|
Стр. 14
Приготовление стандартных растворов
Раствор 1. Навеску 100 мг бензойной кислоты переносят в мерную
колбу на 25 куб. см и доводят до метки этилацетатом (концентрация
полученного раствора 4 мг/куб. см).
Раствор 2. Навеску 40 мг сорбиновой кислоты переносят в мерную
колбу на 100 куб. см и доводят до метки этилацетатом (концентрация
полученного раствора 0,4 мг/куб. см).
Раствор 3. Смешивают равные объемы растворов 1 и 2.
Концентрация БК в полученном растворе 2,0 мг/куб. см, СК - 0,2
мг/куб. см.
Выделение бензойной и сорбиновой кислот
Анализируемую пробу продукта (кроме напитков) массой около 10 г
отвешивают с точностью до 0,01 г, измельчают и гомогенизируют с
добавкой 25 г Na2SO4 и 40 куб. см 1 М H2SO4. Гомогенат переносят в
колбу емкостью 1 куб. дм, соединенную с парообразователем, и
нагревают (рис. 25).
В момент, когда жидкость в колбе начинает закипать, закрывают
парообразователь пробкой и отгоняют БК и СК с паром, собирая около
80 куб. см дистиллята в приемник, содержащий 10 куб. см 1 М NaOH.
Дистиллят переносят в делительную воронку, насыщают Na2SO4 (на 10
куб. см дистиллята добавляют 6 г Na2SO4), подкисляют 1 М H2SO4 до
pH 2,0 - 3,0 и экстрагируют этилацетатом трижды по 10 куб. см.
Объединенный экстракт сушат, добавляя 2 г прокаленного безводного
Na2SO4. Этот экстракт обозначают V . Экстракт упаривают на
1
ротационном испарителе (допускается упаривание в фарфоровой чашке
на песчаной бане) до объема 1 куб. см.
При анализе напитков исключают стадию отгонки, 10 куб. см
напитка разбавляют вдвое 0,5 М H2SO4, добавляя 10 г Na2SO4,
интенсивно перемешивают и экстрагируют БК и СК 3 раза по 5 куб. см
этилацетатом. Объединенный экстракт (V ) сушат 1 г безводного
1
прокаленного Na2SO4. Экстракт упаривают на ротационном испарителе
или в фарфоровой чашке до конечного объема 1 куб. см.
Количественное определение с помощью ВЭЖХ согласно ГОСТ Р 30059-
93 "Напитки безалкогольные. Методы определения аспартама,
сахарина, кофеина и бензоата натрия".
Хроматографический анализ
Аппаратура, материалы
Жидкостной хроматограф с УФ-детектором, длина волны 272 нм.
Автоматическая система обработки данных типа "Амперсент" или
интегратор.
Колонка "Kromasil 5 мю С18", размер колонки 250 х 4,6 мм,
размер частиц 5 мкм.
Полученный экстракт и раствор стандарта 3 поочередно вводят в
жидкостной хроматограф при следующих условиях работы: состав
элюэнта: 0,025 М ацетат натрия, pH 4,5, - ацетонитрил (8:2);
скорость подвижной фазы 1,0 куб. см/мин.; детектирование в УФ-
спектре при 272 нм; объем вводимой пробы 5 - 10 мкл;
чувствительность детектора 0,01 о.е.п.
На хроматограмме экстракта идентифицируют пики БК и СК по
времени удерживания стандартов: для БК - 3,4 мин. +/- 0,2, для СК
- 4,4 +/- 0,2 мин.
Для подтверждения правильности идентификации консервантов
аликвоты раствора 3 и экстракта вводят в хроматограф в тех же
условиях повторно, регистрируя в максимумах хроматографических
пиков спектр поглощения БК (250 - 270 нм) и СК (230 - 270 нм). БК
имеет три максимума поглощения в указанном интервале спектра -
268, 270 и 272 нм, а СК - один - 254 нм, что является
дополнительным идентификационным признаком для подтверждения
присутствия их в образце.
Обработка результатов
Измеряют высоту пиков стандартов БК и СК на хроматограммах и
рассчитывают их содержание в мг/кг или мг/куб. дм по формуле:
Р х H x V
0 1
C = 1000 x K x -----------,
H x M
ст
где:
К - коэффициент, учитывающий степень извлечения БК и СК;
Р - концентрация БК или СК в растворе стандарта (раствор 3),
мг/куб. см;
Н - высота пика БК или СК на хроматограмме экстракта, мм;
0
Н - высота пика БК или СК на хроматограмме стандартов, мм;
ст
V - объем экстракта, куб. см;
1
М - масса образца, взятая для анализа (г), или объем напитка
(куб. см).
Вычисление проводят до второго десятичного знака.
За конечный результат испытаний принимают среднее
арифметическое двух параллельных определений.
Окончательный результат округляют до первого десятичного знака.
