|
Стр. 2
6.2.2. Среды и реактивы для обнаружения бактерий группы
кишечных палочек и эшерхий коли
6.2.2.1. Среда Кесслер (с лактозой)
К 1,0 куб. дм водопроводной воды добавляют 10 г пептона и 50,0
куб. см стерильной желчи крупного рогатого скота. Смесь кипятят на
водяной бане при помешивании 20 - 30 мин. Затем фильтруют ее через
ватно - марлевый фильтр, добавляют 2,5 г лактозы; доводят объем
водой до 1 куб. дм. Устанавливают активную кислотность (7,5 +/-
0,1) ед. pH, используя 1H растворы NaOH или HCl и проверяя
значение pH на потенциометре. Добавляют 4,0 куб. см 1-процентного
indmncn раствора кристаллического фиолетового, разливают в
пробирки по 10,0 куб. см или колбочки по 40,0 - 50,0 куб. см,
закладывают поплавки. Стерилизуют в течение (15 +/- 1) мин. при
(121 +/- 1)- С.
6.2.2.2. Сухая среда Кесслера промышленного производства по ТУ
10.02.875-90
Подготовку среды для посева проводят согласно прописи на
этикетке.
6.2.2.3. Среды сухие Левина, Эндо
Среды Левина (эозинметиленовоголубой агар), Эндо промышленного
выпуска готовят согласно прописи, указанной на этикетке банок.
Изготовленные и разлитые в стерильные чашки Петри среды можно
хранить при температуре (4 +/- 2)- С до 10 суток.
6.2.2.4. Среда на индол
10,0 г сухого панкреатического гидролизата казеина (или 100,0
куб. см жидкого панкреатического гидролизата казеина с содержанием
500 куб. мг аминного азота), 5 г хлористого натрия, 1 г DL-
триптофана растворяют в 1,0 куб. дм дистиллированной воды. Доводят
активную кислотность (7,0 +/- 0,1) ед. pH 1H растворами NaOH или
HCl и, измеряя значение pH на потенциометре, разливают в пробирки
по 5,0 куб. см, стерилизуют в течение (15 +/- 1) мин. при (121 +/-
1)- С.
6.2.2.5. Среда Кларка
Взвешивают 5 г пептона, 5 г глюкозы, 5 г двузамещенного
фосфорно - кислого калия. Растворяют ингредиенты в 950,0 куб. см
дистиллированной воды, устанавливают активную кислотность (6,9 +/-
0,1) ед. pH, используя 1H растворы NaOH или HCl. Проверяют pH на
потенциометре. Доводят общий объем до 1000,0 куб. см
дистиллированной водой и при необходимости фильтруют. Разливают в
пробирки по 5,0 куб. см, стерилизуют в течение (20 +/- 1) мин. при
(115 +/- 1)- С.
6.2.2.6. 90-процентный раствор этилового спирта
В колбу, емкостью 1000 куб. см, с 900,0 куб. см 96-процентного
этилового спирта добавляют 60,0 куб. см дистиллированной воды.
6.2.2.7. Раствор индикатора метилового красного
0,1 г индикатора метилового красного помещают в мерную колбу,
вместимостью 500 куб. см, растворяют в 300,0 куб. см 90-
процентного раствора этилового спирта, доливают до 500,0 куб. см
дистиллированной водой. Хранят раствор в колбе с притертой пробкой
при температуре (4 +/- 2)- С.
6.2.2.8. 0,5-процентный раствор бромтимолового синего в спирте
Взвешивают 0,5 г бромтимолового синего, помещают в мерную
колбу, вместимостью 100 куб. см, и доводят этиловым спиртом до
метки. Раствор хранят при температуре (4 +/- 2)- С течение 30 - 35
суток в колбе с притертой пробкой.
6.2.2.9. 0,5-процентный и 0,1-процентный растворы
бриллиантового зеленого
Для приготовления 0,5-процентного раствора асептически
взвешивают 0,5 г индикатора бриллиантового зеленого, вносят в
стерильную мерную колбу, вместимостью 100 куб. см, и доводят
стерильной дистиллированной водой до метки.
Для приготовления 0,1-процентного раствора в стерильный мерный
цилиндр или колбу к 10,0 куб. см исходного 0,5-процентного
раствора индикатора добавляют 40,0 куб. см стерильной
дистиллированной воды.
Растворы хранят в холодильнике в течение 7 - 10 суток.
6.2.2.10. 1,6-процентного раствор бромкрезолового пурпурного в
спирте
Взвешивают 1,6 г индикатора бромкрезолового пурпурного и
количественно переносят в мерную колбу, вместимостью 100 куб. см.
Доводят 96-процентным этиловым спиртом до метки. При необходимости
фильтруют через бумажный фильтр. Хранят в колбе со шлифом в
условиях холодильника.
6.2.2.11. 5-процентный раствор alfa-нафтола
Взвешивают 5 г alfa-нафтола, растворяют в 100,0 куб. см 96-
процентного этилового спирта. Раствор готовят непосредственно
перед применением.
6.2.2.12. 40-процентный раствор гидроокиси калия
В стакане, вместимостью 100 куб. см взвешивают 40 г гидроокиси
калия, переносят в мерную колбу, вместимостью 100 куб. см,
растворяют в 60,0 куб. см дистиллированной воды, затем доводят до
метки дистиллированной водой. Раствор хранят при температуре 4 -
6- С.
6.2.2.13. 1-процентный водный раствор генцианового
(кристаллического) фиолетового
Взвешивают 1 г генцианового (кристаллического) фиолетового,
помещают в мерную колбу, вместимостью 100 куб. см, и доводят до
метки дистиллированной водой. Раствор хранят при температуре 4 -
6- С в течение 7 суток.
