|
Стр. 3
дифференцированно оценивать пороги эмоциональных поведенческих
реакций страха и ярости (агрессивности) у мышей путем градуального
повышения напряжения электрической площадки, на которую помещают
2-х животных. Изучаемую БАД вводят за 40 мин. до посадки животных
на электрическую площадку (Полевой, 1967, 1970).
Изучение иммуномодулирующего действия
БАД-парафармацевтиков
Общие положения
Во всех случаях развития адаптивных реакций происходит
активация иммунной системы как конкретного звена управляющей части
функциональной системы, ответственной за адаптацию. В основе
иммуноадаптивных процессов лежат межклеточные взаимодействия,
опосредованные гуморальными факторами. Полипептидные факторы
неиммуноглобулиновой природы, относящиеся к медиаторам
неиммунологических реакций, получили название цитокинов. Подобно
регуляторным субстанциям другой природы и гормонам цитокины по
характеру действия представляют собой факторы роста или
дифференцирования клеток и реализуют свое действие через обычные
для подобных факторов механизмы. Основными цитокинами, включающими
группу приспособительных реакций функциональной системы, являются
медиаторы естественного иммунитета, которые, действуя на клетки -
мишени разных органов, изменяют их функции. В результате
выявляются следующие эффекты:
- в печени происходит усиление синтеза белков острой фазы
(C-реактивный белок, гаптоглобин, церулоплазмин и т.д.) и их
выделение в кровь;
- в костном мозге стимулируется развитие нейтрофилов, что
приводит к нейтрофилии. Усиливается их хемотаксис и активируется
образование этими клетками лактоферрина;
- активируются центры терморегуляции в гипоталамусе (действие
в качестве эндогенных пирогенов);
- стимулируется катаболизм белков в мышцах. Образующиеся
аминокислоты поступают в печень, где они используются для синтеза
белков острой фазы и глюконеогенеза (135).
Типичным представителем группы медиаторов естественного
иммунитета, которые непосредственно участвуют в развитии иммунной
реакции на действие раздражителя, является фактор некроза опухоли
- ( ) (ФНО-).
ФНО - является медиатором широкого спектра действия,
посредством которого осуществляется регуляция функциональной
активности клеток иммунной и воспалительной системы организма.
Биологическое действие ФНО-, подобно влиянию ЛПС, определяется его
концентрационной зависимостью. В низкой концентрации порядка
-9
10 М действует на лейкоциты и клетки эндотелия локально, т.е.
по паракринному или аутокринному типу. В результате ФНО- вызывает
на клетках эндотелия сосудов появление новых рецепторов адгезии
лейкоцитов, прежде всего нейтрофилов, а затем и моноцитов и
лимфоцитов. Усиление адгезии клеток на сосудистых стенках вызывает
появление очагов локального воспаления. В пределах данных очагов
лейкоциты усиливают бактериальный киллинг, а действие ФНО- на
мононуклеарные фагоциты и другие типы клеток активирует продукцию
цитокинов, включая ИЛ-1, ИЛ-6, хемокинов и самого ФНО-. Таким
образом, возникает каскад цитокиновых реакций, регулирующий
активность локального иммунного и воспалительного процесса. Кроме
того, ФНО- обладает интерфероно - подобным действием, усиливает
экспрессию антигенов 1 класса МНС и цитолитическую активность
Т-лимфоцитов (CD8+) в отношении вирус - инфицированных клеток
(144, 145, 146).
Другая группа медиаторов включает цитокины, регулирующие
активацию, рост и дифференцирование лимфоцитов. Среди них наиболее
важным и хорошо изученным медиатором является интерлейкин-2
(ИЛ-2).
ИЛ-2 является ключевым цитокином, активирующим митотическую
активность и переход клетки из фазы G1 в фазу S. Основное
количество ИЛ-2 продуцируется Т-лимфоцитами CD-4+, и гораздо
меньший вклад для образования медиатора имеют Т-лимфоциты CD-8+.
Основными клетками - мишенями ИЛ-2 являются сами клетки -
продуценты, то есть данный медиатор выполняет роль аутокринного
фактора активации и созревания Т-лимфоцитов. Регуляция роста и
созревания Т-лимфоцитов, прежде всего хелперных
(C-D4+)-лимфоцитов, включает механизм последовательного
взаимодействия ИЛ-2 с рецепторами разной аффинности. Созревание
покоящихся Т-лимфоцитов ограничено действием высокой концентрации
ИЛ-2, а пролиферация активированных лимфоцитов - диапазоном его
низких концентраций.
