|
Стр. 12
предварительно активированный 10 куб. см метилового спирта и 20
куб. см дистиллированной воды. Патрон промывают 20 куб. см
дистиллированной воды. Гинзенозиды смывают 10 куб. см метилового
спирта в круглодонную колбу вместимостью 25 куб. см. Раствор
отгоняют досуха на роторном испарителе при температуре не более 50
-С. Сухой остаток в колбе растворяют в 1 куб. см метилового
спирта. 200 мкл полученного раствора помещают поверх мембранного
фильтра в патрон набора для микрофильтрации образцов на 1,0 куб.
см (НПФ "БИОХРОМ", Москва, Россия) и центрифугируют на
микроцентрифуге-вортекс "MINIGEN" (фирма "Диа-М", Москва, Россия)
или Опн-8 при 3000 об./мин. в течение 10 мин.
Биологически активные добавки к пище в сухом виде
Определение содержания суммы гинзенозидов Rb1, Re, Rc
0,005 г (точная навеска) препарата помещают поверх мембранного
фильтра в патрон набора для микрофильтрации образцов на 1,0 куб.
см. Добавляют 400 мкл гексана и центрифугируют на микроцентрифуге-
вортекс "MINIGEN" при 3000 об./мин. в течение 3 мин. Промывку
гексаном повторяют трижды. Затем патрон для образцов сушат под
вакуумом до удаления запаха гексана. Фильтр с образцом
количественно переносят в герметически закрывающуюся пробирку
вместимостью 5 куб. см и добавляют 2 куб. см дистиллированной
воды. Содержимое пробирки перемешивают на микроцентрифуге-вортекс
"MINIGEN" или аналогичной в течение 1 мин. 1 куб. см раствора
помещают в микропробирку из полипропилена объемом 1,5 куб. см и
центрифугируют на микроцентрифуге-вортекс "MINIGEN" или Опн-8 при
3000 об./мин. в течение 10 мин.
Мед
10 +/- 0,01 г меда с женьшенем помещают в коническую колбу
вместимостью 100 куб. см и растворяют в 50 куб. см воды
дистиллированной. 40 куб. см полученного раствора наносят на
патрон Диапак С18, предварительно активированный 10 куб. см
метилового спирта и 20 куб. см дистиллированной воды. Далее
проводят те же операции, которые были описаны выше для напитков и
биологически активных добавок к пище в жидком виде.
Приготовление рабочих стандартных растворов
Для приготовления раствора РСО гинзенозида Rb1 (Rc или Re) в
фирменный флакон с РСО соответствующего гинзенозида (Sigma, кат. N
G-0777, G-0902 и G-1027) прибавляют 5 куб. см метилового спирта и
перемешивают до растворения. Срок годности раствора РСО при
хранении его при температуре не выше 4 -С - 1 мес.
Проведение анализа
Колонка: Кромасил 100 С18 (Kromasil), 7 мкм, 150 х 4 мм ID.
Элюент: ацетонитрил - 0,05% ортофосфорная кислота (30:70), 1,0
куб. см/мин.
Детектирование: UV, 203 нм.
Таблица 39
МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ГИНЗЕНОЗИДОВ Rb1, Rc, Re В КОРНЯХ ЖЕНЬШЕНЯ
----------------------------------------------------T------------¬
¦ Статистический параметр ¦Rb1, Rc, Re ¦
+---------------------------------------------------+------------+
¦Предел обнаружения, мг/мл ¦0,001 ¦
+---------------------------------------------------+------------+
¦Интервал определяемых концентраций, мг/мл ¦0,001 - 1,00¦
+---------------------------------------------------+------------+
¦Среднее значение открываемости (показатель ¦95,5 ¦
¦правильности), % ¦ ¦
+---------------------------------------------------+------------+
¦Максимально допустимое расхождение между ¦7,0 ¦
¦результатами двух параллельных внутрилабораторных ¦ ¦
¦определений (сходимость) при р = 0,95, % ¦ ¦
+---------------------------------------------------+------------+
¦Максимально допустимое расхождение между ¦10,0 ¦
¦результатами двух параллельных межлабораторных ¦ ¦
¦определений (воспроизводимость) при р = 0,95, % ¦ ¦
L---------------------------------------------------+-------------
13. Определение содержания схизандрина
в БАД, содержащих лимонник китайский
(Schizandra Chinensis (Turcz.) Baill)
Метод основан на определении схизандрина с помощью метода
ВЭЖХ.
