Законы России
 
Навигация
Популярное в сети
Курсы валют
19.09.2017
USD
57.62
EUR
68.75
CNY
8.78
JPY
0.52
GBP
78.05
TRY
16.65
PLN
16.05
 

КОНТРОЛЬ СЫВОРОТКИ КРОВИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА НА ПРИСУТСТВИЕ ПОСТОРОННИХ ВИРУСОВ И МИКОПЛАЗМ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУК 4.2.2123-06" (УТВ. ГЛАВНЫМ ГОСУДАРСТВЕННЫМ САНИТАРНЫМ ВРАЧОМ РФ 17.08.2006)

Текст документа с изменениями и дополнениями по состоянию на ноябрь 2007 года

Обновление

Правовой навигатор на www.LawRussia.ru

<<<< >>>>


                                                             УТВЕРЖДАЮ
                                                          Руководитель
                                                 Федеральной службы по
                                                надзору в сфере защиты
                                                   прав потребителей и
                                                благополучия человека,
                                               Главный государственный
                                                       санитарный врач
                                                  Российской Федерации
                                                          Г.Г.ОНИЩЕНКО
                                                    17 августа 2006 г.
   
                                                        Дата введения:
                                                 с момента утверждения
   
                   4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ
                      И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
   
                        КОНТРОЛЬ СЫВОРОТКИ КРОВИ
                 КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА НА ПРИСУТСТВИЕ
                     ПОСТОРОННИХ ВИРУСОВ И МИКОПЛАЗМ
   
                          МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
                             МУК 4.2.2123-06
   
       1.  Разработаны: ФГУН "Государственный научно-исследовательский
   институт   стандартизации   и  контроля  медицинских  биологических
   препаратов   им.  Л.А.Тарасевича"  Роспотребнадзора  (Н.В.Шалунова,
   З.Е.Бердникова, Е.М.Петручук).
       2.  Рекомендованы  к  утверждению Комиссией по государственному
   санитарно-эпидемиологическому  нормированию  Федеральной  службы по
   надзору  в  сфере  защиты прав потребителей и благополучия человека
   (протокол N 2 от 11.07.2006 г.).
       3.  Утверждены  и  введены в действие Руководителем Федеральной
   службы  по  надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия
   человека,  Главным  государственным  санитарным  врачом  Российской
   Федерации Г.Г.Онищенко 17 августа 2006 г.
       4.  Введены взамен: "Контроль сыворотки крови крупного рогатого
   скота   на   отсутствие   вирусов-контаминантов   и  микоплазм"  РД
   42-28-14-88.
   
                          1. Область применения
   
       1.1.   Методические   указания  устанавливают  методы  контроля
   коммерческой  сыворотки  крови  крупного  рогатого  скота  (далее -
   сыворотка)   на   присутствие   посторонних  вирусов  и  микоплазм.
   Сыворотка  широко  применяется при культивировании органов и тканей
   животных,   используемых   для   приготовления  профилактических  и
   диагностических   иммунобиологических   препаратов   и   в  научных
   исследованиях.  Сыворотка является одним из компонентов питательных
   сред,  используемых  для  культивирования  первичных и перевиваемых
   клеточных культур.
       1.2.   Методические  указания  предназначены  для  специалистов
   органов  и  учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты
   прав   потребителей   и   благополучия   человека,   выпускающих  и
   контролирующих   медицинские  иммунобиологические  профилактические
   препараты.
       1.3.   Методические   указания   также   могут   использоваться
   организациями,    зарегистрированными   в   Российской   Федерации,
   выпускающими   и  контролирующими  медицинские  иммунобиологические
   профилактические препараты, и специалистами научных лабораторий.
   
                           2. Общие положения
   
       Контроль   сыворотки   на   присутствие   посторонних   вирусов
   предусматривает    использование    первично-трипсинизированных   и
   перевиваемых  клеточных культур, являющихся высокочувствительными и
   доступными    для    выявления    наиболее    часто   встречающихся
   вирусов-контаминантов.  В  этих  культурах  хорошо  размножаются  с
   развитием     цитопатических     изменений    вирусы    парагриппа,
   инфекционного      ринотрахеита,      диареи     и     аденовирусы.
   Продолжительность контроля 28 сут.
       Контроль  сыворотки  на  присутствие  микоплазм предусматривает
   проведение двух методов:
       1.  Микробиологический  метод. Метод основан на выявлении роста
   микоплазм  при  внесении  испытуемой сыворотки в питательные среды.
   Продолжительность контроля 21 сут.
       2.   Метод   индикаторной  клеточной  культуры  (цитохимический
   метод).
       Метод   основан   на   выявлении   ДНК   микоплазм,  окрашенных
   флюорохромом   Hoechst-33258  на  индикаторной  клеточной  культуре
   Vero.
       Продолжительность контроля 3-5 сут.
   