Указанные взаимодействия ИЛ-2 и Т-лимфоцитов осуществляются
преимущественно по аутокринному типу. Однако ИЛ-2 может оказывать
действие и на клетки ближайшего окружения, выполняя функции
паракринного ростового фактора CD-4+ и CD-8+ Т-лимфоцитов. В
период развития физиологической иммунной реакции на антиген ИЛ-2
не поступает в кровяное русло. Поэтому при нормальном течении
иммунного ответа его действие как эндокринного ростового фактора
не проявляется. Локальная продукция ИЛ-2 в зоне созревания CD-4+ и
CD-8+ клеток позволяет регулировать количество и соотношение
субпопуляций Т-лимфоцитов, определяя тем самым величину иммунного
ответа на Т-зависимые антигены. Кроме того, ИЛ-2 стимулирует
B-лимфоциты и усиливает продукцию специфических антител (5, 6, 14,
21).
Таким образом, в механизмах адаптационных изменений иммунного
статуса организма ведущая роль принадлежит продукции таких
медиаторов иммуногенеза, как ФНО- и ИЛ-2. В этой связи влияние БАД
к пище на иммунную систему следует оценивать по изменению уровня
продукции иммунокомпетентными клетками вышеупомянутых цитокинов.
Методы оценки действия БАД к пище
на показатели иммунной системы
При оценке специфической активности БАД в отношении
показателей иммунной системы необходимо исследовать ее действие не
только на уровень секретируемых иммунокомпетентными клетками
растворимых медиаторов иммуногенеза, но и исследовать следствия
изменения продукции цитокинов, т.е. изучать клеточный и
гуморальный ответ. Комплексное иммунологическое исследование
необходимо для решения вопроса о сохранении функциональной
полноценности иммунной системы после применения БАД.
Как известно, одним из важнейших условий формирования
иммунного ответа является пролиферация антиген - стимулированных
иммунокомпетентных клеток под действием медиаторов иммуногенеза, в
частности ИЛ-2. Моделью такой пролиферации является реакция
бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) под воздействием митогенов.
Митогены, конканавалин А (Кон А) или фитогемагглютинин ФГА,
связываясь с рецептором клеточной поверхности, приводят к
продукции ИЛ-1 и ФНО-, способствующих усилению экспрессии
рецептора для ИЛ-2 - основного фактора пролиферации Т-лимфоцитов.
Кроме того, ИЛ-2 стимулирует B-лимфоциты и усиливает продукцию
специфических антител. Наиболее распространенный экспериментальный
подход изучения гуморального иммунитета заключается в инициации
процесса антигензависимой пролиферации и дифференцирования
B-лимфоцитов, являющихся предшественниками антителообразующих
клеток.
Для статистической обработки данных следует использовать
критерий t Стьюдента, представляя среднюю ошибку и ошибку средней
(М + m) (147).
1. Оценка влияния БАД на показатели иммунной
системы интактных мышей
а. Определение влияния БАД на неспецифическую резистентность
мышей к бактериальной инфекции.
Мышам вводят перорально и внутривенно БАД в трех дозах.
Контролем служат мыши, не получавшие БАД. На каждую дозу берут по
10 мышей. Через 24 ч всех мышей внутрибрюшинно заражают штаммом
S.tiphi 4446, ресуспендированным в 0,5%-ном муцине или используют
любую другую инфекционную модель. Заражающая доза равна 100 LD50,
оттитрованная на интактных мышах предварительно. Гибель животных
учитывается в течение 5 сут. Параллельно ставят контроль
вирулентности используемого штамма. Через 5 сут. подсчитывают
ЕД-50 по формуле Кебера (Ашмарин И.Л., Воробьев А.А., 1962) или
любым другим статистическим методом.
Статистически значимое уменьшение значения ЕД-50 в опытных
группах свидетельствует о стимулирующем действии БАД, увеличение -
о супрессивном.
б. Определение уровня антител в сыворотке крови мышей к
корпускулярному тимусзависимому антигену.
Для определение антител в сыворотке крови мышей используют
эритроциты барана. Иммунизируют мышей 2-х линий: С57В1 -
низкореагирующие на эритроциты барана и мышей линии СВА -
высокореагирующие. Опытную группу мышей (5 мышей) внутрибрюшинно
иммунизируют 0,5 мл эритроцитами барана (концентрация 20 млн.