6.2.2.14. Реактив на индол (Эрлиха)
Взвешивают 5 г пара-диметиламинобензальдегида в стеклянном
стакане, вместимостью 100 куб. см, помещают в коническую колбу,
вместимостью 200 куб. см, и растворяют в 50,0 куб. см этилового
спирта. С помощью мерного цилиндра, вместимостью 100 куб. см,
медленно добавляют 50,0 куб. см концентрированной соляной кислоты.
Раствор хранят в колбе с притертой пробкой при температуре 4 - 6-
С.
6.2.2.15. Среда Козера
Взвешивают 1,5 г натрия - аммония фосфорно - кислого, 1 г калия
фосфорно - кислого двузамещенного, 0,2 г магния сульфата, 3 г
натрия лимонно - кислого трехзамещенного. Растворяют в 950,0 куб.
см дистиллированной воды, добавляют 10,0 куб. см 0,5-процентного
спиртового раствора бромтимолового синего. Устанавливают активную
кислотность (6,8 +/- 0,1) ед. pH растворами NaOH или HCl, проверяя
значение pH на потенциометре. Доводят объем дистиллированной водой
до 1,0 куб. дм. Разливают по 10,0 куб. см в пробирки, стерилизуют
в течение (15 +/- 1) мин. при (121 +/- 1)- С.
6.2.2.16. Среда Симмонса
Среду готовят аналогично среде Козера (п. 5.2.2.15), но после
измерения pH в нее добавляют 2 г агар - агара на 1000 куб. см,
прогревают на водяной бане до расплавления агара, стерилизуют в
течение (15 +/- 1) мин. при (121 +/- 1)- С. Разливают в стерильные
чашки Петри или пробирки.
6.2.2.17. Среда с 5% сахарозы
В 1000,0 куб. см дистиллированной воды растворяют 30 г сухого
питательного агара (по ТУ 42-14-33-75 или по ТУ 10-02-789-177-94)
и 50 г сахарозы. Стерилизуют в течение (30 +/- 1) мин. при (112 +/-
1)- С.
6.2.3. Среды и реактивы для обнаружения
бактерий рода Salmonella
6.2.3.1. Магниевая среда
Среду готовят из трех растворов <*>.
1 раствор:
пептон - 4,2 г
натрий хлористый - 7,15 г
дрожжевой диализат или дрожжевой
экстракт (ЭКД) - 20 куб. см
или 2 г
калий фосфорно - кислый однозамещенный - 1,42 г
вода дистиллированная - 890,0 куб. см
--------------------------------
<*> При необходимости использования среды двойной концентрации
масса (объем) всех ингредиентов, кроме воды, удваивается.
2 раствор:
магний хлористый кристаллический
(MgCl2 x 6H2O) - 35,7 г
вода дистиллированная - 90,0 куб. см
3 раствор:
0,5-процентный водный раствор
бриллиантового зеленого - 0,9 куб. см
После растворения всех ингредиентов растворы соединяют,
устанавливают активную кислотность (7,2 +/- 0,2) ед. pH, разливают
приготовленную таким образом среду в колбы и флаконы. Среду
стерилизуют при температуре (112 +/- 1)- С в течение (30 +/- 1)
мин.
6.2.3.2. Дрожжевой диализат
Взвешивают 1000 г свежих хлебных (прессованных) дрожжей,
размешивают в 1000,0 куб. см дистиллированной воды в кастрюле до
состояния гомогенной массы, которую переливают в целлофановый
мешок, предварительно промытый дистиллированной водой. Мешок
завязывают, обмывают под струей питьевой воды, а затем
дистиллированной водой и погружают в эмалированную посуду, в
которую предварительно наливают 1300,0 куб. см дистиллированной
воды. Мешок должен быть полностью погружен в жидкость. Диализ
ведут при температуре 60 - 80- С в течение (6 +/- 0,5) ч. За это
время количество жидкости в кастрюле должно уменьшиться примерно в
2 раза. Затем жидкость из кастрюли переливают в стерильную бутыль
и добавляют хлороформ (0,5% к общему объему жидкости) и сохраняют
при 5 - 7- С до 7 месяцев.
6.2.3.3. Среда Мюллера
К 90,0 куб. см стерильного мясо - пептонного бульона добавляют:
- 4,5 г химически чистого мела (CaCO3), предварительно
простерилизованного во флаконе сухим жаром (при 160- С в течение 2
ч);
- 10 куб. см раствора гипосульфита натрия (50 г чистого
кристаллического гипосульфита натрия в мерной колбе доводят до
100,0 куб. см дистиллированной водой, стерилизуют текучим паром в
течение (30 +/- 1) мин.);
- 2 куб. см раствора Люголя (металлического йода - 25 г,
йодистого калия - 20 г, дистиллированной воды - 100,0 куб. см).
После добавления указанных ингредиентов смесь взбалтывают и
разливают в необходимых количествах. Допускается использовать
среду в течение 7 дней после приготовления.
6.2.3.4. Среда Кауфмана
К 100,0 куб. см среды Мюллера добавляют 0,2 куб. см 0,5-
процентного водного раствора бриллиантового зеленого и 5,0 см 3
стерильной желчи крупного рогатого скота. Приготовленную смесь
стерилизуют текучим паром и течение (30 +/- 1) мин. До
стерилизации - среда зеленого цвета, после стерилизации она
приобретает зеленовато - коричневый тон.
6.2.3.5. Приготовление селенитовой среды
6.2.3.5.1. Селенитовая среда накопления Лейфсона <*>
Натрий кислый селенисто - кислый - 4 г
Пептон импортный - 5 г
Натрий фосфорно - кислый двузамещенный - 7 г
Натрий фосфорно - кислый однозамещенный - 3 г
Лактоза - 4 г
Дистиллированная вода - 1000,0 куб. см
--------------------------------
<*> При использовании среды двойной концентрации масса (объем)
всех ингредиентов, кроме воды, удваивается.
