|
Стр. 4
микроскопического исследования материал колоний снимают петлей и
инокулируют в питательный бульон с сывороткой крупного рогатого
скота (10%) или глюкозы (0,2%), или высевают на питательную среду
для выделения гемокультур стрептококков. Оптимальная температура
культивирования стрептококков - 37°С.
Второй день. Просматривают пробирки с посевами, сделанными
накануне. Характер роста стрептококков в жидких питательных средах
определяется длиной цепочек. Соответственно этому различают:
а) придонно-пристеночный рост с образованием мелкокрошковатого
осадка с сохранением полной прозрачности среды. Зернистый рост
характерен для видов и штаммов стрептококка, образующих длинные
цепочки (S. pyogenes);
б) придонный рост в виде пушистого рыхлого осадка, с
сохранением полной прозрачности или равномерным более или менее
интенсивным помутнением надосадочного слоя бульона (S.
pneumoniae). С уменьшением длины цепочек возрастает наклонность к
диффузному росту (S. agalactiae, отдельные штаммы вирулентных S.
pyogenes, S. faecalis, S. faecium);
в) диффузный рост с интенсивным помутнением бульона и
образованием небольшого гомогенного осадка (S. faecalis, S.
faecium, отдельные штаммы S. agalactiae, единичные штаммы S.
pyogenes).
Из содержимого пробирок бактериальной петлей берут небольшое
количество материала, делают мазок, окрашивают его по Граму и
микроскопируют. После установления чистоты выделенной культуры
приступают к идентификации вида стрептококка.
Идентификация гемолитического стрептококка
S. pyogenes (группы А) <*>
Идентификацию культур гемолитического стрептококка (группы А)
осуществляют на третий день исследования серологическим методом
Ленсфильд, модифицированным в лаборатории стрептококковых инфекций
ИЭМ АМН СССР им. Н.Ф.Гамалеи.
--------------------------------
<*> - Метод является дополнительным к основным методам
идентификации.
Принцип. Образование видимого преципитата в результате
взаимодействия группоспецифического полисахарида С с
соответствующими ему антителами группоспецифической
антистрептококковой сыворотки.
Ингредиенты
1. Солянокислый экстракт, приготовленный из испытуемых штаммов
стрептококка.
2. Преципитирующая диагностическая сыворотка к стрептококку
группы А.
3. 1% агар очищенный в 0,85% растворе хлорида натрия.
Приготовление группоспецифических антигенов
а) Колонии стрептококков, подлежащие исследованию, засевают во
флаконы с 50 мл питательного бульона;
б) суточную бульонную культуру стрептококков, выращенную на
питательном бульоне, отмывают большими объемами 0,85% раствора
хлорида натрия, применяя для этой цели центрифугирование в течение
30 минут при 3 тыс. об/минуту.
К отмытому осадку микробных тел добавляют 0,06 моль/л соляную
кислоту, приготовленную на 0,85% растворе хлорида натрия, из
расчета: 0,5 мл раствора на 10 (в степени 11) микробных клеток
(число микробных клеток определяют по оптическому стандарту
мутности).
Приготовленную в соляной кислоте взвесь периодически
встряхивают, кипятят 15 минут (от момента закипания) в водяной
бане. После кипячения охлаждают и центрифугируют для отделения
экстракта от микробной массы. Доводят рН экстракта до 7,0,
добавляя в него 1 моль/л раствор едкого натра.
В качестве индикатора используют 0,01 мл 0,04% раствора
бромтимолового синего. Во время нейтрализации экстракт из
соломенно-желтого становится оливково-зеленым. Образующийся при
добавлении щелочи осадок удаляют центрифугированием. Готовые
экстракты хранят в холодильнике.
Техника постановки реакции преципитации в агаровом геле
для идентификации стрептококков группы А
На предметное стекло или тонкие стеклянные пластины наливают
1% расплавленный агар, приготовленный на 0,85% растворе хлорида
натрия так, чтобы толщина его слоя не превышала 2 мм.
В застывшем прозрачном агаре при помощи трафарета и
металлической полой трубочки вырезают контуры лунок диаметром 4
мм, агар из которых отсасывают при помощи капилляра пастеровской
пипетки.
Одну лунку наносят в центре и 6 лунок - по радиусам на равном
расстоянии от центра. Расстояние между краями центральной лунки и
периферическими лунками должно составлять 3 мм.
Центральную лунку заполняют диагностической сывороткой к
стрептококку группы А, концентрированную в 2,5 раза. Для этого к
содержимому ампулы (0,5 мл высушенной сыворотки) добавляют 0,2 мл
дистиллированной воды и оставляют на 5 минут при комнатной
температуре для полного растворения сыворотки.
В периферические лунки вносят солянокислые экстракты,
приготовленные из исследуемых культур стрептококка. Одна из
периферических лунок служит для постановки контроля. Ее заполняют
солянокислым экстрактом, содержащим полисахарид стрептококка гр.
А, который в качестве эталона прилагается в лиофилизированном виде
к каждой коробке диагностической стрептококковой сыворотки группы
А. После заполнения лунок стекла с агаром помещают во влажную
камеру (на сетку эксикатора с водой) и оставляют при комнатной
температуре. Просмотр пластин производят через 2-3 часа и
окончательно - через 24 часа от момента постановки реакции. Перед
учетом реакции пластины с агаром погружают на 20 минут в 10%
раствор хлорида натрия для устранения неспецифической реакции с
тейхоевой кислотой, которая может находиться в солянокислом
экстракте исследуемого штамма стрептококка. Экстракты, содержащие
полисахаридные антигены стрептококка группы А, образуют с
соответствующими антителами диагностической сыворотки тонкие,
молочно-белого цвета линии преципитата, расположенные между
центральной и соответствующей антигену стрептококка группы А
периферической лункой.