           3. Средства измерений, вспомогательные устройства,
                   оборудование, реактивы и материалы
   
       3.1.  При  выполнении  контроля должны быть применены следующие
   средства измерений, оборудование и вспомогательные устройства:
   весы аптечные от 1 до 20 г, погрешность
   +/- 20 мг                                 ТУ 64-1-2834-80
   колбы стеклянные, конические,
   вместимостью 50 мл, 100 мл                ГОСТ 25336-82Е
   стакан химический, вместимостью 1000 мл   ГОСТ 25336-82Е
   пипетки градуированные от 1,0 до 10,0 мл  ГОСТ 29227-91
   пробирки  бактериологические
   вместимостью от 10,0 до 20,0 мл           ГОСТ 25336-82Е
   стакан химический, вместимостью 1000 мл   ГОСТ 25336-82Е
   флаконы для  культивирования из
   нейтрального стекла (матрасы)             ГОСТ 5636-70
   флаконы, вместимостью 100, 500 мл         МРТУ 5031-32
   мешалка магнитная                         МРТУ 64-1-1503-67
   микроскоп биологический (любой модели)
   микроскоп люминесцентный серии ЛЮМАМ
   ножницы медицинские                       ГОСТ 21239-93
   пинцеты анатомические                     ТУ 64-1-37-78
   пробки резиновые                          ТУ 38.006269-95
   стекла предметные                         ТУ 9464-001-33016370-95
   чашки Петри (однократного применения)     ТУ 64-2-19-79
   воронка стеклянная                        ГОСТ 25336-82Е
   камера Горяева                            ТУ 9443-001-11856833-94
   термостат на температуру 37 град. С
   с погрешностью измерения не более
   +/- 1 град. С
   холодильник с температурой от 4 до
   10 град. С, вместимостью 1000 мл
   холодильник с температурой минус
   (20 +/- 4) град. С
   центрифуга ЦЛС-3                          МРТУ 42.1778-65 (495)
   
       3.2.  При  выполнении  контроля должны быть применены следующие
   реактивы и материалы:
   бензилпенициллина натриевая соль          ФСП 42-0048-1083-01
   стрептомицина сульфат                     ФС 42-3726-99
   версена раствор                           ФСП 42-0196-3274-02
   вода дистиллированная                     ГОСТ 6709-72
   гидролизат сердца крупного рогатого
   скота
   дрожжи хлебопекарные прессованные         ГОСТ 171-81
   глицерин, чда                             ГОСТ 6259-75
   масло иммерсионное кедровое (чистое)      ТУ 81-05-79-75
   мясная вода                               ТУ 42.14.271-82
   натрия гидроокись                         ГОСТ 4228-77
   натрия хлорид                             ГОСТ 4233-77
   раствор Хенкса                            ФСП 42-0343-3541-02
   спирт этиловый ректификованный
   96 град.                                  ГОСТ 18300-87
   питательная среда ДМЕМ                    ФСП 42-0343-3544-02
   сыворотка крови крупного рогатого
   скота, жидкая для культур клеток
   (предварительно отконтролированная
   на присутствие посторонних вирусов
   и микоплазм)                              ФСП 42-0196-4672-03
   тестикулы эмбрионов быка (получают
   на мясокомбинате, срок хранения не
   более 1 сут. при температуре от  4
   до 10 град. С)
   трипсин (0,25%-й раствор)                 ФСП 42-0343-3805-03
   хлороформ                                 ГОСТ 20015-88
   бумага фильтровальная                     ГОСТ 12026-761
   вата медицинская гигроскопическая         ТУ 8195-01116673801-99
   марля медицинская                         ГОСТ 9412-93,
                                             ТУ 9390-0119-34576906-95
   
                       4. Требования безопасности
   
       Работу  с  микроорганизмами 3 и 4 групп проводят в соответствии
   с  СП  1.2.731-99  "Безопасность  работы  с микроорганизмами III-IV
   групп патогенности и гельминтами".
   
