|
Стр. 15
I. Методы определения микотоксинов
Для обнаружения, идентификации и количественного определения
микотоксинов используют следующие методы:
- двумерную и одномерную ТСХ (для серийных определений);
- ВЭЖХ с УФ-фотометрическим и флуориметрическим детектированием
(для серийных и арбитражных анализов).
Специфическое оборудование и материалы
Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С, ТУ 64-1-2451-78.
Ротационный испаритель с ловушкой, модель ИР-2М (завод
"Химлабприбор"), или аналогичный.
Мельница лабораторная электрическая ЭМ-3А, ТУ 46-22-236-79, или
аналогичная.
Облучатель настольный ультрафиолетовый, снабженный
светофильтром с максимумом пропускания при длине волны 365 нм.
Жидкостной хроматограф с насосом высокого давления с подачей
растворителя от 0,1 до 5 куб. см/мин.; колонка и предколонка с
силикагелем или с силикагелем, химически связанным с
октадецилсиланом (силикагель С18), или с силикагелем, химически
связанным с алкилнитрилом, с размером частиц 5 мкм; длина колонок
- 25 см, предколонок - 4,5 см, внутренний диаметр колонок - 0,46
см; ультрафиолетовый детектор с переменной длиной волны;
флуориметрический детектор; регистрирующий потенциометр
(самописец) или интегратор.
Микрошприцы МШ-10 и МШ-25 для жидкостной хроматографии.
Спектрофотометр СФ-26, СФ-46 или подобный, позволяющий
проводить измерения при длине волны 275 - 360 нм, с допустимой
абсолютной погрешностью измерений коэффициента пропускания не
более 1%.
Кюветы кварцевые с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм.
Шкаф сушильный, обеспечивающий нагрев до 150 -С.
Центрифуга лабораторная, обеспечивающая скорость вращения 4000
об./мин., стаканы центрифужные стеклянные вместимостью 200 куб.
см.
Насос водоструйный лабораторный, ГОСТ 25336.
Стеклянные камеры для ТСХ с притертыми крышками, например
стеклянный четырехугольный сосуд размером 195 х 195 х 200 мм
завода "Дружная горка".
Пластинки для ТСХ "Силуфол" размером 15 х 15 или 20 х 20 см
(Чехия) или подобные.
Распылитель стеклянный с грушей.
Воронки делительные ВД 2-250 или ВД 2-500, ГОСТ 25336.
Колонки стеклянные хроматографические 230 х 15 и 300 х 22 мм.
Силикагель L для колоночной хроматографии с размером частиц 100
- 160 мкм, "Lachema" (Чехия).
Флоризил, 60 - 100 меш., "Merk" (Германия).
Ацетон, ч.д.а., ГОСТ 2603-71.
Ацетонитрил, ч., ТУ 6-09-3543-74.
Бензол, ч.д.а., ГОСТ 5955-75.
Гексан, ч., ТУ 6-09-3375-73.
1,4-Диоксан, ч.д.а., ГОСТ 10455.
Изопропиловый спирт (пропанол-2), ч.д.а., ТУ 6-09-402-76.
Метанол, ч., ГОСТ 6995-77.
Спирт этиловый ректификат, ТУ 6-09-1710-77.
Толуол, ч., ГОСТ 5789-78.
Хлороформ медицинский, ГОСТ 3160-51, или технический, ГОСТ
20015.
Этиловый эфир уксусной кислоты (этилацетат), ч., ГОСТ 22300-76.
Эфир диэтиловый медицинский, ГОСТ 6265-52.
Кислота азотная, ч.д.а., ГОСТ 4461-67.
Кислота лимонная, 1-водная, ч.д.а., ГОСТ 3652-29.
Кислота муравьиная, ч.д.а., ГОСТ 5848-73.
Кислота серная, ч., ГОСТ 4204-77.
Кислота соляная, х.ч., ГОСТ 3118.
Кислота уксусная, ч.д.а., ГОСТ 61-75.
Алюминия оксид нейтральный по Брокману 11 для колоночной
хроматографии, "Reanal" (Венгрия), номер по каталогу 01125, или
алюминия оксид для хроматографии, ТУ 6-09-3916-75.
Алюминий хлористый, 6-водный, х.ч., ГОСТ 3759-75.
Бензидин, ч.д.а., раствор в муравьиной кислоте концентрацией 5
г/куб. дм.
Йод, ч., ГОСТ 4159, раствор в этиловом эфире концентрацией 250
г/куб. дм.
Калий хлористый, х.ч., ГОСТ 4234-77.
Калий железосинеродистый 3-водный, х.ч., ГОСТ 4207, водный
раствор концентрацией 150 г/куб. дм (раствор Карреза I).
Цинк уксуснокислый, 2-водный, х.ч., ГОСТ 5823, водный раствор
концентрацией 300 г/куб. дм (раствор Карреза II).
Калий марганцовокислый, х.ч., ГОСТ 20490, водный раствор
концентрацией 15 г/куб. дм.
Натрия сульфат безводный, х.ч., ГОСТ 4166-76.
Натрий хлористый, х.ч., ГОСТ 4233-66.
Натрий углекислый кислый (гидрокарбонат), х.ч., ГОСТ 4201-79,
водный раствор концентрацией 50 г/куб. дм.
