|
Стр. 2
антибиотиками, предупреждающими рост посторонней микрофлоры. В
органах животных 1-ой группы туляремийные бактерии могут быть
обнаружены микроскопическим исследованием (лучше люминесцентной
микроскопией). Использование микроскопии мазков из органов трупов
животных 2-ой группы может быть безуспешным из-за малой
обсемененности их органов туляремийными бактериями. Наряду с
микроскопией и посевом органы трупов зверьков исследуют путем
биологической пробы, а остатки суспензии используют для постановки
серологических реакций (РНАт, РИФ и др.). В условиях установленной
эпизоотии можно ограничиться посевом и бактериоскопией мазков из
органов, сохраняя часть их на холоду до выяснения результатов и
выделения возбудителя прямым посевом. В сомнительных случаях
(плохая сохранность трупов, отсутствие при вскрытии типичных
патологоанатомических изменений) прибегают к биологическому
методу. При этом часть органов оставляют до выяснения результатов
посева или биологического исследования. Если биопробное животное
погибнет преждевременно от посторонней причины, а посев неудачен,
то проводят повторное биологическое исследование. У животных с
признаками разложения в первую очередь исследуют костный мозг
трубчатой кости. При исследовании сильно разложившихся трупов
применяют накожный метод заражения биопробного животного. Трупы
животных, как правило, исследуют параллельно и серологическими
методами (РНАт, РИФ и др.). Трупы животных 2-ой и 3-ей групп
обязательно исследуют биологическим методом, позволяющим выявить
даже единичные бактерии. Исследование завершают выделением чистой
культуры, ее идентификацией, что служит неоспоримым
доказательством зараженности объекта.
1.2. ИССЛЕДОВАНИЕ МУМИФИЦИРОВАННЫХ ТРУПОВ ЖИВОТНЫХ.
Обнаруженные при обследовании природных очагов туляремии
мумифицированные трупы, высохшие шкурки и кости зверьков не
содержат живых туляремийных бактерий, поэтому такие объекты
исследуют серологическими методами, позволяющими обнаружить
туляремийный антиген.
1.З. ИССЛЕДОВАНИЕ ЖИВОТНЫХ, ДОБЫТЫХ ЖИВЫМИ. Основным методом
исследования ММ, добытых в природе орудиями лова или живыми,
служит биологическая проба. Этот метод позволяет обнаруживать даже
единичные бактерии возбудителя туляремии на различных стадиях
заболевания или бактерионосительства, когда использование других
методов (посев, бактериоскопия) не дает положительного результата.
При биологическом исследовании ММ (кроме трупов и зверьков с
патологоанатомическими изменениями) применяют групповое
исследование, т.е. объединение органов нескольких зверьков (5-10)
одного вида и пойманных в одном месте. Используют кусочки
селезенки, печени, почек, лимфатические узлы, костный мозг. При
групповом анализе посевы и мазки от каждого вскрываемого зверька
не делают. Отобранные органы помещают в стерильную ступку,
тщательно растирают пестиком, добавляют стерильный физиологический
раствор и смешивают в гомогенную суспензию. Количество
физиологического раствора колеблется от 0,5 до 5 мл в зависимости
от величины органов. Сразу после приготовления 0,2-0,5 мл взвеси
набирают в шприц через небольшой кусочек стерильной ваты и вводят
белой мыши под кожу паховой области правой ноги (морской свинке
можно ввести до 2 мл взвеси).При вскрытии смену инструментов
производят после группы зверьков, входящих в общий анализ. Органы
животных, у которых на вскрытии обнаружены патологоанатомические
изменения, исследуют индивидуально. В этом случае применяют
дополнительно посев и бактериоскопию (люминесцентную микроскопию).
Бактериоскопия, как правило, дает положительный результат только в
септической (терминальной) фазе заболевания. Животных, добытых
живыми, исследуют на наличие туляремийных антител, для чего
используют сыворотку крови или "смывы" из грудной полости.
ВЗЯТИЕ КРОВИ У ЖИВЫХ ММ. Живых грызунов умерщвляют, вскрывают
грудную клетку и берут из правого желудочка сердца еще не
свернувшуюся кровь (обычно от 0,5 до 3 мл в зависимости от вида
животного). Кроме того, кровь можно брать из кончика хвоста или
уха, не убивая животное, что позволяет при необходимости повторить
исследование. При этом используют индивидуальные пипетки и шприцы.
Отстоявшуюся сыворотку консервируют мертиолатом натрия до конечной
концентрации 1:10000 (на 1 мл сыворотки добавляют 2 капли по 0,05
мл раствора мертиолата натрия 1:1000). Можно использовать плазму
крови животных (особенно мелких видов). Для этого кровь берут из
сердца или периферических сосудов и помещают в количестве 0,1 мл в
лунку пластины, содержащей 0,2 мл 5%-ного раствора лимоннокислого
натрия. Через 2 часа плазму крови можно использовать в
серологических реакциях микрообъемным способом. Исходное разведение
плазмы приравнивается к разведению сыворотки 1:5.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ "СМЫВА" ИЗ ГРУДНОЙ ПОЛОСТИ. При исследовании
мертвых ММ готовят суспензию из сгустков крови сердца и
околосердечного пучка сосудов ("смыв"). Суспензию готовят
непосредственно в грудной полости грызунов после взятия материала
для бактериологического исследования. Для этого целиком удаляют
легкие, ножницами иссекают сердце, аорту и другие крупные сосуды.
Шприцем с толстой иглой или пастеровской пипеткой вливают в
грудную полость физиологический раствор с мертиолатом натрия
1:4000 в количестве 1 мл. После перемешивания взвесь отсасывают и
переносят в пробирку, в которую добавляют еще 2 мл
физиологического раствора. "Смывы" отстаивают 1-2 часа, отсасывают
надосадочную жидкость. Условно "смыв" приравнивают к разведению
сыворотки 1:10. Желательно использовать забуференный
физиологический раствор рН 7,2. "Смывы", как правило, исследуют в
РПГА, поэтому их прогревают 30 мин при 56°С, затем выдерживают
12-14 часов. За это время взвешенные частицы полностью оседают и
надосадочная жидкость просветляется.