Идентификация стрептококков S. agalactiae (группа В)
Штаммы гемолитических и зеленящих стрептококков, выделенные
при пуэрперальных инфекциях, инфекциях новорожденных и
заболеваниях урогенитального тракта дифференцируют с S. agalactiae
группы В.
Для идентификации S. agalactiae используют САМР-тест.
САМР-тест
Австралийские ученые Christiae, Atkins, Munch-Petersen (1944)
предложили оригинальный метод, получивший название САМР-теста по
первым буквам фамилий его авторов.
Принцип. Выращивание на кровяном агаре S. agalactiae совместно
со стафилококком, продуцентом токсина, ведет к усилению лизиса
эритроцитов и соответственно - увеличению образуемых зон гемолиза.
Ход исследования
На пластинку кровяного агара, толщиной не более 3 мм, через
центр чашки сплошной линией наносят суточную бульонную культуру
стафилококка <*>, продуцирующего бета-токсин. Спустя несколько
минут на эту же чашку высевают штаммы стрептококка, подлежащие
идентификации. Суточные бульонные культуры стрептококков наносят
отдельными штрихами, параллельными друг другу и перпендикулярными
по отношению к линии посева стафилококка, не доходя до нее 2 мм.
На одну чашку высевают не более 4 штаммов стрептококка. Посевы
инкубируют при 37°С в течение 18-15 часов. При положительном
результате реакции в месте пересечения посевов стрептококка со
стафилококком гемолиз приобретает форму бабочки.
--------------------------------
<*> - Используют штамм S. aureus Sg N 511.
Дифференциация гемолитических и зеленящих
стрептококков с энтерококками
Культуры гемолитических и зеленящих стрептококков, клетки
которых при микроскопическом исследовании представляют собой
грамположительные, полиморфные кокки, располагающиеся парами,
короткими цепочками или небольшими скоплениями, необходимо
дифференцировать с энтерококками.
Первый день. Суточную бульонную культуру стрептококка, для
идентификации ее с энтерококками, высевают:
а) на желчно-щелочной агар (ЖЩА),
б) в молоко с 0,1% метиленового синего.
Второй и третий дни. 1. На ЖЩА - растут только энтерококки.
Колонии их круглые, блестящие, с ровным краем, синеватого цвета,
слегка выпуклые, появляются большей частью на третьи сутки
инкубирования в термостате при 37°С.
2. В пробирках с молоком энтерококк редуцирует метиленовый
синий, вследствие чего уже через 16-20 часов после посева и
инкубации в термостате среда обесцвечивается и из голубой
становится кремового цвета.
Способность микробных культур к росту на ЖЩА и редуцированию
0,1% метиленового синего в молоке указывает на принадлежность
исследуемой культуры к группе энтерококков.
Дифференциация энтерококков внутри группы <*>
Внутри группы энтерококки делятся по ферментативным,
редуцирующим и гемолитическим свойствам на ряд видов и подвидов.
Дифференциация культур энтерококка внутри группы ведется по схеме,
представленной в таблице 5.
--------------------------------
<*> - Дополнительное исследование при проведении более
глубокой дифференциации.
Первый день. Бульонные культуры энтерококков для установления
их видовой принадлежности высевают параллельно на 3 среды:
а) на энтерококковую дифференциально-диагностическую среду
(ЭДДС) для определения гемолитической, протеолитической активности
и способности редуцировать ТТХ,
б) на сахарно-дрожжевой агар для испытания резистентности
исследуемой культуры к теллуриту калия,
в) в столбик с 0,2% агаром для определения подвижности
энтерококков.
Таблица 5
Дифференциация энтерококков внутри группы
-------------------T--------T-----------------------T------------¬
¦ ¦Резист- ¦ Энтерококковая ¦ ¦
¦ ¦ентность¦ дифференциально- ¦ ¦
¦ Виды и подвиды ¦к теллу-¦ диагностическая среда ¦Подвижность ¦
¦ ¦риту ка-+-------T-------T-------+в 0,2% агаре¦
¦ ¦лия ¦редук- ¦гемолиз¦протео-¦ ¦
¦ ¦ ¦ция ТТХ¦ ¦ лиз ¦ ¦
+------------------+--------+-------+-------+-------+------------+
¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦
+------------------+--------+-------+-------+-------+------------+
¦S. faecalis ¦ + ¦ + ¦ - ¦ - ¦ - ¦
+------------------+--------+-------+-------+-------+------------+
¦S. faecalis subsp.¦ + ¦ + ¦ + ¦ +- ¦ - ¦
¦zymogenes ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+------------------+--------+-------+-------+-------+------------+
¦S. faecalis subsp.¦ + ¦ + ¦ - ¦ + ¦ - ¦
¦liquefaciens ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+------------------+--------+-------+-------+-------+------------+
¦S. faecium ¦ - ¦ - ¦ +- ¦ - ¦ - ¦
+------------------+--------+-------+-------+-------+------------+
¦Подвижные ¦ + ¦ + ¦ +- ¦ - ¦ + ¦
¦энтерококки ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
L------------------+--------+-------+-------+-------+-------------
Второй день. 1. Через 15-18 часов предварительно учитывают
гемолитическую активность энтерококков, ввиду того, что при
инкубации в термостате многие штаммы энтерококков вырабатывают
кислые продукты метаболизма со снижением рН питательной среды до
3,8-4,2, разрушением гемоглобина и появлением вокруг колоний зон
бурого цвета.
