|
Стр. 3
после восстановления при (37 +/- 1)- С и (70 +/- 1)- С, перед
посевом должны подвергаться предварительной инкубации в
неселективной жидкой среде для восстановления физиологических
свойств бактерий, поврежденных в процессе технологической
обработки продукта. В качестве неселективной среды обогащения
используют фосфатный буферный раствор (п. 6.1.2).
Без предварительной инкубации исследуют сухие продукты,
подвергающиеся различным способам термической обработки перед
употреблением (разведение кипяченой водой (85 +/- 1)- С и выше,
доведение до кипения, пастеризация восстановленной смеси и т.д.),
биологически активные добавки, стерилизованные, кисло - молочные
(сухие и жидкие) и пастообразные продукты детского питания, а
также составляющие их компоненты.
7.2.2. Подготовка к анализу
Посуду, материалы и реактивы подготавливают как указано в п.
5.3.
7.2.3. Приготовление разведений
Подготовку проб и приготовление разведений осуществляют как
указано в п. п. 5.1 и 5.2.
7.2.4. Посев с предварительной инкубацией детских
сухих молочных продуктов
Асептически взвешивают 1 г сухого продукта, вносят в колбочку
или пробирку с 9,0 куб. см разбавленного фосфатного буфера для
предварительного обогащения. Взвесь тщательно перемешивают,
проверяют значение pH при помощи индикаторной бумаги (стерильной
стеклянной палочкой наносят каплю испытуемой взвеси на полоску
универсальной индикаторной бумаги и полученную окраску немедленно
сравнивают со шкалой). При необходимости доводят активную
кислотность до 7,0 ед. pH, используя стерильные растворы 1H
гидроокиси натрия или 1H соляной кислоты.
Колбочки помещают в термостат при температуре (37 +/- 1)- С и
выдерживают 24 часа. На следующий день засевают 1,0 куб. см
проинкубированной в буферном растворе взвеси продукта в пробирку с
10,0 куб. см среды Кесслер с лактозой и проводят анализ в
соответствии с п. 7.2.5.
7.2.5. Прямой посев
Для посева используют то количество продукта, в котором
предусматривается отсутствие БГКП (колиформных бактерий)
соответствующими пунктами таблиц 1 - 9. Посев производится в среду
Кесслер с лактозой (с поплавками), с соблюдением соотношения
продукта и среды 1:10. Применение среды Кода не допускается.
В производственных лабораториях возможно производить посев
сухих продуктов из первого разведения в объеме 10,0 куб. см (при
необходимости засева 1 г).
Прямые посевы продуктов или посевы после преинкубации помещают
в термостат при температуре (37 +/- 1)- С на (24 +/- 1) ч. При
отсутствии признаков роста - газообразования или помутнения среды,
дают заключение об отсутствии БЭКП (колиформных бактерий) и
соответствии исследуемого продукта нормативу на БГКП (колиформные
бактерии). При наличии признаков роста - газообразования,
помутнения среды Кесслер с лактозой, для окончательного заключения
о наличии в продукте БГКП (колиформных бактерий), из
подозрительных колб или пробирок производят высев на чашки со
средой Эндо или Левина (п. 6.2.2.3). Посев производят петлей из
каждой пробирки так, чтобы получить рост изолированных колоний -
на отдельный сектор, лучше - на отдельную чашку. Чашки с посевами
помещают в термостат при температуре (37 +/- 1)- С от 18 до 24 ч.
Учет результатов.
При отсутствии на среде Эндо или Левина колоний, типичных для
бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий) (на среде
Эндо - красных с металлическим блеском или без него, розовых и
бледно - розовых; на среде Левина - черных с металлическим
блеском, темных с черным центром, сиреневых с темным центром)
засеянная навеска продукта считается незагрязненной ими, т.е.
исследуемый продукт соответствует нормативу на БГКП (колиформные
бактерии).
При наличии на среде Эндо или Левина типичных или
подозрительных для кишечных палочек (колиформных бактерий) колоний
- их продолжают изучать. Из изолированных колоний, характерных или
подозрительных на БГКП, делают препараты, окрашивают их по Граму и
микроскопируют.
Обнаружение грамотрицательных не содержащих спор палочек
указывает па наличие БГКП (колиформных бактерий) в анализируемой
массе продукта и несоответствие продукта микробиологическому
нормативу.
Примечание. Обнаружение на среде Эндо колоний с желтым или
желто - коричневым оттенком при анализе сухих молочных каш,
содержащих в качестве компонента муку рисовую и гречневую, толокно
овсяное, крупу манную, указывает на возможную принадлежность
выделенных бактерий к роду Erwinia.
Бактерии рода Erwinia - грамотрицательные, необразующие спор
палочки, способные утилизировать лактозу с образованием кислоты и
газа, по комплексу других биохимических признаков отличающиеся от
бактерий группы кишечных палочек. Бактерии рода Ervinia являются
типичными представителями эпифитной микрофлоры зерновых культур и
не обладают патогенностью для человека и животных. Для определения
принадлежности к роду Ervinia выросших на среде Эндо нетипичных
для БГКП колоний последние пересевают на питательный агар с 5%
сахарозы (п. 6.2.2.17), на котором они дают выраженный мукоидный
рост, не свойственный бактериям группы кишечных палочек. При
подтверждении принадлежности подозрительных колоний роду Erwinia и
отсутствии других микроорганизмов, типичных для БГКП, исследуемый
продукт считается соответствующим нормативу на БГКП (колиформные
бактерии).