кл/мл). Эритроциты барана предварительно 3 раза отмывают 0,9%-ным
раствором хлорида натрия путем центрифугирования 7 мин. при 400 g
и доводят до концентрации 50 млн. кл/мл. Одновременно этой же
группе животных вводят исследуемую добавку к пище в трех дозах.
Контролем служат две группы мышей: одна группа - интактные мыши,
другая - иммунизирована только эритроцитами барана. Через равные
промежутки времени, начиная с 4-го дня после введения препаратов,
у каждой мыши берут кровь из ретроорбитального пространства. Срок
исследования - не менее 21 дня. Из крови мышей получают сыворотку,
которую титруют в реакции прямой гемагглютинации общепринятым
методом.
Подсчитывают среднеарифметическую титра гемагглютиногенов в
сыворотке крови опытной группы мышей. Увеличение титров
гемагглютиногенов в сыворотке крови опытной группы мышей
свидетельствует о стимулирующем действии БАД.
в. Определение уровня антител в сыворотке крови мышей к
растворимому тимусзависимому антигену.
В качестве растворимого тимусзависимого антигена используют
бычий сывороточный альбумин (БСА).
Мышей иммунизируют БСА дозой 50 мкг в 0,5 мл 0,9%-ного
раствора хлорида натрия внутрибрюшинно. Исследуемые продукты
вводят в трех дозах одновременно с БСА или за 30 мин. до
иммунизации БСА. Контролем служат две группы мышей: одна группа
получает только БСА (без БАД), другая - интактная.
На 28 день после иммунизации проводится ревакцинация мышей той
же дозой БСА и берется кровь у мышей на 7, 14 и 21 дни после
ревакцинации. Получают сыворотку крови и исследуют ее в реакции
РПГА на наличие гемагглютининов к БСА общепринятым методом.
Для постановки РПГА готовят эритроцитарный диагностикум.
Формалинизированные эритроциты в 50%-ной концентрации трехкратно
отмывают 0,9%-ным физиологическим раствором центрифугированием при
400 g 10 мин. После чего концентрация эритроцитов доводится до
2,5%.
На 1000 мл диагностикума берется 50 мг танина, 2 л буфера pH
7,2 (фосфатного), все смешивается и энергично встряхивается 10
мин. После чего производится осаждение и двукратное отмывание
эритроцитов на центрифуге при том же режиме. Ресуспензируют
фосфатным буфером (pH 6,4) до 1 л. Затем на 1000 мл эритроцитов
(2,5%) добавляют 250 мг БСА, перемешивают и помещают в термостат
на 24 ч при 37 -C, перемешивают не менее 5 раз. После
инкубирования добавляют 10 мл формалина, перемешивают и помещают в
термостат на 30 мин. После этой процедуры отмывают физиологическим
раствором (pH 7,2) два раза, затем ресуспензируют буфером pH 7,2 с
добавлением формалина так, чтобы в конечном продукте содержалось
2,5% эритроцитов и 1% формалина. Для постановки реакции
обязательно применяется 0,9%-ный физиологический раствор,
содержащий 1% формалина.
Подсчитывают среднеарифметическую титра гемагглютиногенов в
группе и определяют их разницу по критерию Стьюдента.
Увеличение титров антител в опытных группах свидетельствует о
стимулирующем действии их проявления вторичного иммунного ответа
БАД.
г. Определение поликлональной активности B-лимфоцитов.
Активность B-лимфоцитов определяется на модели подсчета
спонтанных "фоновых" клеток селезенки мышей, продуцирующих
антитела к эритроцитам барана (АОК) методом локального гемолиза
эритроцитов в геле. Опытной группе мышей двух линий (по три мыши)
вводят БАД. На 5 - 7 день мышей забивают, извлекают селезенки и
готовят взвесь спленоцитов (концентрация 100 млн. кл/мл).
Эритроциты барана отмывают 0,9%-ным раствором хлорида натрия путем
центрифугирования 7 мин. при 400 g три раза. Приготавливают
0,9%-ный раствор агара "Дифко" с раствором Хенкса, доводят pH
раствора до 7,2 1%-ным раствором КН РО или NaOH по цвету
индикатора, находящегося в растворе Хенкса. Для приготовления 10
чашек Петри необходимо 225 мг агара, 22,5 мл дистиллированной воды
и 2,5 мл раствора Хенкса. К приготовленному раствору агара
добавляют отмытые эритроциты барана из расчета получаемой
концентрации эритроцитов 20 - 30 млн. в 1 мл.