Прочный синий В-соль (диазоль синий С) для гистологии
("Chemapol", Чехия), водный раствор концентрацией 10 г/куб. дм.
Свинец уксуснокислый, х.ч., ГОСТ 1027-67, водный раствор
концентрацией 150 г/куб. дм.
Серебро азотнокислое, ч., ГОСТ 1277, водный раствор
концентрацией 250 г/куб. дм.
Уголь активированный, Р.72.270.3.
Бумажные фильтры обеззоленные марки ФОМ.
Приготовление и хранение стандартных
растворов микотоксинов
Чистоту и аутентичность стандартных препаратов микотоксинов
определяют с помощью УФ-спектрофотометрии (табл. 47) и
хроматографических методов (ТСХ, ВЭЖХ).
Расчет концентрации стандартных растворов проводят по данным УФ-
спектрофотометрии. Данные о коэффициентах молярной экстинкции
микотоксинов в максимумах поглощения в УФ-спектре приведены в
табл. 47.
Таблица 47
КОЭФФИЦИЕНТЫ МОЛЯРНОЙ ЭКСТИНЦИИ МИКОТОКСИНОВ
-------------T------------T------------T-------------------------¬
¦Микотоксины ¦Молекулярная¦Длина волны ¦ Коэффициент молярной ¦
¦ ¦ масса ¦ максимума ¦экстинкции Е, кв. см/моль¦
¦ ¦ ¦поглощения, +-------------------------+
¦ ¦ ¦ нм ¦ растворитель ¦
¦ ¦ ¦ +------------T------------+
¦ ¦ ¦ ¦ метанол ¦ бензол- ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ацетонитрил ¦
+------------+------------+------------+------------+------------+
¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦
+------------+------------+------------+------------+------------+
¦Афлатоксины ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+------------+------------+------------+------------+------------+
¦В1 ¦312,3 ¦223 ¦22100 ¦ ¦
+------------+------------+------------+------------+------------+
¦ ¦ ¦265 ¦12400 ¦ ¦
+------------+------------+------------+------------+------------+
¦ ¦ ¦362 <*> ¦21800 ¦19800 <**> ¦
+------------+------------+------------+------------+------------+
¦В2 ¦314,3 ¦223 ¦18600 ¦ ¦
+------------+------------+------------+------------+------------+
¦ ¦ ¦265 ¦12100 ¦ ¦
+------------+------------+------------+------------+------------+
¦ ¦ ¦362 <*> ¦24000 ¦20900 <**> ¦
+------------+------------+------------+------------+------------+
¦G1 ¦328,3 ¦242 ¦9600 ¦ ¦
+------------+------------+------------+------------+------------+
¦ ¦ ¦265 ¦9600 ¦ ¦
+------------+------------+------------+------------+------------+
¦ ¦ ¦362 <*> ¦17700 ¦17100 <**> ¦
+------------+------------+------------+------------+------------+
¦G2 ¦330,3 ¦242 ¦10500 ¦ ¦
+------------+------------+------------+------------+------------+
¦ ¦ ¦265 ¦9000 ¦ ¦
+------------+------------+------------+------------+------------+
¦ ¦ ¦362 <*> ¦19300 ¦18200 <**> ¦
+------------+------------+------------+------------+------------+
¦M1 ¦328,3 ¦226 ¦23100 ¦ ¦
+------------+------------+------------+------------+------------+
¦ ¦ ¦265 ¦11600 ¦ ¦
+------------+------------+------------+------------+------------+
¦ ¦ ¦357 <*> ¦19000 ¦18815 <**> ¦
+------------+------------+------------+------------+------------+
¦Стеригмато- ¦324,1 ¦326 <*> ¦15310 ¦15200 <**> ¦
¦цистин ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+------------+------------+------------+------------+------------+
¦ ¦- ¦277 ¦3040 ¦ ¦
+------------+------------+------------+------------+------------+
¦ ¦ ¦246 ¦32870 ¦ ¦
+------------+------------+------------+------------+------------+
¦Дезоксини- ¦296,0 ¦218 <*> ¦4500 <**> ¦ ¦
¦валенол ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+------------+------------+------------+------------+------------+
¦Зеараленон ¦318,1 ¦236 ¦28850 ¦ ¦
+------------+------------+------------+------------+------------+
¦ ¦ ¦274 <*> ¦12710 <**> ¦ ¦
+------------+------------+------------+------------+------------+
¦ ¦ ¦316 ¦5840 ¦ ¦
+------------+------------+------------+------------+------------+
¦Охратоксин А¦403,1 ¦214 ¦37200 ¦ ¦
+------------+------------+------------+------------+------------+
¦ ¦ ¦333 <*> ¦6400 ¦5550 <***> ¦
+------------+------------+------------+------------+------------+
¦Патулин ¦154,0 ¦276 <*> ¦14500 <**> ¦ ¦
L------------+------------+------------+------------+-------------
------------------------------------
<*> Длины волн, используемые для определения концентрации
стандартных растворов.
<**> Растворитель, используемый для определения концентрации
стандартного раствора.
<***> Для охратоксина А используется смесь бензол - уксусная
кислота (99:1).