                     5. Условия проведения контроля
   
       Подготовительные    операции   и   испытания   на   присутствие
   посторонних  вирусов  и  микоплазм  проводят  в  чистых  помещениях
   класса  А/В  (GMP)  с  ламинарным  потоком  воздуха  при соблюдении
   правил   асептики,   при   температуре   (20   +/-  2)  град.  С  и
   относительной влажности 60-70%.
   
        6. Контроль сыворотки на присутствие посторонних вирусов
   
       При  выполнении контроля используют два вида клеточных культур:
   первично-трипсинизированные   -   тестикулы   эмбрионов  быка  (ТБ)
   4-6-месячного  возраста  и  перевиваемые  -  почки  быка (МДВК) или
   любые   другие   перевиваемые  клеточные  культуры  почки  крупного
   рогатого  скота,  в  которые  вносят исследуемые сыворотки. Принцип
   метода  основан  на  появлении  цитопатического  действия (ЦПД) или
   гемадсорбции под действием вирусов-контаминантов.
   
                  6.1. Подготовка к выполнению контроля
   
       При  подготовке  к выполнению контроля сыворотки на присутствие
   посторонних вирусов должны быть выполнены следующие операции:
       6.1.1.   Приготовление   первично-трипсинизированной  клеточной
   культуры тестикулов эмбрионов быка (ТБ).
       6.1.2.   Доставляют  тестикулы  эмбрионов  быков  4-6-месячного
   возраста   с   перевязанной   мошонкой   с  мясокомбината  в  любом
   стерильном  сосуде  с  250-270  мл  раствора  Хенкса  с  500  ед/мл
   бензилпенициллина калиевой или натриевой соли.
       6.1.3.   Обжигают   кожу   мошонки   над   пламенем  горелки  и
   обрабатывают тампоном со спиртом.
       6.1.4.  Срезают  ножницами кожу с кончика мошонки и, подтягивая
   тестикулы за семенные канатики, извлекают их.
       6.1.5.  Помещают  тестикулы  в стерильную чашку Петри и удаляют
   ножницами белочную оболочку.
       6.1.6.  Переносят  тестикулы  в чашку Петри с 30-35 мл раствора
   Хенкса с 100 ед/мл антибиотика.
       6.1.7.   Разрезают   тестикулы  вдоль  и  вылущивают  ножницами
   содержимое в раствор Хенкса.
       6.1.8.  Промывают ткань тестикулов до просветления жидкости 2-3
   раза в растворе Хенкса с 500 ед/мл антибиотика.
       6.1.9.  Помещают ткань тестикулов в колбу вместимостью 500 мл с
   перемешивающим стержнем, прилагаемым к магнитной мешалке.
       6.1.10.  Нагревают  0,2%-й  раствор трипсина до температуры (20
   +/-  2)  град.  С  и  наливают  100-150 мл в колбу. Колбу ставят на
   магнитную  мешалку и включают ее. Скорость вращения перемешивающего
   стержня  должна  быть  такой, чтобы жидкость не пенилась и стержень
   не ударялся о стенки колбы.
       Перемешивание проводят 5-6 мин.
       6.1.11.  Сливают  надосадочную  жидкость  после  первого  цикла
   трипсинизации в колбу для отходов.
       6.1.12. Проводят 4-5 циклов трипсинизации.
       6.1.13.  Сливают  надосадочную  жидкость после каждого цикла во
   флаконы вместимостью 100 мл.
       6.1.14.  Помещают  флаконы  в  центрифугу и осаждают клетки при
   скорости 1000-1500 об/мин. в течение 10-15 мин.
       6.1.15.  Вынимают  флаконы  из центрифуги, сливают надосадочную
   жидкость в сосуд для отходов.
       6.1.16.  Добавляют  в каждый флакон к осадку клеток по 10-15 мл
   среды 0,5%-го гидролизата лактальбумина на растворе Хенкса.
       6.1.17.  Объединяют полученные суспензии клеток в один флакон и
   отбирают пипеткой (0,5 +/- 0,01) мл.
       6.1.18.  Добавляют  к  0,5  мл  этой  суспензии 0,5 мл 0,1%-го
   раствора  метиленового  синего  и подсчитывают окрашенные клетки в
                                       х
   камере  Горяева  при  увеличении  70.  Для  точности   результатов
   подсчет  проводят  в  нескольких  пробах. Количество клеток в 1 мл
   подсчитывают по формуле:
   