Возможно также производить забор сыворотки и цельной крови на
фильтровальную бумагу, предварительно обработанную мертиолатом
натрия в разведении 1:1000.
2.МЕТОД ПОИСКА ЗИМНИХ ЭПИЗООТИЙ ТУЛЯРЕМИИ. Во время зимних
лыжных маршрутов под одиноко стоящими деревьями и кустами, на
ометах соломы, под столбами и другими возвышениями на снегу можно
обнаружить обрывки шкурок ММ, которые хищные птицы сдирают, прежде
чем съесть зверька. Иногда на снегу около обрывков шкурок имеются
замороженные капли крови. Обрывки шкурок и капли замороженной
крови собирают в пробирки и исследуют с помощью биологической
пробы. Во время зимнего тропления следов лисы собирают
экскременты, обрывки шкурок, остатки трупов ММ и гнездового
материала, раскопанных лисой нор ММ. Собранный таким образом
материал исследуют путем биологической пробы и серологическими
методами.
3.СБОР И ИССЛЕДОВАНИЕ ПОГАДОК ПТИЦ И ПОМЕТА ХИЩНЫХ
МЛЕКОПИТАЮЩИХ (ПП И ПХМ). Для рекогносцировочного обследования
значительных территорий применяют серологическое исследование ПП и
ПХМ на содержание туляремийного антигена. Преимущества метода
заключаются в малой трудоемкости процесса сбора и быстроте
исследования полевого материала, в возможности за короткий срок
обследовать значительные территории открытых ландшафтов и быстро
получить ответ о наличии или отсутствии инфекции. Метод применим
для раннего и ретроспективного выявления эпизоотии, определения ее
границ, установления видов животных, вовлеченных в эпизоотический
процесс, и оценки их численности. Поедая в природе преимущественно
ослабленных, больных зверьков или их трупы, хищники осуществляют
выбор из популяции именно того материала, который желателен для
лабораторного исследования.
ПОГАДКА представляет собой плотный, продолговатый комок
непереваренных птицей частей пищи (шерсть, кости, перья, хитин
насекомых и т.п.), выбрасываемый ею через рот по окончании
процесса предварительного пищеварения. Образование погадок
отмечается у всех хищных птиц, чаек, вороновых и некоторых других.
Костные остатки млекопитающих в погадках хорошо сохраняются, что
позволяет установить видовую принадлежность съеденных зверьков.
Птицы сбрасывают погадки во время отдыха через 10-20 часов после
кормежки. Погадка может содержать остатки одного зверька у мелких
птиц и нескольких - у крупных хищников. Установлено, что птицы
сбрасывают погадки недалеко от мест кормежки и можно считать, что
исследование содержимого погадок характеризует именно ту
территорию, на которой они собраны (в пределах 2-3 км от точек
сбора).
ПОМЕТ ХИЩНЫХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ (семейства куньих, собачьих) также
состоит из непереваренных частей пищи, видовой состав которой в
полевых условиях определить трудно, т.к. они были разжеваны и
прошли пищеварительный тракт хищника. Участок охоты хищных
млекопитающих, как правило, постоянен и занимает территорию в
несколько квадратных километров.
Длительность сохранения погадок и помета в природе прежде
всего зависит от климатических условий местности. В зоне
достаточного увлажнения разрушение их происходит в течение 4-5
месяцев под воздействием гнилостных процессов и
насекомых-некрофагов. В засушливом климате степей и пустынь они
могут сохраняться более длительное время (в течение года и более).
Чем свежее погадка и помет, тем они темнее окрашены. Гибель
туляремийного микроба в погадках и помете происходит быстро (в
первые сутки; при отрицательных температурах, возможно, дольше), в
связи с чем бактериологическое исследование этого материала
нецелесообразно. Туляремийный антиген сохраняется в погадках и
помете в течение всего периода их существования. Для поиска
туляремийного антигена в ПП и ПХМ используют различные
серологические методы, чаще всего наиболее простой и доступный
-РНАт.
3.1. СБОР ПП И ПХМ В ПОЛЕВЫХ УСЛОВИЯХ. В бесснежное время года
в открытых ландшафтах в течение одного дня можно собрать материал,
содержащий остатки большого числа ММ с территории несколько сотен
квадратных км, если использовать автомашину для передвижения.
Труднее, но возможно, проводить сбор ПП и ПХМ зимой. Погадки
собирают вблизи гнездовий, мест кормежки, ночевок и отдыха птиц.
Обычно это возвышенные предметы, столбы ЛЭП, одиноко стоящие
деревья, стога сена и ометы соломы, вышки и т.д. ПХМ также можно
обнаружить около возвышающихся на местности предметов, а также на
охотничьих тропах хищников и на их лежках. ПП и ПХМ собирают
обычно ранней весной, сразу после схода снега и поздней осенью.
Это позволяет получить характеристику эпизоотийного состояния
популяции ММ на протяжении всего года, установить начало и
длительность эпизоотии. В пойменно-болотных очагах наиболее
удобное время сбора ПП и ПХМ - вторая половина лета, когда
возникают эпизоотии среди околоводных видов млекопитающих. В
лесных ландшафтах ПП и ПХМ удается собирать возле гнезд или по
кромке леса и опушкам. Непосредственно в лесных массивах особое
внимание уделяют сбору ПХМ в зимнее время.
Каждую найденную погадку или пробу помета заворачивают в
отдельный лист бумаги во избежание контаминации. Собранный с
одного места материал помещают в отдельные матерчатые мешки и
этикетируют. Быстрое отмирание туляремийного микроба в кислой
среде ПП и ПХМ позволяет проводить их сбор в природе и дальнейшую
обработку без специального режима, соблюдая лишь правила обычной
гигиены. При необходимости материал может храниться длительное
время, если его тщательно просушить.
3.2. ПОДГОТОВКА ПП И ПХМ К ИССЛЕДОВАНИЮ. Каждую погадку или
пробу помета рекомендуется исследовать индивидуально. После
доставки в лабораторию материал просушивают при комнатной
температуре и взвешивают каждую пробу с точностью до 0,1 г. Это
позволит в дальнейшем придерживаться сравнимого исходного
разведения суспензии (по сухому весу). Например, если к образцу
весом 1 г добавить 4 мл физиологического раствора, то получим
разведение 1:5, а при добавлении 9 мл - 1:10 и т.д. После
взвешивания дальнейшую обработку материала можно проводить двумя
способами:
а) взвешенный образец помещают в специальный пакетик из тонкой
полиэтиленовой пленки. Размер пакетика определяется величиной
исследуемого материала. После помещения в пакетик исследуемого
образца верхний край его перегибают и сшивают скрепочной машинкой.