Полученную рабочую смесь разливают по 2,5 мл в пробирки,
которые помещают в водяную баню при температуре 43 - 44 -C. В
каждую пробирку добавляют по 0,2 мл взвеси исследуемых клеток
селезенки, перемешивают и выливают на чашку Петри. Через 5 - 7
мин. чашки помещают в термостат при температуре (37 +/- 2) -C на 1
ч, затем в каждую чашку выливают по 2,5 мл разведенного в 5 раз
средой 199 сухого комплемента морской свинки (при использовании
свежезамороженного комплемента его разводят в 10 раз). Чашки Петри
оставляют при комнатной температуре на 30 мин. и затем
подсчитывают макроскопически число зон гемолиза в каждой чашке
Петри. Рассчитывают число клеток, образующих антитела на селезенку
и на 1 млн. ядросодержащих клеток селезенки.
Полученные результаты в опытных группах сравнивают с контролем
(группа мышей, не получавшая БАД). Увеличение количества АОК после
введения БАД свидетельствует о поликлональной активности
B-лимфоцитов.
д. Определение гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к
эритроцитам барана.
Мышей одного веса, одной линии разделяют на 2 группы. Опытной
группе мышей вводят подкожно в межлопаточную область эритроциты
барана в дозе 10 млн. клеток на одну мышь в объеме 0,1 мл.
Одновременно "per os" этим же мышам вводят БАД. Вторая группа
мышей - интактная. На 5 день всем мышам обеих групп в подушечку
одной задней лапки вводят разрешающую дозу эритроцитов барана в
концентрации 1 млрд. кл/мышь в объеме 0,02 мл. В контрлатеральную
подушечку лапки в том же объеме - 0,9%-ный раствор хлорида натрия.
Местную воспалительную реакцию оценивают через 18 - 20 ч путем
определения веса опытной (Ро) и контрольной (Рк) лапок мышей.
Забивают мышей хлороформом. Отделяют лапки по выступу кости ниже
сочленения большеберцовой кости и выше пяточного сустава.
Интенсивность местной реакции определяют по индексу реакции
(ИР), рассчитываемому по формуле:
ИР = (Ро - Рк) : Рк x 100%.
Препарат, влияющий на клеточное звено иммунитета, вызывает
изменение индекса реакции.
е. Определение фагоцитарной активности макрофагов под влиянием
БАД.
Опытной группе (3 - 5 мышей) вводят БАД в дозе, оптимальной
для человека. Контролем служат интактные животные. От забитых
животных получают перитонеальный эксудат (ПЭ) путем 2 - 3-кратного
промывания брюшной полости мышей средой 199, содержащей 5 ME
гепарина в 1 мл. ПЭ собирают в центрифужные пробирки, стоящие на
льду. После центрифугирования ПЭ при 150 g в течение 10 мин.
клетки ресуспендируют в среде 199 с 10%-ной сывороткой крупного
рогатого скота и антибиотиками (100 ед. в мл). Концентрацию клеток
доводят до 2 млн. кл/мл и разливают по 2 мл в чашки Петри
диаметром 40 мм. Чашки помещают в термостат с содержанием 5%
углекислого газа. Через 1 ч смывают неприлипшие клетки раствором
Хенкса, добавляют 2 мл среды 199 и помещают в термостат с
углекислым газом на 18 - 24 ч.
Объектом фагоцитоза могут служить эритроциты барана,
лабораторные штаммы Staphilococcus или любые другие
микроорганизмы.
Суточные культуры живых или убитых прогреванием при
температуре (90 +/- 2) -C микроорганизмов отмывают не менее трех
раз 0,9%-ным раствором хлорида натрия. Определяют концентрацию
суспензии микробных клеток по стандарту оптической плотности.
Суспензию клеток разводят средой 199 до концентрации 10 - 20 млрд.
кл/мл.
Эритроциты барана отмывают 3-кратно 0,9%-ным раствором хлорида
натрия центрифугированием при 800 g 5 мин. и готовят 0,5%-ную
взвесь эритроцитов в среде 199. Наливают 1 мл среды 199 в чашки
Петри с клетками ПЭ, затем вносят 1 мл взвеси эритроцитов барана
или микроорганизмов. Через 30 - 60 мин. в чашки Петри наливают
холодный раствор Хенкса и тут же выливают, высушивают и фиксируют
клетки метанолом. Затем клетки окрашивают азур - эозином по
Романовскому - Гимзе.