Приготовление и расчет концентрации стандартных
растворов микотоксинов
Для приготовления стандартных растворов микотоксинов
рекомендуется использовать растворители, очищенные перегонкой.
Данные о растворителях и концентрациях стандартных и рабочих
растворов микотоксинов приведены в табл. 48.
Таблица 48
СТАНДАРТНЫЕ И РАБОЧИЕ РАСТВОРЫ МИКОТОКСИНОВ
-----------------T--------------------T--------------------------¬
¦ Микотоксины ¦ Растворители для ¦Концентрации микотоксинов ¦
¦ ¦ приготовления ¦ в растворах, мкг/куб. см ¦
¦ ¦ стандартного +------------T-------------+
¦ ¦ раствора ¦стандартном ¦ рабочем ¦
+----------------+--------------------+------------+-------------+
¦Афлатоксины ¦ ¦ ¦ ¦
+----------------+--------------------+------------+-------------+
¦В1 ¦Бензол - ацетонитрил¦10 ¦1,0 ¦
¦ ¦(98:2) ¦ ¦ ¦
+----------------+--------------------+------------+-------------+
¦В2 ¦ ¦10 ¦0,5 ¦
+----------------+--------------------+------------+-------------+
¦G1 ¦ ¦10 ¦0,4 ¦
+----------------+--------------------+------------+-------------+
¦G2 ¦ ¦10 ¦0,2 ¦
+----------------+--------------------+------------+-------------+
¦M1 ¦Бензол - ацетонитрил¦10 ¦0,2 ¦
¦ ¦(9:1) ¦ ¦ ¦
+----------------+--------------------+------------+-------------+
¦Стеригматоцистин¦Бензол ¦10 ¦10,0 ¦
+----------------+--------------------+------------+-------------+
¦Дезоксиниваленол¦Бензол - ацетонитрил¦25 ¦10,0 ¦
¦ ¦(5:1) ¦ ¦ ¦
+----------------+--------------------+------------+-------------+
¦Зеараленон ¦Бензол ¦100 ¦10,0 ¦
+----------------+--------------------+------------+-------------+
¦Охратоксин А ¦Бензол - уксусная ¦50 ¦5,0 ¦
¦ ¦кислота (99:1) ¦ ¦ ¦
+----------------+--------------------+------------+-------------+
¦Патулин ¦Бензол - ацетонитрил¦10 ¦10,0 ¦
¦ ¦(9:1) ¦ ¦ ¦
L----------------+--------------------+------------+--------------
В мерную колбу вместимостью 100 или 250 куб. см помещают
навеску микотоксина (1 - 10 мг), взятую с точностью до 0,01 мг,
приливают нужное количество ацетонитрила согласно таблице 33 или
20 - 30 куб. см бензола, тщательно перемешивают до полного
растворения вещества, доводят бензолом до метки и измеряют
оптическую плотность по данным УФ-спектрофотометрии против
соответствующего растворителя.
При необходимости измерения концентрации стандартного раствора
в метаноле 3 куб. см бензольного или бензол-ацетонитрильного
раствора переносят в чистую пробирку, растворитель упаривают в
токе азота досуха, к остатку добавляют 3 куб. см метанола и
измеряют оптическую плотность полученного метанольного раствора.
Рассчитывают концентрацию микотоксина в стандартных растворах
по формуле:
D х М х 1000
С = ------------,
L x E
где:
С - концентрация исследуемого раствора, мкг/куб. см или нг/мкл;
D - оптическая плотность раствора;
М - молекулярная масса микотоксина (табл. 47);
Е - коэффициент молярной экстинкции (табл. 47);
L - толщина слоя раствора, см.
Рабочие растворы стандартов готовят путем разбавления
соответствующих стандартных растворов, для чего необходимую
аликвоту рабочего раствора микотоксина доводят до соответствующего
объема бензолом или смесью бензол - ацетонитрил согласно табл. 48.
Например, для приготовления рабочего раствора смеси афлатоксинов
B1, B2, G1 и G2 с концентрациями 1,0, 0,5, 0,4 и 0,2 мкг/куб. см
соответственно в мерную колбу 50 куб. см помещают 5,0 куб. см
стандартного раствора афлатоксина B1, 2,5 куб. см раствора B2, 2,0
куб. см раствора G1 и 1,0 куб. см раствора G2, затем доводят до
метки смесью бензол - ацетонитрил (98:2). Для приготовления
стандартного раствора афлатоксина M1 с концентрацией 0,2 мкг/куб.
см в мерную колбу на 50 куб. см помещают 1 куб. см стандартного
раствора афлатоксина M1 и доводят до метки смесью бензол -
ацетонитрил (9:1).
Если используют расфасованные во флаконы кристаллические
стандарты микотоксинов, полученные от фирм-поставщиков, поступают
следующим образом: во флакон с веществом добавляют, согласно табл.
48, необходимое количество растворителя и тщательно перемешивают
до полного растворения микотоксинов, содержимое флакона
количественно переносят в мерную колбу с объемом, необходимым для
получения концентрации стандартного раствора микотоксина,
указанной в соответствующей колонке табл. 48. Флакон тщательно
промывают несколькими порциями растворителя, каждый раз перенося
содержимое флакона в мерную колбу, затем доводят объем до метки
растворителем. Измеряют концентрацию полученного раствора по
данным УФ-спектрофотометра, как описано выше.