Затем шприцем непрерывного действия через прокол верхнего края
пакета в него вводят подогретый (до 70°С) физиологический раствор
в необходимом количестве. Использование подогретого
физиологического раствора на 1-2 разведения повышает титр реакции
в сравнении с холодным раствором. Содержимое пакета разминают в
однородную массу и через 20-30 мин отжимают в пробирку, отрезав
нижний заостренный край пакета. Суспензию прогревают на кипящей
водяной бане 5- 10 мин и после охлаждения абсорбируют взвесью
50%-ных формалинизированных эритроцитов (2 капли эритроцитов на 1
мл суспензии). Через 20-30 мин суспензию центрифугируют 10-15 мин
при 2000 об/мин. Полученную прозрачную надосадочную жидкость
используют для постановки серологической реакции. Процедура
истощения суспензии формалинизированными эритроцитами необходима
для избежания неспецифических реакций;
б) при отсутствии полиэтиленовых мешочков или центрифуги
суспензию можно подготовить к исследованию другим, более
трудоемким способом. Погадку (или помет) растирают пестиком в
фарфоровой ступке с необходимым количеством подогретого до 70°С
физиологического раствора. Полученную взвесь отсасывают через
кусок стерильной ваты пастеровской пипеткой, переносят в пробирку
и прогревают 5-10 мин на кипящей водяной бане. Затем суспензию
фильтруют на стеклянной воронке с асбестовым фильтром до получения
прозрачной жидкости, которую используют в реакции. Такой фильтрат,
как правило, не дает неспецифических реакций даже в начальных
разведениях, поэтому дополнительная обработка формалинизированными
эритроцитами не требуется.
3.3. АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ ПП И ПХМ. Обнаружение
туляремийного антигена в исследуемом материале служит достоверным
критерием наличия эпизоотии на обследуемой территории в настоящее
время или в недавнем прошлом и является основанием для организации
работ, направленных на выделение возбудителя. Количество
положительных ПП и ПХМ позволяет судить об интенсивности
эпизоотического процесса: в местах разлитых эпизоотий этот
показатель составляет 20-60% от всего материала, а при локальных
(вялых) эпизоотиях - 0,5-3 %. Для обнаружения антигена при вяло
текущих эпизоотиях туляремии необходимо собрать и исследовать не
менее 100 ПП или ПХМ из одного места в течение одного сезона
обследования, а для контроля за эпизоотической ситуацией в
известных очагах туляремии - не менее 25 ПП и ПХМ, собранные
весной в лесной и лесостепной зонах, характеризуют эпизоотическое
состояние зимнего периода и ранней весны, а собранные осенью -
лета. Видовой состав ММ, вовлеченных в эпизоотический процесс в
лабораторных условиях, удается определить до вида (или рода) по
хорошо сохраняющимся костным остаткам (фрагментам черепа и зубам)
при сравнении с эталонной коллекцией костей скелета и зубов ММ,
обитающих на данной территории.
4. ПОДГОТОВКА КРОВОСОСУЩИХ ЧЛЕНИСТОНОГИХ И БЕСПОЗВОНОЧНЫХ
ЖИВОТНЫХ-ГИДРОБИОНТОВ ДЛЯ ЛАБОРАТОРНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ.
Добытых в природе насекомых и других беспозвоночных животных
исследуют, как правило, в день доставки в лабораторию или не
позднее следующего дня. Исключение может быть только для взрослых
иксодовых клещей, которых можно сохранять живыми 2-3 недели на
холоду. Погибшие и высохшие членистоногие непригодны для
бактериологического исследования.
Беспозвоночных животных перед исследованием определяют до вида
(или рода) и группируют в отдельные пробы, содержащие животных
одного вида (рода) и добытых из одного места. Обнаружение
туляремийного микроба в организме беспозвоночных наиболее
эффективно при использовании биологического метода или
ПЦP-анализа, выявляющего специфическую ДНК возбудителя туляремии.
Однако последний метод может быть использован и оценен в настоящее
время только специализированными научными лабораториями. В редких
случаях удается обнаружить туляремийные бактерии в иксодовых
клещах посевом содержимого их тела на питательную среду или с
помощью люминесцентной микроскопии.
4.1. ИКСОДОВЫЕ КЛЕЩИ. Перед исследованием взрослых клещей (~50
особей в один анализ) помещают в пробирку, приливают 10-15 мл
этилового спирта, энергичным встряхиванием промывают клещей 0,5-1
мин, сливают спирт, после чего 3-4 раза таким же образом промывают
их в стерильной дистиллированной воде. Отмытых клещей помещают на
фильтровальную бумагу для удаления излишней влаги, а затем - в
ступку. Клещей раздавливают пестиком и растирают в кашицу, избегая
разбрызгивания. К растертой массе добавляют 5 мл стерильного
физиологического раствора и тщательно перемешивают в однородную
суспензию, которую набирают в шприц через небольшой кусочек
стерильной ваты и вводят биопробному животному.
При исследовании личинок и нимф иксодовых клещей промывание в
спирте не проводят, т.к. это может повредить анализу. Личинок
объединяют по 100-200 экземпляров, нимф - по 50-100 в зависимости
от степени их упитанности. Затем помещают в стерильную ступку,
растирают пестиком, добавляют 1-3 мл физиологического раствора,
тщательно перемешивают и полученную суспензию вводят биопробному
животному.
4.2. БЛОХ, ГАМАЗОВЫХ КЛЕЩЕЙ, ВШЕЙ сортируют по видам (родам),
а также видам зверьков, с которых они были собраны, помещают в
стерильные пробирки и далее подвергают обработке по той же
методике, что личинок и нимф иксодовых клещей.