7.3. Определение E.соli
E.coli - не утилизирующие цитрат грамотрицательные бесспоровые
палочки, входящие в группу колиформных бактерий и являющиеся
индикатором относительно свежего фекального загрязнения, способные
расти и ферментировать лактозу при температурах выше температуры
тела человека и теплокровных животных (от 44,0 до 45,5- С).
7.3.1. Сущность метода
Метод основан на способности E.coli ферментировать лактозу с
образованием кислоты и газа при температуре 44,0- С от 24 до 48
часов. Идентификацию E.coli проводят по признакам: образование
индола, положительная реакция с метиловым красным, отрицательная
реакция Фогес - Проскауэра (образование ацетилметилкарбинола) и
отсутствие способности утилизировать цитраты.
7.3.2. Аппаратура, материалы и реактивы
При проведении анализов используют аппаратуру, материалы и
реактивы, перечисленные в п. 4.
7.3.3. Подготовка к анализу
Подготовку проб и приготовление разведений осуществляют как
указано в п. п. 5.1 и 5.2.
Посуду и материалы стерилизуют как указано в п. 5.3.
7.3.4. Проведение анализа с предварительной инкубацией
7.3.4.1. Асептически взвешивают 10 г сухого продукта типа
"Детолакт" (табл. 1), растворяют в колбе 90,0 куб. см
разбавленного фосфатного буфера.
Для доведения активной кислотности до 7,0 ед. pH используют
простерилизованный 1H раствор гидроокиси натрия или 1H раствор
соляной кислоты, проверяя pH индикаторной бумагой.
Колбу помещают в термостат и выдерживают при температуре (37 +/-
1)- С и течение (24 +/- 1) ч.
7.3.4.2. На следующий день засевают из этих колб 1,0 куб. см в
пробирку или колбу с 9,0 куб. см среды Кесслер с лактозой (пп.
6.2.2.1, 6.2.2.2) (с поплавками), помещают в термостат и
выдерживают при температуре (44 +/- 1)- С в течение (24 +/- 1) ч.
При отсутствии газа, помутнения, изменения цвета среды в посевах
продуктов, подвергшихся предварительной инкубации, результат
анализа считают отрицательным и дают заключение об отсутствии
Е.coli и соответствии нормативу по этому показателю.
7.3.5. Проведение анализа без предварительной инкубации
7.3.5.1. Навеску продукта 10 г (куб. см) помещают в колбу с
90,0 куб. см среды Кесслер с лактозой (с поплавками). Помещают в
термостат при (44 +/- 1)- С на (24 +/- 1) ч. На следующий день
колбы просматривают, при отсутствии признаков роста посевы
оставляют в термостате еще на (24 +/- 1) ч.
7.3.5.2. Пробирки и колбы с посевами просматривают на
присутствие газа. При отсутствии газа и других признаков роста
(помутнения и т.д.) в посевах дают заключение об отсутствии в
продукте E.coli и соответствии нормативу по этому показателю.
Пробирки (колбы), в которых обнаружен газ или другие признаки
роста (помутнение среды), подвергают дальнейшим исследованиям. Из
этих пробирок производят посев штрихом или рассевом на поверхность
чашки Петри с подсушенной средой Эндо или Левина так, чтобы
получить изолированные колонии. Посевы выдерживают в термостате
(37 +/- 1)- С в течение (24 +/- 1) ч.
Эшерихии на среде Эндо образуют колонии красные с металлическим
блеском или без него, розовые, на агаре Левина - черные, темно -
коричневые колонии с темным центром, с металлическим блеском или
без него. Если при окрашивании по Граму и просмотре под
микроскопом подтверждается наличие грамотрицательных бесспоровых
палочек, то все типичные колонии подвергают идентификации по ИМАЦ
- тестам (реакция на индол, реакция с метиловым красным, реакция
Фогес - Проскауэра, утилизация цитрата).
7.3.5.3. Реакция на индол. Из типичной изолированной колонии на
среде Эндо (Левина) производят высев в пробирку с бульоном на
индол (п. 6.2.2.4). Пробирки выдерживают в термостате при
температуре (37 +/- 1)- С в течение (24 +/- 1) ч.
После выдерживания в термостате в пробирки с индольной средой
добавляют 5 - 10 капель реактива Эрлиха (п. 6.2.2.14). Появление
темно - красного окрашивания в поверхностном слое свидетельствует
об образовании индола.
7.3.5.4. Реакция Фогес - Проскауэра
Типичную, хорошо изолированную колонию пересевают в пробирку со
средой Кларка (п. 6.2.2.5). Выдерживают в термостате при
температуре (37 +/- 1)- С в течение (48 +/- 1) ч. Вынимают
пробирки из термостата и из каждой из них пипеткой стерильной
отбирают 1,0 куб. см культуральной жидкости в чистые пробирки.
Затем к 1,0 куб. см добавляют 0,60 куб. см 5-процентного раствора
alfa-нафтола (п. 6.2.2.11) и 0,20 куб. см 40-процентного раствора
гидроокиси калия (п. 6.2.2.12), хорошо перемешивают. Появление
красного окрашивания свидетельствует о положительной реакции
(образование ацетилметилкарбинола).