Хранение стандартных растворов микотоксинов
Стандартные растворы микотоксинов следует хранить в стеклянной
посуде с притертыми пробками в темном прохладном месте (при
температуре около 0 -С) до одного года и использовать для
приготовления рабочих стандартных растворов.
Перед употреблением в работе стандартные растворы следует
довести до комнатной температуры и только после этого открывать
пробки.
В процессе хранения стандартных растворов вследствие испарения
растворителей могут происходить некоторые изменения их
концентраций. По этой причине следует проводить их систематический
контроль (1 - 2 раза в квартал), как описано выше.
1. Метод обнаружения, идентификации
и определения содержания афлатоксинов в БАД
на зерновой и зернобобовой основе с помощью тонкослойной
и высокоэффективной жидкостной хроматографии
Экстракция
Отобранную пробу измельчают в течение 1 - 2 мин. в кофемолке
или лабораторной мельнице. Навеску 25 г измельченного БАД помещают
в плоскодонную коническую колбу на 250 куб. см, тщательно
перемешивают с 25 куб. см 10% раствора хлорида натрия. Добавляют
0,0125 куб. см стандартного раствора афлатоксина В2 (внутренний
стандарт), что соответствует загрязнению пробы афлатоксином на
уровне 1 ПДК, перемешивают. Добавляют 100 куб. см ацетона и
встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 30 мин.
Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр,
отбирают 50 куб. см фильтрата.
Очистка экстракта
К 50 куб. см фильтрата добавляют 20 куб. см 15% раствора
ацетата свинца и 30 куб. см дистиллированной воды, перемешивают и
оставляют на 10 мин. в темноте. Отфильтровывают образовавшийся
осадок через бумажный складчатый фильтр, отбирают 80 куб. см
фильтрата. Встряхивают в делительной воронке с гексаном (2 х 30
куб. см), каждый раз отбрасывая верхний гексановый слой. Водно-
ацетоновый слой экстрагируют хлороформом (1 раз 40 куб. см, 2 раза
30 куб. см смеси хлороформ - ацетон, 3:1). Объединенные
хлороформные экстракты помещают в плоскодонную колбу на 250 куб.
см, для удаления воды добавляют 5 - 7 г безводного сульфата
натрия, встряхивают и оставляют на 30 мин. в темноте. Высушенный
раствор фильтруют через химическую воронку с комочком ваты в
грушевидную колбу, сульфат натрия промывают 10 куб. см хлороформа,
добавляя смыв к фильтрату. Хлороформный экстракт упаривают на
ротационном испарителе досуха. Остаток растворяют в 0,4 куб. см
смеси бензол - ацетонитрил (98:2) - раствор А и анализируют с
помощью ТСХ.
Обнаружение афлатоксинов с помощью одномерной ТСХ
Пластинку для ТСХ ("Силуфол") размечают тонкими карандашными
линиями в соответствии с рис. 28. На горизонтальной линии,
проведенной в 1,5 см от нижнего края пластинки, наносят с помощью
микрошприца в 2 см друг от друга по 0,002, 0,005 и 0,01 куб. см
рабочих растворов афлатоксина B1 (2, 5 и 10 нг соответственно) и
афлатоксина В2 (1, 2,5 и 5 нг соответственно) или рабочего
раствора смеси афлатоксинов В1, В2, G1 и G2. На расстоянии 1 см
между пятнами стандартов наносят 0,01 и 0,02 куб. см раствора А.
Пластинку помещают в камеру для ТСХ со смесью эфир - метанол -
вода (94:4,5:1,5) и развивают пластинку до достижения фронтом
растворителя линии, проведенной в 1 см от верхнего края пластинки.
Пластинку извлекают из камеры, сушат на воздухе 5 мин. и
рассматривают в длинноволновом УФ-свете. Обнаружение на пластинке
пятен, соответствующих по хроматографической подвижности и цвету
флуоресценции пятнам стандартов афлатоксинов, свидетельствует о
возможном наличии афлатоксинов в БАД. Наличие пятна внутреннего
стандарта свидетельствует о правильном извлечении афлатоксинов из
пробы.
Тесты, подтверждающие наличие афлатоксинов в БАД
Тест первый
Для подтверждения наличия афлатоксинов ТСХ-пластинку
опрыскивают раствором азотной кислоты в воде (1:2) и рассматривают
ее в длинноволновом УФ-свете. Если цвет флуоресценции стандартов
афлатоксинов изменился с синего (B1, B2) или сине-зеленого (G1,
G2) на желтый, а цвет флуоресценции пятен экстракта на желтый не
изменился, то афлатоксины в пробе отсутствуют. Если же цвет
флуоресценции пятен экстракта также изменился на желтый, то это
служит подтверждением возможного наличия афлатоксинов в БАД.