4.3. КРОВОСОСУЩИХ ДВУКРЫЛЫХ насекомых слегка усыпляют парами
эфира для ограничения подвижности. У слепней предварительно
отстригают ноги и крылья, комаров и мошек исследуют целиком. В
один анализ включают 25-50 слепней, или 100 комаров, или 250
мошек. Насекомых растирают в ступке, добавляют 5 мл
физиологического раствора, полученную суспензию вводят биопробному
животному
4.4. БЕСПОЗВОНОЧНЫЕ ЖИВОТНЫЕ - ГИДРОБИОНТЫ. Гидробионтов -
ручейников, бокоплавов, дафний, циклопов и др. перед исследованием
промывают в нескольких порциях воды и 1-2 порциях стерильной
дистиллированной воды. У животных, имеющих чехлики или раковинки,
последние по возможности удаляют. Животных объединяют в группы по
5-10-50 экземпляров в зависимости от размеров особей отдельных
видов, растирают в ступке, добавляют физиологический раствор 2-5
мл и полученную суспензию вводят биопробному животному.
5. ИССЛЕДОВАНИЕ ОБЪЕКТОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ.
Исследование объектов внешней среды является эффективным
способом обнаружения возбудителя туляремии, т.к последний
обнаруживает значительную устойчивость во внешней среде, особенно
при низкой температуре.
Так, в замороженной воде при -5°С возбудитель сохраняется до
10,5 месяцев, во влажной почве при 4°С- до 4-х месяцев, в зерне,
соломе при -5°С - до 6 месяцев, при 8-12°С - 2 месяца, в
замороженных трупах мышей - 6 месяцев, зайцев - 112 дней.
5.1. ИССЛЕДОВАНИЕ ВОДЫ. Пробы воды берут из различных
водоемов: речек, ручьев, прудов, озер, болот, колодцев и т.п. Из
каждой точки желательно брать 2 пробы. Пробы берутся в затененном
месте, на глубине 10-20 см от поверхности стоячей или слабо
проточной воды. Желательно отбирать пробы в местах обитания
зверьков (возле кормовых столиков, нор, хаток бобров или ондатр).
Воду в количестве 100-200 мл отбирают в стерильные бутылочки
емкостью 200-250 мл, закрывают пробкой, бумажным колпачком и
обвязывают шпагатом. Бутылочки с водой помещают в клеенчатые или
полиэтиленовые мешки, упаковывают в металлический ящик и
доставляют в лабораторию. В зимнее время пробы берут в прорубях, в
незамерзающих местах ручьев, мелиоративных каналов, рыболовных
лунках. При глубоком промерзании водоема со дна берут лед или ил.
После взятия каждой пробы руки (перчатки) и инвентарь обрабатывают
70°спиртом. Исследование воды проводят в день ее доставки в
лабораторию биологическим методом. Для концентрирования
возбудителя используют фильтрование, цетрифугирование, магнитные
сорбенты и другие приемы. После этого белой мыши вводят подкожно
до 1 мл, а морской свинке до 5 мл воды (желательно по 2 биопробы).
Наиболее эффективно применение исследования воды в
пойменно-болотных очагах туляремии в зимнее время.
5.2. 3ЕРНО, СОЛОМА, ПОДСНЕЖНЫЕ ГНЕЗДА ГРЫЗУНОВ, ДРУГИЕ
СУБСТРАТЫ. С зерна, соломы, гнездового материала и других
субстратов делают смыв физиологическим раствором. Для этого 5-10 г
исследуемого субстрата помещают в стерильный сосуд, заливают
двойным по весу количеством физиологического раствора и тщательно
встряхивают. Смыв набирают в шприц (через кусочек ваты) и вводят
биопробному животному. Зимой с соломы ометов собирают замерзшую
мочу, экскременты грызунов, которые также используют для биопробы.
Подснежные гнезда грызунов исследуют биологическим и
серологическим методами.
6. ИССЛЕДОВАНИЕ ДОМАШНИХ ЖИВОТНЫХ. Домашние животные (крупный
рогатый скот, свиньи, овцы, северные олени) относятся к видам,
малочувствительным к туляремии (3-я группа). При их исследовании
используют главным образом серологические методы (РА и РПГА), реже
- внутрикожную пробу с тулярином. Посевы из органов или
биологические пробы применяют только при обследовании павших,
забитых или больных животных. Исследуют в первую очередь
лимфатические узлы и селезенку. При серологическом исследовании
следует учитывать возможность обнаружения перекрестных реакций с
бруцеллами и микробной флорой кишечника животных. Целесообразно
исследовать сыворотки домашних животных по крайней мере в двух
серологических реакциях: РА и РПГА, считая диагностически
значимыми титры в РА -1:40 и выше и в РПГА - 1:160 и выше.
Положительные реакции в РПГА следует контролировать в реакции
торможения гемагглютинации (РТПГА). Обнаружение специфических
антител у домашних животных имеет ориентировочное значение и
служит сигналом для проведения на данной территории детальных
эпизоотологических исследований на туляремию.
МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
В практике эпизоотологического исследования на туляремию
основное место принадлежит бактериологическим методам,
обеспечивающим выявление и выделение возбудителя туляремии. Вместе
с тем существенную роль приобретают серологические методы
исследования, позволяющие с меньшими трудозатратами и в короткий
срок дать заключение об эпизоотическом состоянии территории. И,
наконец, в последние годы разрабатываются и находят применение
высокочувствительные методы молекулярной биологии (ПЦР-анализ),
позволяющие по обнаружению специфической ДНК возбудителя туляремии
судить о наличии эпизоотии и выявлять "некультивируемые" или
"покоящиеся" формы возбудителя туляремии в различных объектах.
1. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
1.1. БАКТЕРИОСКОПИЯ. Ввиду очень мелких размеров туляремийный
микроб может быть достоверно обнаружен в окрашенных
мазках-отпечатках только из обильно обсемененного патологического
материала Четко положительные результаты получают при содержании в
1 г ткани более 1 млрд микробов. Поэтому бактериоскопия эффективна
при исследовании павших диких или биопробных животных, но обычно
безуспешна при исследовании убитых на ранних стадиях заболевания
зверьков. Она не используется также при исследовании воды, смывов
с объектов внешней среды, где концентрация возбудителя может быть
незначительной.
Мазок-отпечаток делают, прикладывая к обезжиренному стеклу
поверхность свежего среза исследуемого органа - лимфатического
узла, селезенки, печени, а также мазок крови из сердца. Препарат
хорошо просушивают, после чего 15-20 мин фиксируют в смеси
Никифорова (этиловый спирт и серный эфир в равных пропорциях).