При учете результатов необходимо просмотреть под микроскопом
не менее 200 клеток, подсчитывают фагоцитирующие клетки и
количество эритроцитов или микробов в одном макрофаге.
Подсчитывают процент фагоцитирующих клеток и фагоцитарное
число.
Результаты, полученные в опытной группе, сравнивают с
контролем.
ж. Оценка влияния БАД на продукцию растворимых медиаторов
иммуногенеза - цитокинов.
Для определения продукции цитокинов клетки селезенки (КС) мыши
инкубируют в течение: 12 - 14 ч в присутствии ЛПС для инициации
синтеза ФНО-, 24 ч в присутствии конканавалина А (Кон А) или
фитогемагглютинина (ФГА) для инициации синтеза ИЛ-2.
Количественное содержание цитокинов оценивают в надосадочных
жидкостях при помощи цитокин - зависимых или цитокин -
чувствительных клеточных линий.
з. Определение ФНО-.
Содержание ФНО- в исследуемых образцах надосадочной жидкости
(НЖ) КС мыши определяют по прямому лизису клеток ФНО-зависимой
клеточной линии L-929 (фибробласты мыши) в присутствии
актиномицина D (148). Клетки пересевают по 2030 тыс./лунка в
плоскодонные 96-луночные планшеты в среде 199 с добавлением 5%
инактивированной при 56 -C сыворотки крови крупного рогатого скота
и инкубируют 24 ч при 37 -C. Образцы НЖ вносят в микропласты в
разведениях 1:2 - 1:16 и инкубируют при 37 -C в течение 16 - 20 ч.
Результаты реакции учитывают после окрашивания клеток 0,2%-ным
раствором кристалл - виолета в 2%-ном этаноле в течение 12 мин.
Оптическую плотность слоя выживших окрашенных клеток измеряют при
длине волны 540 нм на спектрофотометре с вертикальным лучом
(Multiscan, Великобритания). В качестве стандарта в данном тесте
используют рекомбинантный ФНО-. Количество ФНО- в НЖ оценивают в
пкг/мл, используя калибровочные кривые, полученные при
использовании стандарта.
и. Определение ИЛ-2.
При определении ИЛ-2 КС мыши культивируют в концентрации 5 x
6
10 /мл в присутствии 5 мкг/мл Кон А в среде RPMI-1640, содержащей
2% сыворотки АВ в течение 20 - 24 ч. Содержание ИЛ-2 в НЖ
определяют по способности образцов поддерживать пролиферацию
ИЛ-зависимой цитотоксической клеточной линии.
CTLL-2 (лимфоциты мыши), оцениваемую по включению Н-тимидина в
ДНК клеток. Уровень включения радиоактивной метки определяют с
помощью сцинтилляционного бета - спектрометра. В качестве контроля
используют раствор рекомбинантного ИЛ-2 с известной активностью.
Количество ИЛ-2 в НЖ оценивают в МЕ/мл, используя калибровочные
кривые, полученные при использовании стандарта.
к. Оценка влияния БАД на пролиферацию Т-лимфоцитов при
циклоспорин - индуцированной иммунодепрессии.
Мышей - самцов линии Balb/c иммунизируют внутривенно
8
эритроцитами барана в оптимальной дозе (5 x 10 ), с целью индукции
иммунодепрессии через 24 ч вводят циклоспорин А внутрибрюшинно в
дозе 100 мг/кг. Через 4 ч - изучаемую БАД в различных дозах, еще
через 4 ч животных забивают, извлекают клетки селезенки, которые
культивируют с Кон А (митогеном, реализующим свой эффект
преимущественно на Т-клетки) в течение 72 ч. Степень пролиферации
клеток селезенки мыши оценивают по включению в ДНК лимфоцитов
тимидина, меченного тритием, который вносят в культуру за 4 - 6 ч
до окончания инкубации. Количество включенного клетками изотопа
после соответствующей обработки измеряют на сцинтилляционном бета
- счетчике (149).
л. Оценка влияния БАД на гуморальный иммунный ответ.