20
Температура плавления схизандрина 133 -С; [альфа] + 78- (с
D
1,0; хлороформ); склонен удерживать кристаллизационную воду даже
при нагревании в вакууме. В УФ-спектре максимумы длин волн в
диапазонах 221 - 224 нм и 249 - 251 нм.
Подготовка проб для анализа
Напитки и биологически активные добавки к пище в жидком виде,
содержащие лимонник, его экстракты, настои и настойки
1 куб. см пробы переносят в пробирку для микропроб однократного
применения объемом 1,5 куб. см и центрифугируют на микроцентрифуге-
вортекс "MINIGEN" (фирма "Диа-М", Москва, Россия) или на
центрифуге медицинской лабораторной ОПн-8 при 3000 об./мин. в
течение 10 мин. Если при анализе пик схизандрина не обнаружен, то
раствор предварительно центрифугируют и супернатант упаривают
досуха на роторном испарителе. Остаток растворяют в 1 - 3 куб. см
30% этилового спирта.
Биологически активные добавки к пище в сухом виде, содержащие
лимонник, его экстракты, настои и настойки
Навеску 0,5 г +/- 0,001 биологически активной добавки к пище
помещают в коническую колбу вместимостью 25 куб. см и приливают 5
куб. см 30% этилового спирта. Содержимое колбы перемешивают в
течение 5 мин. 1 куб. см раствора переносят в пробирку для
микропроб однократного применения объемом 1,5 куб. см и
центрифугируют при 3000 об./мин. в течение 10 мин.
Мед, содержащий лимонник, его экстракты, настои и настойки
Навеску 10 +/- 0,01 г меда растворяют в 25 куб. см
дистиллированной воды при нагревании. Концентрирующий патрон
Диапак С16 активируют 10 куб. см спирта и отмывают 10 куб. см
воды. 20 куб. см водного раствора образца наносят на патрон
концентрирующий Диапак С16 порциями по 10 куб. см, после каждой
порции патрон промывают 20 куб. см воды. Вещества элюируют с
патрона 10 куб. см спирта и помещают в круглодонную колбу
вместимостью 25 куб. см. Раствор упаривают досуха на роторном
испарителе. В колбу приливают 2 куб. см спирта и растворяют сухой
остаток. 1 куб. см раствора помещают в пробирку для микропроб
однократного применения объемом 1,5 куб. см и центрифугируют при
3000 об./мин. в течение 10 мин.
Приготовление рабочих стандартных растворов
5 +/- 0,1 мг стандартного образца схизандрина переносят в
мерную колбу на 10 куб. см, растворяют в небольшом количестве
метанола и затем доводят до метки метанолом. Получают раствор РСО
с концентрацией 0,5 мг/куб. см. Раствор РСО хранят в темном месте
в холодильнике в посуде с пришлифованной пробкой не более 3 мес. В
хроматограф вводят 5 - 10 мкл раствора образца.
Проведение анализа
Предколонка: мини-картридж Элсикарт, 8 x 4 мм, Диасорб 130
С16Т.
Колонка: Диасорб 130 С16Т, 11 мкм, 250 х 4 мм ID.
Подвижная фаза: ацетонитрил - вода (50:50), 1,0 куб. см/мин.
Детектирование: UV, 216 нм.
Время удерживания схизандрина составляет около 12 мин.
Таблица 40
МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
СХИЗАНДРИНА В ПЛОДАХ, СЕМЕНАХ И ЛИАНАХ ЛИМОННИКА
----------------------------------------------------T------------¬
¦ Статистический параметр ¦ Схизандрин ¦
+---------------------------------------------------+------------+
¦Предел обнаружения, мг/мл ¦0,001 ¦
+---------------------------------------------------+------------+
¦Интервал определяемых концентраций, мг/мл ¦0,001 - 1,00¦
+---------------------------------------------------+------------+
¦Среднее значение открываемости (показатель ¦95,5 ¦
¦правильности), % ¦ ¦
+---------------------------------------------------+------------+
¦Максимально допустимое расхождение между ¦7,0 ¦
¦результатами двух параллельных внутрилабораторных ¦ ¦
¦определений (сходимость) при р = 0,95, % ¦ ¦
+---------------------------------------------------+------------+
¦Максимально допустимое расхождение между ¦10,0 ¦
¦результатами двух параллельных межлабораторных ¦ ¦
¦определений (воспроизводимость) при р = 0,95, % ¦ ¦
L---------------------------------------------------+-------------
14. Определение содержания элеутерозида В (сирингина)
в БАД, содержащих элеутерококк колючий
Компонентами элеутерококка являются стероиды (даукостерин),
фенилпропаноиды с замещенными фенольными группами (сирингин),
лигнаны (элеутерозид D), оксикумарины (7-О-бета-D-
глюкозилизофраксидин), алканы (этил-альфа-D-галактозид или
элеутерозид С), а также негликозилированные соединения различных
классов: фенилпропаноиды со свободными фенольными гидроксилами
(хлорогеновая кислота, конифериловый альдегид, этиловый эфир
кофейной кислоты, синаповый спирт), лигнаны (сирингарезинол,
сезамин), тритерпеноиды (олеаноловая кислота), кумарин
(изофраксидин), ситостерины (бета-ситостерин, кампестерин),
полисахариды и др.