Метрологические характеристики
Относительное допустимое расхождение между результатами двух
параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, по
отношению к среднему арифметическому значению (Rr) и относительное
допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в
двух разных лабораториях, по отношению к среднему арифметическому
значению (RR) приведены в табл. 44.
Таблица 44
ОТНОСИТЕЛЬНЫЕ ДОПУСТИМЫЕ ВНУТРИЛАБОРАТОРНЫЕ (Rr)
И МЕЖЛАБОРАТОРНЫЕ (RR) РАСХОЖДЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
------------------T----------------------T-----------------------¬
¦Содержание, мг/кг¦ Бензойная кислота ¦ Сорбиновая кислота ¦
¦ +-----------T----------+-----------T-----------+
¦ ¦ Rr, % ¦ RR, % ¦ Rr, % ¦ RR, % ¦
+-----------------+-----------+----------+-----------+-----------+
¦150 - 300 ¦ 15 ¦ 30 ¦ 15 ¦ 30 ¦
+-----------------+-----------+----------+-----------+-----------+
¦300 - 2000 ¦ 15 ¦ 25 ¦ 15 ¦ 25 ¦
L-----------------+-----------+----------+-----------+------------
II. Метод определения заменителей сахара
Идентификация и количественное определение осуществляется
методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
1. Метод определения аспартама
Аспартам: 1-метиловый эфир N-L-альфа-аспартил-L-фенилаланина.
Условия ВЭЖХ
Колонка из нержавеющей стали, длина 150 мм, диаметр 4,6 мм.
Сорбент - Кромасил 100 С18, зернение 5 мкм. Перед работой новую
колонку необходимо перевести на обратнофазный режим работы. Для
этого колонку промывают 40 куб. см изопропанола, затем 80 куб. см
деионизированной воды, после чего уравновешивают колонку подвижной
фазой до стабильной нулевой линии.
Подвижная фаза
5,6 г фосфорнокислого калия однозамещенного, безводного
(КН2РO4) растворяют в 820 куб. см бидистиллированной воды, доводят
pH до 4,3 добавлением фосфорной кислоты, после чего прибавляют 180
куб. см ацетонитрила. Смесь дегазируют на роторном испарителе.
Стандарт аспартама с концентрацией 1 мг/куб. см.
Детектирование
Спектрофотометр, длина волны УФ 255 нм, шкала 0,5 AUFS,
скорость потока 0,8 куб. см/мин., время удерживания аспартама -
6,2 +/- 0,05 мин. Обработка хроматографических данных по программе
МультиХром для Windows, версия 1.39.
Стандартный образец и испытываемую пробу хроматографируют не
менее трех раз. Ошибка метода +/- 5%.
2. Метод определения дикетопиперазина
Дикетопиперазин: 5-бензил-3,6-диокси-2-пиперазилуксусная
кислота.
Подготовка образца
При определении аспартама и дикетопиперазина в БАД учитывают
неустойчивость аспартама к нагреванию, а также то, что он
гидролизуется в сильнокислых и нейтрально-щелочных средах.
Проведение анализа
Подготовка хроматографической колонки и условия ВЭЖХ - по
методу 1.
Детектирование: УФ 210 нм, шкала 0,01 AUFS, скорость потока 0,8
куб. см/мин., стандартный раствор 2 мкг/куб. см, время удерживания
дикетопиперазина 3,9 +/- 0,02. Ошибка метода +/- 2 %.
3. Метод определения ацесульфама К
Ацесульфам: 6-метил-1,2,3-оксатиазин-4(3Н)-он-2,2-диоксид,
калиевая соль.
Проведение анализа
Подготовка хроматографической колонки и условия ВЭЖХ - по
методу 1.
Детектирование: УФ 225 нм, шкала 0,05 AUFS, время удерживания
2,8 +/- 0,02.
4. Метод определения сахарина
Сахарин: 3-оксо-2,3-дигидробензо[d]изотиазол-1,1-диоксид.
Подготовка образца
При выделении из БАД учитывают следующие свойства сахарина: 1 г
сахарина растворяется в 290 куб. см холодной воды или в 25 куб. см
кипящей воды, в 31 куб. см этилового спирта и в 12 куб. см
ацетона. Сахарин практически нерастворим в хлороформе, хорошо
экстрагируется этиловым и петролейным эфирами. Растворимость его
увеличивается при добавлении лимонной, винной или уксусной кислот.
Он устойчив при нагревании до 150 -С при pH 3,3 и 7,0.
Проведение анализа
Подготовка хроматографической колонки и условия ВЭЖХ - по
методу 1.
Детектирование: УФ 269 нм, шкала 0,1 AUFS, время удерживания
2,9 +/- 0,1 мин.
5. Метод определения цикламата и цикламата
в смеси с сахарином
Цикламат: натриевая соль циклогексиламино-N-сульфоновой
кислоты.