7.3.5.5. Реакция с метиловым красным
В пробирки с оставшейся культурой в среде Кларка добавляют по 5
капель реактива метилового красного (п. 6.2.2.7) в каждую
пробирку. Четкое малиново - красное окрашивание указывает на
положительную реакцию.
7.3.5.6. Утилизация цитратов
Производят пересев из типичных колоний со среды Эндо или Левина
на чашки Петри с подсушенной средой Симмонса (или в пробирки со
средой Козера (пп. 6.2.2.15, 6.2.2.16). Посевы выдерживают в
термостате при температуре (37 +/- 1)- С от 24 до 48 ч. При учете
результатов обращают внимание на наличие роста и изменение окраски
среды.
Наличие роста и изменение цвета среды с зеленого в синий или
желтый характерно для цитрат - положительных культур.
Для цитрат - отрицательных разновидностей характерно отсутствие
роста и изменения цвета среды.
7.3.6. Оценка результатов идентификации
Таблица 11
КЛАССИФИКАЦИЯ КОЛИФОРМНЫХ БАКТЕРИЙ ПО ИМАЦ - ТЕСТАМ
--------T---------T-----------T----------T-----------------------¬
¦Образо-¦Реакция с¦ Реакция ¦Утилизация¦ Тип бактерий ¦
¦ вание ¦метиловым¦ Фогес - ¦ нитратов ¦ ¦
¦индола ¦ красным ¦ Проскауэра¦ ¦ ¦
+-------+---------+-----------+----------+-----------------------+
¦ + ¦ + ¦ - ¦ - ¦ Типичные E.coli ¦
+-------+---------+-----------+----------+-----------------------+
¦ - ¦ + ¦ - ¦ - ¦ Атипичные E.coli ¦
+-------+---------+-----------+----------+-----------------------+
¦ - ¦ - ¦ + ¦ + ¦ Типичные A.aerogenes ¦
+-------+---------+-----------+----------+-----------------------+
¦ + ¦ - ¦ + ¦ + ¦ Атипичные A.aerogenes ¦
+-------+---------+-----------+----------+-----------------------+
¦ + ¦ + ¦ - ¦ + ¦ Типичные Citrobacter ¦
+-------+---------+-----------+----------+-----------------------+
¦ - ¦ + ¦ - ¦ + ¦ Атипичные Citrobacter ¦
L-------+---------+-----------+----------+------------------------
При выделении из продукта грамотрицательных неспорообразующих
палочек, продуцирующих газ из лактозы при (44 +/- 1)- С,
образующих и не образующих индол, дающих положительную реакцию с
метиловым красным, отрицательную Фогес - Проскауэра и не растущих
на среде Симмонса (Козера) считают, что в 10 г продукта содержатся
эшерихии коли. Продукт в данном случае бракуется.
При обнаружении в 10 г продукта бактерий родов Enterobacter и
Citrobacter, но при отсутствии колиформных бактерий (БГКП) в 1 г,
продукт браковке не подлежит. Однако микробиолог предприятия
должен усилить контроль за соблюдением санитарно - гигиенических
правил на предприятии и обратить внимание на необходимость
дополнительного контроля технологических режимов при изготовлении
продукта.
7.4. Определение сальмонелл
Сальмонеллы - обширный род семейства энтеробактерий, включающий
более 2000 серотипов, большинство которых обладает патогенными
свойствами. К сальмонеллам относятся аэробные и факультативно -
анаэробные грамотрицательные подвижные палочки, хорошо растущие на
обычных питательных средах и разнообразных пищевых субстратах.
7.4.1. Сущность метода
Метод основан на использовании сред обогащения для увеличения
роста сальмонелл, их выделения на специальных агаровых средах, с
последующим проведением серологической реакции.
7.4.2. Аппаратура, материалы, реактивы
Аппаратура, материалы, реактивы - согласно п. 4.
7.4.3. Подготовка к анализу
7.4.3.1. Подготовку проб и приготовление разведений
осуществляют как указано в п. п. 5.1 и 5.2. Посуду и материалы
стерилизуют как указано в п. 5.3.
7.4.4. Проведение анализа
Для посева используют то количество продукта, в котором
регламентируется отсутствие бактерий рода сальмонелла
соответствующими пунктами таблиц 1 - 9.
Посев продуктов производится с предварительной инкубацией в
фосфатном буферном растворе.
Компоненты детских сухих молочных продуктов засевают без
предварительной инкубации непосредственно в колбы со средой для
селективного обогащения. В случае выявления бактерий рода
сальмонелла в готовых сухих молочных продуктах, компоненты,
входящие в их состав, повторно исследуются на наличие сальмонелл с
предварительной инкубацией продукта по п. 7.4.4.1.
7.4.4.1. Посев с предварительной инкубацией
Взвешивают в стерильных условиях в стакане продукт в
количествах, предусмотренных в табл. N 1 - 9, и затем для
предварительного обогащения навеску асептически переносят в колбу
с разбавленным фосфатным буфером (п. 6.1.2). Соблюдают соотношение
массы продукта и буферного раствора 1:10. Проверяют pH с помощью
индикаторной бумаги и доводят активную кислотность смеси до (7,0
+/- 0,2) ед. pH 1H раствором гидроокиси натрия.