                              а х 1000 х 2
                          Х = ------------ , где
                                  0,9
   
       X - концентрация клеток в 1 мл исходной суспензии;
       а - среднее число клеток в нескольких пробах;
       0,9 - объем камеры Горяева в куб. мм;
       1000 - число куб. мм в 1 куб. см;
       2   -  коэффициент  разведения  суспензии  добавленным  объемом
   краски.
       6.1.19. Разводят суспензию клеток средой ДМЕМ  во  флаконе  по
                                                                    5
   п. 6.1.17. с   таким  расчетом, чтобы в 1 мл содержалось 4-5 х 10
   клеток/мл.
       6.1.20.  Вносят  в каждый из 2 флаконов вместимостью 1000 мл по
   100-120  мл разведенной суспензии клеток и добавляют 10% сыворотки,
   предварительно   отконтролированной   на   присутствие  посторонних
   вирусов и микоплазм.
   
             6.2. Культивирование и подготовка перевиваемой
                  клеточной культуры почки быка (МДВК)
   
       6.2.1.  Готовят  во  флаконе  вместимостью  100 мл 50 мл смеси,
   состоящей  из  равных  объемов 0,02%-го раствора версена и 0,25%-го
   раствора  трипсина  и  нагревают ее до температуры (20 +/- 2) град.
   С.
       6.2.2.  Просматривают  флаконы с МДВК вместимостью 1000 мл под
                                   х
   микроскопом  при  увеличении  70   и  отбирают  с полным монослоем
   клеток.
       6.2.3.  Сливают  питательную  среду  из  флаконов  в  сосуд для
   отходов и добавляют смесь версена и трипсина.
       6.2.4.   Оставляют  клетки  в  смеси  версена  и  трипсина  при
   температуре (20 +/- 2) град. С и наблюдают за ними визуально.
       6.2.5.  Когда  начнется "набухание" и слабое "отслоение" клеток
   от  стекла  (обычно  через  15-20  мин.),  сливают  смесь версена и
   трипсина в сосуд для отходов.
       6.2.6.  Флаконы  с клеточной культурой помещают при температуре
   (37 +/- 1) град. С на 30-35 мин.
       6.2.7.  Добавляют  во флаконы по 50 мл среды ДМЕМ и встряхивают
   их так, чтобы все клетки отделились от стекла.
       6.2.8.  Подсчитывают  клетки в камере Горяева, как указано в п.
   5.1.18.
       6.2.9. Разводят клетки средой ДМЕМ с таким расчетом, чтобы в 1
                        5
   мл содержалось 2 х 10  клеток/мл.
       6.2.10.   Вносят   в   каждый  из  2  флаконов  по  100-120  мл
   разведенной   суспензии   клеток   и   добавляют   10%   сыворотки,
   предварительно   отконтролированной   на   присутствие  посторонних
   вирусов и микоплазм.
       6.2.11.  Через  5-6  сут.  просматривают  флаконы  под световым
   микроскопом и отбирают с полным монослоем клеток.
   
                  6.3. Выполнение контроля сыворотки на
                     присутствие посторонних вирусов
   