Среду готовят из 2 основных растворов. Прежде всего
экспериментально определяют точную пропорцию двузамещенного и
однозамещенного фосфата натрия, которая с используемым образцом
пептона и кислого селенисто - кислого натрия дает активную
кислотность (7,0 +/- 0,1) ед. pH, что регулируется соотношением
фосфатов. Такая предварительная подтитровка производится всякий
раз, когда меняется серия любого из входящих в среду основных
ингредиентов (пептон, кислый селенисто - кислый натрий, фосфаты).
После установления указанных соотношений к приготовленному
раствору фосфатов добавляют пептон и лактозу, разливают во флаконы
и стерилизуют текучим паром 2 дня по (30 +/- 1) мин. или при (112
+/- 1)- С однократно в течение (30 +/- 1) мин.
Отдельно на стерильной воде асептически готовят 10-процентный
раствор кислого селенита натрия. Перед началом работы на каждый
флакон с 50,0 куб. см основного раствора добавляют 2,0 куб. см
раствора кислого селенита натрия. Приготовленную среду разливают в
необходимых количествах в стерильные пробирки или колбы, плотно
закрывают приготовленными пробками.
6.2.3.5.2. Селенитовая среда сухая
Селенитовую среду приготавливают согласно прописи на этикетке.
6.2.3.6. Среды Плоскирева и висмут - сульфитный агар
Среды Плоскирева и висмут - сульфитный агар (ВСА) промышленного
производства выпускаются в сухом виде. Их следует готовить
согласно прописи, указанной на этикетке банки. Изготовленные и
разлитые в стерильные чашки Петри среды можно хранить и
холодильнике до 10 суток.
6.2.3.7. Трехсахарный агар с мочевиной (среда Олькеницкого)
Трехсахарный агар с мочевиной готовят смешением следующих
ингредиентов:
Дистиллированная вода - 100,0 куб. см
Сухой питательный агар - 2,5 г
Лактоза - 1,0 г
Сахароза - 1,0 г
Глюкоза - 0,1 г
Мочевина - 1,0 г
Железо серно - кислое (FeSO4 7H2O) - 0,02 г
Натрий серноватисто - кислый
(Na2S2O3 x 5H2O) - 0,03 г
0,04-процентный водный раствор фенолового
красного - 0,04 куб. см
Тщательно перемешивают и устанавливают активную кислотность
(7,3 +/- 0,1) ед. pH. Разливают в пробирки по 5,0 куб. см и
стерилизуют текучим паром по 20 мин. 3 дня подряд. После
стерилизации среду скашивают таким образом, чтобы высота столбика
была не менее 3 см. Готовая среда имеет бледно - розовый цвет.
6.2.3.8. 0,4-процентный водный раствор фенолового красного
Взвешивают 0,1 г индикатора фенолового красного, вносят в
колбу, вместимостью 50 куб. см, и вливают 25,0 куб. см
дистиллированной воды. Тщательно перемешивают до полного
растворения. Раствор хранят в холодильнике до 7 суток.
Для получения 0,04-процентного рабочего раствора индикатора 1,0
куб. см 0,4-процентного раствора смешивают с 9,0 куб. см
дистиллированной воды.
6.2.3.9. Среда Ресселя из сухих питательных сред
К 950,0 куб. см дистиллированной воды добавляют 40 г сухого
питательного агара с лактозой и индикатором ВР и 5 г питательного
агара. Смесь растворяют при нагревании до кипения. Затем в 50,0
куб. см дистиллированной воды растворяют 1 г химически чистой
глюкозы и добавляют к приготовленной смеси.
Разливают в стерильные пробирки по 5,0 - 6,0 куб. см и
стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по (30 +/- 1) мин. или
однократно при (111 +/- 1)- С в течение (30 +/- 1) мин. Среду
скашивают так, чтобы остался небольшой столбик (не менее 3 см
высотой).
6.2.3.10. Среда Клиглера из сухих питательных сред
Среду готовят и стерилизуют согласно прописи на этикетке.
Готовую среду скашивают в пробирках так, чтобы остался небольшой
столбик (не менее 3 см высотой).
6.2.3.11. Диагностическая поливалентная агглютинирующая
адсорбированная сальмонеллезная сыворотка.
Необходимые разведения сыворотки готовят перед использованием
согласно прилагаемой к коробке инструкции.
6.2.4. Среды и реактивы для обнаружения стафилококков
6.2.4.1. Солевой бульон
К 100,0 куб. см мясо - пептопного бульона (МПБ) с активной
кислотностью (7,3 +/- 0,1) ед. pH в колбе, вместимостью 200 куб.
см, добавляют 6,5 г хлористого натрия и разливают в пробирки по
10,0 куб. см. Стерилизуют в автоклаве при (121 +/- 1)- С в течение
(20 +/- 1) мин.
6.2.4.2. Бульон солевой и агар солевой - сухая питательная
основа для приготовления желточно - солевого или молочно -
солевого агара - промышленного производства. Подготовку сред для
посевов проводят согласно прописи на этикетке.
6.2.4.3. Агар типа Байрд - Паркер
Основа среды: 30 г сухого питательного агара на основе
ферментативного гидролизата кормовых дрожжей размешивают в 1,0
куб. дм дистиллированной воды, добавляют 10 г пирувата натрия, 5 г
хлористого лития, тщательно перемешивают. Смесь нагревают при
помешивании и кипятят в течение 1 минуты до полного растворения
ингредиентов. Устанавливают активную кислотность (7,1 +/- 0,1) ед.
pH. Разливают во флаконы объемами 100 - 200 - 300 куб. см в
зависимости от потребности и стерилизуют при (121 +/- 1)- С в
течение (15 +/- 1) мин. Основа среды может храниться в течение
месяца в условиях холодильника. Перед употреблением в растопленную
и охлажденную (45 - 50)- С основу, с соблюдением правил асептики
прибавляют (из расчета на 100,0 куб. см среды) 0,5 см 2-
процентного раствора теллурита калия и 5,0 куб. см эмульсии
яичного желтка. Среду тщательно перемешивают и разливают в чашки
Петри, в объеме, не менее 20,0 куб. см на чашку. Чашки со средой
могут быть использованы в течение 24 - 48 часов. Перед посевом
чашки со средой подсушивают в термостате общепринятым способом.