Все тщательно перемешивают. При плохом растворении продукта
пробы подвергают механическому встряхиванию на аппарате для
встряхивания жидкости (шуттель - аппарат). К приготовленной взвеси
продукта добавляют 0,1-процентный водный раствор бриллиантового
зеленого (п. 6.2.2.9) в количестве 2% к объему (т.е. 20 куб. см
раствора красителя к 1000 куб. см взвеси продукта), перемешивают и
выдерживают в термостате при температуре (37 +/- 1)- С и от 18 до
24 ч.
На следующий день переносят 1,0 куб. см выдержанной в
термостате смеси в пробирке с 10,0 куб. см магниевой среды (п.
6.2.3.1) или среды Мюллера (п. 6.2.3.3). Пробирки помещают в
термостат с температурой (37 +/- 1)- С от 18 до 24 ч.
7.4.4.2. Прямой посев в среды для селективного обогащения
Асептически взвешенные навески сухих компонентов, стерильно
отмеренные объемы жидких компонентов в количествах,
предусмотренных соответствующими графами табл. 9, засевают в колбы
с магниевой средой или средой Мюллера, соблюдая соотношение
продукта и среды не менее 1:9.
Для жидких продуктов допускается использование среды с двойной
концентрацией ингредиентов при соотношении продукта и среды 1:1.
Колбы с посевами помещают в термостат с температурой (37 +/-
1)- С от 18 до 24 ч.
7.4.4.3. После инкубации в термостате производят высев из колб
и пробирок с магниевой средой или средой Мюллера на поверхность
подсушенных чашек с дифференциально - диагностическими средами
Плоскирева и висмут - сульфитного агара. Для получения отдельных
колоний петлей берут минимальное количество посевного материала и
производят посев штрихом. Чашки с посевами помещают в термостат с
температурой (37 +/- 1)- С от 24 до 48 ч. Проверку посевов
осуществляют дважды: через 24 и 48 ч. после инкубации в
термостате.
7.4.5. Обработка результатов
7.4.5.1. На среде Плоскирева колонии сальмонелл бесцветные,
прозрачные, плоские, на висмут - сульфитном агаре - черные, с
характерным металлическим блеском, зеленоватые с темным ободком,
при этом наблюдается прокрашивание в черный цвет участка среды под
колонией.
При отсутствии типичных колоний сальмонелл на каждой из сред
конечный результат анализа записывают как "отрицательный", т.е. в
исследуемой массе продукта сальмонеллы отсутствуют.
При наличии на любой из питательных сред на чашках Петри
типичных или подозрительных колоний на сальмонеллы производят их
дальнейшее изучение.
7.4.5.2. Из каждой среды на чашке Петри, содержащей
подозреваемую колонию сальмонелл <*>, выбирают хорошо
изолированную колонию и высевают штрихом и уколом на трехсахарный
агар с мочевиной (п. 6.2.3.7) или среду Клиглера (п. 6.2.3.10).
Пробирки с посевами выдерживают в термостате при (37 +/- 1)- С в
течение (24 +/- 1) ч. Производят идентификацию культур, высеянных
на среду Клиглера или трехсахарный агар с мочевиной по ферментации
лактозы, глюкозы, сахарозы и расщеплению мочевины.
--------------------------------
<*> При наличии смешанного роста необходимо сделать пересев на
питательный агар для поручения изолированных колоний.
Покраснение или пожелтение (в зависимости от добавленного
индикатора) скошенной части столбика среды указывает на
образование кислоты в результате ферментации лактозы, сахарозы или
обоих сахаров. Покраснение самого столбика указывает на
расщепление глюкозы. Восстановление цвета среды до исходного
(бледно - розовый) свидетельствует о расщеплении мочевины.
Механизм действия среды Клиглера идентичен с трехсахарным
агаром. Об образовании сероводорода судят по почернению среды в
столбике. Если культуры сбраживают лактозу с образованием газа и
расщепляют мочевину, они не принадлежат к бактериям рода
сальмонелла.
Культуры, не ферментирующие лактозу и не расщепляющие мочевину,
но ферментирующие глюкозу (с образованием или без образования
газа), подвергаются дальнейшему изучению.
Культуры, ферментирующие глюкозу без образования газа,
подозрительны как брюшнотифозные или дизентерийные.
Культуры, ферментирующие глюкозу с образованием газа, дающие в
среде пузырьки и продуцирующие сероводород, могут принадлежать к
роду сальмонелла.
Если ни в одной из пробирок не обнаружено ни одной характерной
для сальмонелл реакции, то результат считают отрицательным и дают
заключение об отсутствии в исследуемой массе продукта бактерий
рода сальмонелл.
7.4.5.3. Определение образования ацетилметилкарбинола проводят
по п. 7.3.5.4. Бактерии рода Salmonella не образуют
ацетилметилкарбинола (реакция Фогес - Проскауэра отрицательная).
7.4.5.4. Если обе пробирки покажут типичную для сальмонелл
окраску сред, а выделенный штамм дает отрицательную реакцию Фогес
- Проскауэра, проводят серологическое исследование. Для этой цели
берут петлей небольшое количество культуры из пробирок с
трехсахарным агаром или средой Клиглера, эмульгируют в капле
физиологического раствора на предметном стекле. Добавляют каплю
сальмонеллезной 0-сыворотки (п. 6.2.3.11) к раствору и осторожно
покачивают предметное стекло, чтобы смешать жидкости.