       При  выполнении  контроля  сыворотки на присутствие посторонних
   вирусов должны быть выполнены следующие операции:
       6.3.1.  Отбирают по 1 флакону с клеточными культурами ТБ и МДВК
   для  проверки  испытуемой  сыворотки  и  по  1  флакону  с  теми же
   культурами в качестве контрольных.
       6.3.2.  Сливают  питательную  среду  из  флаконов  в  сосуд для
   отходов.
       6.3.3.  Монослой  клеток ТБ и МДВК промывают 3 раза средой ДМЕМ
   без сыворотки.
       6.3.4.  Вносят  пипеткой в каждый из двух флаконов вместимостью
   1000  мл  с  клеточными  культурами  ТБ  и МДВК по 25 мл испытуемой
   сыворотки  так,  чтобы  разведение  в  среде  не  превышало  1:4 из
   расчета не менее 3 кв. см площади на 1 мл сыворотки.
       Одновременно  вносят  пипеткой  в  каждый  из  двух контрольных
   флаконов  вместимостью 1000 мл с клеточными культурами ТБ и МДВК по
   25   мл   сыворотки,   ранее   отконтролированной   на  присутствие
   посторонних вирусов и микоплазм.
       6.3.5.  Инкубируют клеточные культуры ТБ и МДВК при температуре
   (20 +/- 2) град. С (60 +/- 5) мин.
       6.3.6.  Сливают  сыворотку  и добавляют в опытные и контрольные
   флаконы с культурами ТБ и МДВК по 75 мл среды ДМЕМ.
       Инкубируют при температуре (37 +/- 1) град. С 14 сут.
       6.3.7.  С  целью  обнаружения  цитопатогенного  действия  (ЦПД)
   просматривают   опытные   и   контрольные  клеточные  культуры  под
   микроскопом на 2, 5, 7, 10 и 14 сут.
       6.3.8.  Если  в  опытных  и  контрольных клеточных культурах не
   будет  наблюдаться  ЦПД,  через  14 сут. их трижды замораживают при
   температуре   минус   (20  +/-  2)  град.  С  и  размораживают  при
   температуре (37 +/- 2) град. С.
       6.3.9.   После  размораживания  культуры  флаконы  встряхивают,
   отбирают  из  каждого  флакона с клеточными культурами ТБ и МДВК по
   25  мл  суспензии  и вносят во флаконы с клетками того же вида. Два
   флакона с клеточными культурами ТБ и МДВК оставляют для контроля.
       6.3.10.  Вносят в опытные и контрольные клеточные культуры ТБ и
   МДВК по 75 мл среды ДМЕМ.
       6.3.11.  Клеточные  культуры инкубируют при температуре (37 +/-
   2) град. С в течение 14 сут.
       Если  в  течение  14  сут.  в  опытных  и контрольных клеточных
   культурах   не   наблюдается   ЦПД,   их   проверяют   на   наличие
   гемадсорбирующих вирусов.
       6.3.12.  Сливают  из  флаконов  питательную  среду  и промывают
   культуры 3 раза раствором Хенкса.
       6.3.13.  Добавляют  в  опытные и контрольные клеточные культуры
   по  50  мл 0,25%-й взвеси куриных эритроцитов и эритроцитов морской
   свинки и инкубируют их при температуре (37 +/- 2) град. С.
       6.3.14.  Через  30-35  мин.  эритроциты из флаконов удаляют, а
   монослой   промывают   раствором   Хенкса   и   просматривают  под
                                х
   микроскопом при увеличении 70 .
   
                          6.4. Учет результатов
   
       6.4.1.  Если  в  клеточных  культурах  при первичной инокуляции
   сыворотки  и  в пассаже не выявлено ЦПД и не отмечено гемадсорбции,
   сыворотка признается пригодной.
       6.4.2.  Если  при  исследовании  наблюдается ЦПД или отмечается
   гемадсорбция  в  испытуемых  клеточных  культурах  при отсутствии в
   контроле, сыворотку бракуют.
       6.4.3.  Если  ЦПД  или гемадсорбция появились в контрольных и в
   опытных  клеточных  культурах, допускается однократный переконтроль
   сыворотки.
   
             7. Контроль сыворотки на присутствие микоплазм
   
            7.1. Микробиологический метод контроля сыворотки
                        на присутствие микоплазм
   
       Обнаружение      микоплазм      микробиологическим      методом
   предусматривает   внесение   исследуемой   сыворотки   в  бульонную
   питательную  среду,  инкубирование  в  течение 7 сут. и последующий
   высев на питательную среду, содержащую 0,3% агара.
   
            7.2. Чувствительность микробиологического метода
   
       Микробиологический    метод    контроля   сыворотки   позволяет
   обнаруживать  одну  и более колоний микоплазм в объеме не более 100
   мл сыворотки.
   