При учете ферментативной (гемолитической и протеолитической)
активности определяется 4 возможных варианта изменения ЭДДС:
а) гемолитически активные штаммы энтерококков образуют вокруг
колоний белые зоны, соответствующие цвету молочного агара,
б) у протеолитически активных штаммов появляются
четко выраженные темно-красные или бурые зоны вокруг колоний,
в) при наличии обоих (гемолитического и протеолитического)
ферментов среда вокруг колоний просветляется, приобретая вид
обычного питательного агара,
г) штаммы энтерококков, не продуцирующие этих ферментов, сред
не изменяют.
В конце первых суток инкубации учитывают на этой же среде
способность исследуемых культур к редукции
2,3,5-трифенилтетразолия хлорида (ТТХ). S. faecalis и его варианты
(S. faecalis subsp. zymogenes, S. faecalis subsp. liquefaciens),
восстанавливающие ТТХ, растут в виде вишнево-красных колоний с
белыми ободками.
Вид S. faecium не восстанавливает ТТХ - колонии его бесцветны
или окрашены в слабо-розовый цвет.
Подвижные формы энтерококков, обладая слабой редуцирующей
активностью, образуют (особенно в первичном посеве материала)
карликовые колонии розовых оттенков разной интенсивности.
2. На сахарно-дрожжевом агаре с теллуритом калия (0,07%)
растут только штаммы вида S. faecalis, устойчивые к высоким
концентрациям теллурита калия. В процессе роста они
восстанавливают теллурит калия, образуя при этом черные колонии,
окруженные узким бесцветным ободком.
3. В полужидком (0,2%) агаре, засеянном уколом, подвижные
формы энтерококков вызывают диффузное помутнение всего столбика
среды, тогда как неподвижные виды (S. faecium, S. faecalis и его
разновидности) растут только по ходу прокола.
Таким образом, основными тестами дифференциации видов S.
faecalis, S. faecium являются редукция ТТХ и устойчивость к
теллуриту калия.
S. faecalis и его варианты: S. faecalis zymogenes, S. faecalis
liquefaciens различаются по образованию гемолитического и
протеолитического ферментов.
Основным диагностическим признаком подвижных энтерококков,
позволяющим дифференцировать их от всех остальных видов этой
группы, является подвижность.
Идентификация пневмококков (S. pneumoniae)
Оптохиновый тест
Чистую культуру засевают на агар, содержащий
1:50.000-1:100.000 оптохина. На следующие сутки учитывают
результат. Пневмококки не растут в присутствии оптохина.
Можно использовать бумажные диски с 6 мкг оптохина, которые
накладываются после посева на поверхность среды (посев лучше
производить секторами). У пневмококков вокруг диска образуется
зона задержки роста не менее 18 мм.
Тест с желчью
Основан на способности 10% желчи и 2% раствора оксихолатов
лизировать пневмококк. В две пробирки с 2-3 мл сывороточного
бульона с 10% желчи крупного рогатого скота и без нее добавляют
0,5-1 мл испытуемой бульонной культуры и выдерживают 1 час при
37°С. При лизисе пневмококка отмечается просветление бульона по
сравнению с контролем. При сомнительном результате пробирки
оставляют при комнатной температуре до следующего дня и проводят
окончательный учет результатов.
Можно использовать диски, пропитанные 20% раствором желчи.
Диски накладывают на выросшую культуру и чашки инкубируют в
термостате 1-2 часа. По окружности диска на расстоянии 1-2 мм
пневмококки лизируются, а стрептококки остаются без изменения.
Серологические тесты
Основаны на реакции полисахаридных антигенов капсулы с
соответствующими антисыворотками. Используют реакции Нейфельда и
агглютинации на стекле.
Реакция Нейфельда ("набухания капсулы") основана на увеличении
капсулы пневмококков в присутствии иммунной сыворотки. На мазок с
чистой культурой наслаивают диагностическую поливалентную
сыворотку, добавляют по 1 капле раствора метиленового синего и
накрывают покровным стеклом; выдерживают при 37°С от 10 минут до 1
часа (в зависимости от активности сыворотки). Затем
микроскопируют, сравнивая с контрольным мазком, где вместо
сыворотки использовали физиологический раствор.
Реакцию агглютинации ставят на стекле с диагностическими
сыворотками, оценивая интенсивность реакции в баллах (крестах).
При отсутствии диагностических сывороток и оптохина
пневмококки можно идентифицировать с помощью теста с желчью в
сочетании с культуральными и морфологическими свойствами.
Биопроба <*>
Используется для выделения пневмококков из материала и
изучения вирулентности чистой культуры. Гомогенизированный
материал разводят физиологическим раствором 1:2-1:5 и вводят
внутрибрюшинно по 0,5 мл 2 белым мышам весом 18-20 г. Через сутки
вскрывают погибших животных или забивают 1 мышь. Производят посев
крови из сердца на кровяной агар, можно также исследовать печень,
селезенку.
--------------------------------
<*> - Рекомендуется как дополнительный тест.