6.2.4.4. Агар типа Байрд - Паркера - арбитражная среда
промышленного производства в сухом виде
6.2.4.5. Желточно - солевой агар (ЖСА)
Основа - солевой агар: к мясо - пептонному бульону (МПБ) с
активной кислотностью (7,3 +/- 0,1) ед. pH добавляют 2% агара и
6,5% хлористого натрия, расплавляют на водяной бане, при
необходимости фильтруют через ватно - марлевый фильтр, разливают
мерным цилиндром по 100,0 куб. см в колбы, вместимостью 250 куб.
см, и стерилизуют при (121 +/- 1)- С в течение (3 +/- 1) мин.
Вместо мясо - пептонного бульона можно использовать сухой
питательный агар на основе килечного гидролизата, приготовленный
по прописи на этикетке.
ЖСА: на 100,0 куб. см стерильного расплавленного и остуженного
до (45 +/- 1)- С солевого агара добавляют 20,0 куб. см эмульсии
яичного желтка. После полного размешивания желточно - солевой агар
разливают в стерильные чашки Петри по 20,0 - 25,0 куб. см и хранят
в холодильнике до 5 - 7 дней.
6.2.4.6. Эмульсия яичного желтка
На дно стерильной чашки Петри помещают куриное яйцо, которое
тщательно протирают ватой, смоченной этиловым спиртом. Стерильным
пинцетом пробивают с двух противоположных сторон яйца два
отверстия. Через одно из этих отверстий из яйца полностью удаляют
белок, а затем, несколько увеличив отверстие, выливают желток в
стерильную колбу, вместимостью 200 куб. см. К желтку постепенно
добавляют (частями по 20,0 - 30,0 куб. см) 50,0 куб. см
стерильного физиологического раствора, затем содержимое тщательно
встряхивают до получения гомогенной массы.
6.2.4.7. Цитратная плазма кролика
Цитратная плазма кролика для реакции плазмокоагуляции
выпускается в сухом виде. Готовят непосредственно перед
употреблением согласно прописи в прилагаемом наставлении.
6.2.5. Среды и реактивы для обнаружения B.cereus
6.2.5.1. Среда Донована
К 1,0 куб. дм расплавленного питательного или мясо - пептонного
агара добавляют 2,5 г трехзамещенного цитрата натрия, 2,5 г
хлористого лития, стерилизуют при (110 +/- 1)- С в течение (30 +/-
1) мин., охлаждают до 45 - 50- С, добавляют 200000 ЕД полимиксина
"М" и эмульсию двух желтков. Тщательно перемешивают и разливают в
чашки Петри, которые можно хранить в холодильнике не более 7 - 10
суток.
6.2.5.2. Эмульсия яичных желтков для среды Донована
Асептически отделяют от яиц 2 желтка, как описано в п. 6.2.4.6.
К желткам добавляют 100,0 куб. см стерильного физиологического
раствора, тщательно встряхивают для получения гомогенной массы.
6.2.5.3. Солевой полимексиновый агар с 2,3,5 -
трифенилтетразолием хлористым
К 1,0 куб. дм 2-процентного питательного или мясо - пептонного
агара добавляют 60 г хлористою натрия, 200000 ЕД полимиксина "М",
0,1 - 0,2 г 2,3,5-трифенилтетразолия хлористого, эмульсию 2
желтков.
Полимиксин, 2,3,5-трифенилтетразолий хлористый и эмульсию
желтков асептично добавляют в агар после расплавления и охлаждения
до 40 - 45- С, хорошо перемешивают и разливают в чашки Петри.
Хранят среду в холодильнике не более 7 - 10 суток.
6.2.5.4. Кровяной агар
К 100,0 куб. см расплавленного и остуженного до 40 - 45- С с 2%
мясо - пептонного агара добавляют 5,0 куб. см дефибринированной
крови <*> человека, барана или кролика, тщательно перемешивают и
разливают в стерильные чашки Петри. Приготовленную среду хранят в
холодильнике до 5 суток.
--------------------------------
<*> В качестве антикоагулянта применяют 5-процентный раствор
лимонно - кислого натрия или 5-процентный раствор щавелево -
кислого натрия (или калия). Антикоагулянт берут из расчета 1 объем
на 9 объемов крови (1:9).
6.2.5.5. Среда с маннитом
В дистиллированную воду прибавляют 1% пептона и 0,5% хлористого
натрия. Растворяют при нагревании, прибавляют 0,1% спиртового
(1,6%) раствора бромкрезолового пурпурного (можно бромкрезолового
синего), нагревают до 80- С и устанавливают активную кислотность
(7,1 +/- 0,1) ед. pH, проверяя значение на pH-метре. Затем среду
кипятят (5 +/- 1) мин., фильтруют и доливают до первоначального
объема дистиллированной водой. Добавляют 0,5 - 1% маннита,
разливают по пробиркам с поплавками. Стерилизуют автоклавированием
при (115 +/- 1)- С в течение (15 +/- 1) мин.
6.2.5.6. Среда с индикатором ВР и маннитом сухая промышленного
производства.
Подготовку среды для посева проводят согласно прописи на
этикетке.