Тест второй
На стеклянную пластинку 20 х 20 см наносят 2 - 4 куб. см 5 -
10%-ного раствора йода в эфире, распределяют его по всей
поверхности и дают испариться. Над ТСХ-пластинкой на расстоянии
0,5 - 1 см помещают пластинку с тонким слоем йода и подвергают ее
воздействию паров йода в течение 1 - 2 мин. Затем пластинку
рассматривают в длинноволновом УФ-свете. Сохранение цвета и
интенсивности флуоресценции пятен стандартов и соответствующих им
пятен экстракта подтверждает возможное наличие афлатоксинов в БАД.
Подтверждение наличия афлатоксинов
и количественное определение афлатоксина В1
с помощью двумерной ТСХ
Пластинку "Силуфол" размечают тонкими карандашными линиями
согласно рис. 29. В правом нижнем углу на расстоянии 1,5 см от
краев наносят 0,02 куб. см раствора А, в правом верхнем углу
наносят 0,005 куб. см рабочего раствора смеси афлатоксинов или
рабочих растворов афлатоксинов B1 и В2. В левом нижнем углу на
расстоянии 1, 2 и 3 см от левого края и 1,5 см от нижнего края
пластинки наносят 0,002, 0,004 и 0,006 куб. см рабочего раствора
смеси афлатоксинов или рабочих растворов афлатоксинов B1 и В2.
Пластинку помещают в камеру для ТСХ со смесью эфир - метанол -
вода (94:4,5:1,5) и развивают пластинку в первом направлении до
достижения фронтом растворителя тонкой карандашной линии,
проведенной в 3 см от верхнего края пластинки. Пластинку извлекают
и сушат на воздухе 5 мин., затем развитие пластинки проводят во
втором направлении в системе хлороформ - ацетон - вода (90:10:1).
После достижения фронтом растворителя карандашной линии ее
извлекают, сушат на воздухе и рассматривают в длинноволновом УФ-
свете. Обнаружение афлатоксинов в растворе А производят аналогично
описанному выше. В случае подтверждения наличия афлатоксинов
сравнивают интенсивность флуоресценции пятна стандарта B1 с пятном
афлатоксина B1 в растворе А и определяют количество вещества в
пятне. Расчет содержания афлатоксина B1 в образце производят по
формуле:
V х V х V х m
1 3 5
С = -------------------------,
10 x K x V x V x V x M
2 4 6
где:
С - концентрация афлатоксина B1 в образце, мг/кг;
V - объем водно-ацетоновой смеси для экстракции, куб. см (125
1
куб. см);
V - объем водно-ацетонового фильтрата, взятый для анализа,
2
куб. см (50 куб. см);
V - объем водно-ацетонового фильтрата и раствора ацетата
3
свинца, куб. см (100 куб. см);
V - объем водно-ацетонового фильтрата после очистки ацетатом
4
свинца, куб. см (80 куб. см);
V - объем экстракта перед ТСХ (раствор А), куб. см (0,4 куб.
5
см);
V - объем экстракта (раствор А), наносимый на пластинку, куб.
6
см (0,02 куб. см);
M - навеска образца, взятая для анализа, г (25 г);
m - масса афлатоксина В1 в V куб. см экстракта, оцененная по
6
ТСХ, нг;
К - степень извлечения афлатоксина B1 по табл. 50.
При приведенных в скобках объемах и навесках формула
содержания афлатоксина B1 выражается следующим образом:
m
С = 0,25 х - , мг/кг.
K
Если интенсивность флуоресценции афлатоксина B1 в экстракте
выше интенсивности флуоресценции пятна стандарта, соответствующего
0,006 куб. см рабочего раствора (6 нг афлатоксина В1), на
пластинку следует нанести либо меньшее количество экстракта
(уменьшить объем V ), либо разбавить раствор А смесью бензол -
6
ацетонитрил (98:2) (увеличить объем V ), внеся соответствующие
5
коррективы в расчетную формулу.
По интенсивности флуоресценции внутреннего стандарта можно
оценить степень извлечения афлатоксинов из пробы.
Очистка экстракта перед ВЭЖХ
В случае анализа экстракта на содержание афлатоксинов методом
ВЭЖХ необходимо произвести его очистку с помощью колоночной
хроматографии. На дно стеклянной колонки размером 230 х 5 мм
помещают кусочек ваты, присыпают безводный сульфат натрия (толщина
слоя 5 мм), заливают суспензию 2 г силикагеля в бензоле и, не
давая бензолу стечь (колонка закрыта снизу), насыпают слой
безводного сульфата натрия (20 мм). Дают бензолу стечь и на
колонку наносят экстракт образца (раствор А). Грушевидную колбу из-
под экстракта ополаскивают смесью бензол - ацетонитрил (98:2) 2
раза по 0,3 куб. см и раствор наносят на колонку, бензольный элюат
отбрасывают. Колонку элюируют 60 куб. см смеси хлороформ - ацетон
(9:1), элюат фильтруют через бумажный или капроновый фильтр,
упаривают досуха на ротационном испарителе, остаток растворяют в
0,4 куб. см смеси бензол - ацетонитрил (98:2) (очищенный раствор
А) и анализируют с помощью ВЭЖХ.
Обнаружение и количественное определение афлатоксинов
B1, B2, G1 и G2 с помощью ВЭЖХ
Условия и параметры хроматографического анализа приведены в
табл. 49.
