержащий 7,5 г NaCl на 100 мл среды. К 200 мл растопленного и
охлажденного до 50°С агара добавляют молочно-желточную смесь,
которую готовят следующим образом: во флаконе с 20 мл стерильного
снятого молока эмульгируют (со стеклянными бусами) 2 мл яичного
желтка. После добавления смеси в агар среду тщательно перемешивают
и разливают примерно по 20 мл в чашки Петри. Готовая среда
содержит примерно 10% молока и 1% яичного желтка.
Ход исследования
Для выявления лецитиназы достаточно инкубации посева в течение
18-24 часов при 37°С. Выявление пигмента у колоний в ряде случаев
требует дополнительной инкубации в течение 18-24 часов при
комнатной температуре. О наличии лецитиназы свидетельствует, как
уже было отмечено, образование вокруг колонии радужного венчика.
Наличие пигмента легко определяется на глаз.
Как правило, штаммы S. aureus обладают лецитиназой и
пигментом, а культуры двух других видов лишены их. Возможны,
однако, исключения: некоторые штаммы S. aureus не имеют пигмента
или лецитиназы, а ряд штаммов S. epidermidis обладает лецитиназной
активностью.
Окончательная идентификация S. aureus требует постановки еще 2
тестов. На первом этапе определяют наличие у штаммов
плазмокоагулазы. Если после этого штамм идентифицировать не
удается, дополнительно определяют один из двух следующих
признаков: наличие ДНК-азы (что предпочтительнее) или способность
ферментировать маннит в анаэробных условиях. Схема идентификации
представлена в табл. 3.
При наличии положительного результата в реакции
плазмокоагуляции и хотя бы в одном из двух предварительных тестов
(пигмент, лецитиназа) исследуемый штамм может быть отнесен к виду
S. aureus (варианты 1-3). Отсутствие плазмокоагулазы и хотя бы
одного из первых двух признаков дает основание считать, что штамм
не принадлежит к S. aureus (варианты 5-7). Расхождения между
результатами реакции плазмокоагуляции, с одной стороны, и двух
предварительных тестов - с другой (варианты 4 и 8) требуют
постановки одного из двух дополнительных тестов (ДНК-аза или
ферментация маннита в анаэробных условиях). В случае совпадения
результатов дополнительного теста с результатами реакции
плазмокоагуляции штамм считается либо относящимся к виду S. aureus
(при положительных результатах, варианты 4а и 4в), либо не
относящимся к нему (при отрицательных результатах, варианты 8б и
8г). При расхождении результатов реакции плазмокоагуляции и
дополнительного теста вопрос решается с учетом большинства
положительных (принадлежность к виду S. aureus, варианты 8а и 8в)
или отрицательных (принадлежность к другим видам, варианты 4б и
4г) результатов. Проводить идентификацию S. aureus лишь на
основании результата одного теста не рекомендуется.
Реакция плазмокоагуляции
Принцип. Под действием фермента плазмокоагулазы активируется
естественная система свертывания крови (плазминогенпротромбин).
Реактивы. Плазма кроличья, сухая, цитратная для реакции
плазмокоагуляции, готовая.
При отсутствии сухой кроличьей, лиофилизированной плазмы
готовят свежую плазму.
Приготовление свежей плазмы
Стерильно взятую из сердца кровь кролика в количестве 8 мл
вносят в пробирку с 2 мл стерильного 5% раствора лимоннокислого
натрия, смешивают и центрифугируют для осаждения форменных
элементов крови в течение 10 минут при 1500 об/мин. Плазму
отсасывают, разводят в 5 раз стерильным физиологическим раствором
и разливают в стерильные пробирки по 0,5 мл.
Ход исследования
В пробирку вносят 1 петлю суточной агаровой культуры
исследуемого штамма, которую суспендируют в плазме. Штатив с
пробирками помещают в термостат при 37°С и регистрируют результаты
реакции через 1, 2, 4 и 18 часов инкубации.
Оценка результатов
Появление на дне пробирки студнеобразного сгустка любого
размера считается положительным результатом реакции. Положительным
результатом следует считать наличие плазмокоагуляции в первые 4
часа инкубации. Отсутствие свертывания плазмы в течение 18 часов
расценивается как отрицательный результат. В качестве контроля
рекомендуется ставить реакцию с заведомо коагулирующим и
некоагулирующим штаммами, а также оставлять одну пробирку с
плазмой незасеянной.