Условия ВЭЖХ
Колонка из нержавеющей стали, длина 150 мм, диаметр 4,6 мм.
Сорбент - Кромасил 100 С18, зернение 5 мкм. Перед работой новую
колонку необходимо перевести на обратнофазный режим работы
согласно описанию в методе 1.
Подвижная фаза
5,6 г фосфорнокислого калия однозамещенного, безводного
(КН2РO4) растворяют в 850 куб. см бидистиллированной воды, доводят
pH до 1,8 добавлением фосфорной кислоты, после чего прибавляют 150
куб. см ацетонитрила. Смесь дегазируют на роторном испарителе.
Детектирование
Спектрофотометр, длина волны УФ 210 нм, шкала 0,02 AUFS,
скорость потока 0,6 куб. см/мин., время удерживания цикламата -
7,1 +/- 0,02 мин., сахарина - 8,5 +/- 0,05 мин.
Стандартный образец и испытываемую пробу хроматографируют не
менее трех раз. Ошибка метода +/- 5 %.
6. Метод определения сукралозы
Сукралоза: 1,6-дихлор-1,6-дидеокси-бета-D-фруктофуранозил-4-
1 1
деокси-альфа-D-галактопиранозид; 4,1 ,6 -трихлоргалактосахароза.
Условия ВЭЖХ
Колонка из нержавеющей стали, длина 150 мм, диаметр 4,6 мм.
Сорбент: сепарон SGX С18, зернение 7 мкм. Перед работой новую
колонку необходимо перевести на обратнофазный режим работы
согласно описанию в методе 1.
Подвижная фаза
Ацетонитрил - вода (15:85).
Стандарт концентрацией 1,0 мг/куб. см. Стандартный раствор
готовят в подвижной фазе.
Детектирование: рефрактометр, скорость потока 0,7 куб. см/мин.,
время удерживания сукралозы - 6,5 +/- 0,05 мин. Ошибка метода +/-
5%.
7. Метод определения изомальта
Пищевая добавка, заменитель сахара Е 953 изомальт -
дисахаридный полиол, состоящий из смеси примерно равных частей D-
глюкопиранозил-1,6-D-сорбита (GPS) и D-глюкопиранозил-1,1-D-
маннита (GPM). Брутто-формула С12Н24О11.
Принципиальная схема метода
Метод заключается в количественном определении основных
компонентов изомальта (GPS и GPM) или суммы их концентраций и
предусмотренных спецификацией примесей сорбита, маннита,
изомальтулозы, а также глюкозы, фруктозы и сахарозы в исследуемом
++
экстракте с помощью катионообменной ВЭЖХ в форме Са при
температуре хроматографической колонки 80 -С или с помощью ВЭЖХ на
амино-фазе с использованием рефрактометрического детектора.
Материалы и реактивы
Жидкостной хроматограф с насосом высокого давления с подачей
растворителя от 0,1 до 5 куб. см/мин. с устройством для
термостатирования колонки.
++
Колонка и предколонка с катионитом в форме Са "НРХ-87 С,
BioRad" или аналогичная колонка и предколонка на основе
сульфированного стиролдивинилбензола в ионной кальциевой форме
(8%), например "Rezex RCU-USP Sugar Alcohols" или "Waters
Sugar-Pak", длина колонки 250 мм, предколонки - 30 мм, внутренний
диаметр колонки и предколонки 4,0 или 4,6 мм.
Колонка и предколонка Kromasil NH2 (MetaChem Technologies, США)
или аналогичная, параметры колонки 250 х 4,6 мм, размер частиц
сорбента 5 мкм.
Рефрактометрический детектор; например, MERK L 7490, Германия,
регистрирующий потенциометр (самописец) или интегратор или
автоматическая система обработки данных "МультиХром для Windows
9x&NT;", версия 1,5х.
Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с допустимой
погрешностью +/- 0,01 г.
Весы лабораторные общего назначения с допустимой погрешностью
+/- 0,001 г.
Микрошприцы МШ-10 и МШ-25 для жидкостной хроматографии.
Вакуум-сушилка.
Эксикатор.
Термометр ртутный стеклянный лабораторный на 200 -С по ГОСТ 215-
73.
Изомальт фирмы Sudzucker, LIMS N 200009040.
Фруктоза, глюкоза, сорбит, маннит, сахароза, изомальтоза
кристаллические.
Аппарат для встряхивания типа АВУ-6С по ТУ 64-1-2451-78.
Капроновый фильтр марки 0,45 мкм RC.
Вода бидистиллированная деионизированная по ГОСТ 6709 и
фильтрованная через капроновый фильтр марки 0,45 мкм RC.
Шкаф сушильный, обеспечивающий нагрев до 150 -С.
Бумажные фильтры обеззоленные марки ФОМ.
Бюкса с притертой крышкой по ГОСТ 7148-70.