Таблица 49
УСЛОВИЯ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗА АФЛАТОКСИНОВ
-----------T-------------------T---------------------------------¬
¦ Сорбент ¦ Подвижная фаза ¦ Коэффициент емкости К' для ¦
¦ ¦ +------T------T------T------T-----+
¦ ¦ ¦ B1 ¦ В2 ¦ G1 ¦ G2 ¦ M1 ¦
+----------+-------------------+------+------+------+------+-----+
¦Силикагель¦Эфир - метанол - ¦1,1 - ¦1,8 - ¦2,2 - ¦3,3 - ¦2,6 -¦
¦ ¦вода, 95:4:1 ¦1,5 ¦2,1 ¦2,5 ¦3,6 ¦2,9 ¦
+----------+-------------------+------+------+------+------+-----+
¦Силикагель¦Эфир - метанол - ¦0,9 - ¦1,2 - ¦1,4 - ¦1,8 - ¦1,4 -¦
¦ ¦вода, 90:8:2 ¦1,3 ¦1,5 ¦1,7 ¦2,1 ¦1,7 ¦
+----------+-------------------+------+------+------+------+-----+
¦Силикагель¦Толуол - этилацетат¦1,2 - ¦1,8 - ¦2,0 - ¦3,1 - ¦3,0 -¦
¦ ¦- 85% муравьиная ¦1,5 ¦2,1 ¦2,3 ¦3,4 ¦3,3 ¦
¦ ¦кислота, 80:40:9,5 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
L----------+-------------------+------+------+------+------+------
Время удерживания токсина на колонке при конкретных условиях
анализа целесообразно выражать через коэффициент ее емкости,
средние значения которого приведены в данной табл. 49. Коэффициент
емкости характеризует удерживание анализируемого компонента
(афлатоксина) в единицах мертвого объема колонки и определяется по
формуле:
T - T
1 0
К' = -------,
T
0
где:
К' - коэффициент емкости данной колонки;
Т - мертвый объем системы, соответствующий времени выхода
0
растворителя;
Т - время удерживания афлатоксина.
1
Рекомендуется использовать перегнанные метанол, толуол,
этилацетат и дистиллированную воду. Эфир перед использованием
пропускают через колонку с оксидом алюминия. Все растворители
необходимо предварительно отфильтровать.
Для достижения необходимого предела обнаружения при ВЭЖХ
афлатоксинов групп В, G и М с использованием подвижной фазы эфир -
метанол - вода необходимо заполнить кювету флуориметрического
детектора силикагелем типа "Силасорб 600" с размером частиц 5 - 8
мкм.
Флуориметрический детектор устанавливают на длину волны
возбуждающего излучения 360 нм (или устанавливают соответствующий
фильтр на линии возбуждения при работе с флуориметрическим
детектором без монохроматора), на линии эмиссии устанавливают
эмиссионный фильтр с полосой пропускания от 400 или 420 нм.
Входное напряжение самописца - 10 мВ, чувствительность детектора
устанавливают таким образом, чтобы 1 - 2 нг афлатоксина В1
соответствовало отклонению пера на полную шкалу самописца при
уровне шума от 3 до 5% от полной шкалы.
Для калибровки прибора по флуориметрическому детектору в
инжектор с помощью микрошприца вводят 0,001 куб. см рабочего
раствора смеси стандартов для ВЭЖХ или по 0,001 куб. см рабочих
растворов афлатоксинов В1 и В2 (соответствует 1,0 нг афлатоксина
В1, 0,5 нг - В2, 0,4 нг - G1 и 0,2 нг - G2) и затем 0,002 куб. см
рабочего раствора (2,0 нг - В1, 1,0 нг - В2, 0,8 нг - G1 и 0,4 нг
- G2). Для каждого количества афлатоксинов определяют высоту пика.
Рассчитывают калибровочные коэффициенты для афлатоксинов по
следующей формуле:
Г x h
1
K = ------,
C x h
1
где:
К - калибровочный коэффициент для афлатоксинов В1, G1 или G2;
С - концентрация афлатоксинов В1, G1 или G2 в рабочих
растворах, мкг/куб. см;
C - концентрация афлатоксина В2 (внутренний стандарт) в
1
рабочем растворе, мкг/куб. см;
h - высота пика афлатоксина В2 (внутренний стандарт), мм;
1
h - высота пика афлатоксинов B1, G1 или G2, мм.
При высоких уровнях загрязнения БАД афлатоксинами (свыше 0,1
мг/кг по афлатоксину В1) возможно использование также ВЭЖХ с УФ-
детектором. Калибровку прибора по УФ-детектору проводят так же,
как в случае флуориметрического детектора, вводя в петлю инжектора
0,010, 0,015 и 0,020 куб. см рабочего раствора (соответствует 10,
15 и 20 нг афлатоксина В1; 5, 7,5 и 10 нг афлатоксина В2; 4, 6 и 8
нг - G1; 2, 3 и 4 нг - G2).
В инжектор хроматографа вводят с помощью микрошприца 0,02 куб.
см раствора А (20 мкл). При наличии пика, совпадающего по времени
удерживания с афлатоксином B1 (B2, G1, G2), определяют его высоту
(h).