                   7.3. Приготовление бульонной среды
   
       7.3.1.  Для  приготовления  1  л  среды  к 200 мл триптического
   гидролизата   бычьего   сердца  (содержание  сухих  веществ  8-10%)
   добавляют  400  мл  мясного экстракта 1:2 (содержание сухих веществ
   3,0-3,5%),  экстракт  хлебопекарных  дрожжей из расчета 1,5 г сухих
   веществ на 1 л среды, и 5,0 г хлорида натрия.
       7.3.2.  С  помощью  10%-го раствора NaOH устанавливают значение
   рН бульонной среды от 8,0 до 8,2.
       7.3.3.  Среду нагревают до кипения, кипятят 2-3 мин., фильтруют
   через складчатый бумажный фильтр.
       7.3.4.   Разливают   по   300-305   мл   во  флаконы,  закрытые
   ватно-марлевыми    или   резиновыми   пробками   и   завальцованные
   алюминиевыми   колпачками,   и  стерилизуют  автоклавированием  при
   температуре  110  град.  С 30 мин. С помощью 5%-го раствора соляной
   кислоты устанавливают рН от 7,8 до 8,0.
       7.3.5.   Для   приготовления   среды,  содержащей  0,3%  агара,
   дополнительно вносят 3,0 г агара.
       Готовые  среды  хранят  при  температуре  от  2 до 8 град. С не
   более 4 мес.
   
                   7.4. Стерильность питательной среды
   
       7.4.1.  Для  испытания  на стерильность отбирают не менее 2% от
   количества   емкостей   в   серии.   Определение   проводят   путем
   визуального  просмотра  каждого  флакона с питательной средой после
   выдерживания  в  течение 44-48 ч при температуре (37 +/- 1) град. С
   и 14 сут. при температуре 20-25 град. С.
       7.4.2.  В  случае  пророста хотя бы в одном флаконе бракуют всю
   серию. Далее питательная среда не используется.
   
                7.5. Определение ростовых свойств среды,
                          содержащей 0,3% агара
   
       Каждую   серию   приготовленной  среды  проверяют  на  ростовые
   свойства,  используя  тест-штамм  Mycoplasma  arginini  G  230 (ОСО
   42-28-378-05).
       Среду   считают   чувствительной   и   признают   годной,  если
   результаты  ее испытания соответствуют Инструкции по применению ОСО
   42-28-378-05.
   
                    7.6. Подготовка сред для контроля
   
       7.6.1.  Перед  употреблением  полужидкую среду, содержащую 0,3%
   агара,  разогревают  в водяной бане до полного расплавления агара и
   охлаждают до температуры 40-45 град. С.
       7.6.2.  Добавляют  15-20% нормальной сыворотки крови лошади без
   консерванта,   предварительно   проверенной   на   стерильность   и
   присутствие  микоплазм,  и  100  ед/мл  бензилпенициллина натриевой
   соли.
       7.6.3.  Разливают  по  10  мл  в  бактериологические пробирки и
   закрывают  ватно-марлевыми  пробками.  Хранят среду при температуре
   от 2 до 8 град. С не более 7 сут.
   
            7.7. Выполнение контроля сыворотки на присутствие
                  микоплазм микробиологическим методом
   
       При  выполнении  контроля  сыворотки микробиологическим методом
   должны быть выполнены следующие операции:
       7.7.1.  Вносят  (300  +/-  2)  мл  бульонной  среды  во  флакон
   вместимостью 500 мл. Флакон закрывают ватно-марлевой пробкой.
       7.7.2.  Вносят  (100 +/- 2) мл исследуемой сыворотки в (300 +/-
   2)  мл бульонной среды. Смесь инкубируют 7 сут. при температуре (37
   +/- 1) град. С и относительной влажности 80-90%.
       7.7.3.  Отбирают  10 пробирок со средой, содержащей 0,3% агара,
   и  вносят  в  каждую пробирку по (1,0 +/- 0,1) мл смеси исследуемой
   сыворотки  и  бульонной  среды.  Посев проводят прокалыванием всего
   столбика   питательной   среды,  содержащейся  в  пробирке,  концом
   пипетки  вместимостью  1,0  мл,  выпуская равномерно ее содержимое,
   начиная от дна до поверхности.
       7.7.4.  Инкубируют  посевы  14  сут. при температуре (37 +/- 1)
   град. С и относительной влажности 80-90%.
   