Мышей - самцов Balb/c иммунизируют внутривенно эритроцитами
8
барана в оптимальной дозе (5 x 10 ), через 24 ч вводят циклоспорин
А (мощный иммунодепрессант, оказывающий свое действие
преимущественно путем ингибиции процессов активации Т-лимфоцитов)
внутрибрюшинно в дозе 100 мг/кг, еще через 4 ч - изучаемую БАД в
различных дозах (рекомендуемая доза обязательна). На 4 сутки после
иммунизации определяют число антителообразующих клеток в селезенке
мыши методом локального гемолиза в агарозном геле по Jerne Nordin
(150).
Методы исследования аллергических свойств
биологически активных добавок к пище
1. Оценка влияния БАД на общую анафилактическую реакцию.
Морских свинок 200 - 250 г сенсибилизируют подкожно каким-либо
чужеродным белком. Наиболее удобно использовать нормальную
лошадиную сыворотку или бычий сывороточный альбумин в дозе 0,1 мл
и 10 мг соответственно. Одновременно свинкам вводят "per os" или
внутримышечно исследуемую субстанцию - это опытная группа
животных. Контролем служит группа свинок, не получавшая БАД. На 14
- 21 день после иммунизации свинкам двух групп внутрисердечно или
внутривенно вводят ту же или удвоенную дозу антигена,
использованного для сенсибилизации. Реакция у животных наступает
через 1 - 2 мин. Наблюдают за животными в течение 30 мин.
Оценка реакции производится по четырехплюсовой системе:
А (+) - кратковременное почесывание носа, взъерошивание
шерсти, падение температуры (не менее чем на 1-);
Б (++) - четко выраженные частые почесывания, единичные
чихания, падение температуры;
В (+++) - спастический кашель, боковое положение животного,
отделение кала и мочи;
Г (++++)- спазм дыхательных путей, конвульсивные движения,
судороги. Животные погибают;
Д - реакция отсутствует.
Полученные результаты в контрольной группе сравнивают с
результатами в опытной группе.
В качестве положительного контроля используют животных,
сенсибилизированных нормальной гетерологической сывороткой и
получивших разрешающую дозу в те же сроки. Одновременно
разрешающую дозу испытуемой БАД "per os" вводят животным, которые
предварительно получили соответствующий объем 0,9%-ного хлорида
натрия - отрицательный контроль.
Индекс синдрома в группе вычисляют по формуле Вейгла (И):
(А x 1) + (Б x 2) + (В x 3) + (Г x 4)
И = -------------------------------------,
А + Б + В + Г + Д
где А, Б, В, Г, Д - число животных с данной выраженностью
синдрома.
Изучаемые БАД не должны вызывать развития смертельного шока.
Изучение действия БАД на показатели
окислительно - антиокислительной системы
Общие положения
К основным внутриклеточным химическим повреждающим агентам
следует, в первую очередь, отнести свободные радикалы, образование
которых приводит к нарушению функционирования клеточных структур,
включая биологические мембраны. Наибольшее значение для патологии
имеют свободные радикалы кислорода, а также пероксид водорода. Все
эти так называемые активные формы кислорода образуются в большом
количестве клетками - фагоцитами, а также могут образовываться в
митохондриях и эндоплазматической сети других клеток в условиях
патологии. Реагируя с ненасыщенными жирными кислотами, входящими в
состав мембранных липидов, радикалы инициируют цепную реакцию их
перекисного окисления. Реакции перекисного окисления липидов (ПОЛ)
тормозятся антиоксидантными системами клетки, благодаря наличию
которых скорость реакции образования гидроксильных радикалов и
разветвления цепи окисления липидов находится в пределах
физиологической нормы. Постоянное образование прооксидантов
уравновешено той же скоростью их дезактивации антиоксидантами.
Резкое усиление окислительных процессов при недостаточности
системы антиоксидантной защиты приводит к развитию "оксидантного
стресса", который рассматривается как один из общих механизмов
повреждения тканей организма. Реакции окислительного стресса
являются результатом нарушения взаимоотношений между оксидантной и
антиоксидантной составляющими свободнорадикальных процессов за
счет гиперактивности или недостаточности одного из указанных
компонентов. В ходе реализации окислительного стресса, являющегося
реакцией организменного уровня, создаются условия для развития
специфических для нервной системы патологических процессов, что в
свою очередь усугубляет окислительный стресс в центральной нервной
системе (151).