После фиксации мазок окрашивают по Романовскому-Гимзе. Раствор
краски готовят из расчета 3-4 капли на 1 мл дистиллированной воды
(рН 7,0- 7,2). Окраска продолжается не менее 1 часа (можно до 24
часов). В правильно окрашенном мазке бактерии туляремии имеют
сиреневый цвет и легко определяются по размерам, форме и тенденции
к кучечному расположению.
С целью ускоренной окраски мазков применяют метод, основанный
на одновременной фиксации и окраске мазка. Для этого краску
Романовского-Гимза смешивают в равных частях с метиловым спиртом
(или химически чистым ацетоном). Смесь можно длительно хранить в
посуде с притертой стеклянной пробкой. На свежий ( не более 2-х
суток), высушенный и не фиксированный мазок наносят 20 капель
смеси. Через минуту к краске приливают 10 мл дистиллированной воды
(рН 7,2). Осторожным покачиванием краску смешивают с водой. Через
10-15 мин краску сливают, мазок промывают водопроводной водой,
высушивают и просматривают под микроскопом. Бактерии туляремии
окрашиваются в темно-фиолетовый цвет и четко дифференцируются от
светло-сиреневого окружающего фона. Количество бактерий,
обнаруженных в мазках-отпечатках из органов и крови, учитывают по
4-х балльной шкале. Достоверным для диагностики является
обнаружение туляремийных бактерий в количестве, оцениваемом Ш-1У
баллами (большое количество крупных, средних и небольших по
величине скоплений бактерий в каждом поле зрения).
1.2. ЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ. В основе метода лежит реакция
иммунофлуоресценции (РИФ) в ее прямом варианте. Люминесцентная
микроскопия является эффективным методом экспресс-диагностики
туляремии, позволяющим выявлять как живые, так и мертвые
туляремийные бактерии при концентрации 1 млн м.кл. в 1 мл. При
меньших концентрациях - 100 тыс., 10 тыс. и 1 тыс. м.кл. в 1 мл
возбудитель может быть обнаружен, но его выявление не носит
закономерного характера. РИФ позволяет обнаружить туляремийные
бактерии при отрицательном результате световой бактериоскопии.
Объектами исследования в РИФ могут служить бактериальные взвеси,
отпечатки органов и тканей животных, гомогенаты органов животных,
беспозвоночных переносчиков. Метод используют для выявления
возбудителя в органах павших и убитых биопробных животных, в
трупах диких животных, органах отловленных диких животных. Метод
прост в постановке, не имеет себе равного в быстроте получаемого
ответа (1,5-2 часа) и рекомендуется для ускоренного выявления и
идентификации возбудителя туляремии. При приготовлении препаратов
для РИФ на обезжиренном предметном стекле делают мазки-отпечатки
из лимфатического узла, селезенки, печени, легкого или гомогенатов
исследуемых органов. В последнем случае используют суспензию,
приготовленную для биологической пробы или серологического
исследования, делая по возможности тонкий мазок. Дальнейшие
процедуры постановки РИФ и учета ее результатов подробно описаны в
приложении 4 настоящего документа.
1.3. ПОСЕВ НА ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ. Посев на питательные среды
применяют для выделения культуры возбудителя туляремии из органов
павших или забитых диких животных, павших или убитых лабораторных
животных, а также зверьков, у которых обнаружены
патологоанатомические изменения, характерные для туляремии.
Иксодовых клещей, воду, почву, смывы с объектов внешней среды не
исследуют посевом ввиду их загрязнения посторонней микрофлорой.
Возбудитель туляремии не растет на обычных питательных средах
(мясо-пептонном агаре и бульоне), что служит одним из признаков
при идентификации культуры. Наиболее практичной и обычно
применяемой средой для выделения и культивирования туляремийного
микроба является свернутая желточная среда.
Посевы могут быть произведены методом отпечатков кусочками
органа или путем тщательного втирания кусочка органа по всей
поверхности среды. При обильном засеве рост туляремийных бактерий
на свернутой желточной среде появляется в виде сплошного роста уже
через 18-24 часа инкубирования при 37°С ; при засеве малым
количеством бактерий отдельные колонии становятся заметными на 3-5
сутки и позднее. Посевы следует выдерживать в термостате до 10-12
суток. По внешнему виду рост туляремийных бактерий на свернутой
желточной среде хорошо отличается от большинства других бактерий,
имеет вид извилистого, слегка блестящего (не сухого), почти
бесцветного нежного налета.
Для выделения и культивирования туляремийного микроба
используют также агаровую среду с добавлением желтка. Среда
готовится на основе сухого питательного агара Иркутского НИПЧИ: на
100 мл стерильного, расплавленного и охлажденного до 45°С агара
добавляют 5 мл куриного желтка с физиологическим раствором (в
соотношении 3:2).
Для культивирования туляремийных бактерий применяются
различные варианты агаровых сред на рыбных, мясных, дрожжевых
основах с обязательным добавлением цистина (цистеина) 0,1%;
глюкозы 1%; дрожжевого экстракта (источник витамина В).
Чувствительность указанных агаровых сред можно повысить
добавлением дефибринированной кроличьей или лошадиной крови
(5-10%).
Разработаны и используются на практике питательные сухие
агаровые среды для культивирования и выделения туляремийного
микроба, содержащие все необходимые факторы роста и не требующие
добавления крови (или желтка). Примером является FT агар,
выпускаемый Государственным Научным Центром прикладной
микробиологии.
На свежей агаровой среде приживаются единичные бактерии, при
этом формируются колонии, которые становятся заметными через 2-3
суток инкубации, редко - в более отдаленные сроки. Посевы следует
выдерживать при 37°С до 10-12 суток. При посеве взвеси из
растертых тканей животного высокоэффективные агаровые среды
позволяют обнаруживать единичные бактерии и не уступают
биологической пробе. При исследовании трупов животных в первую
очередь производят посев из селезенки, печени, лимфатического
узла. При посеве из недостаточно свежих органов животных полезно
использовать селективные добавки (СД). В качестве СД можно
применять пенициллин (100 ед/мл), ампициллин (100 ед/мл),
полимиксин (50-100 мкг/мл), кефзол (или цефалексин), амфотерицин В
(или амфоглюкамин), ристомицин - сульфат и некоторые другие.