Определение ДНК-азы
Принцип. Под действием ДНК-азы (дезоксирибонуклеазы)
добавленная в плотную среду высокополимерная ДНК распадается на
низкополимерные фрагменты. При этом мутная среда, содержащая
высокополимерную ДНК, становится прозрачной.
Реактивы. Сухая высокополимерная ДНК; 2 моль/л раствор едкого
натра (NaOH), 3 моль/л раствор соляной кислоты (HCl), стерильный
10%-ный раствор хлористого кальция (CaCl2), 50 мг, 100 мг или 200
мг высокополимерной ДНК растворяют в 3-5 мл дистиллированной воды,
подщелоченной 4-5 каплями 2 моль/л NaOH. К 100 мл расплавленного
1,8% мясопептонного агара (рН 8,6) добавляют приготовленный
раствор ДНК и прогревают среду 20 минут в кипящей бане. Затем в
слегка охлажденный агар вносят 0,5 мл стерильного 10% раствора
СаСl2, среду тщательно перемешивают и разливают тонким слоем в
чашки Петри (по 10-12 мл на чашку), в зависимости от взятой дозы.
Содержание ДНК в готовой среде составляет 0,5; 1,0 или 2,0 мг/мл.
Ход исследования
Суточную агаровую культуру исследуемого штамма засевают
коротким (1-1,5 см) штрихом на поверхность подсушенного агара. На
одну чашку можно посеять до 16 штаммов. После 18-24 часовой
инкубации при 37°С поверхность агара заливают небольшим
количеством (5-7 мл) 3 моль/л раствора HCl. Через 2-3 минуты
кислоту сливают и регистрируют результаты.
Оценка результатов
Появление вокруг культуры прозрачной зоны (деполимеризация
ДНК), которая в 4 и более раз превосходит по ширине зону
микробного роста (ширина последней должна превышать 2-3 мм),
свидетельствует о положительной реакции на ДНК-азу. Меньшая зона
деполимеризации ДНК расценивается как сомнительная реакция и учету
не подлежит.
Определение ферментации маннита
в анаэробных условиях
См. определение ферментации глюкозы в анаэробных условиях.
Определение проводят аналогичным путем, но в качестве субстрата
используют 1% раствор маннита.
Идентификация S. epidermidis и S. saprophyticus
Те штаммы, которые после исследований, описанных в предыдущем
разделе, признаны не относящимися к S. aureus, подвергаются
дальнейшей идентификации для установления их видовой
принадлежности.
Дифференциацию S. epidermidis от S. saprophyticus
рекомендуется проводить в 3 тестах: определение 1) устойчивости к
новобиоцину, 2) фосфатазы, 3) способности окислять маннит.
Упрощенная схема идентификации указанных видов представлена в
таблице 4. Для штаммов S. epidermidis характерны: чувствительность
к новобиоцину, наличие фосфатазы, неспособность окислять маннит,
для штаммов S. saprophyticus - противоположные свойства. Поскольку
не все стафилококки по своим характеристикам укладываются в
указанную схему, такие штаммы следует обозначать Staphylococcus
spp.
Определение устойчивости к новобиоцину <*>
Принцип. Антибиотик новобиоцин в избранной концентрации
подавляет рост штаммов S. epidermidis, но не влияет на рост
естественно устойчивых к нему штаммов S. saprophyticus.
--------------------------------
<*> - Может быть использован метод диффузии в агар с
применением бумажных стандартных дисков с новобиоцином.
Ингредиенты. Из стерильного водного раствора новобиоцина (10
мг в 10 мл дистиллированной воды) берут 0,5 мл и вносят в пробирку
с 3 мл стерильного физиологического раствора. Содержимое пробирки
переносят во флакон с 250 мл расплавленного и охлажденного до 50°С
1,8% питательного агара, перемешивают и разливают среду в чашки
Петри. Конечная концентрация новобиоцина в среде составляет 2
мкг/мл.