В связи с вышеизложенным БАД к пище следует изучать как по
изменению активности ферментных систем генерирования свободных
радикалов кислорода и гидроперекисей, так и по изменению
содержания антиоксидантных белков и ферментов, обеспечивающих
утилизацию активных форм кислорода, H2O2 и липопероксидов.
Методы оценки действия БАД к пище
на показатели перекисного окисления липидов
Мышам - самцам линии Balb/с вводят 0,25 мл 7%-ного масляного
раствора CCl4 - одного из сильнейших стимуляторов ПОЛ,
внутримышечно или алиментарно, через 15 - 20 мин. животным "per
os" вводят исследуемую БАД к пище (5 животных в группе), 5-ти
мышам контрольной группы вводят аналогичный объем физиологического
раствора. Через 2 сут. животных забивают, выделяют печень и
определяют продукты перекисного окисления липидов, такие как
диеновые конъюгаты (появляются на начальных этапах перекисного
окисления), гидроперекиси липидов (обнаруживаются на более поздних
этапах перекисного окисления) и малоновый диальдегид (один из
наиболее важных конечных продуктов перекисного окисления липидов).
а. Определение малонового диальдегида в гомогенате печени мыши.
Печень мыши растирают в гомогенезаторе Поттера в 3 мл 0,025 М
трис-HCl (pH 7,4), содержащей 0,175 М хлорида калия. Гомогенат по
2,5 мл помещают в центрифужные пробирки и осаждают белок
добавлением 1 мл 17%-ного раствора ТХУ (конечная концентрация 5%).
Образующийся осадок отделяют центрифугированием в течение 10 мин.
при 4000 g. Надосадочную жидкость переносят в пробирки, добавляют
по 1 мл 0,8%-ного водного раствора 2-тиобарбитуровой кислоты и
помещают пробы на 10 мин. в кипящую водяную баню. В качестве
контроля используют пробы, содержащие вместо надосадочной жидкости
буфер (pH 7,4). После развития розовой окраски пробы охлаждают до
комнатной температуры и измеряют оптическую плотность при 532 нм.
Количество малонового диальдегида рассчитывают, используя молярный
5 -1 -1
коэффициент экстикции 1,56 x 10 см x М , а полученный
результат выражают в н-молях на пробу (152).
б. Определение диеновой конъюгации полиненасыщенных высших
жирных кислот в гомогенате печени мыши.
Печень мыши растирают в гомогенизаторе Поттера с 9 мл
экстрагирующей смеси гептана с изопропиловым спиртом в объемном
отношении 1:1. Полученную суспензию центрифугируют 10 мин. при
4000 g. Надосадочную фракцию переносят в пробирки и добавляют одну
десятую часть объема дистиллированной воды. После 2-кратного
встряхивания и расслаивания фаз отсасывают гитпановую фазу. К
равным объемам по 0,5 мл добавляют этиловый спирт в отношении 1:5
- 1:10. Оптическую плотность проб измеряют при 233 нм. В качестве
контроля используют только экстрагирующую смесь.
Содержание диеновых конъюгатов рассчитывают, исходя из
величины молярного коэффициента экстинкции при 233 нм для
5 -1 -1
сопряженных диенов ПНЖК, равного 2,2 x 10 см x М (152).
в. Определение гидроперекиси липидов в гомогенате печени мыши.
Печень мыши растирают в гомогенизаторе Поттера в 3 мл 0,025 М
трис HCl буфера (pH 7,4), содержащей 0,175 М хлорида калия.
Гомогенат по 2,0 мл помещают в центрифужные пробирки и осаждают
белок добавлением 0,2 мл 50%-ного раствора ТХУ (конечная
концентрация 5%). Образующийся осадок отделяют центрифугированием
в течение 10 мин. при 4000 g. 2 мл надосадочной жидкости доводят
96%-ным этанолом до 27 мл. К равным объемам до 27 мл добавляют 0,2
мл концентрированной соляной кислоты и 0,025 мл 5%-ного раствора
соли Мора в 3%-ной соляной кислоте, пробы интенсивно встряхивают.
Точно через 30 с приливают 1 мл 20%-ного раствора тиоцианата
аммония, после чего развивается малиновая окраска. В качестве
контроля используют пробы, содержащие 96%-ный этанол вместо НЖ.
Изменение оптической плотности проводят в течение 10 мин. после
добавления тиоцианата аммония при 480 нм. Об относительном уровне
гидроперекисей в биологическом материале судят по величине
оптической плотности при 480 нм (152).