6.2.6. Среды и реактивы для обнаружения плесневых
грибов и дрожжей
6.2.6.1. Раствор солодового сусла с массовой долей сухих
веществ (7,5 +/- 0,5)%
Сусло фильтруют через фильтрованную бумагу, разливают в колбы и
стерилизуют (30 +/- 1) мин. в автоклаве при (108 +/- 2)- С. Затем
сусло декантируют. В сусле определяют массовую долю сухих веществ
ареометром - сахарометром. Сусло разбавляют водой до массовой доли
сухих веществ (7,5 +/- 0,5)%, разливают в колбы и стерилизуют при
(116 +/- 1)- С в течение (20 +/- 1) мин. Солодовое сусло можно
заменить виноградным суслом, которое готовят аналогично
солодовому.
6.2.6.2. Сусловый агар
К 1,0 куб. дм солодового сусла с массовой долей сухих веществ
(7,5 +/- 0,5)% прибавляют 30 г агара. Среду нагревают до полного
расплавления агара и фильтруют через вату или фильтровальную
бумагу. Охлаждают до (50 +/- 5)- С и устанавливают активную
кислотность (3,6 +/- 0,1) ед. pH с помощью молочной кислоты.
Фильтрат разливают в колбы и стерилизуют при (116 +/- 1)- С в
течение (20 +/- 1) мин.
6.2.6.3. Приготовление среды из сухого сывороточного агара "БФ"
К 1,0 куб. дм дистиллированной воды прибавляют 60 г порошка
агара сывороточного "БФ", нагревают до полного растворения (при
наличии осадка фильтруют). Устанавливают активную кислотность (4,0
- 4,5) ед. pH добавлением молочной кислоты, разливают в пробирки
или колбы и стерилизуют при (121 +/- 1)- С в течение (15 +/- 1)
мин.
6.2.6.4. Среда для определения дрожжей и плесневых грибов в
молоке и молочных продуктах промышленного производства <*> по ТУ
49 1059-84.
Среда готовится по прописи на этикетке.
--------------------------------
<*> Использование сред 6.2.6.4 - 6.2.6.6 допускается только в
производственных лабораториях.
6.2.6.5. Среда Сабуро
К 1,0 куб. дм дистиллированной воды добавляют 18 г агара и
оставляют на 30 мин. для его набухания, затем 40 г мальтозы или
глюкозы и 10 г пептона, нагревают до полного растворения (при
наличии осадка фильтруют). Устанавливают активную кислотность (6,5
+/- 0,1) ед. pH с помощью молочной кислоты. Разливают в пробирки
или колбы и стерилизуют при (116 +/- 1)- С в течение (20 +/- 1)
мин.
6.2.6.6. Среда с солодовым экстрактом
К 1,0 куб. дм дистиллированной воды добавляют 20 г солодового
экстракта, 5 г пептона, 0,4 г лимонной кислоты, 5 г сахарозы, 18 г
агара. Среду плавят в автоклаве, поднимая температуру до (120 +/-
1)- С (без выдержки). Давлению дают упасть, расплавленную среду
фильтруют через ватно - марлевый фильтр, разливают и стерилизуют
при (115 +/- 1)- С в течение (15 +/- 1) мин.
Среды хранят при температуре от 4 до 6- С не более 14 суток.
Для повышения элективности питательных сред 6.2.6.3 - 6.2.6.6
добавляют антибиотики в объеме, указанном в табл. 10.
Антибиотики готовят согласно пп. 6.2.6.7 - 6.2.6.10.
Таблица 10
----------T------------------------------------------------------¬
¦ Объем ¦ Объем добавляемых к среде растворов антибиотиков, ¦
¦питатель-¦ куб. см ¦
¦ной среды+------------T--------------T------------T-------------+
¦ ¦ пенициллин ¦ стрептомицин ¦ неомицин ¦ левомицетин ¦
+---------+------------+--------------+------------+-------------+
¦ 980 ¦ 10 ¦ 10 ¦ - ¦ - ¦
+---------+------------+--------------+------------+-------------+
¦ 930 ¦ - ¦ - ¦ 70 ¦ - ¦
+---------+------------+--------------+------------+-------------+
¦ 975 ¦ - ¦ - ¦ - ¦ 25 ¦
L---------+------------+--------------+------------+--------------
Водные растворы антибиотиков готовят непосредственно перед
использованием и вносят в расплавленную и охлажденную до (46 +/-
1)- С питательную среду.
Среды с антибиотиками хранению не подлежат.
6.2.6.7. Приготовление раствора пенициллина
Во флакон с пенициллином, содержащим 500000 ЕД, добавляют 5 - 7
куб. см стерильной дистиллированной воды (п. 6.1.6), тщательно
перемешивают до растворения. Содержимое флакона переносят в
стерильную мерную колбу, вместимостью 100 куб. см, и доводят до
метки стерильной дистиллированной водой при температуре от 35 до
40- С. Получают раствор пенициллина, содержащий 5000 ЕД/куб. см.
При использовании флаконов с пенициллином другой активности,
его растворяют в мерной колбе соответствующей вместимости до 5000
ЕД/см.
6.2.6.8. Приготовление раствора стрептомицина
400 мг стрептомицина вносят в стерильную мерную колбу,
вместимостью 100 куб. см, добавляют 10,0 - 20,0 куб. см стерильной
дистиллированной воды (п. 6.1.6) при температуре от 35 до 40- С,
перемешивают до растворения, затем доливают стерильной
дистиллированной водой до метки. Массовая концентрация
стрептомицина в растворе 4 г/куб. дм.
6.2.6.9. Приготовление раствора неомицина
500 мг неомицина вносят в стерильную мерную колбу вместимостью
100 куб. см, добавляют 10,0 - 20,0 куб. см стерильной
дистиллированной воды (п. 6.1.6) при температуре от 35 до 40- С,
перемешивают до растворения, затем доливают стерильной
дистиллированной водой до метки. Массовая концентрация неомицина в
растворе 5 г/куб. дм.