СВЕРНУТАЯ ЖЕЛТОЧНАЯ СРЕДА МАККОЯ. Среду готовят из желтков
куриных яиц, которые тщательно моют, протирают спиртом, обжигают
на пламени горелки, разбивают, сливают желтки, отделяя их от
белка, в стерильный градуированный сосуд, смешивают с
физиологическим раствором (рН 7,0-7,2) в соотношении :60% желтка и
40% физиологического раствора. Жидкую среду разливают в пробирки
по 4-5 мл и помещают в аппарат для свертывания сывороток при
наклонном положении пробирок, чем достигают скашивания среды.
Свертывание среды производят при 80°С в течение 1 часа. Среду
сохраняют при 4-6°С, предохраняя от высыхания. Правильно
приготовленная среда должна иметь на дне пробирки конденсационную
жидкость. Приготовленную среду можно использовать в течение 1
месяца.
КРОВЯНАЯ СРЕДА ЕМЕЛЬЯНОВОЙ. Среду готовят на рыбно-дрожжевом
гидролизате. К 100 мл дистиллированной воды добавляют 20 мл
гидролизата свежей рыбы, 10 мл гидролизата желатины, 2,5 мл
аутолизата дрожжей, 0,5 г хлорида натрия, 1 г глюкозы, 0,1 г
цистина (цистеина), 1,5-2,5 г агара (в зависимости от его
качества); рН среды 7,0-7,2. После стерилизации в расплавленную и
охлажденную до 45°С среду добавляют 10 мл свежей кроличьей или
лошадиной дефибринированной крови, разливают в пробирки (или
чашки) и скашивают. Правильно приготовленная кровяная среда
хранится при 4-6°С в течение 1 месяца. Однако в процессе хранения
чувствительность среды постепенно снижается. При необходимости в
среду одновременно с кровью добавляют селективные добавки (СД).
FT АГАР. Питательная среда выпускается в виде комплекта,
состоящего из рыбно-солевого агара (РСА), глюкозо-витаминной
добавки (ГВД) и селективной добавки (СД). Состав и способ
приготовления среды полностью описаны в инструкции по применению
FT агара, прилагаемой к комплекту.
1.4. БИОЛОГИЧЕСКАЯ ПРОБА. Биологическая проба является самым
эффективным способом обнаружения туляремийных бактерий в любом
исследуемом материале. Биологическим методом можно исследовать
органы павших или убитых диких млекопитающих, кровососущих
членистоногих, гидробионтов, воду, смывы с различных субстратов,
т.е. материалы, где могут содержаться живые туляремийные бактерии.
Для биологической пробы обычно используют белых мышей, которые
заболевают и гибнут от туляремии при подкожном введении суспензии,
содержащей единичные бактерии. При массивном инфицировании
исследуемых объектов мыши погибают уже на 3-4 сутки; при меньшей
обсемененности материала гибель животных может затянуться до 7-9
суток, иногда до 15-20 суток. В большинстве случаев животные
погибают от туляремии с характерными патологоанатомическими
изменениями: обнаруживаются воспалительные изменения ткани на
месте заражения (плотный инфильтрат), увеличение, уплотнение и
гиперемия лимфатических узлов, особенно близлежащих к месту
заражения, резкая гиперемия сосудов подкожной клетчатки,
уплотнение и увеличение селезенки, печени, увеличение и гиперемия
надпочечников, гиперемия тонкого кишечника. В мазках-отпечатках из
селезенки, печени и крови (при окраске по Романовскому-Гимзе или
путем люминесцентной микроскопии) обнаруживают большое количество
туляремийных бактерий, а в посеве на специальные питательные среды
селезенки и печени уже через 18-24 часа появляется рост культуры
возбудителя туляремии. Для биологической пробы могут быть
использованы и морские свинки, обладающие такой же высокой
чувствительностью к туляремии, как и белые мыши, а также дикие
грызуны 1-ой группы (обыкновенные полевки, домовые мыши),
отловленные на неэпизоотических территориях и выдержанные в
карантине 30 суток. Биопробных животных содержат поодиночке. При
гибели биопробных животных или обнаружении у забитых характерных
для туляремии патологоанатомических изменений осуществляют
следующий пассаж через белую мышь (подкожным или накожным
методами).Биопробных животных выдерживают: белых мышей до 21
суток, морских свинок - до 25 суток, после чего забивают.
1.5. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ТУЛЯРЕМИИ. Идентификацию
осуществляют на основании совокупности следующих признаков: 1)
морфологии и окраски бактерий в мазках и специфического свечения в
РИФ; 2) характера роста на питательных средах; 3) отсутствия роста
на простых питательных средах; 4) агглютинации специфической
туляремийной сывороткой; 5) патогенности для белых мышей и морских
свинок.
Выделенная культура должна иметь характерный для микроба
туляремии рост на свернутой желточной среде в виде извилистого,
слегка блестящего (не сухого) почти бесцветного налета не очень
сильно выраженной слизистой консистенции, хорошо снимающегося
петлей. Культура легко суспендируется. Для изучения морфологии и
тинкториальных свойств готовят мазок на предметном стекле, который
фиксируют и окрашивают по Граму. В мазке возбудитель туляремии
представляет собой мелкую, грамотрицательную коккобактерию. В
окрашенных мазках из культуры с плотной среды обнаруживается
обильная слизь. Присутствие в мазке окрашенной слизи весьма
характерно для возбудителя туляремии. Для проверки отсутствия
роста на простых питательных средах используют слабощелочной
питательный агар и бульон.