Вирулентность изучают, заражая белых мышей путем введения
внутрибрюшинно по 0,5 мл различных разведений чистой культуры
пневмококка (начиная с 10 (в степени -8) до 10 (в степени -1)).
Заражают по 4 мыши на каждое разведение. Через 5-7 дней определяют
LD 50, по величине которой судят о вирулентности выделенной
культуры.
Питательные среды
1. Кровяной агар для постановки САМР-теста. К 2% питательному
агару, рН 7,4-7,6, добавляют 0,2% глюкозы и эритроциты барана или
крупного рогатого скота. Эритроциты из цитратной крови трижды
промывают изотоническим раствором хлорида натрия с целью удаления
антигемолизина, который может содержаться в сыворотке, затем
ресуспендируют их в том же растворе до первоначального объема
крови. К агару добавляют 5% взвеси эритроцитов.
2. Желчно-щелочной агар (ЖЩА). Сухой питательный агар - 35,0
г; дрожжевой автолизат - 20,0 мл; глюкоза - 10,0 г;
дистиллированная вода - 600 мл. Агар расплавляют,
профильтровывают, добавляют свежей бычьей желчи - 400,0 мл и
карбонат натрия - 5,0 г.
Стерилизуют готовую среду автоклавированием при 112°С в
течение 15 минут. Перед разливкой в чашки к среде прибавляют 50,0
мл свежей крови (барана, кролика или человека), 12,5 мл 0,01%
раствора кристаллического фиолетового и 20 мл раствора гидроксида
калия (КОН).
3. Молоко с метиленовым синим. Свежее молоко доводят до
кипения, оставляют на сутки, освобождают от сливок, вторично
кипятят, снова оставляют на сутки и вторично снимают верхний слой.
Обезжиренное таким образом молоко фильтруют через толстый слой
ваты, подщелачивают 10% раствором карбоната натрия до рН 7,2. К
100 мл молока прибавляют 2,0 мл 1% водного раствора метиленового
синего. Приготовленную таким образом среду разливают по 5,0 мл в
стерильные пробирки, стерилизуют текучим паром 3 дня по 30 минут.
4. Энтерококковая дифференциально-диагностическая среда
(ЭДДС). Сухой питательный агар - 35 г, автолизат дрожжевой для
приготовления питательных сред - 20 мл, глюкоза - 10 г,
дистиллированная вода - 800 мл. Расплавляют при нагревании,
профильтровывают, стерилизуют при 112°С в автоклаве 15 минут, рН
7,2-7,4.
Перед разливкой в чашки в питательную среду добавляют ТТХ -
0,1 г; водного раствора кристаллического фиолетового 0,01% - 12,5
мл; налидиксовой кислоты - 0,1 г; стерильного обезжиренного
молока, подогретого до 44-45°С - 200 мл; свежей дефибринированной
крови (животных или человека) - 50 мл. Содержимое тщательно
размешивают и разливают по чашкам по 7 мл.
5. Сахарно-дрожжевой питательный агар с теллуритом калия.
Сухой питательный агар - 35 г, дрожжевой автолизат - 20 мл,
глюкоза - 10 г, дистиллированная вода - 1000 мл. Приготовленную
смесь расплавляют при нагревании, добавляют лимоннокислого натрия
- 5,0 г.
Стерилизуют среду при 112°С в течение 15 минут, рН 7,2-7,4.
Перед разливкой среды в стерильные чашки добавляют 50 мл
лошадиной сыворотки, 0,1 г налидиксовой кислоты и 0,7 г (35 мл 2%
водного раствора) теллурита калия, тщательно размешивают.
6. Питательный бульон с глюкозой. К 100 мл питательного
бульона, рН 7,2-7,4, прибавляют 0,2 г глюкозы.
Приготовленную среду стерилизуют дробно 3 дня подряд по 20
минут или однократно 15 минут при 0,5 атм. в автоклаве.
7. 5% кровяной агар. К 100 мл 2% питательного агара,
расплавленного и остуженного до 45°С, рН 7,4-7,6, соблюдая правила
асептики, добавляют 5 мл дефибринированной бараньей, лошадиной или
кроличьей крови. Смесь тщательно перемешивают, разливают в чашки
слоем 3-4 мм.
8. Сывороточный питательный бульон. (см. раздел 3.2.).
2.3. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ
МИКРОБОВ СЕМЕЙСТВА НЕЙССЕРИЕВЫХ (Neisseriaceae)
Семейство нейссериевых (Neisseriaceae) объединяет группу
аэробных парных кокков и парных палочек, грамотрицательных,
неподвижных, не образующих спор.
Семейство включает 4 рода: Neisseria, Branhamella, Moraxella,
Acinetobacter.
В род нейссерия (Neisseria) согласно Берги (1980) включено 6
видов, которые выделяются от человека: патогенные виды - N.
meningitidis, N. gonorrhaeae, и так называемые, непатогенные
нейссерии - N. mucosa, N. siccae, N. subflava, N. flavescens.
N. meningitidis - является возбудителем эпидемического
цереброспинального менингита, менингококкцемии, менингоэнцефалита
и назофарингита. Значительно реже менингококк является причиной
пневмоний, эндокардитов, полиартрита и иридоциклитов. N.
gonorrhoeae - возбудитель венерического заболевания гонореи.
Гонококки могут быть причиной артритов, эндокардитов,
конъюнктивитов, тонзиллитов.