Ход исследования
Одну каплю суточной бульонной культуры исследуемого штамма
засевают с помощью петли на поверхность агара (на одну чашку можно
сеять не менее 25 штаммов). Посевы инкубируют 24 часа при 37°С,
регистрируют результаты. Рост штамма в виде крупной бляшки
свидетельствует об его устойчивости к новобиоцину. Полное
отсутствие роста или наличие небольшого числа отдельных мелких
колоний дает основание считать штамм чувствительным к новобиоцину.
Тест на фосфатазу
Определение фосфатазы можно проводить двумя методами, дающими
совпадающие результаты, с использованием двух разных реактивов (в
зависимости от наличия одного из них).
Принцип. Фермент фосфатаза отщепляет фосфатную группу от
фосфорорганического соединения. Образующийся в результате продукт
реакции либо уже является окрашенным, либо приобретает окраску при
добавлении соответствующего реактива.
Реактивы. Динатриевая соль пара-нитрофенилфосфата (1-й метод);
фенолфталеинфосфат натрия, 25% раствор аммиака (2-й метод).
Ход исследования
1-й метод. 50 мг пара-нитрофенилфосфата (динатриевая соль)
растворяют в 3 мл стерильной дистиллированной воды. Указанный
раствор добавляют к 100 мл расплавленного и охлажденного 1,8%
питательного агара, перемешивают и разливают в чашки Петри.
Конечная концентрация реактива в среде составляет 0,05%. Суточные
агаровые культуры исследуемых штаммов с помощью петли сеют на
среду (не более 16 штаммов на одну чашку). Учет результатов
проводят после 18-24 часовой инкубации при 37°С. Реакция считается
положительной, если в толще среды вокруг выросшей колонии видна
зона интенсивного желтого окрашивания.
2-й метод. Фенолфталеинфосфат натрия добавляют к агару в
концентрации 0,01%. Посев и инкубация осуществляется также, как и
в предыдущем методе. По окончании инкубации на крышку чашки Петри
наливают 5-6 капель 25% раствора аммиака, выдерживают чашку в
перевернутом состоянии 5-10 минут, подвергая выросшую культуру
воздействию паров аммиака, после чего регистрируют результаты. О
положительной реакции свидетельствует появление розового
окрашивания макроколоний.
Определение окисления маннита
Принцип. При окислении маннита в аэробных условиях, образуется
уксусная кислота, которая закисляет среду, что выявляется с
помощью индикатора.
Ингредиенты. Для постановки опыта рекомендуется плотная (1,8%
агара) среда с индикатором ВР и среда Хью-Лейфсона, содержащие 1%
маннита. Среду разливают в чашки Петри.
Ход исследования
Суточные агаровые культуры исследуемых штаммов сеют на среду
бляшками (не более 16 штаммов на одну чашку). Посевы инкубируют
при 37°С, результаты регистрируют через 1 сутки. Появление желтого
окрашивания вокруг макроколонии свидетельствует о положительной
реакции.
Фаготипирование штаммов S. aureus <*>
Для внутривидового дифференцирования S. aureus применяется
метод фаготипирования, позволяющий получить фаговую метку
большинства штаммов и с большей долей вероятности решить вопрос об
идентичности или различии сопоставляемых культур, что очень важно
для выявления источников и путей распространения стафилококковой
инфекции.
--------------------------------
<*> - Сухие фаги Международного набора (22 фага) выпускаются
предприятием по производству бактерийных препаратов
НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи АМН СССР. В
каждую коробку вложена инструкция по применению фагов и учету
результатов.
Принцип. Штаммы S. aureus обладают избирательной
чувствительностью к литическому действию ряда стафилококковых
бактериофагов, составляющих Международный набор типовых фагов.
Чувствительность исследуемого штамма к одному или нескольким
типовым фагам определяет фаготип штамма, т.е. его фаговую метку.