Сирингин мало и медленно растворим в воде и в 95%-ном спирте.
В качестве метода анализа используют высокоэффективную
обращеннофазную жидкостную хроматографию. Предел обнаружения
элеутерозида В составляет 0,001 мг/куб. см. Диапазон определяемых
концентраций от 0,001 до 1,00 мг/куб. см.
Приборы и реактивы
Облучатель ультрафиолетовый.
Пластины для ТСХ "Сорбфил ПТСХ-П-А" 10 х 15 см.
Пластины Silufol.
ВЭЖХ с УФ-детектором.
Приготовление рабочего раствора сирингина
(элеутерозида В)
0,01 +/- 0,0005 г сирингина помещают в мерную колбу
вместимостью 50 куб. см, прибавляют 40 куб. см 60% этилового
спирта, перемешивают до растворения и доводят объем раствора до
метки. Срок хранения рабочего раствора при температуре 5 - 10 -С
составляет 1 мес.
Подготовка образца
К 0,2 г препарата (содержание элеутерококка 15%) добавляют 25
куб. см этилового спирта 30% и перемешивают в течение 30 мин.
Центрифугируют при 3000 об./мин. 1,5 куб. см экстракта в пробирке
для микропроб однократного применения.
0,05 г измельченного сырья обезжиривают 3-кратной экстракцией
хлороформом или гексаном, из остатка экстрагируют элеутерозиды
метанолом или 95% этанолом (10 куб. см) при нагревании с обратным
холодильником при 50 -С в течение 1 ч, раствор фильтруют и доводят
объем до первоначального.
Идентификация тестового соединения
с помощью метода ТСХ
На пластину для ТСХ полосой наносят 30 мкл экстракта,
высушивают при 100 -С в течение 15 мин. Хроматографирование
проводят в системе растворителей: этиловый спирт 96% - хлороформ
(7:3). Пластину сушат при 100 -С в течение 5 мин. В УФ-свете (360
нм) наблюдают бледно-голубую полоску с Rf 0,64.
Проводят хроматографирование экстракта (п. 3.2) на пластинах
Silufol в системе хлороформ - метанол - вода (61:32:7). Проявление
пятен производят опрыскиванием пластины 20% серной кислотой.
Проведение ВЭЖХ
Колонка: Диасорб 130 С16Т, 11 мкм, 250 х 4 мм ID, или
аналогичная.
Подвижная фаза: ацетонитрил - вода - ледяная уксусная кислота
(85:15:0,5), 1 куб. см/мин.
Детектирование: UV, 266 нм.
Время удерживания элеутерозида В около 12 мин.
Таблица 41
МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ЭЛЕУТЕРОЗИДА В НАПИТКАХ И БАД В СУХОМ ВИДЕ
----------------------------------------------------T------------¬
¦ Статистический параметр ¦Элеутерозид ¦
¦ ¦В (сирингин)¦
+---------------------------------------------------+------------+
¦Предел обнаружения, мг/мл ¦0,001 ¦
+---------------------------------------------------+------------+
¦Интервал определяемых концентраций, мг/мл ¦0,001 - 1,00¦
+---------------------------------------------------+------------+
¦Среднее значение открываемости (правильность), % ¦95,5 ¦
+---------------------------------------------------+------------+
¦Максимально допустимое расхождение между ¦7,0 ¦
¦результатами двух параллельных внутрилабораторных ¦ ¦
¦определений (сходимость) р = 0,95, % ¦ ¦
+---------------------------------------------------+------------+
¦Максимально допустимое расхождение между ¦10,0 ¦
¦результатами двух параллельных межлабораторных ¦ ¦
¦определений (воспроизводимость) р = 0,95, % ¦ ¦
L---------------------------------------------------+-------------
15. Определение производных кофейной
(3,4-дигидроксикоричной) кислоты в БАД на основе
экстрактов эхинацеи пурпурной
Идентификация и количественное определение производных кофейной
кислоты в препаратах эхинацеи проводятся с помощью метода ВЭЖХ.