Антигенную специфичность выделенной культуры проверяют с
помощью реакции агглютинации с лошадиной (коммерческой)
агглютинирующей сывороткой. Для этого испытуемую культуру
выращивают в течение 2-х суток при 37°С на свернутой желточной
среде в количестве 2-3 пробирок. Чистоту посева контролируют
бактериоскопией. Реакцию агглютинации (РА) ставят общепринятым
способом в пробирках. В качестве антигена используют живую
испытуемую культуру, суспендированную в физиологическом растворе
(рН 7,0-7,2) до концентрации 10 (в степени 9) м.кл./мл по
оптическому стандарту мутности, соответствующей 10 единицам. После
добавления антигена к разведениям сыворотки пробирки выдерживают 2
часа при 37°С, затем 12-18 часов при комнатной температуре, после
чего проводят учет результатов. Культура должна агглютинироваться
до титра или 2/3 титра сыворотки. При этом должна иметь место
четкая реакция, сопровождающаяся полным просветлением жидкости и
выпадением на дно пробирки плотного агглютината. При встряхивании
пробирки аггютинат разбивается на крупные хлопья, а жидкость
остается прозрачной. Специфичность выделенной культуры может быть
подтверждена также с помощью РИФ. При обработке культуры
туляремийной люминесцирующей сывороткой обнаруживают специфическое
яркое зелено-желтое свечение бактерий.
Желательна проверка вирулентности выделенных культур, но не
позднее месячного срока после их выделения. Определение
вирулентности проводят, как правило, на одном из двух видов
животных (белые мыши или морские свинки). Взвесь исследуемой
культуры готовят на физиологическом растворе (рН 7,0-7,2) с
содержанием 10 (в степени 9) м.кл/мл по оптическому стандарту
мутности, которую затем титруют путем 10-кратных разведений от 10
(в степени -1) до 10 (в степени -9) от исходной взвеси. Для
заражения используют 2 дозы: 10 (в степени -9) (1 м.кл.) и 10 (в
степени -8) (10 м.кл.) по 2-3 животных на каждую дозу.
Свежевыделенные туляремийные культуры при подкожном введении
вызывают гибель белых мышей (морских свинок) при дозе 1 м.кл. с
обнаружением характерных для туляремии изменений в органах и
выделением чистой культуры.
На территории Российской Федерации циркулируют и выделяются
культуры голарктического подвида возбудителя туляремии F.
tularensis subspecies holarctica, различающиеся по
чувствительности к эритромицину (и другим макролидам). Для
определения этого свойства используют диски с эритромицином,
содержащими 15 мкг антибиотика. Эта концентрация антибиотика
позволяет дифференцировать штаммы туляремийного микроба на два
биологических варианта: биовар 1 Егу(s) и биовар П Еrу(r). Для
определения принадлежности к тому или иному биовару готовят
суспензию испытуемой культуры в концентрации 10 (в степени 9)
м.кл./мл по оптическому стандарту мутности. 0,5 мл такой суспензии
вносят на чашку с агаровой средой, равномерно распределяя по
поверхности, после чего накладывают в центральную часть чашки диск
с эритромицином. Чашку помещают в термостат при 37°С. Учет и
оценку результатов производят через 1 - 2 суток. При посеве
чувствительной к эритромицину культуры вокруг диска с антибиотиком
обнаруживают выраженную зону задержки роста диаметром 2-3 см; при
посеве культуры, резистентной к эритромицину, по всей поверхности
чашки отмечается равномерный рост.
Возбудитель туляремии - грамотрицательные, неспорообразующие
мелкие коккобактерии, не способные расти на простых питательных
средах, обладают слабой ферментативной активностью (способны
утилизировать до кислоты немногие углеводы и спирты на специальных
средах), патогенные для теплокровных животных с приуроченностью
размножения главным образом в паренхиматозных органах и
способностью вызывать у чувствительных животных геморрагическую
септицемию.
2. СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. В настоящее время в
практике эпизоотологического обследования находят все большее
применение серологические методы, предназначенные для обнаружения
туляремийного антигена и антител к нему. Значительно расширился
круг объектов исследования. Возможность исследования материала, не
пригодного для бактериологического исследования, делает
серологические методы в ряде случаев основным методическим
приемом, позволяющим выявить туляремийные эпизоотии.
2.1.СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ТУЛЯРЕМИЙНЫХ АНТИТЕЛ.
Наиболее эффективными и доступными методами выявления антител
являются реакция агглютинации (РА) и реакция пассивной
гемагглютинации (РПГА). Титры антител у переболевших диких
животных колеблются в пределах 1:10 - 1:320, редко выше, в
зависимости от давности заболевания. У сельскохозяйственных
животных они могут достигать 1:320 - 1:640, но чаще бывают
низкими. Для выявления антител у животных могут быть использованы
сыворотка, плазма или "смывы" из грудной полости. Наличие антител
у животных указывает на контакт животного с возбудителем туляремии
и наличие эпизоотии. Техника постановки серологических реакций, их
учет и анализ результатов подробно представлен в приложении 4
настоящего документа.
2.2.СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ТУЛЯРЕМИЙНОГО АНТИГЕНА.
Все найденные трупы грызунов подлежат обязательному
серологическому исследованию на наличие туляремийного антигена
параллельно с бактериологическим исследованием, включая
люминесцентную микроскопию. Серологические методы особенно
эффективны при поисках антигена в ПП, ПХМ, субстратах гнезд и
других объектов внешней среды.
2.2.1. ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛА К ИССЛЕДОВАНИЮ. При исследовании
трупов диких или лабораторных животных готовят суспензию из
кусочков органов животных (селезенка, печень) путем растирания их
в ступке с добавлением физиологического раствора из расчета 1:5
или 1:10. Полученную суспензию прогревают на кипящей водяной бане
10-15 мин, фильтруют (лучше через асбестовую вату) для получения
относительно прозрачного фильтрата. Можно использовать остатки
суспензии из органов, приготовленных для постановки биологической
пробы.
Для исследования субстрата гнезда грызунов желательно брать
его целиком вместе с прилегающими слоями почвы. Материал заливают
физиологическим раствором с избытком (примерно 10 мл). Через 1-6
часов надосадочную жидкость отсасывают, прогревают на кипящей
водяной бане 10-15 мин, фильтруют и используют в серологических
реакциях.
Для серологического исследования бактериальной культуры
последнюю выращивают 2 суток при 37°С на желточной или агаровой
среде, готовят взвесь на физиологическом растворе (рН 7,0-7,2) с
концентрацией 10 (в степени 9) м.кл./мл по оптическому стандарту
мутности, обеззараживают прогреванием 10-15 мин на кипящей водяной
бане. Взвесь разводят в 10 раз до концентрации 100 млн м.кл./мл,
которую используют в серологических реакциях.