Таблица 3
Схема идентификации S. aureus
------T------------------------------T-----------T---------------¬
¦ NN ¦ Наличие ¦Ферментация¦Принадлежность ¦
¦вари-+--------T------T------T-------+ маннита в ¦ штамма к виду ¦
¦анта ¦пигмента¦леци- ¦коагу-¦ДНК-азы¦анаэробных ¦Staphylococcus ¦
¦ ¦ ¦тиназы¦лазы ¦ ¦ условиях ¦ aureus ¦
+-----+--------+------+------+-------+-----------+---------------+
¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦ 7 ¦
+-----+--------+------+------+-------+-----------+---------------+
¦ 1. ¦ + ¦ + ¦ + ¦ ¦ ¦ да ¦
+-----+--------+------+------+-------+-----------+---------------+
¦ 2. ¦ - ¦ + ¦ + ¦ ¦ ¦ да ¦
+-----+--------+------+------+-------+-----------+---------------+
¦ 3. ¦ + ¦ - ¦ + ¦ ¦ ¦ да ¦
+-----+--------+------+------+-------+-----------+---------------+
¦ 4. ¦ - ¦ - ¦ + ¦ ¦ ¦ ? ¦
+-----+--------+------+------+-------+-----------+---------------+
¦ 4а. ¦ - ¦ - ¦ + ¦ + ¦ ¦ да ¦
+-----+--------+------+------+-------+-----------+---------------+
¦ 4б. ¦ - ¦ - ¦ + ¦ - ¦ ¦ нет ¦
+-----+--------+------+------+-------+-----------+---------------+
¦ 4в. ¦ - ¦ - ¦ + ¦ ¦ + ¦ да ¦
+-----+--------+------+------+-------+-----------+---------------+
¦ 4г. ¦ - ¦ - ¦ + ¦ ¦ - ¦ нет ¦
+-----+--------+------+------+-------+-----------+---------------+
¦ 5. ¦ - ¦ - ¦ - ¦ ¦ ¦ нет ¦
+-----+--------+------+------+-------+-----------+---------------+
¦ 6. ¦ - ¦ + ¦ - ¦ ¦ ¦ нет ¦
+-----+--------+------+------+-------+-----------+---------------+
¦ 7. ¦ + ¦ - ¦ - ¦ ¦ ¦ нет ¦
+-----+--------+------+------+-------+-----------+---------------+
¦ 8. ¦ + ¦ + ¦ - ¦ ¦ ¦ ? ¦
+-----+--------+------+------+-------+-----------+---------------+
¦ 8а. ¦ + ¦ + ¦ - ¦ + ¦ ¦ да ¦
+-----+--------+------+------+-------+-----------+---------------+
¦ 8б. ¦ + ¦ + ¦ - ¦ - ¦ ¦ нет ¦
+-----+--------+------+------+-------+-----------+---------------+
¦ 8в. ¦ + ¦ + ¦ - ¦ ¦ + ¦ да ¦
+-----+--------+------+------+-------+-----------+---------------+
¦ 8г. ¦ + ¦ + ¦ - ¦ ¦ - ¦ нет ¦
L-----+--------+------+------+-------+-----------+----------------
Таблица 4
Схема идентификации S. epidermidis И S. saprophyticus
-----------------T--------------T-------------T------------------¬
¦ ¦ Устойчивость ¦ Фосфатаза ¦Окисление маннита ¦
¦ ¦ к новобиоцину¦ ¦ ¦
+----------------+--------------+-------------+------------------+
¦S. epidermidis ¦ - ¦ + ¦ - ¦
+----------------+--------------+-------------+------------------+
¦S. saprophyticus¦ + ¦ - ¦ + ¦
L----------------+--------------+-------------+-------------------
4. Схема идентификации стафилококков
День 1.
Посев исследуемого материала на МЖСА или кровяной агар.
День 2.
А. Учет наличия лецитиназы и пигмента (МЖСА), гемолиза
(кровяной агар).
Б. Приготовление и просмотр окрашенных по Граму мазков.
В. Постановка и учет каталазной реакции.
Г. Отсев чистой культуры на косой агар.
День 3.
А. Окончательный учет наличия пигмента.
Б. Постановка теста на ферментацию глюкозы в анаэробных
условиях.
В. Постановка реакции плазмокоагуляции и предварительный учет
ее результатов.
Г. Отсев чистой культуры на бульон.
День 4.
А. Учет ферментации глюкозы.