6.2.6.10. Приготовление раствора левомицетина (хлорамфеникола)
400 мг левомицетина вносят в стерильную мерную колбу
вместимостью 100 куб. см, добавляют 10,0 - 20,0 куб. см стерильной
дистиллированной воды (п. 6.1.6) при температуре от 35 до 40- С,
перемешивают до растворения, затем доливают стерильной
дистиллированной водой до метки. Массовая концентрация
левомицетина в растворе 4 г/куб. дм.
6.2.7. Среды и реактивы для определения бифидобактерий
6.2.7.1. Гидролизованное молоко
Обычное или восстановленное обезжиренное молоко (обрат) доводят
до кипения и кипятят (2 +/- 1) мин., охлаждают до (14 +/- 1)- С,
устанавливают активную кислотность (7,8 +/- 0,1) ед. pH 10 - 20-
процентным раствором NaOH.
Добавляют панкреатин из расчета 1 г/куб. дм, предварительно
разведенный в небольшом количестве нагретой до 44- С воды,
размешивают, ставят в термостат и выдерживают при температуре (40
+/- 1)- С под ватной пробкой. В течение первых 2 часов
перемешивание и коррекции активной кислотности до (7,8 +/- 0,1)
ед. pH проводят каждые (30 +/- 1) мин., в следующие 2 часа - через
каждый час. Через 4 часа от начала гидролиза к смеси добавляют 1 -
2% хлороформа, закрывают резиновой или корковой пробкой и снова
ставят в термостат. В течение первых часов молоко несколько раз
перемешивают (пробку после встряхивания прокалывают для удаления
паров хлороформа). Через 4 часа доводят активную кислотность до
(4,3 +/- 0,1) ЕД pH 30-процентным раствором уксусной кислоты,
кипятят, помешивая, в течение (15 +/- 1) мин., фильтруют через
бумажный фильтр. Готовый гидролизат должен содержать 200 - 300
мг/% аминного азота. Хранят гидролизат под хлороформом (1% к
объему) при температуре от 4 до 6- С.
6.2.7.2. Гидролизатно - молочная среда
Гидролизованное молоко, приготовленное по п. 6.2.7.1 разводят
питьевой водой в соотношении 1:1.
В небольшом количестве разведенного гидролизата расплавляют
агар в количестве 2,5 г на 1,0 куб. дм приготовляемой среды (в
случае приготовления селективной среды с неомицином 17 г на 1,0
куб. дм). К остальному количеству гидролизата добавляют 20 г
пептона и 3,5 г хлористого натрия, смесь нагревают до температуры
(80 +/- 2)- С, после чего соединяют с расплавленным агаром. В
смеси устанавливают активную кислотность (7,4 +/- 0,1) ед. pH,
кипятят к течение (15 +/- 1) мин., дают отстояться, сливают с
осадка, не фильтруя, доливают горячей дистиллированной водой до
заданного объема и добавляют в нее 10 г лактозы и 0,15 г соляно -
кислого цистина. Сведу разливают в пробирки высоким столбиком по
10,0 куб. см и стерилизуют при температуре (112 +/- 1)- С в
течение (30 +/- 1) мин. с предварительным подогревом автоклава
паром в течение (30 +/- 1) мин., активная кислотность готовой
среды (7,1 +/- 0,1) ед. pH.
6.2.7.3. Кукурузно - лактозная среда
В небольшом количестве дистиллированной воды расплавляют агар в
количестве 2,5 г на 1,0 куб. дм приготовляемой среды. К остальному
количеству дистиллированной воды добавляют 10 г пептона, 40,0 куб.
см водного раствора кукурузного экстракта, разбавленного 1:6, 6 г
натрия лимонно - кислого трехзамещенного, 0,12 г магния серно -
кислого, 2 г калия фосфорнокислого двузамещенного, смесь нагревают
до температуры (80 +/- 2)- С, после чего соединяют с расплавленным
агаром, добавляют 10 г лактозы и 0,15 г солянокислого цистина или
0,5 г аскорбиновой кислоты. Цистин предварительно растворяют в
небольшом количестве дистиллированной воды, в которой
устанавливают активную кислотность (8,4 +/- 0,1) ед. pH с помощью
10-процентного раствора NaOH и нагревают на водяной бане до
полного его растворения. Смесь доливают горячей дистиллированной
водой до заданного объема и устанавливают активную кислотность
среды (7 +/- 0,1) ед. pH с помощью 40-процентного раствора NaOH
или 25-процентного раствора аммиака. Среду разливают в пробирки
высоким столбиком по 10,0 куб. см и стерилизуют при (112 +/- 1)- С
в течение (30 +/- 1) мин.
6.2.7.4. Селективная среда для определения количества
бифидобактерий в продуктах, в микрофлоре которых присутствуют
молочно - кислые бактерии
В составе гидролизатно - молочной (по п. 6.2.7.2) или кукурузно
- лактозной среды (по п. 6.2.7.3) массовую долю агара увеличивают
до 17 г 1,0 куб. дм питательной среды. Среды разливают в широкие
пробирки но (20,0 +/- 0,5) куб. см и стерилизуют по п. 6.2.7.2.
При проведении анализа в готовые среды перед расплавлением
вносят 0,2 куб. см раствора неомицина (приготовленного по п.
6.2.7.5) из расчета по 20 куб. см среды.
6.2.7.5. Приготовление раствора неомицина
50 г неомицина (сульфата или основания) растворяют в 500,0 куб.
см дистиллированной воды. Массовая концентрация неомицина в
растворе 100 г/куб. дм.