Колбы мерные по ГОСТ 1770 вместимостью 100 и 250 куб. см.
Цинк уксуснокислый 2-водный, х.ч. по ГОСТ 5823-78; раствор
концентрацией 300 г/куб. дм.
Приготовление стандартных растворов
Аналитический образец изомальта высушивают до постоянного веса
согласно ГОСТ 12570-67 "Сахар-песок и сахар-рафинад. Метод
определения содержания влаги". Готовят стандартный раствор
изомальта с массовой концентрацией 3 мг/куб. см. Точные
концентрации GPS и GPM в полученном стандартном растворе
рассчитывают исходя из навески изомальта и количеств каждого
компонента смеси, декларированных в аналитическом сертификате.
Таким образом, концентрации GPS и GPM должны составить от 1,4 до
1,6 мг/куб. см.
Готовят стандартные растворы фруктозы, глюкозы, сорбита,
маннита, сахарозы, изомальтулозы с массовыми долями 3 мг/куб. см.
Приготовление исследуемого образца
Анализируемый образец БАД или пищевого продукта размельчают или
растирают в ступке. Навеску массой 5 +/- 0,01 г помещают в
коническую колбу вместимостью 250 куб. см, добавляют 150 куб. см
подогретой до 75 - 80 -С дистиллированной воды и встряхивают на
аппарате для встряхивания 20 - 30 минут. Доводят температуру смеси
до комнатной, переносят в делительную воронку, встряхивают с
хлороформом (3 раза по 50 куб. см), хлороформный слой отбрасывают,
верхний водный слой количественно переносят в мерную колбу
вместимостью 250 куб. см. Добавляют 15 куб. см 30%-ного раствора
ацетата цинка, встряхивают, доводят дистиллированной водой до
метки и тщательно перемешивают. Фильтруют через капроновый фильтр
марки 0,45 мкм RC или складчатый бумажный фильтр "синяя лента".
Остаток хлороформа из фильтрата отдувают в токе азота и аликвоту
вводят в хроматограф.
Анализ с помощью ВЭЖХ
I вариант (с использованием катионообменной ВЭЖХ).
Условия ВЭЖХ: температура 80 - 90 -С, подвижная фаза
бидистиллированная, деионизированная и фильтрованная вода,
скорость подвижной фазы 0,4 - 0,8 куб. см/мин., аликвота, вводимая
в инжектор, 10 - 15 мкл; чувствительность рефрактометрического
детектора устанавливается таким образом, чтобы ввод 1,5 мкг GPS
или GPM соответствовал отклонению пера на полную шкалу самописца
при уровне шума от 1 до 3% от полной шкалы; входное напряжение
регистрирующего потенциометра (самописца) или интегратора 10 mV.
Определяют каждый компонент изомальта (GPS и GPM) и суммируют
их.
Ориентировочный порядок времен удерживания углеводов в минутах
при использовании катионообменной ВЭЖХ (зависят от типа колонки,
скорости подвижной фазы и температуры колонки): сахароза - 9 +/-
1, изомальтулоза - 10 +/- 1, глюкоза - 12 +/- 2, GPM - 14 +/- 1,
фруктоза - 15 +/- 1, GPS - 16 +/- 1, маннит - 22 +/- 2, сорбит -
29 +/- 2.
II вариант (с использованием аминофазы).
Условия ВЭЖХ: подвижная фаза: ацетонитрил - вода (77:23),
скорость подвижной фазы 1,0 куб. см/мин., аликвота, вводимая в
инжектор, 10 - 15 мкл; чувствительность рефрактометрического
детектора устанавливают таким образом, чтобы ввод 30 мкг фруктозы,
глюкозы или сахарозы соответствовал отклонению пера на полную
шкалу самописца при уровне шума от 1 до 3% от полной шкалы;
входное напряжение регистрирующего потенциометра (самописца) или
интегратора 10 mV.
Определяют сумму концентраций (GPS и GPM) в виде изомальта.
Ориентировочный порядок времен удерживания углеводов в минутах
при использовании амино-фазы: фруктоза - 7,0 +/- 0,2, сорбит - 7,5
+/- 0,2, глюкоза - 8,5 +/- 0,1, сахароза - 11 +/- 0,1, изомальт -
13 +/-0,2.
Метрологические характеристики метода
Предел обнаружения метода по манниту, сорбиту и изомальтулозе -
около 30,0 мг/куб. дм, или 0,003%. Стандартное отклонение
сходимости (Sr) при концентрации сорбита 1% не превышает 0,1 -
0,13. Среднее значение открываемости маннита, сорбита и
изомальтулозы 91 - 95%, GPS и GPM - 96 - 98%.
Метод позволяет определять содержание GPS, GPM или изомальта, а
также концентрации примеси глюкозы, фруктозы, сорбита, маннита,
сахарозы и изомальтозы.