Б. Окончательный учет реакции плазмокоагуляции и сопоставление
ее результатов с результатами определения лецитиназы и пигмента
(см. табл. 3). В зависимости от этого:
а) при вариантах 1, 2 и 3 штамм идентифицируется как S. aureus
- проводится фаготипирование;
б) при вариантах 5, 6 и 7 штамм не относится к S. aureus -
проводится его дальнейшая идентификация: постановка тестов на
устойчивость к новобиоцину (посев бульонной культуры), окисление
маннита, тест на фосфатазу (посев агаровой культуры);
в) при вариантах 4 и 8 идентификация еще невозможна;
постановка тестов на ДНК-азу или ферментацию маннита в анаэробных
условиях.
День 5.
А. Предварительный учет ферментации глюкозы.
Б. Учет результатов фаготипирования S. aureus (см. пункт А дня
3).
В. Учет результатов определения устойчивости к новобиоцину,
окисление маннита, фосфатазы (см. пункт Б дня 3); штамм
идентифицируется либо как S. epidermidis, либо как S.
saprophyticus, либо как S. spp. (табл. 4). Идентификацию можно
считать окончательной при положительном результате анаэробной
ферментации глюкозы.
Г. Учет результатов определения ДНК-азы (см. пункт Б дня 3);
при вариантах 4а и 8а (табл. 3) ход исследований тот же, что в
пункте А дня 3; при вариантах 4б и 8б ход исследований тот же, что
в пункте Б дня 3.
Д. Учет анаэробной ферментации маннита (см. пункт Б дня 3).
День 6.
А. Учет ферментации глюкозы.
Б. Учет ферментации маннита.
В. Учет результатов фаготипирования S. aureus и результатов
определения устойчивости к новобиоцину, окисления маннита,
фосфатазы коагулазонегативных стафилококков (раздел Б, день 4).
День 7.
А. Окончательный учет ферментации глюкозы.
Б. Учет ферментации маннита.
День 8.
А. Окончательный учет ферментации маннита, далее ход
исследований как в разделе Г дня 4. Если положительный результат
ферментации маннита получен ранее, то сроки исследования
сокращаются.
День 9.
Учет результатов (см. раздел В дня 5).
1. Среда Хью-Лейфсона - см. раздел 3.2.
2. Среда с индикатором ВР и одним из углеводов - см. раздел
3.2.
3. Тест на каталазу - см. раздел 3.3.
2.2. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ
МИКРОБОВ СЕМЕЙСТВА СТРЕПТОКОККОВЫХ
(Streptococcaceae)
Согласно классификации, представленной в "Кратком определителе
бактерий Берги" (М., 1980 г.) семейство Streptococcaceae
объединяет 5 родов, из них три рода Streptococcus, Aerococcus,
Gemella включают представителей, которые могут быть патогенными
для человека.
Род Streptococcus объединяет обширную, широко распространенную
в природе группу грамположительных, факультативно анаэробных
микроорганизмов, облигатным признаком которых является
отрицательный катализный тест. Род Streptococcus объединяет 21 вид
стрептококков, различающихся по антигенным, биохимическим
свойствам патогенности в отношении человека.
Облигатно патогенным для человека видом является S. pyogenes
(группа А). Стрептококки этого вида являются возбудителями ряда
острозаразных заболеваний, поражающих преимущественно детей и лиц
молодого возраста. Они являются также причиной возникновений
гнойно-воспалительных процессов разной локализации и
этиологическим фактором таких хронических заболеваний, как
ревматизм, диффузный гломерулонефрит.
S. pneumoniae (пневмококк) является возбудителем острых
пневмоний, часто сопровождающихся бактериемией, менингитов у
детей, острых отитов, гнойных конъюнктивитов и др.
Среди многочисленных условно-патогенных для человека видов
стрептококка лидирующее место занимают S. agalactiae (группа В),
S. faecalis и S. faecium (группа D).
Названные виды стрептококков являются одной из частых причин
различных заболеваний урогенитального тракта, постхирургических
гнойно-воспалительных процессов кишечника и брюшины, тяжелых
пуэрперальных инфекций и инфекций новорожденных. Иногда они
участвуют в этиологии и патогенезе подострого эндокардита.
S. faecalis и S. faecium, по месту естественного их обитания, в
кишечнике человека и кишечнике различных животных, выделены в
отдельную группу "энтерококков".