6.2.8. Среды для определения молочно - кислых бактерий
6.2.8.1. Стерилизованное обезжиренное молоко
Обезжиренное молоко (кислотностью от 16 до 18- Т) разливают в
пробирки по 10,0 куб. см и затем стерилизуют при (115 +/- 1)- С в
течение (10 +/- 1) мин.
6.2.8.2. Агар с гидролизованным молоком
К приготовленному гидролизованному молоку (п. 6.2.7.1)
добавляют 1,5% агара. Смесь расплавляют при (121 +/- 1)- С (15 +/-
1) мин., фильтруют через вату (в теплом автоклаве), разливают в
пробирки или колбы и стерилизуют при (121 +/- 1)- С в течение (10
+/- 1) мин.
6.2.8.3. Агар с гидролизованным молоком, глюкозой и дрожжевым
автолизатом
В приготовленное гидролизованное молоко (п. 6.2.7.1) вносят
агар из расчета 17 г на 1,0 куб. дм, расплавляют и фильтруют его,
как указано в п. 6.2.8.2, после чего на 1,0 куб. дм раствора
добавляют 10 г глюкозы и 10,0 куб. см дрожжевого автолизата
(приготовленного по п. 6.2.8.4).
6.2.8.4. Приготовление дрожжевого автолизата
1 кг прессованных дрожжей разводят в 1,0 куб. дм воды и
помещают в термостат при температуре (56 +/- 1)- С на (72 +/- 2)
ч. После этого полученную суспензию обрабатывают в автоклаве при
температуре (115 +/- 1)- С в течение (15 +/- 1) мин. Автолизат
фильтруют через ватно - марлевый фильтр, промывая осадок таким
количеством воды, чтобы общее количество фильтрата составило (4,0
+/- 0,1) куб. дм.
6.2.8.5. Приготовление водного (голодного) агара
К 1,0 куб. дм питьевой воды добавляют 20 г агара, расплавляют и
фильтруют его, разливают и пробирки и стерилизуют при температуре
(121 +/- 2)- С в течение (15 +/- 1) мин.
6.2.9. Среды и реактивы для обнаружения энтерококков
6.2.9.1. Молочная среда с полимиксином по Г.П. Калине
К 1,0 куб. дм мясо - пептонного бульона добавляют 5,0 г натрия
хлористого, 15,0 г агара. Стерилизуют при (121 +/- 1)- С в течение
(20 +/- 1) мин. Полученный таким образом основной агар расплавляют
и охлаждают до 45- С. К 85,0 куб. см основного агара добавляют
1,25 куб. см и 0,01% водного раствора 2,3,5-трифенилтетразолия
хлористого, 15,0 куб. см стерильного обезжиренного молока (п.
6.2.8.1), 20000 - 40000 ЕД полимиксина "М". Все ингредиенты
асептически смешивают и среду тонким слоем разливают в чашки
Петри. Чашки со средой можно хранить в холодильнике в течение от 7
до 10 суток.
6.2.9.2. 1-процентный раствор перекиси водорода
К 320,0 куб. см дистиллированной воды в колбе, вместимостью 400
куб. см, добавляют 10,0 куб. см концентрированного раствора
пергидроля с исходной концентрацией 33%. Тщательно перемешивают,
переливают в колбу с притертой пробкой. Хранят в холодильнике в
колбе, обернутой темной бумагой.
6.2.9.3. Бульон с 40% желчи
К 60,0 куб. см мясо - пептонного бульона прибавляют 40,0 куб.
см нативной профильтрованной желчи крупного рогатого скота,
устанавливают активную кислотность (7,0 +/- 0,2) ед. pH. Разливают
во флаконы или пробирки, стерилизуют при (121 +/- 1)- С в течение
(30 +/- 1) мин.
6.2.9.4. Бульон с активной кислотностью 9,6 ед. pH
Мясо - пептонный бульон с активной кислотностью (7,0 +/- 0,2)
ед. pH нейтрализуют 1H раствором гидроокиси натрия до активной
кислотности 9,6 ед. pH, проверяя значение pH универсальной
индикаторной бумагой или по pH-метру. Разливают в пробирки или
флаконы и стерилизуют при (121 +/- 1)- С в течение (30 +/- 1) мин.
6.2.10. Контроль питательных сред
6.2.10.1. Определение активной кислотности (pH)
Электрометрическое определение проводят на потенциометре или pH-
метре по прилагаемым к ним инструкциям.
Определение активной кислотности с помощью индикаторной бумаги
проводится по прилагаемой к ней инструкций.
6.2.10.2. Контроль на стерильность
Среды проверяют на стерильность путем выдержки при температуре
(37 +/- 1)- С в течение 2 суток. Если после этого на пробных
питательных средах не обнаруживается колоний микроорганизмов, а в
жидких средах нет помутнения среды или осадка, свидетельствующих о
росте микроорганизмов, питательные среды считаются стерильными.
6.2.10.3. Сроки и условия хранения питательных сред
При отсутствии специально установленных условий и сроков
хранения плотные питательные среды хранят не более месяца при
температуре (20 +/- 3)- С и не более 2 месяцев при температуре 6-
С. Жидкие питательные среды хранят не более 14 дней при 6- С.
7. Методы анализа
При контроле микробиологического качества и безопасности
продуктов детского питания определяются следующие группы
микроорганизмов: общее количество мезофильных аэробных и
факультативно - анаэробных микроорганизмов; бактерии группы
кишечных палочек, E.coli, S.aureus, B.cereus; бактерии рода
Salmonella; дрожжи; плесневые грибы.
В кисло - молочных продуктах проводится контроль за количеством
технологически значимой микрофлоры: молочно - кислых бактерий и
бифидобактерий.
При проведении посевов па индикаторные, условно патогенные и
патогенные микроорганизмы должны быть использованы контрольные
культуры соответствующих микроорганизмов, которые изучают в тестах
идентификации параллельно с культурами, выделенными из исследуемых
образцов продуктов.