Положительная реакция на сальмонеллы (агглютинация) наблюдается
в течение 30 - 60 сек. Обязательна постановка отрицательной
реакции (культура + физиологический раствор). Если при проведении
серологического исследования агглютинации не обнаруживается,
конечный результат записывают как "отрицательный".
Любая агглютинация, которая появляется на стекле, говорит о
вероятности присутствия сальмонелл.
7.4.5.5. При выделении культур грамотрицательных палочек,
ферментирующих глюкозу с образованием или без образования газа, не
ферментирующих лактозу и сахарозу, образующих или не образующих
сероводород, дающих отрицательную реакцию Фогес - Проскауэра и
обладающих четкой серологической характеристикой, считают, что в
исследуемой навеске продукта присутствуют бактерии рода
сальмонелла. Продукт к реализации не допускается. Проводится
тщательная санитарная обработка всей технологической линий, а при
необходимости - контроль всех исходных компонентов продукта.
7.5. Определение коагулазоположительных
стафилококков (S.aureus)
S.aureus - аэробные грамположительные сферические
пигментообразующие микроорганизмы, обладающие ферментом
коагулазой, большая часть из которых способна продуцировать
энтеротоксины.
7.5.1. Сущность метода
Метод основан на способности микроорганизмов из рода
Staphylococcus расти на питательных средах с повышенным
содержанием поваренной соли. Наибольшее санитарно - гигиеническое
значение имеет Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк),
принадлежность к которому, в основном, определяется по способности
коагулировать цитратную плазму крови человека или кролика.
7.5.2. Аппаратура, материалы и реактивы
Аппаратура, материалы и реактивы - согласно п. 4.
7.5.3. Подготовка к анализу
7.5.3.1. Подготовку проб и приготовление разведений
осуществляют как указано в п. п. 5.1, 5.2.
Посуду и материалы стерилизуют как указано в п. 5.3.
7.5.4. Проведение анализа
При исследовании продуктов, употребляемых без предварительной
термической обработки после восстановления (см. табл. 1) навеска
продукта должна составлять 10 г; для продуктов, употребляемых с
предварительной термической обработкой и компонентов - 1 г (см.
табл. 1 - 9). Сухие молочные продукты типа "Детолакт", "Новолакт
ММ", "Новолакт-1" и т.п., восстанавливаемые перед употреблением
при (37 +/- 1)- С и (70 +/- 1)- С, подвергаются предварительной
инкубации в фосфатном буферном растворе перед посевом.
Остальные продукты и компоненты, предусмотренные в табл. 1 - 9,
засевают без предварительной инкубации непосредственно в
питательную среду.
В случае выявления S.aureus в готовых сухих молочных продуктах,
компоненты, входящие в их состав, исследуются на наличие S.aureus
с предварительной инкубацией.
7.5.4.1. Взвешивают в стерильных условиях 10, или 1 г продукта
и помещают в колбы с 90,0 куб. см или 9,0 куб. см разбавленного
фосфатного буфера. Хорошо размешивают. Смесь выдерживают в
термостате при температуре (37 +/- 1)- С от 18 до 24 ч. На
следующий день пипеткой переносят 1,0 куб. см смеси в пробирку с
солевым бульоном (п. 6.2.4.1) и помещают в термостат при
температуре (37 +/- 1)- С на (24 +/- 1) ч.
Жидкие и пастообразные продукты, подготовленные согласно п.
5.1.5 и другие продукты, не подвергающиеся предварительной
инкубации, в количестве 1, или 10 г (см) засевают в пробирки или
колбы с солевым бульоном при соотношении продукта и среды 1:10 и
помещают в термостат при температуре (37 +/- 1)- С.
7.5.4.2. Через (24 +/- 1) ч производят пересев петлей из
бульона для получения изолированных колоний на чашки Петри с
подсушенными средами тина Байрд - Паркер (п. 6.2.4.3) или ЖСА
(желточно - солевой агар) (п. 6.2.4.4). Чашки с посевами
выдерживают в термостате при температуре (37 +/- 1)- С от 18 до 24
ч.
S.aureus на среде Байрд - Паркера растут в виде черных,
блестящих, выпуклых колоний в диаметре 1 - 1,5 мм, окруженных
зоной просветления среды, шириной 1 - 3 мм. Около 90% S.aureus,
выделенных из пищевых продуктов, и штаммы, образующие
энтеротоксин, на агаре типа Байрд - Паркер дают зоны просветления
через (24 +/- 1) ч инкубации при (37 +/- 1)- С. Эти колонии не
требуют подтверждения в принадлежности к S.aureus и подлежат учету
через (24 +/- 1) ч инкубации.
На ЖСА колонии стафилококков имеют форму выпуклых дисков
диаметром 2 - 4 мм, белого, желтого, кремового, лимонного,
золотистого цвета с ровными краями; вокруг колоний образуется
радужное кольцо и зона помутнения среды.