Расчет концентрации афлатоксинов проводят по формуле:
C x h x V
ст
С = K x -----------,
h x m
1
где:
С - концентрация афлатоксина в БАД, мг/кг;
K - калибровочный коэффициент для афлатоксинов В1 (или G1,
G2);
h - высота пика афлатоксинов B1 (или G1, G2);
h - высота пика афлатоксина В2 (внутренний стандарт),
1
внесенный в пробу, куб. см;
С - концентрация афлатоксина В2 (внутренний стандарт) в
ст
стандартном растворе, мкг/куб. см (см. табл. 48);
V - объем стандартного раствора афлатоксина В2 (внутренний
стандарт), внесенный в пробу, куб. см;
m - навеска образца, взятая для анализа, г.
Если пик афлатоксина выходит за пределы шкалы самописца, анализ
с помощью ВЭЖХ проводят повторно, уменьшая объем вводимого в
инжектор раствора экстракта или разбавляя раствор очищенного
экстракта смесью бензол - ацетонитрил (98:2). При необходимости
дополнительного подтверждения проводят совместную ВЭЖХ экстракта
со стандартом афлатоксинов.
Метрологические характеристики
Относительное допустимое расхождение между результатами двух
параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, по
отношению к среднему арифметическому значению (Rr) и относительное
допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в
двух разных лабораториях, по отношению к среднему арифметическому
значению (RR), а также предел определения, по данным авторов
методов анализа микотоксинов В1 и M1, приведены в табл. 50, в
которой приведены также относительные внутрилабораторные (Rs ) и
r
межлабораторные (RS ) среднеквадратичные отклонения и средняя
R
степень извлечения микотоксинов.
Таблица 50
ОТНОСИТЕЛЬНЫЕ ДОПУСТИМЫЕ ВНУТРИЛАБОРАТОРНЫЕ (Rr)
И МЕЖЛАБОРАТОРНЫЕ (RR) РАСХОЖДЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ,
ВЕЛИЧИНА ПРЕДЕЛА ОПРЕДЕЛЕНИЯ И СТЕПЕНЬ ИЗВЛЕЧЕНИЯ
ДЛЯ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКОТОКСИНОВ B1
--------T-------T-----T------T----T----T---T------------T--------¬
¦Загряз-¦Уровень¦Метод¦Rs , %¦RS ,¦ Rr,¦RR,¦ Предел ¦Степень ¦
¦нитель ¦загряз-¦ ¦ r ¦ R ¦ % ¦ % ¦определения,¦извлече-¦
¦ ¦нения, ¦ ¦ ¦ % ¦ ¦ ¦ мг/кг ¦ния, % ¦
¦ ¦г/кг ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-------+-------+-----+------+----+----+---+------------+--------+
¦ ¦0,02 ¦ТСХ ¦26 ¦50 ¦73 ¦140¦0,001 ¦80 ¦
+-------+-------+-----+------+----+----+---+------------+--------+
¦ ¦ ¦ВЭЖХ ¦7 ¦14 ¦20 ¦40 ¦0,00015 ¦70 ¦
+-------+-------+-----+------+----+----+---+------------+--------+
¦ ¦0,003 ¦ТСХ ¦38 ¦59 ¦106 ¦166¦0,001 ¦75 ¦
+-------+-------+-----+------+----+----+---+------------+--------+
¦ ¦ ¦ВЭЖХ ¦13 ¦23 ¦36 ¦64 ¦0,00015 ¦80 ¦
L-------+-------+-----+------+----+----+---+------------+---------
2. Метод обнаружения, идентификации
и определения содержания охратоксина А
Экстракция
Навеску 25 г отобранной измельченной пробы помещают в
плоскодонную коническую колбу на 250 куб. см, добавляют 12,5 куб.
см 1% раствора уксусной кислоты в воде и 125 куб. см хлороформа.
Встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 30 мин.
Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр в
мерный цилиндр вместимостью 100 куб. см, отбирают 50 куб. см
фильтрата.
Очистка экстракта
В делительную воронку переносят 50 куб. см фильтрата, добавляют
35 куб. см 3% раствора гидрокарбоната натрия в смеси метанол -
вода (1:4). Встряхивают, после разделения слоев верхний водный
слой отделяют. Нижний хлороформный слой экстрагируют (2 раза по 35
куб. см) водно-метанольным раствором гидрокарбоната натрия.
Объединенные водные экстракты встряхивают в делительной воронке с
хлороформом (2 х 25 куб. см), каждый раз после разделения слоев
отбрасывая нижний хлороформный слой. Водный экстракт подкисляют
раствором серной кислоты в воде с концентрацией 2 моль/куб. дм до
pH 2 - 3 по универсальной индикаторной бумаге (примерно 9,5 - 10
куб. см раствора серной кислоты). Подкисленный водный раствор
немедленно экстрагируют в делительной воронке хлороформом (1 раз
по 50 куб. см и 2 раза по 25 куб. см). Объединенные хлороформные
экстракты сушат безводным сульфатом натрия (10 - 12 г) в течение
0,5 ч. Раствор порциями фильтруют через химическую воронку с
кусочком ваты в грушевидную колбу, осушитель промывают 15 куб. см
хлороформа, который также фильтруют в ту же колбу, и раствор
упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре водяной
бани не выше 40 - 45 -С. Остаток растворяют в 0,4 куб. см смеси
бензол - уксусная кислота (99:1) для проведения ТСХ анализа или в
0,4 куб. см метанола для проведения анализа с помощью ВЭЖХ
(раствор А).