Так называемые непатогенные нейссерии являются коменсалами. У
ослабленных больных признана их роль в развитии менингитов,
эндокардитов, сепсиса, пневмоний, отитов и синуситов, бронхиальной
астмы. Не доказано их значение как возбудителей уретритов,
цервицитов и инфекций верхних дыхательных путей.
В род бранхамелла (Branhamella) пока включен один вид B.
catarrhalis. Он обнаруживается на слизистых верхних дыхательных
путей и мочеполового тракта. Описаны случаи выделения B.
catarrhalis при менингитах, острых фарингитах, бронхитах.
Род моракселла (Moraxella) состоит из 7 видов, встречающихся у
человека. Иногда моракселлы могут быть причиной воспалительных
заболеваний человека - конъюнктивитов (M. lacunata),
вульвовагинитов, менингитов (M. nonliquefaciens, M. osloensis и
др.).
Род ацинетобактер (Acinetobacter) представлен 2 видами A.
calcoaceticus и A. lwoffii. Описаны случаи их выделения при
менингитах, бронхоэктатической болезни, конъюнктивитах и при
хронических отитах.
Патогенные виды нейссерий не стойки в окружающей среде, очень
требовательны к условиям культивирования, растут на питательных
средах с добавлением нативного белка (5% крови, 10%-20%
сыворотки). Культивирование проводят при повышенной влажности
среды в атмосфере, содержащей 5%-10% СО2. Посев лучше производить
на свежеприготовленных средах, после предварительного подогрева
сред в термостате. При подозрении у больного менингококковой
инфекции следует руководствоваться методическими указаниями
согласно приказа МЗ СССР N 98 от 29 января 1981 года. При
подозрении на гонорею следует руководствоваться "Методическим
письмом по культуральной диагностике гонореи" МЗ СССР от 28 марта
1969 года N 10-83/14-34 и "Методическими рекомендациями по
приготовлению безасцитных питательных сред для культуральной
диагностики гонореи" МЗ СССР от 15 июня 1973 года N 10-83/9-95.
Ход микробиологического исследования
Первый день. В зависимости от локализации воспалительного
процесса исследуют спинномозговую жидкость, мокроту, отделяемое
конъюнктивы, среднего уха, уретры и т.д.
Бактериоскопический метод
Мазки из исследуемого материала окрашивают по Граму.
Обнаружение в мазках грамотрицательных диплококков, расположенных
внутри лейкоцитов, позволяет заподозрить патогенные виды нейссерий
(менингококк или гонококк). Наличие в мазках из патологического
материала грамотрицательных кокков или мелких овоидных палочек,
расположенных парами или короткими цепочками, характерно для
других представителей семейства нейссериевых.
Культуральный метод
Патологический материал засевают на 5% кровяной и 10%
сывороточный агар, рН 7,2-7,4.
Все посевы выращивают при 37°С в атмосфере, содержащей ў 10%
СО2 (в эксикаторе с зажженной свечой).
Второй день. Через 24 часа просматривают засеянные чашки.
Менингококки на кровяных средах растут в виде непрозрачных,
беловато-серых, крупных колоний, с блестящей поверхностью и
ровными краями, маслянистой консистенции. Менингококки не лизируют
эритроциты.
На свежеприготовленном сывороточном агаре менингококки имеют
вид бесцветных, опалесцирующих, плоских, круглых колоний с ровным
краем, не имеющих валика и уплотнения в центре.
Непатогенные нейссерии растут на поверхности кровяного агара в
виде круглых гладких колоний с ровными краями, блестящей
поверхностью или шероховатых колоний неправильной формы с
неровными краями с причудливо изрезанной поверхностью, некоторые
имеют желтый пигмент.
Различные виды Moraxella хорошо растут на кровяных и
сывороточных средах в виде крупных полупрозрачных, круглых,
влажных, иногда слизистых колоний с небольшой зоной гемолиза или
без него.
Микробы рода Acinetobacter (A. calcoaceticus, A. lwoffii)
хорошо растут как на кровяных, сывороточных средах, так и на
питательных средах без добавок нативного белка, в виде крупных,
белых, круглых, блестящих колоний, часто слизистых. Можно
наблюдать небольшую зону гемолиза вокруг колоний (непостоянно).
В мазках из гладких колоний микробы рода нейссерий имеют вид
грамотрицательных бобовидных, округлых кокков, расположенных
парами и довольно равномерно распределяющихся в поле зрения; в
мазках из шероховатых колоний - грамотрицательные кокки
располагаются в виде скоплений; клетки микробной популяции имеют
однородное окрашивание у нейссерий, полиморфно окрашены у
менингококков; у гонококков, вследствие лизиса части клеток,
всегда имеются более светлоокрашенные особи.
Моракселлы и ацинетобактер при окраске по Граму имеют форму
коротких или округлых палочек, часто напоминают кокки, но могут
встречаться самые разнообразные формы клеток, даже нитевидные.
Следующим этапом в изучении колоний является определение их
каталазной и оксидазной активности.
Тест на каталазу
Все микробы семейства нейссериевых обладают ферментом
каталазой, способным расщеплять 10% раствор перекиси водорода с
образованием пузырьков газа.
Тест на цитохромоксидазу
Принцип. (См. раздел 3.3.).
Реактивы
Свежеприготовленный 1% водный раствор
диметил-парафенилендиамина гидрохлорида.
Ход исследования. На 18-20 часовую культуру на чашке наливают
реактив и, наклонив чашку, дают ему стечь. Через 20-30 секунд
колонии микробов, обладающие цитохромоксидазой, приобретают
пурпурную окраску. Можно снять колонию с чашки и растереть ее в
капле реактива на стекле или на бумажке, пропитанной реактивом. В
этом случае окрашиваться в красный цвет будет капля или бумажка.