Из характерных колоний, подозрительных на стафилококки, готовят
мазки - препараты, окрашивают по Граму и микроскопируют. Колонии
грамположительных мелких кокков, расположенных в мазке
гроздьевидно, отсеивают на сектора чашки Петри или в пробирки со
скошенным мясо - пептонным агаром (п. 6.1.12), посевы выдерживают
в термостате при (37 +/- 1)- С от 18 до 24 ч. Из культур, выросших
на МПА, после предварительной проверки мазка на чистоту под
микроскопом, ставят реакцию плазмокоагуляции.
7.5.4.3. Постановка реакции плазмокоагуляции
В пробирку с 0,5 куб. см разведенной кроличьей плазмы вносят
петлю суточной агаровой культуры. Одну пробирку с плазмой
оставляют незасеянной, а в другую засевают заведомо
коагулазоположительный стафилококк в качестве контроля. Пробирки
помещают в термостат при температуре (37 +/- 1)- С. Учитывают
результаты через 2 - 4 часа и оставляют до утра при комнатной
температуре для окончательного учета. Ускорение реакции производят
за счет использования 3 и 4 часовых бульонных культур
стафилококков, добавляя их по 0,1 куб. см в 0,5 куб. см
разведенной цитратной плазмы.
Пробирки на свертывание плазмы следует просматривать осторожно,
чтобы не разрушить начало образования сгустка.
При учете реакции плазмокоагуляции могут наблюдаться три
степени активности фермента коагулазы:
++++ - сгусток плотный;
+++ - сгусток, имеющий небольшой отсек;
++ - сгусток в виде взвешенного мешочка.
Все три варианта являются положительным результатом.
7.5.5. Обработка результатов
7.5.5.1. Положительная реакция плазмокоагуляции свидетельствует
о присутствии коагулазоположительных стафилококков в засеянной
массе продукта (в 10, или в 1 г (куб. см)).
7.5.5.2. Отрицательная реакция плазмокоагуляции свидетельствует
об отсутствии коагулазоположительных стафилококков в засеянной
массе продукта (в 10, или 1 г (куб. см)).
Примечание. При обнаружении значительного роста
коагулазоотрицательных стафилококков в готовых детских сухих
молочных смесях, микробиолог должен обратить внимание на санитарно
- гигиеническое содержание предприятия, т.к. у детей грудного
возраста некоторые варианты коагулазоотрицательных стафилококков
(S.epidermidis) также способны вызывать острые стафилококковые
энтериты.
7.6. Определение энтерококков
Определение энтерококков проводят в случае обнаружения в
выработанной партии значительного превышения количества
мезофильных аэробных и факультативно - анаэробных микроорганизмов
в целях выяснения причин несоответствия изготовленного продукта
этому нормативу.
7.6.1. Сущность метода
Метод основан на количественном подсчете колоний энтерококков,
вырастающих на плотных питательных средах, в состав которых входят
ингибиторы (кристаллический фиолетовый, трифенилтетразолий
хлористый, антибиотики: пенициллин, стрептомицин, полимиксин),
подавляющие развитие других бактерий.
7.6.2. Аппаратура, материалы, лабораторная
посуда и реактивы
Аппаратура, материалы, лабораторная посуда и реактивы -
согласно п. 4.
7.6.3. Подготовка к анализу
Подготовку проб и приготовление разведений проводят как указано
в п. п. 5.1 и 5.2.
Посуду и материалы стерилизуют как указано в п. 5.3.
7.6.4. Проведение анализа
7.6.4.1. Посев
Берут по 0,1 куб. см жидких продуктов или из первого разведения
сухих и пастообразных продуктов и высевают на подсушенную
поверхность молочной среды с полимиксином (п. 5.2.5.1) в 2 чашках
Петри. Посевной материал тщательно втирают шпателем в поверхность
среды. Посевы инкубируют при (37 +/- 1)- С в течение (48 +/- 1) ч.
7.6.4.2. Обработка результатов
Посевы просматривают. Типичные колонии энтерококков имеют
округлую форму, ровные края, блестящую поверхность, диаметр 1,5 -
2 мм и красную окраску с зоной протеолиза на светло - голубом фоне
среды. Подсчитывают все типичные колонии на обеих чашках и
среднеарифметическое их число умножают на 10 или 100,
соответственно, получая количество энтерококков в 1 г или 1,0 куб.
см продукта.
Идентификация культур.
Три - пять колоний отсеивают на скошенный мясо - пептонный агар
для дальнейшей идентификации. На скошенном агаре посевы
культивируют при (37 +/- 1)- С и течение (24 +/- 1) ч.
Из колоний, выросших на скошенном агаре, готовят мазки и
окрашивают по Граму. Определяют каталазную активность культуры: на
чистое обезжиренное стекло наносят каплю 1-процентного водного
раствора перекиси водорода (п. 6.2.9.2) и в ней растирают петлю
культуры. Если пузырьки газа не выделяются, значит реакция
отрицательная. Кроме того, изучаемые культуры засевают в бульоны,
содержащие 40% желчи (п. 6.2.9.3) и имеющие активную кислотность
9,6 ед. pH (п. 6.2.9.4). Инкубируют посевы при (37 +/- 1)- С от 18
до 24 ч. Рост изучаемых культур в указанных бульонных средах
подтверждают микроскопией мазка, окрашенного но Граму.