                          7.8. Учет результатов
   
       7.8.1.  Учет  результатов  проводят путем визуального просмотра
   засеянных пробирок в проходящем свете на 4, 7, 10, 14 сут.
       7.8.2.  Сыворотка  считается свободной от микоплазм, если через
   14  сут.  не  обнаруживают  роста микоплазм ни в одной из засеянных
   пробирок.
       7.8.3.  В  случае  получения  сомнительных результатов проводят
   повторный контроль.
       7.8.4.  При  повторном  контроле,  при  наличии роста микоплазм
   хотя  бы  в  одной  пробирке, сыворотка считается контаминированной
   микоплазмами.
   
         8. Контроль сыворотки на присутствие микоплазм методом
         индикаторной клеточной культуры (цитохимический метод)
   
       Метод   обнаружения  микоплазм  с  использованием  индикаторной
   клеточной  культуры Vero основан на внесении испытуемой сыворотки в
   клеточную    культуру    и    обработку   препарата   специфическим
   флюоресцирующим  красителем  Hoechst-33258, окрашивающим ДНК клеток
   и    микоплазм.    Возможно    применение    другого   флюорохрома,
   аттестованного  в  ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Клеточную культуру Vero
   (или   другую  чувствительную  к  микоплазмам)  получают  из  банка
   клеток,  аттестованного  в  соответствии  с требованиями ВОЗ в ГИСК
   им. Л.А.Тарасевича.
   
          8.1. Подготовка к выполнению контроля на присутствие
            микоплазм методом индикаторной клеточной культуры
   
       При  подготовке  к выполнению контроля сыворотки на присутствие
   микоплазм  методом  индикаторной  клеточной  культуры  должны  быть
   выполнены  следующие  операции:  приготовление основного и рабочего
   раствора   красителя   Hoechst-33258,   подготовка  люминесцентного
   микроскопа, подготовка предметных стекол.
   
           8.1.1. Приготовление основного и рабочего раствора
                              Hoechst-33258
   
       Соблюдая   стерильность,   5   мг   концентрата   Hoechst-33258
   растворяют  в  100  мл  стерильной  дистиллированной воды (основной
   раствор).
       Для  получения рабочего раствора добавляют концентрат красителя
   в  раствор Хенкса без индикатора в соотношении 1:9 и используют для
   окраски препаратов немедленно.
   
              8.1.2. Подготовка люминесцентного микроскопа
   
       Используют  для  анализа  препаратов  фильтры:  ФС1-4, СС15-2,
                                                           х        х
   БС8-2.  Просматривают  препараты  при  увеличении ок. 10 , об. 90
                                х           х
   масляная иммерсия, или об. 70  или об. 85  водная иммерсия.
   
                   8.1.3. Подготовка предметных стекол
   
       Промывают  стекла  в  проточной  водопроводной  воде  в течение
   10-15  мин.  Помещают  стекла  в  сосуд  с дистиллированной водой и
   кипятят  5-7  мин.  После  охлаждения  до температуры 20-22 град. С
   извлекают  стекла  с  помощью  пинцета  и  помещают  в чашку Петри.
   Протирают  каждое  стекло стерильной салфеткой и помещают на 1 сут.
   в   смесь   Никифорова,   состоящую  из  равных  объемов  96  град.
   этилового  спирта  и  эфира для наркоза. Извлекают стекла с помощью
   пинцета  из  смеси  Никифорова и протирают каждое стекло стерильной
   салфеткой.  Стерилизуют стекла (30 +/- 2) мин. при температуре (120
   +/- 2) град. С.
   
            8.2. Выполнение контроля сыворотки на присутствие
            микоплазм методом индикаторной клеточной культуры
   
       При  проведении  испытания  на  присутствие  микоплазм  методом
   индикаторной клеточной культуры выполняют следующие операции:
       8.2.1.  Вносят  1  мл  испытуемого  материала  в  чашку  Петри
   диаметром  90  мм, содержащую стерильное предметное стекло и 20-23
                                                         5
   мл суспензии клеточной культуры Vero в концентрации 10  кл/мл.
       8.2.2.  Инкубируют  чашку  Петри  с клеточной культурой Vero в
   течение  3-5  сут. при температуре (37 +/- 1) град. С в анаэробных
   условиях  до  формирования  50-70%  монослоя. Образование монослоя
                                                        х        х
   наблюдают в световом микроскопе при увеличении ок. 10 , об. 20 .
       8.2.3.   Сливают  культуральную  жидкость,  промывают  препарат
   питательной средой или буфером (рН 7,2-7,4).
       8.2.4.  Помещают  предметное  стекло  на  30-35 мин. в 96 град.
   этиловый спирт.
       Сливают спирт и высушивают препарат на воздухе.
       8.2.5.  Добавляют  рабочий  раствор  красителя  Hoechst-33258 и
   окрашивают  в  темноте при температуре (37 +/- 1) град. С в течение
   30-35 мин.
       8.2.6.   Сливают   краситель,   промывают  препарат  стерильной
   дистиллированной водой, подсушивают на воздухе и микроскопируют.
   