Приготовление пробы
1 г измельченной травы, содержимое капсул или растертых
таблеток помещают в колбу объемом 200 куб. см, прибавляют 100 куб.
см смеси метанол - вода (7:3) и ведут экстракцию при нагревании на
кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 10 - 15
мин. Экстракт охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через
бумажный фильтр.
Приготовление рабочего стандартного образца (РСО)
В качестве внутреннего стандарта используют 3-О-
метилпроизводное кофейной кислоты - феруловую кислоту V (3-(4'-
гидрокси-3'-метоксифенил)-проп-2-еновая кислота) - вещество,
близкое по хроматографической подвижности и спектральным свойствам
к анализируемым производным кофейной кислоты. Для приготовления
РСО с концентрацией 0,1 мг/куб. см в мерную колбу на 50 куб. см
вносят навеску 5 мг феруловой кислоты и добавляют до метки
метанола. Смесь взбалтывают до полного растворения. Концентрацию
РСО проверяют с помощью УФ-спектрофотометрии (длина волны
максимума 234 нм (log E 4,10)).
Проведение анализа
Условия ВЭЖХ. К 1 куб. см экстракта добавляют 1 куб. см
стандартного раствора феруловой кислоты с концентрацией 0,1
мг/куб. см (100 мкг). Анализ проб проводят с помощью жидкостного
хроматографа с УФ-спектрофотометрическим детектором. Колонка с
силикагелем, химически связанным с октадецилсиланом, "Нуклеосил
С18" (250 x 4,6 мм) или аналогичная. Подвижная фаза: ацетонитрил -
0,05 М NaH2PO4, pH 2,6 (15:85); скорость потока 1,2 куб. см/мин.;
детектирование при лямбда = 330 нм; объем вводимой пробы 5 - 20
мкл.
Содержание цикориевой, кафтаровой и хлорогеновой кислот в
образце вычисляют по формуле:
K x C x S x V x 100%
1
Х% = ---------------------,
S x M
2
где:
С - концентрация внутреннего стандарта в анализируемой пробе,
мг/мл;
S - площадь пика цикориевой кислоты;
1
S - площадь пика феруловой кислоты;
2
V - общий объем экстракта, мл;
М - масса навески, мг;
К - коэффициент, учитывающий различие в УФ-поглощении
внутреннего стандарта V и анализируемых кислот I - III.
K = 1,212 (для цикориевой кислоты);
I
K = 1,548 (для кафтаровой кислоты);
II
К = 1,744 (для хлорогеновой кислоты).
III
Таблица 42
МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕТОДИКИ
ОПРЕДЕЛЕНИЯ 3,4-ДИГИДРОКСИКОРИЧНОЙ КИСЛОТЫ
-----------------------------------------------------T-----------¬
¦ Статистический параметр ¦Цикориевая ¦
¦ ¦ кислота ¦
+----------------------------------------------------+-----------+
¦Предел обнаружения, % ¦0,005 ¦
+----------------------------------------------------+-----------+
¦Интервал определяемых концентраций, % ¦0,005 - 10 ¦
+----------------------------------------------------+-----------+
¦Среднее значение открываемости (правильность), % ¦90 - 95 ¦
+----------------------------------------------------+-----------+
¦Максимально допустимое расхождение между ¦8,0 ¦
¦результатами двух параллельных внутрилабораторных ¦ ¦
¦определений (сходимость) р = 0,95, % ¦ ¦
+----------------------------------------------------+-----------+
¦Максимально допустимое расхождение между ¦10,0 ¦
¦результатами двух параллельных межлабораторных ¦ ¦
¦определений (воспроизводимость) р = 0,95, % ¦ ¦
L----------------------------------------------------+------------
16. Определение берберина и иохимбина в БАД
Описание берберина
Светло-желтые кристаллы. Растворимость: растворим в воде; легко
растворим в спирте; очень легко растворим в горячем спирте и воде;
растворим в бензоле, хлороформе, эфире. Алкалоид встречается в
корневищах канадского желтокорня (Hydrastis canadensis), а также в
растениях сем. лютиковых (Ranunculaceae), барбарисовых
(Berberidaceae), лунносемянниковых (Menispermaceae), рутовых
(Rutaceae) и др.
Описание берберина гидрохлорида
Из H2O кристаллизуется в виде игл. Растворимость: практически
нерастворим в спирте. UV спектр - 228 нм (Е1%-814), 263 нм (Е1%-
794), 345 нм (Е1%-722), 421 нм (Е1%-160) (данные по стандарту на
гидрохлорид берберина Национального института здравоохранения
Японии Eisei Shikenjo Hokoku 1995; 113: 121 - 126) (рис. 23).