Энтерококки - грамположительные кокки, в мазках из жидких сред
располагаются в виде коротких или длинных цепочек, с плотных - в
виде диплококков или скоплений кокков; растут в бульонах с 40%
желчи и при активной кислотности (9,9 +/- 0,3) ед. pH, не
разлагают перекись водорода, так как не вырабатывают фермент
каталазу.
Обнаружение значительного роста энтерококков при посеве
исследуемого материала свидетельствует о необходимости контроля за
термическим режимом технологического процесса или проведения
санитарной обработки оборудования и технологических линий.
7.7. Определение B.cereus <*>
--------------------------------
<*> Допускается использование рекомендованных в ГОСТе 104444.8-
88 "Продукты пищевые. Метод определения B.cereus селективных сред
и тестов идентификации".
B.cereus - аэробные спорообразующие грамположительные палочки,
часть штаммов способна продуцировать энтеротоксин.
7.7.1. Сущность метода
Метод основан на количественном подсчете B.cereus, относящихся
к спорообразующим аэробным бациллам, при росте их на плотных
питательных средах с антибиотиком и яичным желтком.
7.7.2. Аппаратура, материалы и реактивы
Аппаратура, материалы и реактивы - согласно п. 4.
7.7.3. Проведение анализа
7.7.3.1. Подготовку проб и приготовление разведении проводят
как указано в п. п. 5.1 и 5.2.
Посуду, материалы и реактивы стерилизуют как указано в п. 5.3.
7.7.3.2. Посев
Производят посев по 0,1 куб. см разведения сухих молочных
продуктов 1:10 (0,01 г продута), по 0,2 куб. см БАДов из
разведения 1:10 (0,02 г продукта) на поверхность хорошо
подсушенной питательной среды в 2 чашках Петри. Посевной материал
тщательно растирают шпателем. Для посева используют питательные
среды по п. 6.2.5.1 (среда Донована) или п. 6.2.5.3 (солевой
полимиксиновый агар).
Посевы инкубируют в термостате при температуре (37 +/- 1)- С от
24 до 96 ч.
7.7.3.3. Обработка результатов
При отсутствии роста на обеих чашках дают заключение о
соответствии детской сухой молочной смеси нормативу за этот
показатель. При обнаружении роста изучают морфологию колоний:
штаммы В.cereus на солевом полимиксиновом агаре с 2,3,5-
трифенилтетраводном хлористым образуют ярко - рубиновые колонии на
фоне широкой зоны глубокого равномерного коагулята, колонии в
первые часы округлые, выпуклые; в дальнейшем (через 24 - 48 ч) -
распластанные по поверхности агара с изрезанными краями. На среде
Донована штаммы B.cercus образуют крупные белые распластанные
колонии со слегка изрезанными краями, окруженные широкой зоной
глубокого белого равномерного матового коагулята или двойной зоной
- коагулята и просветления (лецитиназная активность).
Из типичных колоний готовят мазки и окрашивают по Граму.
B.cereus - грамположительные споровые палочки, в некоторых
культурах - грамотрицательные.
7.7.3.4. Идентификация культур
Пересеивают 3 - 5 колоний на скошенный агар с последующей
инкубацией при температуре (30 +/- 1)- С от 18 до 24 ч.
Проводят микроскопию висячей и раздавленной капли для
установления подвижности и посев на среду с маннитом (п. 6.2.5.5)
и на кровяной агар (п. 6.2.5.4). Инкубацию посевов проводят при
(30 +/- 1)- С от 24 до 48 ч. Культуру также пересевают в пробирки
со средой Кларка (п. 6.2.2.5), которую инкубируют при температуре
(30 +/- 1)- С в течение (48 +/- 1) ч, для последующей постановки
реакции Фогес - Проскауэра.
Постановка реакции Фогес - Проскауэра описана в п. 7.3.5.4.
Характерными признаками для В.cereus являются образование зон
просветления на кровяном агаре (гемолитическая активность),
положительные реакции на лецитиназу и Фогес - Проскауэра,
подвижность и отсутствие способности сбраживать маннит.
7.7.3.5. При обнаружении роста, для определения количества
B.cereus в исследуемом продукте, количество выросших типичных
колоний на чашках умножают на соответствующее разведение и
выражают в пересчете на 1 г или 1,0 куб. см исследуемого продукта.
7.7.3.6. В продуктах, выработанных с соблюдением
технологических правил, при посеве 0,01 г рост B.cereus должен
отсутствовать, что соответствует показателю на этот микроорганизм
- "менее 100 клеток/г".
При обнаружении роста микробиолог в заключении указывает
подсчитанное количество B.cereus в 1 г продукта.
При несоответствии нормативу только по B.cereus в сухих
молочных продуктах типа "Детолакт" (в отдельных случаях от 100 до
200 КОЕ/г), партия однократно не задерживается для реализации. В
таких случаях микробиолог проводит исследования на наличие
B.cercus в компонентах растительного и животного происхождения и в
случае обнаружения в них значительных количеств B.cercus дает
рекомендации о возможности и путях использования их в
производстве.
Аналогично поступают при обнаружении от 200 до 400 КОЕ/г
B.cereus в сухих молочных продуктах типа "Малыш", подвергающихся
термической обработке перед употреблением.