                          8.3. Учет результатов
   
       Учет  результатов  испытания  на  присутствие микоплазм методом
   окрашивания   ДНК   флюорохромом   Hoechst-33258   на  индикаторной
   культуре   клеток   Vero  проводят  путем  просмотра  препаратов  в
   люминесцентном микроскопе.
       Микоплазмы  выглядят, как однородно окрашенные тела сферической
   формы,  имеющие  вид  отдельных,  парных, цепочечных или нитевидных
   образований  яркого зеленоватого свечения. Диаметр обычно находится
   в пределах 0,1-0,3 микрона.
       Микоплазмы  в  виде  ярко светящейся зернистости на фоне темной
   цитоплазмы   выявляют   по   периферии   клеток  и  в  межклеточном
   пространстве.
       Условно   интенсивность  контаминации  микоплазмами  обозначают
   знаками креста:
       1 крест - единичные микоплазмы в препарате;
       2 креста - небольшие скопления микоплазм в поле зрения;
       3 креста - отдельные микоплазмы и скопления в 20-50% клеток;
       4  креста  - максимальное количество микоплазм в виде скоплений
   в межклеточном пространстве в каждом поле зрения.
       В   качестве   положительных  контрольных  образцов  используют
   заведомо контаминированные микоплазмами клеточные культуры.
       Отрицательными    контрольными   образцами   служат   клеточные
   культуры,  в  которых  описанные  выше  светящиеся  образования  не
   выявлены.
       Обнаружение  микоплазм  в  препаратах на индикаторной клеточной
   культуре  Vero свидетельствует о контаминации испытуемого материала
   микоплазмами.
       В  случае  получения сомнительных результатов следует проводить
   повторный контроль.
       Окончательный  ответ  о присутствии микоплазм в сыворотке будет
   учитывать  результаты  двух  методов:  микробиологического и метода
   индикаторной клеточной культуры.
       В  случае обнаружения микоплазм хотя бы одним методом сыворотка
   считается контаминированной и бракуется.
   
   
   
   
   
                                                            Приложение
   
                                                             Таблица 1
   
            Контроль сыворотки крови крупного рогатого скота
                   на присутствие посторонних вирусов
   
   --------------------------------T--------------------------------¬
   ¦      Клеточные культуры       ¦       Результаты контроля      ¦
   ¦                               +---------------T----------------+
   ¦                               ¦     ЦПД       ¦   Гемадсорбция ¦
   +-------------------------------+---------------+----------------+
   ¦Первично-трипсинизированная    ¦ Не обнаружено ¦  Не обнаружено ¦
   ¦клеточная культура ТБ          ¦               ¦                ¦
   +-------------------------------+---------------+----------------+
   ¦Перевиваемая клеточная культура¦ Не обнаружено ¦  Не обнаружено ¦
   ¦МДВК                           ¦               ¦                ¦
   L-------------------------------+---------------+-----------------
   
                                                             Таблица 2
   
            Контроль сыворотки крови крупного рогатого скота
                        на присутствие микоплазм
   
   --------------------------T--------------------------------------¬
   ¦            Методы       ¦          Результаты контроля         ¦
   +-------------------------+--------------------------------------+
   ¦Микробиологический (посев¦Отсутствие роста                      ¦
   ¦на питательные среды)    ¦                                      ¦
   +-------------------------+--------------------------------------+
   ¦Цитохимический           ¦Отсутствие люминесцентного свечения в ¦
   ¦                         ¦индикаторной клеточной культуре Vero  ¦
   L-------------------------+---------------------------------------
   
   

Списки

Право 2010


Новости партнеров
Счетчики
 
Популярное в сети
Реклама
Курсы валют
19.09.2017
USD
57.62
EUR
68.75
CNY
8.78
JPY
0.52
GBP
78.05
TRY
16.65
PLN
16.05
Разное
Rambler's Top100