Описание иохимбина C21H26O3N2, М - 354,43
Белый или беловатый кристаллический порошок, без запаха,
слабогорького вкуса. Кристаллизуется в иглах из разбавленного
спирта. Растворимость: трудно растворим в воде, спирте и
20
хлороформе; растворим в эфире. T 234 - 235 -С, [альфа] от 50
пл
-С до 55 -С (С2Н5ОН); 11 -С (СНСl3); 108 -С (пиридин).
Описание иохимбина гидрохлорида
Кристаллизуется в виде орторомбических листочков или призм.
Растворимость: легко растворим в воде; растворим в спирте. T 288
пл
20
- 290 -С (с разл.). [альфа] 100 -С (с = 1, Н2O).
D
Подготовка проб для хроматографического анализа
Методика включает предварительную экстракцию алкалоидов из
препаратов БАД смесями растворителей, близкими по составу к
подвижной фазе при ВЭЖХ. Полноту экстракции алкалоидов оценивали
по методике Британской фармакопеи (British Pharmacopoeia, 1990,
vol., Арр. ХЗ G, A112).
Для БАД, содержащих порошок коры иохимбе
(корневища желтокорня)
0,5 - 1,0 г измельченного содержимого капсул или растертых
таблеток помещают в коническую плоскодонную колбу вместимостью 25
куб. см с притертой пробкой, прибавляют 5 - 10 куб. см 0,01 N и
нагревают на кипящей водяной бане в течение 10 - 15 мин. Водно-
кислотный экстракт фильтруют через слой окиси алюминия.
Для БАД, содержащих экстракт коры иохимбе
(корневища желтокорня)
0,5 - 1,0 г измельченного содержимого капсул или растертых
таблеток помещают в коническую плоскодонную колбу с притертой
пробкой, прибавляют 25 куб. см метанола, подкисленного раствором
соляной кислоты и оставляют на 1 ч (рассчитать количество 0,01 N
HCl для подкисления метанола до pH 2,9). Метанольный раствор
фильтруют через слой окиси алюминия.
Приготовление стандартных растворов (РСО)
Для приготовления РСО с концентрацией 50 нг/мкл в мерную колбу
на 100 куб. см вносят точные навески по 0,005 г стандартных
образцов иохимбина гидрохлорида (берберина гидрохлорида);
добавляют по 50 куб. см воды и метанола для хроматографии (ТУ 6-09-
4326-76, "ХЧ"), затем взбалтывают до полного растворения. Чистоту
РСО проверяют с помощью ВЭЖХ, ТСХ и УФ-спектрофотометрии.
Полученные растворы РСО используют как для идентификации
компонентов БАД по параметрам удерживания при ВЭЖХ, так и для
количественной оценки их содержания в образцах.
Проведение анализа
ТСХ-скрининг
Для ТСХ-скрининга алкалоидов применяют пластинки с силикагелем
с УФ 254 нм индикатором ("Силуфол", Чехия).
Подвижные фазы
Берберин: этилацетат - изопропанол - уксусная кислота 20%
(4:6:1).
Иохимбин: бензол - этилацетат - изопропанол - аммиак
(12:6:4:0,5).
В качестве свидетелей применяют растворы стандартных образцов
(РСО).
Зоны веществ на хроматограммах детектируют с помощью реактива
Драгендорфа по флуоресценции при 366 нм и по гашению флуоресценции
индикатора при 254 нм. После разделения пластинки подсушивают и
детектируют в УФ-свете при длине волны 360 нм. Чувствительность
метода составляет от 1,5 до 0,5 мкг в пятне каждого алкалоида.
Условия ВЭЖХ
Анализ проб проводят с помощью жидкостного хроматографа со
спектрофотометрическим детектором. Колонка с силикагелем,
химически связанным с октадецилсиланом, "Нуклеосил С18" (200 x 4,6
мм) или аналогичная.
Подвижная фаза: метанол - вода - 85% о-фосфорная кислота
(35:65:0,2, pH 3,0).
Содержание алкалоидов определяют методом абсолютной калибровки
по внешнему стандарту. В качестве стандартных образцов используют
химически чистые для хроматографии Yohimbine hydrochloride (Y3125
SIGMA), Berberine Chloride (B3251 SIGMA).