7.8. Определение количества дрожжей и плесневых грибов
7.8.1. Сущность метода
Метод основан на количественном подсчете числа колоний дрожжей
и плесневых грибов, вырастающих на плотных питательных средах с
антибиотиками при температуре (24 +/- 1)- С в течение 5 суток при
посеве исследуемых продуктов.
7.8.2. Аппаратура, материалы и реактивы
Аппаратура, материалы и реактивы - согласно п. 4.
7. 8.3. Проведение анализа
7.8.3.1. Подготовку проб и приготовление разведений для посева
проводят согласно п. п. 5.1 и 5.2.
Посуду, материалы и реактивы стерилизуют как указано в п. 5.3.
7.8.3.2. Посев
Для определения количества дрожжей и плесневых грибов из каждой
пробы делают посев по 1,0 куб. см нативного продукта или по 1,0
куб. см разведений 1:10 и 1:100 на две чашки Петри. В каждую чашку
Петри, с заранее промаркированной крышкой, добавляют не позднее
чем через 15 - 20 мин. 14,0 куб. см одной из агаризованных сред:
(пп. 6.2.6.2; 6.2.6.3; 6.2.6.4; 6.2.6.5; 6.2.6.6), охлажденной до
45- С <*>. Среду немедленно тщательно перемешивают и оставляют для
застывания.
--------------------------------
<*> К средам добавляются антибиотики согласно п. 6.2.6.6.
Чашки с посевами выдерживают в термостате при температуре (24
+/- 1)- С в течение 120 ч (5 суток) с предварительным учетом через
3 суток.
Контроль стерильности питательных сред и воздуха проводят как
указано в п. 6.2.10.2.
Количество колоний дрожжей и плесневых грибов подсчитывают
раздельно на каждой чашке. Колонии дрожжей в указанных средах
имеют беловато - желтый цвет, сметанообразную консистенцию, по
мере роста и увеличения размеров приобретают перламутровый оттенок
и куполообразное возвышение.
Если в посевах на агаризованных средах присутствуют мукоровые,
очень быстро растущие грибы, то снятие предварительных результатов
необходимо проводить очень осторожно, не допуская того, чтобы
споры этих грибов осыпались и дали рост вторичных колоний. Через 5
суток проводят окончательный учет результатов термостатирования
посевов. Колонии дрожжей и плесневых грибов разделяют визуально.
Типичные колонии плесневых грибов с поверхности покрыты
пушистым мицелием, часто напоминающим вату. Окраска варьирует.
Рост дрожжей на агаризованных средах сопровождается
образованием крупных, выпуклых, блестящих, серовато - белых
колоний с гладкой поверхностью и ровным краем.
Для количественного подсчета отбирают чашки, на которых выросло
от 15 до 150 колонии дрожжей и (или) от 5 до 50 колоний плесневых
грибов.
При необходимости для разделения колоний дрожжей и плесневых
грибов проводят микроскопические исследования. Для этого из
отдельных колоний готовят препараты методом раздавленной капли. На
предметное стекло наносят каплю стерильной водопроводной воды.
Затем в эту каплю прокаленной иглой вносится часть колонии.
Полученная суспензия покрывается покровным стеклом.
Результаты микроскопирования оценивают пользуясь
характеристикой дрожжей и плесневых грибов, указанной в табл. 12.
Таблица 12
ХАРАКТЕРИСТИКА ДРОЖЖЕЙ И ПЛЕСНЕВЫХ ГРИБОВ
------------------T----------------------------------------------¬
¦ Группа ¦ Характеристика ¦
¦ микроорганизмов ¦ ¦
+-----------------+----------------------------------------------+
¦ Дрожжи ¦Одноклеточные микроорганизмы, клетки круг- ¦
¦ ¦лой, овальной или продолговатой формы, длиной ¦
¦ ¦от 2,5 до 30 мкм и шириной от 2,5 до 10 мкм, ¦
¦ ¦часто почкующиеся ¦
¦ ¦ ¦
¦ Плесневые гриб ¦Состоят из нитей - гифов, без перегородок или ¦
¦ ¦сентированных на клетки. Гифы образуют боковые¦
¦ ¦выросты и разветвления, от вегетативных гифов ¦
¦ ¦поднимающиеся гифы, несущие плодовые тела ¦
L-----------------+-----------------------------------------------
7.8.3.3. Обработка результатов
Если при испытании продукта на питательных средах обнаружен
рост дрожжей и плесневых грибов и их присутствие подтверждено
микроскопированием, то дают заключение о присутствии этих
микроорганизмов в продукте.
Результаты обрабатывают и пересчитывают отдельно для дрожжей и
плесневых грибов.
Количество дрожжей и плесневых грибов в 1,0 куб. см или в 1 г
продукта - (x) в КОЕ вычисляют но формуле:
m
x = n x 10 , где
n - количество колоний, подсчитанных на чашке Петри;
m - число десятикратных разведений.
За окончательный результат анализа принимают среднее
арифметическое, полученное по всем чашкам.
7.8.3.4. При обнаружении в 1 г исследуемого продукта количеств
дрожжевых и плесневых грибов, превышающих установленные нормативы
по этим показателям, партия готового продукта к реализации
задерживается для повторного расширенного микробиологического
контроля. Отбирают удвоенное количество образцов готовых детских
сухих молочных смесей с проведением посева на все
микробиологические показатели, указанные в табл. 1 Методических
|