Снимать колонию для этой реакции нужно только платиновой
петлей (другой металл катализирует реакцию) или запаянным концом
пастеровской пипетки. Можно использовать готовые системы
индикаторные бумажные - СИБ (см. раздел 3.3.). Такой диск помещают
на сектор с посевом или исследуемую культуру наносят пипеткой на
увлажненный диск.
Оксидазой обладают все микробы семейства нейссериевых, за
исключением рода Acinetobacter.
Таким образом, на второй день по результатам морфологического
изучения колоний, микроскопии мазков, данных каталазной и
оксидазной активности можно дать ответ о предполагаемом роде
микроба семейства нейссериевых - для микробов родов нейссерия и
бранхамелла характерны грамотрицательные диплококки, положительная
реакция на каталазу и оксидазу; для микробов рода моракселла -
грамотрицательные овоидные палочки, положительная реакция на
каталазу и оксидазу; для микробов рода ацинетобактер -
грамотрицательные овоидные палочки, реакция на каталазу -
положительная, на оксидазу - отрицательная.
Колонии, подозрительные для представителей родов семейства
нейссериевых, отсевают секторами на чашку Петри или на косяки с
сывороточным агаром для получения чистой культуры, требующей
видовой идентификации и определения ее чувствительности к
антибиотикам. Если при первичном посеве выросла чистая культура,
выделенная из спинномозговой жидкости, крови, слизистой
конъюнктивы, пунктатов органов, то эта культура может считаться
возбудителем патологического процесса и требует идентификации ее
до вида.
Третий день. Для проверки чистоты культур, выделенных с
сывороточного агара, проводят бактериоскопию мазков, окрашенных по
Граму. Повторно уточняют каталазную и оксидазную активность чистых
культур. Для определения видовой принадлежности чистых выделенных
культур проводят их изучение по биохимическим свойствам.
Определяют чувствительность к антибиотикам. При необходимости
определить вид возбудителя микробов из семейства нейссериевых
лучше сеять взвесь культур, смытых инактивированной лошадиной
сывороткой, уколом на столбики полужидкой среды Хью-Лейфсона,
содержащей глюкозу, лактозу, мальтозу, сахарозу и фруктозу; на
среды для определения редукции нитратов и нитритов; на питательный
агар с 5% сахарозы для определения полисахаридообразования; на
агар на гидролизате казеина для учета йодной реакции и чашки с 5%
желчным агаром с добавлением 20% сыворотки. Чистая культура,
подозрительная на менингококки, подвергается серогруппированию с
помощью агглютинации на стекле или преципитации в геле с
поливалентной (А, С, X, Y, Z) и групповыми менингококковыми
сыворотками (А, В, С, D, X, Y, Z, 29 E, 135 W).
Культуры, подозрительные на марокселлы и ацинетобактер,
следует посеять дополнительно на среды с цитратом, мочевиной и
провести определение желатиназы.
Четвертый день. Просматривают посевы, сделанные в предыдущий
день. Учитывают рост на желчном агаре, сахаролитическую
активность, ставят реакцию с водным раствором Люголя на продукцию
полисахарида, а также учитывают данные утилизации цитрата,
гидролиза мочевины и наличие желатиназы. В этот день выдают
окончательный ответ с указанием вида микроорганизма.
Видовые особенности нейссерий и других представителей
семейства нейссериевых представлены в таблицах 6, 7, 8.
Таблица 6
Культуральные и биохимические свойства
видов рода Neisseria и рода Branhamella
-------------------T-----T-----T----T----T-----T-----T-----T----T-----------------T-----------T-------T-------T--------¬
¦ ¦Ката-¦Окси-¦Пиг-¦Глю-¦Маль-¦Фрук-¦Саха-¦Лак-¦ Редукция ¦Полисахарид¦Гемолиз¦Реакция¦Рост на ¦
¦ Вид ¦лаза ¦даза ¦мент¦коза¦тоза ¦тоза ¦роза ¦тоза+--------T--------+на агаре с ¦ ¦на йод ¦5% желчи¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦нитратов¦нитритов¦5% сахарозы¦ ¦ ¦ ¦
+------------------+-----+-----+----+----+-----+-----+-----+----+--------+--------+-----------+-------+-------+--------+
¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦ 7 ¦ 8 ¦ 9 ¦ 10 ¦ 11 ¦ 12 ¦ 13 ¦ 14 ¦ 15 ¦
+------------------+-----+-----+----+----+-----+-----+-----+----+--------+--------+-----------+-------+-------+--------+
¦N. gonorrhоeae ¦ + ¦ + ¦ - ¦ + ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ + ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦
+------------------+-----+-----+----+----+-----+-----+-----+----+--------+--------+-----------+-------+-------+--------+
¦N. meningitidis ¦ + ¦ + ¦ - ¦ + ¦ + ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ +- ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦
+------------------+-----+-----+----+----+-----+-----+-----+----+--------+--------+-----------+-------+-------+--------+