Содержание действующего вещества в 1 таблетке/капсуле в
миллиграммах (X) в образце вычисляют по формуле:
H x m x V x 1000
x st 1
Х = --------------------,
H x V
st 2
где:
Н - площадь пика соответствующего компонента в испытуемом
х
образце;
H - площадь пика соответствующего компонента в растворе РСО;
st
m - масса стандарта, мг;
уф
V - объем испытуемого раствора, мл;
1
V - объем введенной пробы, мкл.
2
Пределы обнаружения алкалоидов: в таблетках БАД массой от 0,5
до 2,0 г составляют для иохимбина - 0,1 мг/табл., для берберина -
0,02 мг/табл.
17. Определение стевиозидов в БАД,
содержащих стевию (Stevia rebaudiana)
Содержание стевиозида в листьях стевии 10 - 12%, в растениях,
выращенных в Средней Азии, до 18%, в Крыму, Украине, Молдавии,
Грузии - 5 - 7%. Стевиозид хорошо растворим в воде, спирте, при
нагревании неустойчив.
Подготовка образца
Таблетки или содержимое капсулы перетирают в ступке до порошка
и экстрагируют трижды 60%-ным этанолом при 50 -C с обратным
холодильником в течение 15 мин. на водяной бане. Спиртовые
экстракты объединяют, спирт отгоняют на роторном испарителе при
температуре не выше 40 -C. К сухому остатку прибавляют воду, а
затем хлороформ. Пробу переносят в делительную воронку и
встряхивают. Сливают нижний слой и экстракцию проводят еще два
раза. Хлороформ полностью отделяют (если необходимо, пробу
центрифугируют), к водному слою прибавляют этанол до конечной его
концентрации 50%.
Идентификация и количественное
определение стевиозида
ВЭЖХ: колонка из нержавеющей стали, длина 250 мм, диаметр 4,0
мм. Сорбент - сепарон SGX NH2, зернение 7 мкм. Перед работой новую
колонку промывают 40 куб. см изопропанола, затем 80 куб. см
деионизированной воды, после чего уравновешивают колонку подвижной
фазой до стабильной нулевой линии.
Подвижная фаза: ацетонитрил - вода (80:20).
Стандартный раствор стевиозида концентрацией 200 мкг/куб. см в
50%-ном этаноле.
Детектирование: спектрофотометр, длина волны УФ 208 нм, шкала
0,02 AUFS, скорость потока 1,0 куб. см/мин., время удерживания
стевиозида - 12,4 +/- 0,1 мин. Обработка хроматографических данных
по программе МультиХром для Windows, версия 1.39.
Стандартный образец и испытываемую пробу хроматографируют не
менее трех раз. Ошибка метода +/- 2%.
18. Определение салидрозидов в БАД, содержащих
родиолу розовую (Rhodiola rosae L)
Приборы и реактивы
Пластины для ТСХ "Silufol".
Облучатель ультрафиолетовый.
Спектрофотометр.
Раствор ацетата свинца, 10%. Раствор натрия карбоната, 2%.
Насыщенный раствор сульфата натрия.
Диазотированный сульфанил: 7 г сульфацила натрия растворяют в
50 куб. см воды в мерной колбе вместимостью 100 куб. см, добавляют
9 куб. см концентрированной соляной кислоты, доводят раствор до
метки. 1 куб. см полученного раствора помещают в колбу
вместимостью 100 куб. см, ставят на лед, добавляют 50 куб. см
воды, 0,2 куб. см 10% натрия нитрита.
Подготовка образца
1. 1,0 г измельченного образца помещают в плоскодонную колбу,
добавляют 10 куб. см метанола, смесь нагревают на водяной бане с
обратным холодильником при температуре 65 -С и перемешивании в
течение 20 мин. Раствор фильтруют.
2. 0,5 г продукта экстрагируют 10 куб. см воды при нагревании с
обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 15 мин.
Раствор фильтруют или центрифугируют, осадок экстрагируют еще
трижды по 10 куб. см воды, объединенный экстракт фильтруют,
охлаждают.
Идентификация тестовых соединений с помощью ТСХ
На стартовую линию пластины Silufol (20 х 20 см), отстоящую от
края пластины на 20 - 25 мм, с помощью микрошприца или стеклянного
капилляра наносят в виде полосы 20 х 3 мм 10 мкл экстракта,
приготовленного по п. 1. Пластинку помещают в хроматографическую
камеру и элюируют в смеси хлороформа, метанола и воды, взятых в
объемном соотношении 26:14:3. Дают фронту растворителя подняться
на 10 см, затем после высушивания пластинку просматривают в УФ-
свете (254 нм). На хроматограмме обнаруживают доминирующее пятно
фиолетового цвета с Rf 0,4 - розавин. Пластинку опрыскивают 10%
водным раствором натрия карбоната, нагревают в сушильном шкафу при
температуре 110 -С в течение 2 мин., опрыскивают диазотированным
сульфанилом и снова нагревают 2 мин. при 100 -С. На хроматограмме
салидрозид наблюдают в виде полосы красноватого цвета с Rf 0,42.