Обработка результатов измерений
Количественное определение компонентов осуществляют методом
внешнего стандарта. Для калибровки прибора в инжектор с помощью
микрошприца вводят 0,005, 0,01 и 0,02 куб. см соответствующих
стандартных растворов. Для каждого количества определяют площадь
пика на хроматограмме.
В инжектор хроматографа вводят 0,01 куб. см (10 мкл) раствора
анализируемого образца. Определяют площадь пика, соответствующего
по времени удерживания стандартам. Расчет концентрации компонентов
проводят по формуле:
V x m x S
1 обр
С = --------------------, %,
V x M x S x 10000
2 ст
где:
С - концентрация компонента в образце, %;
V - объем анализируемого образца, куб. см (250 куб. см);
1
V - объем аликвоты раствора анализируемого образца, внесенный
2
в хроматограф (0,01 куб. см);
m - масса стандарта, введенного в хроматограф при калибровке,
мкг;
М - навеска образца, взятая для анализа, г;
S - площадь пика в анализируемом образце;
обр
S - площадь пика стандарта.
ст
III. Методы определения состава ароматизаторов
Состав и содержание ароматизаторов определяют методом хромато-
масс-спектрометрии (ХМС). Если допускает состав пробы, ХМС анализ
проводят по следующим схемам:
а) прямой ХМС анализ исходного образца;
б) ХМС анализ экстракта.
Приборы
Хромато-масс-спектрометр с автоматической системой обработки
данных и библиотекой масс-спектров.
Подготовка пробы
Органические компоненты экстрагируют из образца, разбавленного
водой в соотношении 1:5, смесью эфир - пентан (5 x 3 куб. см);
если растворитель - пропиленгликоль, экстракцию проводят пентаном.
Экстракт обезвоживают сульфатом натрия и упаривают в токе азота
при комнатной температуре до 100 мкл, 1 мкл экстракта вводят в
инжектор.
Условия хроматографического разделения
Кварцевая капиллярная колонка длиной 30 - 50 м, внутренним
диаметром 0,2 - 0,23 мм, неподвижная фаза полиметилсилоксан типа
SE 30, толщина пленки 0,2 - 0,3 мкм, газ-носитель - гелий,
давление на входе колонки 1,6 атм. Температура источника ионов 160
-С, испарителя и переходных линий 220 и 200 -С, режим
программирования температуры колонки: 50 -С (2 мин.), 120 -С (5
мин.), далее - повышение температуры за 4 мин. до 250 -С, изотерма
- 20 мин.
Условия масс-спектрометрии: энергия ионизирующих электронов 70
eV, сканирование по ПИТ от 39 до 450 а.е.м., обработка данных с
использованием библиотек масс-спектров для идентификации отдельных
ароматических компонентов
(http://www.nysaes.cornell.edu/fst/faculty/acree/flavornet/OV101.h
tml).
Список разрешенных ароматизаторов приведен в СанПиН 2.3.2.1293-
03 "Продовольственное сырье и пищевые продукты. Гигиенические
требования по применению пищевых добавок".
IV. Метод определения синтетических
пищевых красителей
К синтетическим пищевым красителям относятся органические
соединения следующих групп: азокрасители, пиразолоновые,
трифенилметановые, антрахиноновые, индигоидные, ксантеновые,
хинолиновые и полициклические (Е102 - "Тартразин", Е103 -
"Алканет", Е104 - "Желтый хинолиновый", Е107 - Желтый 2G, Е110 -
"Желтый "Солнечный закат", Е122 - "Азорубин, Кармуазин", Е124 -
"Понсо 4R", Е128 - "Красный 2G", Е129 - "Красный "Очаровательный"
AC", E131 - "Синий патентованный FCF", E142 - "Зеленый S", E143 -
"Зеленый прочный FCF", E151 - "Черный блестящий PN", E155 -
"Коричневый NT").
В зависимости от типов заместителей растворимость в воде
рассматриваемых красителей колеблется от очень хорошей до очень
плохой. Увеличение числа сульфатных или карбоксильных групп
повышает растворимость в воде. Наличие заместителей (хлор,
нитрогруппа или метил) повышает растворимость красителей в
органических растворителях. В настоящей методике органические
красители разделены на несколько групп в соответствии с их
химическим строением: азокрасители, пиразолоновые,
трифенилметановые, антрахиноновые, индигоидные, ксантеновые,
хинолиновые и полициклические.