¦N. subflava ¦ + ¦ + ¦ + ¦ + ¦ + ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ + ¦ - ¦ - ¦ - ¦ + ¦
+------------------+-----+-----+----+----+-----+-----+-----+----+--------+--------+-----------+-------+-------+--------+
¦N. flava ¦ + ¦ + ¦ + ¦ + ¦ + ¦ + ¦ - ¦ - ¦ - ¦ + ¦ - ¦ - ¦ - ¦ + ¦
+------------------+-----+-----+----+----+-----+-----+-----+----+--------+--------+-----------+-------+-------+--------+
¦N. perflava ¦ + ¦ + ¦ + ¦ + ¦ + ¦ + ¦ + ¦ - ¦ - ¦ + ¦ + ¦ + ¦ - ¦ + ¦
+------------------+-----+-----+----+----+-----+-----+-----+----+--------+--------+-----------+-------+-------+--------+
¦N. sicca ¦ + ¦ + ¦ +- ¦ + ¦ + ¦ + ¦ + ¦ - ¦ - ¦ + ¦ + ¦ - ¦ + ¦ + ¦
+------------------+-----+-----+----+----+-----+-----+-----+----+--------+--------+-----------+-------+-------+--------+
¦N. mucosa ¦ + ¦ + ¦ +- ¦ + ¦ + ¦ + ¦ + ¦ - ¦ + ¦ + ¦ + ¦ - ¦ - ¦ + ¦
+------------------+-----+-----+----+----+-----+-----+-----+----+--------+--------+-----------+-------+-------+--------+
¦N. flavescens ¦ + ¦ + ¦ + ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ + ¦ + ¦ - ¦ - ¦ + ¦
+------------------+-----+-----+----+----+-----+-----+-----+----+--------+--------+-----------+-------+-------+--------+
¦B. catarrhalis ¦ + ¦ + ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ + ¦ + ¦ - ¦ - ¦ - ¦ + ¦
L------------------+-----+-----+----+----+-----+-----+-----+----+--------+--------+-----------+-------+-------+---------
Таблица 7
Культуральные и биохимические свойства
видов рода Moraxella, встречающихся у человека
--------------T-----T-----T----T----T---------T------T-------------T-----T-----¬
¦ ¦Окси-¦Ката-¦Уре-¦Цит-¦Фенилала-¦Жела- ¦ Редукция ¦Рост ¦ ¦
¦ Вид ¦даза ¦лаза ¦аза ¦рат ¦ниндеза- ¦тиназа+------T------+на 5%¦Гемо-¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦миназа ¦ ¦нитра-¦нитри-¦желчи¦лиз ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ тов ¦ тов ¦ ¦ ¦
+-------------+-----+-----+----+----+---------+------+------+------+-----+-----+
¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦ 7 ¦ 8 ¦ 9 ¦ 10 ¦ 11 ¦
+-------------+-----+-----+----+----+---------+------+------+------+-----+-----+
¦M. lacunata ¦ + ¦ + ¦ - ¦ - ¦ - ¦ + ¦ + ¦ - ¦ - ¦ - ¦
+-------------+-----+-----+----+----+---------+------+------+------+-----+-----+
¦M. nonlique- ¦ + ¦ + ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ + ¦ - ¦ - ¦ - ¦
¦ faciens ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-------------+-----+-----+----+----+---------+------+------+------+-----+-----+
¦M. phenylpy- ¦ + ¦ + ¦ + ¦ - ¦ + ¦ - ¦ + ¦ - ¦ + ¦ - ¦
¦ ruvica ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-------------+-----+-----+----+----+---------+------+------+------+-----+-----+
¦M. osloensis ¦ + ¦ + ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ +- ¦ - ¦ - ¦ - ¦
+-------------+-----+-----+----+----+---------+------+------+------+-----+-----+
¦M. atlantae ¦ + ¦ + ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ + ¦ ...¦
+-------------+-----+-----+----+----+---------+------+------+------+-----+-----+
¦M. kingae ¦ + ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ N2 ¦ - ¦бета ¦
+-------------+-----+-----+----+----+---------+------+------+------+-----+-----+
¦M. uretralis ¦ + ¦ + ¦ - ¦ +- ¦ - ¦ - ¦ - ¦ N2 ¦ - ¦ ...¦
L-------------+-----+-----+----+----+---------+------+------+------+-----+------
Все виды моракселл углеводы не утилизируют, за исключением M. kingae.
... - нет данных,
N2 - восстановление до газа.
Таблица 8
Биохимические свойства видов Acinetobacter
-------------------T--------T--------T-------T-------T-----------¬
¦ Вид ¦Оксидаза¦Каталаза¦Глюкоза¦Лактоза¦10% лактоза¦
+------------------+--------+--------+-------+-------+-----------+
¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦
+------------------+--------+--------+-------+-------+-----------+
¦A. calcoaceticus ¦ - ¦ + ¦ + ¦ + ¦ + ¦
+------------------+--------+--------+-------+-------+-----------+
¦A. lwoffii ¦ - ¦ + ¦ - ¦ - ¦ - ¦
L------------------+--------+--------+-------+-------+------------
Питательные среды
1. Сывороточный агар (см. раздел 3.2.).
2. Кровяной агар (см. раздел 3.2.).
3. Среда Христенсена с мочевиной (см. раздел 2.6.).
4. Среда Симмонса (см. раздел 2.6.).
5. Среда для определения фенилаланиндезаминазы (см. раздел
2.6.).
6. Желчный агар, 0,5%.
Принцип: ингибиция желчью роста патогенных видов нейссерий
(менингококков, гонококков).
Приготовление среды
В необходимое количество расплавленного и охлажденного
питательного агара добавляют 5% фильтрованной через стерильную
вату желчи, перемешивают, разливают по флаконам и стерилизуют
текучим паром 3 дня подряд по 30 минут или автоклавируют при 0,5
атм. (110°С) в течение 30 минут.