Представитель рода Aerococcus - A. viridans выделяется при
заболеваниях мочеполового тракта и при эндокардитах.
Представитель рода Gemella - вид G. haemolysans выделяется из
секрета бронхов и слизи дыхательных путей.
Установление принадлежности выделенных
культур к роду Streptococcus
Первый день. Идентификация стрептококков начинается с изучения
колоний в первичных посевах патологического материала на чашках с
5% кровяным агаром.
По виду гемолиза на кровяном агаре стрептококки делятся на 3
группы.
1. Гемолитические стрептококки (S. haemolyticus),
обуславливающие лизис эритроцитов с образованием вокруг колоний
прозрачной зоны (полного просветления среды), шириной от десятых
долей до нескольких миллиметров. Колонии гемолитических
стрептококков бывают:
а) мукоидные, диаметром 1,5-2,5 мм, правильной круглой формы,
блестящие, напоминающие своим видом капельки росы. Данный вид
колоний характерен для содержащих капсулу свежевыделенных штаммов
S. pyogenes (группы А);
б) шероховатые ("matt" форма), 1,5-2,5 мм в диаметре, круглые
колонии, серовато-белого цвета, с характерным, слегка приподнятым
центром.
Этот вид колоний также характерен для свежевыделенных,
содержащих М-протеин, штаммов;
в) гладкие ("glossi" форма), мелкие, 1-1,5 мм в диаметре,
колонии сферической формы с ровным краем, с блестящей влажной
поверхностью. Этот тип колоний характерен для слабо вирулентных и
авирулентных штаммов S. pyogenes, многих штаммов S. agalactiae и
некоторых штаммов энтерококков.
2. Зеленящие стрептококки S. viridans, образующие на кровяном
агаре альфа-реакцию в виде полупрозрачной, зеленоватого оттенка
зоны, обусловленной превращением гемоглобина в метгемоглобин.
Зеленящие стрептококки растут в виде мелких, 1,0-1,5 мм в
диаметре, колоний серовато-зеленоватого цвета, с гладкой или
шероховатой поверхностью. Этот тип колоний характерен для многих
стрептококков вегетирующих постоянно на слизистой полости рта
(S. salivarius, S. sanguis, S. bovis), для отдельных штаммов S.
agalactiae, а также для S. faecalis, S. faecium, A. viridans.
Колонии пневмококка на кровяном агаре полупрозрачные, плоские с
приподнятым краем и блюдцеобразным центром, вокруг колоний
зеленящая зона гемолиза.
R-формы образуют сферические колонии с неровными краями. III
тип пневмококка иногда имеет вид серовато-мутных, слизистых
колоний до 2 мм в диаметре, склонных к слиянию между собой.
3. Негемолитические стрептококки (S. anhaemolyticus), не
реагирующие с эритроцитами и в процессе своего роста не
вызывающие изменений кровяного агара.
Гемолитическая активность способствует выявлению патогенных
штаммов стрептококка, не являясь, однако,
дифференциально-диагностическим признаком их патогенности. Штаммы
негемолитических стрептококков, выделенные от человека,
практического значения не имеют, т.к., за очень редким
исключением, они не связаны с инфекционным процессом.
Из колоний, подозрительных в отношении стрептококка,
бактериальной петлей берут небольшое количество материала, делают
мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют.
Микроскопия препаратов на данном этапе исследования
предусматривает дифференциацию стрептококков от грамотрицательных
гемофильных микроорганизмов, рост которых на кровяном агаре сходен
с ростом гемолитических стрептококков.
В препаратах, приготовленных из колоний с плотных питательных
сред, стрептококки располагаются парами, короткими цепочками,
иногда образуют скопления, напоминающие грозди стафилококков.
Морфологические свойства стрептококков, особенно в первых
генерациях, характеризуются выраженным полиморфизмом. Наряду с
шарообразными формами в мазках содержатся вытянутые в длину грубые
кокки разной величины, даже в пределах одной цепочки. Пневмококки
представляют собой ланцетовидные диплококки с заостренными
наружными концами, каждая пара кокков или несколько пар заключены
в капсулу, образуя цепочки.
При обнаружении стрептококков в препарате оставшийся от
микроскопического исследования материал колоний снимают петлей и
|