Обнаружение и количественное определение охратоксина
А с помощью двумерной ТСХ
Пластинку "Силуфол" размечают тонкими карандашными линиями, не
повреждая слой силикагеля, согласно рис. 29. В правом нижнем углу
на расстоянии 1,5 см от краев пластинки наносят с помощью
микрошприца 0,02 куб. см раствора А, в правом верхнем углу наносят
0,002 и 0,004 куб. см рабочего раствора охратоксина А (10 и 20 нг
соответственно). В левом нижнем углу пластинки наносят 0,001,
0,003 и 0,005 куб. см рабочего раствора охратоксина А (5, 15 и 25
нг охратоксина А соответственно).
Пластинку помещают в хроматографическую камеру для ТСХ со
смесью эфир - гексан - хлороформ - муравьиная кислота (30:30:30:1)
и элюируют в первом направлении до достижения фронтом растворителя
тонкой карандашной линии, проведенной в 3 см от верхнего края
пластинки.
Пластинку извлекают из камеры и сушат на воздухе 5 мин. Затем
проводят элюирование во втором направлении в системе толуол -
этилацетат - муравьиная кислота (55:35:10). После достижения
фронтом растворителя тонкой карандашной линии, проведенной в 3,5
см от верхнего края пластинки, ее извлекают из камеры и сушат на
воздухе.
Затем пластинку рассматривают в длинноволновом УФ-свете. В этих
условиях пятна охратоксина А флуоресцируют зелено-синим цветом.
Пластинку опрыскивают насыщенным раствором карбоната натрия в воде
и рассматривают в длинноволновом УФ-свете. Цвет флуоресценции
охратоксина A должен измениться на синий. Обнаружение на пластинке
пятна, соответствующего по цветам флуоресценции и
хроматографической подвижности в двух системах растворителей
пятнам стандарта охратоксина А, свидетельствует о наличии
охратоксина А в образце. Сравнивая интенсивность флуоресценции
разных количеств стандарта охратоксина А с интенсивностью
флуоресценции пятна охратоксина А в образце, оценивают количество
нг охратоксина А в нанесенном на пластинку объеме раствора А.
Концентрацию охратоксина А в образце рассчитывают по формуле:
V x V x m
1 3
С = C = --------------------,
10 x K x V x V x M
2 4
где:
С - концентрация охратоксина А в образце, мг/кг;
V - объем хлороформа для экстракции образца, куб. см (125
1
куб. см);
V - объем хлороформного фильтрата, взятый для анализа, куб.
2
см (50 куб. см);
V - объем экстракта для ТСХ (раствор А), куб. см (0,4 куб.
3
см);
V - объем экстракта (раствор А), нанесенный на пластинку,
4
куб. см (0,02 куб. см);
m - количество охратоксина А в пятне, оцененное по ТСХ, нг;
М - навеска образца, взятая для анализа, г (25 г);
К - степень извлечения охратоксина А по табл. 51.
При приведенных в скобках объемах и навесках формула
концентрации охратоксина А в образце выражается следующим образом:
m
С = 0,2 х -, мг/кг.
K
Если интенсивность флуоресценции пятна охратоксина А в
экстракте выше интенсивности флуоресценции пятна стандарта,
соответствующего 0,005 куб. см стандартного раствора (25 нг
охратоксина А), то на пластинку следует нанести либо меньшее
количество экстракта (уменьшить объем V ), либо разбавить раствор
4
А смесью бензол - уксусная кислота, 99:1 (увеличить объем V ),
3
повторно провести ТСХ и внести соответствующие коррективы в
расчетную формулу.
Обнаружение и количественное определение
охратоксина А с помощью ВЭЖХ
Приготовление стандартного раствора охратоксина А для ВЭЖХ
0,2 куб. см стандартного раствора охратоксина А концентрацией
50 мкг/куб. см помещают в мерную колбу на 10 куб. см, растворитель
удаляют в токе азота, остаток растворяют в метаноле и доводят
метанолом до метки. Получают стандартный раствор охратоксина А для
ВЭЖХ концентрацией 1 мкг/куб. см (1 нг/мкл).
Количественное определение охратоксина А с помощью
обращеннофазной ВЭЖХ
Условия ВЭЖХ: подвижная фаза: метанол - вода - уксусная кислота
(75:25:1,5), расход подвижной фазы - 1 куб. см/мин. Рекомендуется
использовать перегнанный метанол и бидистиллированную воду,
фильтруя их через бумажный складчатый фильтр перед использованием.
Флуориметрический детектор устанавливают на длину волны
возбуждающего излучения 330 - 333 нм (или устанавливают
соответствующий фильтр на линии возбуждения при работе с
флуориметрическим детектором без монохроматора), на линии эмиссии
устанавливают эмиссионный фильтр с границей пропускания от 415 до
420 нм. Входное напряжение самописца 10 мВ, чувствительность
детектора устанавливают таким образом, чтобы 5 нг охратоксина А
|