7.1. Определение общего количества мезофильных аэробных
и факультативно - анаэробных микроорганизмов
7.1.1. Сущность метода
Метод основан на количественном подсчете колоний
микроорганизмов, вырастающих на плотном питательном агаре при
температуре (30 +/- 1)- С в течение 72 ч.
Аппаратура, материалы и реактивы согласно п. 4.
7.1.2. Подготовка к анализу
Подготовку проб и приготовление разведений осуществляют как
указано в п. п. 5.1 и 5.2. Посуду, материалы и реактивы
стерилизуют как указано в п. 5.3.
7.1.3. Проведение анализа
Для определения общего количества мезофильных аэробных и
факультативно - анаэробных микроорганизмов выбирают те разведения,
при посеве которых на чашках вырастает не менее 15 и не более 300
колоний. При посеве продуктов, не требующих разведения, учитывают
все выросшие на чашках колонии (т.е. и менее 15).
Посев на чашки.
Перед посевом чашки маркируют. На дне чашки карандашом по
стеклу ставят номер исследуемого образца продукта, разведение и
дату.
По 1 куб. см цельного продукта или каждого соответствующего его
разведения вносят в 2 чашки Петри (параллельное определение).
Пипетку с посевным материалом держат под углом 45-, касаясь концом
пипетки дна чашки, не выдувая последнюю каплю из пипетки. Затем
наливают в каждую чашку по 15 - 20 куб. см питательной среды,
расплавленной на водяной бане и остуженной до 45- С (приготовление
питательных сред для определения общего количества бактерий
указано в пп. 6.1.9, 6.1.10, 6.2.1.1, 6.2.1.2). Если ожидают
ползучий рост микроорганизмов, посевы заливают вторым слоем
питательной среды или (4 +/- 1) куб. см водного раствора агара (п.
6.2.8.5).
Края колб с питательной средой перед каждой заливкой фламбируют
в пламени газовой горелки или спиртовки. Сразу после заливки агара
содержимое чашки Петри тщательно перемешивают путем легкого
вращательного покачивания для равномерного распределения посевного
материала.
7.1.4. Инкубация
После застывания среды чашки Петри переворачивают крышками вниз
и помещают в таком виде в термостат при (30 +/- 1)- С на 72 ч
(допускается предварительный учет через (48 +/- 1) ч с последующим
окончательным учетом еще через (24 +/- 1) ч.
Чашки Петри с посевами распределяют в термостате таким образом,
чтобы каждая их группа отделялась от соседних чашек, от верха и
стенок термостата не менее, чем на 3 см.
7.1.5. Учет и обработка результатов
Количество выросших колоний подсчитывают на каждой чашке,
поместив ее вверх дном на темном фоне, пользуясь лупой с
увеличением от 4 до 10 раз. Каждую подсчитанную колонию отмечают
на дне чашки чернилами. При подсчете колоний рекомендуется
пользоваться специальным прибором.
При большом числе колоний и равномерном их распределении дно
чашки Петри делят на четыре и более одинаковых сектора,
подсчитывают число колоний на двух - трех секторах (но не менее
чем на 1/3 поверхности чашки), находят среднее арифметическое
число колоний и умножают на общее количество колоний, выросших на
одной чашке.
Если инкубированные чашки с разведением 1:10 не содержат
1
колоний, то результат выражают так: меньше, чем 1 x 10 или
менее 10 бактерий на 1,0 куб. см (г) продукта. Если на каждой из
2 параллельных чашек с разведением 1:10 содержится меньше чем
15 колоний, то результат выражают так: количество микроорганизмов
менее М x 10, где М - число выросших колоний.
Если количество колоний более 15, подсчитывают колонии на обеих
чашках с одним и тем же разведением и вычисляют среднюю величину,
умножают ее на соответствующее разведение и получают число
микроорганизмов в 1,0 куб. см (г) продукта.
Полученный результат округляют в соответствии с ГОСТом 26670-91
"Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов":
- до числа, кратного 5, если среднее арифметическое число
микроорганизмов менее 100;
- до числа, кратного 20, если среднее арифметическое число
микроорганизмов более 100 и оканчивается цифрой 5;
- до числа, кратного 10, если среднее арифметическое число
микроорганизмов более 100 и не оканчивается цифрой 5.
Среднее арифметическое от подсчитанного количества колоний,
выросших на чашках, является общим количеством мезофильных
аэробных и факультативно - анаэробных микроорганизмов в 1 г (куб.
см) исследуемого продукта.
Ответ выражают в виде числа КОЕ/г с указанием соответствия или
несоответствия продукта микробиологическому нормативу на этот
показатель.
Пример: посеяно разведение 1 : 10; чашка 1 - 185 колоний, чашка
2 - 203 колонии;
расчет:
185 + 203 = 388 : 2 = 194 - округляем до 200;
3
результат 200 x 10 = 2000 = 2,0 x 10 КОЕ/г (куб. см).
7.2. Определение бактерий группы кишечных палочек
(колиформных бактерий)
7.2.1. Сущность метода
В соответствии с принятой международной номенклатурой в
настоящих Методических указаниях к бактериям группы кишечных
палочек (БГКП) отнесены грамотрицательные, не образующие спор
палочки, сбраживающие лактозу с образованием кислоты и газа при
температуре (37 +/- 1)- С в течение 24 - 48 ч, в основном
являющиеся представителями родов Esherichia, Citrobacter,
Enterobacter, Klebsiella, Serratia (т.e. учитываются как
цитратотрицательные, так и цитратположительные варианты БГКП).
Сухие продукты типа "Детолакт", "Новолакт ММ", "Алеся" и др.,
предназначенные для детей с первого дня жизни и употребляемые
после восстановления при (37 +/- 1)- С и (70 +/- 1)- С, перед
|