Перед разливом в чашки Петри в каждый флакон с расплавленным и
охлажденным до температуры 50°С желчным агаром добавляют 20%
инактивированной в течение 30 минут лошадиной сыворотки.
7. Среда для определения продукции
полисахаридов на агаре с 5% сахарозы
Принцип: способность отдельных видов нейссерий образовывать
крахмалоподобные вещества при расщеплении сахарозы.
Ингредиенты:
питательный агар,
сахароза,
сыворотка,
раствор Люголя.
Для приготовления раствора Люголя берут калия йодистого - 2 г,
дистиллированной воды - 10 мл, йода кристаллического - 1 г. Смесь
хорошо закупоривают, оставляют на сутки. Затем добавляют
дистиллированной воды 300 мл.
Приготовление среды. К расплавленному и охлажденному до 50°С
питательному агару с 5% сахарозы добавляют 20% сыворотки и
разливают в чашки Петри.
Ход исследования. Производят густой высев культуры петлей, по
секторам. На одну чашку можно посеять несколько штаммов. Через 48
часов инкубации в термостате на поверхность выросшей культуры
наносят 1 каплю водного раствора Люголя. Реакция считается
положительной при образовании бурого окрашивания выросшей
культуры.
8. Среда для постановки йодного теста у N. sicca
Принцип: способность N. sicca на средах с казеиновым
гидролизатом образовывать крахмалоподобное вещество.
Ингредиенты:
0,25% водный раствор йода,
натрий хлористый (NaCl).
Приготовление. Питательный агар готовят на бульоне из
казеинового гидролизата (аминный азот 1,6 г/л) с добавлением
1,5-2% агара, 0,5% NaCl, рН 7,2-7,4, стерилизуют при 1 атм. 15
мин.
Ход исследования. Реакцию на йод определяют на культуре,
выращенной бляшками на указанном выше агаре. На культуру
пастеровской пипеткой наносят 1 каплю 0,25% раствора йода в
дистиллированной воде. Положительная реакция характерна только для
вида N. sicca, она проявляется появлением синего окрашивания
бактериальной массы.
9. Полужидкая среда Хью-Лейфсона
с индикатором Андреде
Принцип (см. раздел 3.2.).
Ингредиенты:
пептон - 0,2 г,
натрий хлористый - 0,5 г,
калий фосфорнокислый, двузамещенный - 0,03 г,
углевод (лактоза, глюкоза, сахароза, мальтоза, фруктоза) -1 г,
агар - 0,3 г,
индикатор Андреде - 2 мл,
вода дистиллированная - 100 мл.
Для приготовления индикатора Андреде берут 1 г кислого
фуксина, растирают в ступке с 64,0 мл 1 моль/л едкого натра и
добавляют 400 мл дистиллированной воды. Раствор на сутки ставят в
термостат при 37°С, двое суток выдерживают на свету и затем
сохраняют в темном месте. Индикатор должен быть бесцветным. Для
приготовления среды к воде добавляют пептон, натрий хлористый и
агар. Смесь подогревают до расплавления агара. Затем добавляют
калий фосфорнокислый двузамещенный и один из углеводов. Продолжают
кипятить 2-3 минуты. Смесь подщелачивают 20% раствором едкого
натра до рН 7,2-7,4, доводят объем среды до первоначального и
добавляют 2 мл раствора индикатора Андреде. Среду фильтруют через
ватно-марлевый фильтр, разливают в пробирки по 5 мл и стерилизуют
текучим паром 3 дня подряд по 20 минут.
Ход исследования. Посев уколом на столбики полужидкой среды
Хью-Лейфсона, содержащей глюкозу, лактозу, мальтозу, сахарозу,
фруктозу. О разложении углеводов судят по появлению розового
окрашивания через 18-24 часа со времени посева, иногда окрашивание
появляется через 48 часов.
Биохимические методы исследования
Определение редукции нитратов и нитритов
1. Определение редукции нитратов
Принцип. Метод основан на способности микроорганизмов
восстанавливать соли азотной кислоты (нитраты) до солей азотистой
кислоты (нитриты) и далее до последующих продуктов восстановления
(аммиак, молекулярный азот, окись азота, гидроксиламин). Редукция
нитратов в нитриты определяется с помощью реактива Грисса, а
газообразные продукты - с помощью поплавка.
Ингредиенты:
бактопептон,
калий азотнокислый (KNO3),
сульфаниловая кислота,
альфа-нафтиламин,
уксусная кислота - 5 моль/л,
цинк металлический.
Приготовление нитратного бульона. Берут KNO3 - 1,0 г;
бактопептона - 5,0 г; добавляют воды дистиллированной до 1000 мл,
рН 7,4. Нитратный бульон разливают в химически чистые пробирки с
поплавками по 5 мл. Автоклавируют при 0,5 атм. (115°С) в течение
20 минут.
Приготовление реактива Грисса. Раствор 1. 0,8 г сульфаниловой
кислоты растворяют в 100 мл 5 моль/л уксусной кислоты при слабом
нагревании.
Раствор 2. 0,6 г альфа-нафтиламина растворяют в 100 мл 5
моль/л уксусной кислоты при слабом нагревании.
Растворы хранят в посуде из темного стекла с притертыми
пробками. Перед употреблением 1 и 2 растворы смешивают в равных
|