Количественное определение салидрозида
К экстракту, полученному по п. 2, прибавляют 6 куб. см 10%
ацетата свинца, 2 куб. см насыщенного раствора сульфата натрия,
перемешивают, доводят объем до 50 куб. см, фильтруют, первые 15
куб. см отбрасывают. В мерную колбу на 25 куб. см переносят 5 куб.
см фильтрата, прибавляют 2,5 куб. см натрия карбоната и 2,5 куб.
см диазотированного сульфанила, доводят объем до метки,
перемешивают и через 5 мин. измеряют оптическую плотность раствора
относительно воды при 486 нм.
Содержание салидрозида, %, вычисляют по формуле:
D x 250 x 100
Х = -------------------,
253 x m x (100 - W)
где:
D - оптическая плотность;
253 - удельный показатель поглощения (Е/% см);
m - масса в г;
W - влажность, %.
19. Определение дубильных веществ в БАД,
содержащих черемуху (Padus Avium Mill); ольху (ALNus incana);
дуб (Qercus robur); бадан (Bergenia crassifolia)
Приборы и реактивы
Раствор перманганата калия 0,02 М.
Раствор индигосульфокислоты: в мерную колбу помещают 1 г
индигокармина, 50 куб. см концентрированной серной кислоты, объем
доводят водой до 1 куб. дм.
Подготовка образца
К 2 г измельченных корней добавляют 250 куб. см нагретой до
кипения воды, смесь кипятят с обратным холодильником в течение 30
мин., экстракт фильтруют.
Количественное определение дубильных веществ
25 куб. см раствора, полученного выше, разбавляют водой до 500
куб. см, добавляют 25 куб. см раствора индигосульфокислоты и
титруют раствором перманганата до золотисто-желтого окрашивания.
1 куб. см раствора перманганата соответствует 4,157 мг таннина.
Содержание дубильных веществ по галловой кислоте
Приборы и реактивы
0,05 М раствор натрия тетрабората - буры (тетраборнокислого 10-
водного): 19,07 г буры растворяют в 1000 куб. см воды.
0,1 Н раствор соляной кислоты: 8,5 куб. см соляной кислоты
концентрированной (плотность 1,190) разбавляют до 1 куб. дм водой.
Буферный раствор, pH 9: смешивают 900 куб. см 0,05 М раствора
буры и 100 куб. см 0,1 Н соляной кислоты.
Количественное определение дубильных веществ
2 - 4 куб. см исследуемого раствора помещают в мерную колбу
вместимостью 50 куб. см, добавляют 30 куб. см 50%-ного этилового
спирта, взбалтывают до растворения, доводят до метки 50%-ным
этиловым спиртом (раствор А).
1 куб. см раствора А помещают в колбу вместимостью 50 куб. см,
доводят до метки буферным раствором (раствор В).
Через 10 мин. измеряют оптическую плотность раствора В при 277
нм. В качестве раствора сравнения используют буферный раствор.
Массовую долю дубильных веществ в пересчете на галловую
кислоту, % (X), определяют по формуле:
50 х 50 х D х 10 х 100 х K
X = --------------------------,
m x E x 1% / 1ст x 1000
где:
E - удельный показатель поглощения галловой кислоты, равный 508
(оптическая плотность 1% раствора галловой кислоты, мг/куб. см);
m - масса образца, г;
К - коэффициент разведения (10 = 250 / 25)
или по формуле:
0,0197 x 50 x 50 x 100 x K
X = --------------------------, %,
m x 1000
где 0,0197 - концентрация раствора галловой кислоты, мг/куб.
см, оптическая плотность которого равна 1.
20. Определение производных антрахинона
20.1. В БАД, содержащих марену красильную
(Rubia tinctorum L.), марену грузинскую
(Rubia iberica (FICH.EX.DC).C.COCH)
Приборы и реактивы
Спектрофотометр или ФЭК.
Щелочно-аммиачный раствор: 50 г едкого натра растворяют в 870
куб. см воды, добавляют 80 куб. см концентрированного раствора
аммиака.