Таблица 45
ПЕРЕЧЕНЬ И СВОЙСТВА СИНТЕТИЧЕСКИХ ПИЩЕВЫХ КРАСИТЕЛЕЙ
-------------------T-----T--------------T--------T---------------¬
¦ Краситель ¦Номер¦ Индекс FD&C; ¦Макс. ¦ Коэффициент ¦
¦ ¦по Cl¦ ¦поглоще-¦светопоглощения¦
¦ ¦ ¦ ¦ния, нм ¦ эталона (Э) ¦
+------------------+-----+--------------+--------+---------------+
¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦
+------------------+-----+--------------+--------+---------------+
¦Тартразин Е102 ¦19140¦FD&C; Yellow 5 ¦427 ¦0,053 ¦
+------------------+-----+--------------+--------+---------------+
¦Алканет Е103 ¦14270¦- ¦425 ¦0,064 ¦
+------------------+-----+--------------+--------+---------------+
¦Хинолиновый желтый¦47005¦Food Yellow 13¦412 ¦0,096 ¦
¦Е104 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+------------------+-----+--------------+--------+---------------+
¦Желтый "Солнечный ¦15985¦Food yellow 6 ¦484 ¦0,054 ¦
¦закат" Е110 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+------------------+-----+--------------+--------+---------------+
¦Кармины E120 ¦75470¦Natural Red 4 ¦ ¦ ¦
+------------------+-----+--------------+--------+---------------+
¦Азорубин E122 ¦14720¦Food Red 3 ¦228 ¦0,045 ¦
+------------------+-----+--------------+--------+---------------+
¦Амарант E123 ¦16189¦Food Red 9 ¦521 ¦ ¦
+------------------+-----+--------------+--------+---------------+
¦Понсо 4R Е124 ¦14700¦- ¦502 ¦0,054 ¦
+------------------+-----+--------------+--------+---------------+
¦Эритрозин E127 ¦45430¦FD&C; Red 3 ¦525 ¦0,057 ¦
+------------------+-----+--------------+--------+---------------+
¦Красный 2G E128 ¦18050¦Food Red 10 ¦ ¦ ¦
+------------------+-----+--------------+--------+---------------+
¦Красный ¦16035¦- ¦500 ¦0,052 ¦
¦"Очаровательный" ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦E129 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+------------------+-----+--------------+--------+---------------+
¦Патентованный ¦42051¦- ¦639 ¦0,048 ¦
¦синий Е131 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+------------------+-----+--------------+--------+---------------+
¦Индигокармин Е132 ¦73015¦FD&C; Blue 2 ¦610 ¦0,048 ¦
+------------------+-----+--------------+--------+---------------+
¦Синий блестящий ¦42090¦FD&C; Blue 2 ¦630 ¦0,164 ¦
¦FCF Е133 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
L------------------+-----+--------------+--------+----------------
1. Определение качественного состава красителей
в БАД методом ТСХ
1.1. Качественное определение индивидуальных
и смесевых синтетических пищевых красителей
Качественный состав индивидуальных и смесевых пищевых
красителей (СПК) определяют методом ТСХ на силикагеле в системах:
Система А
н-пропанол 100 мл
этилацетат 30 мл
вода 30 мл
аммиак 1 мл
Система В
уксусная кислота 20 мл
изобутанол 50 мл
вода 20 мл.
Наносят на пластинку ТСХ 2 - 5 мкл раствора исследуемого
образца с концентрацией 10 мг/100 куб. см. Проводят разделение в
системе А.
Таблица 46
ВЕЛИЧИНЫ Rf НЕКОТОРЫХ СПК ПРИ ТСХ
---------------------------------------T------------T------------¬
¦ Наименование красителя ¦Величина Rf ¦Величина Rf ¦
¦ ¦(система А) ¦(система В) ¦
+--------------------------------------+------------+------------+
¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦
+--------------------------------------+------------+------------+
¦Тартразин Е102 ¦0,595 ¦0,19 ¦
+--------------------------------------+------------+------------+
¦Желтый хинолиновый Е104 ¦ ¦0,56 ¦
+--------------------------------------+------------+------------+
¦Желтый "Солнечный закат" Е110 ¦0,690 ¦0,57 ¦
+--------------------------------------+------------+------------+
¦Кармуазин Е122 ¦0,78 ¦0,51 ¦
+--------------------------------------+------------+------------+
¦Понсо 4R E124 ¦0,571 ¦0,51 ¦
+--------------------------------------+------------+------------+
¦Эритрозин E127 ¦ ¦0,97 ¦
+--------------------------------------+------------+------------+
¦Красный "Очаровательный" E129 ¦ ¦- ¦
+--------------------------------------+------------+------------+
¦Синий патентованный Е131 ¦ ¦0,5 ¦
+--------------------------------------+------------+------------+
¦Индигокармин Е132 ¦0,714 ¦0,26 ¦
+--------------------------------------+------------+------------+
¦Синий блестящий FCF E133 ¦ ¦0,5 ¦
+--------------------------------------+------------+------------+
¦Зеленый S E142 ¦0,571 ¦0,35 ¦
+--------------------------------------+------------+------------+
¦Зеленый прочный FCF E143 ¦ ¦0,18 ¦
L--------------------------------------+------------+-------------
В случае, если в системе А смеси пищевых красителей не
разделились либо величины Rf пищевых красителей, находящихся в
смеси, близки, проводят хроматографическое разделение в системе В
либо двумерную ТСХ, используя в качестве второй подвижной фазы
систему В.