Наиболее эффективной и специфичной серологической реакцией для
выявления туляремийного антигена при исследовании органов
животных, ПП, ПХМ, субстрата гнезд, почвы и т.п. является реакция
нейтрализации (РНАт) с туляремийным эритроцитарным диагностикумом.
При исследовании некоторых объектов (бактериальные суспензии,
органы животных и др.) помимо РНАт можно применять
иммуноферментный анализ (ИФА), реакцию объемной агломерации (РОА),
реакцию коагглютинации (РК) и некоторые другие методы, с успехом
используемые в отдельных регионах и учреждениях.
2.2.2. РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ АНТИТЕЛ (РНАт). Этот метод
является универсальным для выявления туляремийного антигена в
любом исследуемом материале. РНАт может обнаруживать 1-2 млн
туляремийных бактерий и служит простым дополнительным методом
идентификации выделенной культуры. РНАт - трехкомпонентная
серологическая реакция, механизм которой состоит в специфической
нейтрализации вводимых в реакцию туляремийных антител антигеном,
содержащимся в исследуемом материале В РНАт используют
туляремийный антигенный эритроцитарный диагностикум.
ТЕХНИКА ПОСТАНОВКИ И УЧЕТ РНАт. Первоначально проводят
ориентировочное исследование материала в 3-4 разведениях. Для
этого в лунки полистироловой пластины наливают по 0,25 мл
разводящей жидкости (1%-ный раствор нормальной кроличьей сыворотки
на физиологическом растворе рН 7,0- 7,2, предварительно
инактивированной при 56°С 30 мин). Затем в первую лунку вносят
0,25 мл исследуемого материала и титруют переносом по 0,25 мл. Из
последней лунки лишние 0,25 мл выливают. После этого во все лунки
добавляют по 0,25 мл раствора туляремийной агглютинирующей
сыворотки, содержащей 2 гемагглютинирующие единицы (2ГЕ)
сыворотки.
Для определения гемагглютинирующей единицы (ГЕ) сыворотки в 6
лунок полистироловой пластины наливают по 0,5 мл разводящей
жидкости. В первую лунку добавляют 0,5 мл туляремийной сыворотки в
разведении 1:10000 (сыворотку предварительно инактивируют при 56°С
30 мин) и титруют переносом из одной лунки в другую по 0,5 мл.
Получают ряд разведений сыворотки 1:20000; 1:40000; 1000 и т.д.
Затем во все лунки добавляют по 1 капле (0,05мл) антигенного
диагностикума 2,5%-ной концентрации. Результаты учитывают через
2-3 часа. Разведение сыворотки в последней лунке с отчетливой
агглютинацией эритроцитов соответствует 1 ГЕ. Для РНАт сыворотку
берут в 4-х кратной концентрации, принимая во внимание, что в
лунки добавляют по 0,25 мл, т.е. именно в данном объеме должны
содержаться 2ГЕ. Например, если 1ГЕ составляет 1000 (в объеме
0,5 мл), то 2ГЕ = 1:40000, а поскольку в РНАт сыворотку добавляют
в объеме 0,25 мл, то применительно к данному примеру для
постановки реакции следует использовать сыворотку в разведении
1:20000.
Смесь исследуемого материала и сыворотки оставляют на 1-1,5
часа при комнатной температуре. Затем во все лунки добавляют по
одной капле (0,05 мл) антигенного эритроцитарного диагностикума
2,5%-ной концентрации. Пластину встряхивают и оставляют на ровной
поверхности стола. Учет производят через 2-3 часа.
Если в исследуемом материале содержится антиген туляремийного
микроба, то он нейтрализует сыворотку и эритроциты не
агглютинируются, а образуют на дне лунки маленькое колечко с
ровными краями. Результат реакции в таких лунках отмечается как
положительный, а в протоколах отмечают знаком (-). При отсутствии
в исследуемом материале туляремийного антигена наблюдается
агглютинация эритроцитов во всех лунках. Результат отмечают как
отрицательный, а в протоколах обозначают знаком (+). В каждом
опыте должен быть контроль количества ГЕ.
Пробы, в которых в предварительном опыте был обнаружен
антиген, отбирают и реакцию повторяют в развернутом опыте (на 6-10
лунок) для определения точного титра реакции. За титр реакции
принимают последнее разведение исследуемого материала, вызывающее
полное подавление агглютинации эритроцитов. Окончательный опыт
дополняют следующими контролями: 1) 0,25мл исследуемой пробы +
0,25 мл разводящей жидкости + 1 капля диагностикума; 2) 0,5 мл
разводящей жидкости + 1 капля диагностикума. В обоих случаях
агглютинация эритроцитов должна отсутствовать.
При небольшом количестве материала целесообразно ставить РНАт
в микрообъемах, используя микротитратор типа Такачи или
круглодонные микропланшеты с микропипетками. Чувствительность
реакции при этом существенно не меняется. Техника постановки,
последовательность всех манипуляций, учет и оценка результатов, а
также соответствующие контроли такие же, как и при постановке РНАт
в макрообъемах. Более подробно описание техники постановки реакций
в микрообъемах см. в приложении 4.
При массовых исследованиях ПП, ПХМ, других объектов внешней
среды за диагностический титр принимают разведение фильтрата 1:20
и выше. Реакции в более низких титрах расценивают как
сомнительные.
2.2.3. ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ НА ТВЕРДОФАЗНОМ НОСИТЕЛЕ (ИФА).
Метод используется для выявления туляремийного антигена в
различных объектах: органы животных, ПП, ПХМ, другие объекты
внешней среды, а также для идентификации выделенных культур
возбудителя туляремии. Метод характеризуется высокой
чувствительностью, специфичностью, возможностью количественной и
автоматизированной оценки результатов, воспроизводимостью и
стандартностью основных ингредиентов анализа. С помощью ИФА
возможно обнаружение 10 (в степени 4) -5.10 (в степени 4)
туляремийных бактерий в 1 мл или 1-5 нг/мл туляремийного антигена.
Для постановки ИФА используют диагностическую иммуноферментную
тест-систему для определения туляремийного антигена. В
соответствии с назначением тест-система представляет собой набор
ингредиентов для проведения ИФА и включает в себя: иммуноглобулины
|