Подготовка образца
0,1 г измельченного продукта помещают в колбу на 200 куб. см,
добавляют 7,5 куб. см ледяной уксусной кислоты, 1 куб. см
концентрированной соляной кислоты, смесь нагревают с обратным
холодильником на кипящей водяной бане в течение 15 мин.,
периодически встряхивая и смывая осадок со стенок. Колбу охлаждают
и проводят экстракцию эфиром 3 х 30 куб. см при нагревании на
водяной бане при 35 -С с обратными холодильником в течение 15 мин.
с момента закипания эфира. Объединенные эфирные извлечения после
охлаждения фильтруют через вату в делительную воронку на 250 куб.
см, промывают водой 2 х 20 куб. см. При непрерывном охлаждении
приливают малыми порциями сначала 15 куб. см 30%-ного раствора
едкого натра, затем 25 куб. см щелочно-аммиачного раствора, не
переставая охлаждать смесь, встряхивают 5 мин. и окрашенный
раствор собирают в мерную колбу на 500 куб. см. Экстракцию щелочно-
аммиачным раствором повторяют несколько раз до прекращения
окрашивания щелочного раствора. К объединенному извлечению
добавляют 3 капли пергидроля, перемешивают и доводят объем щелочно-
аммиачным раствором до метки (раствор 1).
Для извлечения свободных производных антрахинона 0,1 г
измельченного продукта помещают в колбу на 300 куб. см, прибавляют
50 куб. см эфира и нагревают на водяной бане с обратным
холодильником 10 мин. Экстракцию повторяют трижды, эфирные
извлечения объединяют, охлаждают и экстрагируют производные
антрахинона 4 х 20 куб. см щелочно-аммиачным раствором, каждый раз
встряхивая по 5 мин., щелочной раствор переносят в мерную колбу на
100 куб. см, прибавляют каплю пергидроля, доводят объем до метки
щелочно-аммиачным раствором (раствор 2).
Количественное определение антрахиноновых производных
Количественное определение антрахиноновых производных
Измеряют оптическую плотность растворов 1 и 2 при 530 нм, в
качестве калибровочных используют растворы хлорида кобальта
концентрациями 10 - 50 мг/куб. см. 10 мг/куб. см хлорида кобальта
соответствует концентрации свободных производных антрахинона
0,0027 мг/куб. см.
Содержание суммы производных антрахинона (%) вычисляют по
формуле:
C x 500 x 100 x 100
1
X = --------------------.
1 M x (100 - W)
Содержание свободных производных антрахинона (%) вычисляют по
формуле:
C x 100 x 100 x 100
2
X = --------------------,
2 M х (100 - W)
где:
С и С - концентрации производных анатрахинона, определенные
1 2
в растворах 1 и 2;
М - масса образца;
W - потеря при высушивании, %.
Содержание связанных производных антрахинона (X, %) Х = Х -
1
Х .
2
20.2. В БАД, содержащих ревень тангутский
(Rheum palmatum L.)
Приборы и реактивы
Спектрофотометр или ФЭК.
Щелочно-аммиачный раствор: 50 г едкого натра растворяют в 870
куб. см воды, добавляют 80 куб. см концентрированного раствора
аммиака.
Подготовка образца
1. 1,0 г измельченного продукта помещают в плоскодонную колбу,
добавляют 10 куб. см 10%-ного спиртового раствора едкого натра,
смесь кипятят в течение 3 - 5 мин. Раствор фильтруют, охлаждают,
подкисляют разбавленной соляной кислотой до слабокислой реакции по
индикаторной бумаге, прибавляют 10 куб. см эфира, взбалтывают в
течение 2 - 3 мин. Эфирный слой окрашивается в желтый цвет.
2. 0,05 г продукта экстрагируют 7,5 куб. см ледяной уксусной
кислоты при нагревании с обратным холодильником на кипящей водяной
бане в течение 15 мин. После охлаждения в колбу через обратный
холодильник добавляют 30 куб. см эфира и кипятят 15 мин.,
экстракты охлаждают, фильтруют или центрифугируют, промывают
осадок на фильтре или центрифугат эфиром. Эфирные экстракты
объединяют, фильтруют или центрифугируют. Осадок экстрагируют еще
трижды по 10 куб. см воды, объединенный экстракт фильтруют,
охлаждают, фильтрат подкисляют разбавленной соляной кислотой до
слабокислой реакции по индикаторной бумаге, прибавляют 10 куб. см
эфира, встряхивают в течение 2 - 3 мин.
Идентификация тестовых соединений
5 куб. см эфирного экстракта, полученного по п. 1, смешивают с
5 куб. см раствора аммиака. Аммиачный слой приобретает вишнево-
красное окрашивание (эмодины), эфирный слой остается окрашенным в
желтый цвет (хризофон).
Количественное определение антраценовых производных
|