1.1.1. Очистка образца
В случае, если в матриксе пищевого красителя присутствуют
вещества, препятствующие нанесению на пластинку ТСХ либо
способствующие необратимой сорбции образца пищевого красителя на
старте, необходимо провести предварительную очистку образца. Для
этого на стеклянный фильтр диаметром 25 - 30 мм помещают целлюлозу
в виде суспензии в 25%-ном растворе сульфата аммония слоем
толщиной около 5 мм. На слой целлюлозы наносят очищаемый образец и
производят элюирование поэтапно: метанолом (20 куб. см) и 25%-ным
раствором сульфата аммония (80 куб. см) до исчезновения окраски
целлюлозы. Полученный элюат используют для проведения анализа
методом ТСХ.
1.1.2. Очистка образца хроматографическими методами
10 - 20 г порошка целлюлозы перемешивают примерно с 200 куб. см
воды. Дают смеси отстояться и декантируют жидкость. Повторяют
промывку и декантацию. К промытой целлюлозе добавляют
приблизительно 100 куб. см элюента, перемешивают и переносят
суспензию в хроматографическую колонку. После стекания жидкости
промывают содержимое колонки еще 100 куб. см элюента. 5 г
целлюлозы промывают, как описано выше. К промытой целлюлозе
добавляют 100 куб. см элюента, перемешивают, дают смеси отстояться
и отделяют жидкость декантацией.
Соединяют 5 г промытой целлюлозы с образцом красителя,
добавляют 10 г сульфата аммония. Тщательно перемешивают.
Количественно переносят смесь в колонку. Для ополаскивания
используют приблизительно 25 куб. см элюента. Когда весь раствор
стечет, добавляют около 400 куб. см элюента. Собирают восемь
фракций по 50 куб. см каждая и анализируют с помощью ТСХ.
1.2. Количественное определение состава
синтетических пищевых красителей в БАД с помощью ТСХ
и спектрофотометрии
1.2.1. Обработка образца
Водорастворимые БАД
Твердый образец
Навеску 5,0 г образца переносят в плоскодонную колбу
вместимостью 250 куб. см. Добавляют примерно 50 куб. см кипящей
воды и встряхивают до полного растворения образца. Переносят
окрашенные соединения на полиамидный порошок согласно п. 1.2.2.
Жидкий образец
Отбирают 50,0 куб. см образца и переносят окрашенные соединения
на полиамидный порошок согласно п. 1.2.2.
БАД с высоким содержанием жира
Обезжиривают образец при помощи петролейного эфира. Навеску 5,0
г переносят в центрифужную пробирку. Добавляют приблизительно 20
куб. см петролейного эфира и перемешивают при помощи стеклянной
палочки. Декантируют петролейный эфир. Повторяют до полного
обезжиривания. Если образец не содержит жира, его переносят в
плоскодонную колбу вместимостью 250 куб. см, добавляют 50 куб. см
кипящей воды и далее действуют согласно п. 1.2.2.
БАД с высоким содержанием крахмала и белка
Навеску 5,0 г БАД переносят в центрифужную пробирку. Добавляют
25 куб. см кипящей воды и перемешивают. Добавляют 25 куб. см смеси
метанол - 5%-ный аммиак, 95:5. Проверяют pH (величина pH должна
составлять приблизительно 9). Тщательно перемешивают. Оставляют
образец в холодильнике примерно на 15 мин. Центрифугируют при 2000
об./мин. в течение 10 мин. Декантируют чистый раствор в
плоскодонную колбу емкостью 250 куб. см. Добавляют 5 куб. см воды
в центрифужную пробирку, перемешивают и добавляют 10 куб. см смеси
метанол - 25%-ный аммиак, 95:5. Перемешивают и центрифугируют, как
описано выше. Повторяют указанную процедуру до полной экстракции
окрашенных соединений. Объединяют все экстракты. Упаривают
объединенный экстракт на водяной бане приблизительно до объема 25
куб. см (чтобы удалить весь метанол). Добавляют 25 куб. см воды и
нагревают раствор. Далее действуют согласно п. 1.2.2.
1.2.2. Перевод красителей на полиамидный порошок
Используя раствор уксусной кислоты в метаноле (1:1 по объему)
или водный аммиак, доводят pH образца до 4 - 5. Добавляют 1 г
полиамидного порошка к теплому раствору. Перемешивают в течение 1
минуты. Дают порошку осесть. Проверяют исчезновение окраски
раствора. Если окраска сохранилась, добавляют еще некоторое
количество полиамидного порошка и перемешивают. (Синтетические
красители полностью абсорбируются на полиамиде, натуральные
красители - лишь частично. Свойство красителей абсорбироваться на
полиамидной матрице можно использовать для определения наличия
натурального красителя в образце.) Полиамидный порошок: SC6
"Machery Nagel & Со" Duren, размер пор 0,05 - 0,16 мкм.
Перемешивают и переносят суспензию на стеклянную колонку.
Промывают плоскодонную колбу тремя порциями по 10 куб. см горячей
воды и переносят на колонку. Колонку промывают 10 куб. см горячей
воды и затем 3 х 5 куб. см метанола. Стеклянная колонка: длина -
20 см, внутренний диаметр - 30 мм.
1.2.3. Элюирование и концентрирование индивидуальных красителей
Помещают круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см под
колонку и элюируют красители с полиамида растворителем (метанол -
25%-ный аммиак, 95:5 (по объему)) порциями по 5 мл со скоростью 2
мл/мин. до тех пор, пока полиамид не обесцветится. Упаривают элюат
досуха на вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 -С.
Добавляют 1 - 2 куб. см смеси метанол - 25%-ный аммиак, 95:5.
Используют полученный раствор для разделения красителей методом
ТСХ.
1.2.4. Разделение методом ТСХ
Используя микрошприц или микропипетку, наносят на
хроматографическую пластинку (целлюлоза, толщина слоя 0,10 мм, DC-
Fertigplatten, Merck Art 5716 без флуоресцентного индикатора)
полосу образца, полученного по п. 1.2.3, длиной около 3 см. Объем
пробы 50 - 100 мкл. Высушивают нанесенный образец феном.
ТСХ проводят в одной из трех систем растворителей:
2,5%-ный водный раствор цитрата натрия (C6H5Na3O7 x 2H2O) - 25%-
ный аммиак - метанол, 80:20:12 (по объему);
1-пропанол - этилацетат - вода, 6:1:3 (по объему);
трет-бутанол - пропионовая кислота - вода, 50:12:38 (по
объему).
Соскабливают разделившиеся окрашенные зоны с пластинки в
различные центрифужные пробирки. Доводят аммиаком pH растворов до
7. Добавляют по 5 или 10 куб. см воды, закрывают пробками и
встряхивают в течение 1 мин. Удаляют пробки и центрифугируют при
2000 об./мин. в течение 10 мин. Декантируют супернатант в другие
центрифужные пробирки и повторяют центрифугирование.
1.2.5. Количественное определение
Определяют поглощение чистых растворов на спектрофотометре при
характерных для каждого красителя длинах волн максимума
поглощения. Для контроля чистоты красителя и подтверждения
структуры красителя снимают спектр образца и сравнивают со
спектром стандартного раствора или библиотечным спектром.
1.2.5.1. Расчет содержания основного вещества в красителях
Содержание основного вещества X, определенное
спектрофотометрически, рассчитывают по формуле:
D x 100 x V
X = ------------,
Э x 1000 x g
где:
D - оптическая плотность исследуемого раствора;
V - объем, куб. см;
Э - коэффициент светопоглощения эталона настоящей методики;
g - масса, мг.
2. Определение синтетических пищевых
красителей методом ВЭЖХ
2.1. Условия ОФ ВЭЖХ
Колонка: Kromasil С18, 5 мю м, 250 х 4,6 мм ID.
Элюент: 10 мМ фосфатный буфер, pH 4,2, - ацетонитрил, 80:20 об.
%.
Скорость подачи элюента: 1 куб. см/мин.
Детектирование: UV-Vis 500 нм (красные), 450 нм (желтые) и 600
нм (синие СПК).
2.2. Условия ион-парной ОФ ВЭЖХ
Колонка: Kromasil С18, 5 мю м, 250 х 4,6 мм ID.
Элюент: 10 мМ тетрабутиламмоний фосфат, 10 мМ фосфатный буфер,
pH 4,2, - ацетонитрил, 55:45 об. %.
Скорость подачи элюента: 0,9 куб. см/мин.
Детектирование: UV-Vis 500 нм (красные), 450 нм (желтые) и 600
нм (синие СПК).
2.3. Подготовка стандартных растворов
Стандартные растворы синтетических пищевых красителей готовят
путем растворения точных навесок СПК с известной концентрацией
основного вещества в мерных колбах дистиллированной водой.
Эритрозин (Е 127) растворяют в метаноле. Градуировочные графики
строят в координатах S (площадь пика) - С (концентрация СПК), г/л,
в интервале концентраций 0,002 - 0,01 г/л.
2.4. Пробоподготовка
Соки и сокосодержащие БАД (10 куб. см) разбавляют
дистиллированной водой в колбе объемом 100 куб. см, пробы
фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,2 мкм.
Концентраты соков (10 г) разбавляют дистиллированной водой в колбе
объемом 250 куб. см, пробы фильтруют через мембранный фильтр с
диаметром пор 0,2 мкм.
Глава 5. Методы исследований безопасности
I. Методы определения микотоксинов
|