12.3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ СХЕМА
МОДЕЛИ НА ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ ДЛЯ ОЦЕНКИ
ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОФИЛАКТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ
ПАРАФАРМАЦЕВТИКОВ
-------------T----------T----------T-----------------T-----------¬
¦Вид животных¦Количество¦Количество¦Продолжительность¦ Название ¦
¦ ¦ групп ¦ животных ¦ опыта ¦ групп ¦
¦ ¦ животных ¦ в группе ¦ ¦ ¦
+------------+----------+----------+-----------------+-----------+
¦крысы, мыши,¦ 3 ¦ 8 - 10 ¦в зависимости от ¦контроль ¦
¦кролики и ¦ ¦ ¦срока получения ¦опыт-1 ¦
¦др. ¦ ¦ ¦модели ¦опыт-2 ¦
L------------+----------+----------+-----------------+------------
Описание экспериментальных групп:
контроль - животные находятся на общевиварном рационе или на
обычном полусинтетическом рационе;
опыт-1 - крысы вместе с рационом получают изучаемую БАД к пище
на протяжении одного месяца;
опыт-2 - крысы на протяжении первого месяца находятся на
общевиварном или обычном полусинтетическом рационе.
Через месяц от начала опыта у крыс групп опыт-1 и опыт-2
получают модель патологического состояния или помещают их в
экстремальные условия.
Далее, используя соответствующие тесты, оценивают
профилактические свойства изучаемой БАД.
Конкретные модели патологических и экстремальных состояний
изложены в Приложениях к разделу "Парафармацевтики".
13. О ПОРЯДКЕ ПРОВЕДЕНИЯ КЛИНИЧЕСКИХ ИСПЫТАНИЙ
БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК К ПИЩЕ
1. При направлении Федеральным центром госсанэпиднадзора в
экспертный совет Института питания РАМН материалов для проведения
гигиенической экспертизы и выдачи заключения с целью последующей
государственной регистрации какого-либо типа БАД вопрос о
необходимости проведения клинических испытаний этой БАД решается
главным экспертом экспертного совета.
2. Клинические испытания биологически активных добавок к пище
осуществляются, как правило, в контролируемых условиях стационара
или в амбулаторных условиях в специализированных учреждениях,
которые располагают квалифицированными специалистами в области
науки о питании или в соответствующей области медицины,
современным научным оборудованием, хорошей многопрофильной
клинической базой и аккредитованных на проведение подобных
исследований в порядке, установленном МЗ РФ.
3. Образцы биологически активных добавок к пище
предоставляются фирмой в том количестве, которое предусматривается
программой испытания.
4. Схема проведения испытаний биологически активных добавок к
пище включает следующие этапы:
- экспериментальную и/или аналитическую оценку основных
компонентов БАД к пище на основании представленной фирмой -
производителем документации и результатов исследований (см.
разделы 4, 5, 6);
- разработку программ клинических испытаний биологически
активных добавок к пище, которая определяется, с одной стороны,
особенностями химического состава и предполагаемого биологического
действия исследуемых БАД на организм, применительно к тем
нозологическим формам заболевания, при которых использование
добавок с профилактической целью представляется наиболее
адекватным и перспективным, а с другой стороны, типом
функциональных и метаболических нарушений, свойственных данной
патологии;
- определение методики проведения клинических испытаний. Для
получения достоверных данных о профилактическом действии БАД к
пище необходимым условием является наличие двух групп: основной
(опытной) и контрольной. Они могут формироваться из здоровых лиц
или больных с определенной патологией. Группы сравнения должны
быть максимально сходными по половозрастному признаку, массе тела,
пищевому статусу. В случае проведения испытаний на больных помимо
этого учитывается степень тяжести основного заболевания, характер
сопутствующей патологии. Оценка эффективности БАД к пище
осуществляется на фоне идентичных режимов питания в опытной и
контрольной группах. Предпочтительным при этом является
использование двойного слепого метода испытаний с применением
плацебо в контрольной группе. В процессе проведения клинических
испытаний определяются органолептические свойства БАД и их
переносимость, осуществляется оценка их эффективности, выявление
возможных побочных эффектов;
- помимо общих клинических показателей в план исследований
включаются гематологические и специальные функциональные тесты,
биохимические, микробиологические, иммунологические и другие
показатели. Выбор критериев оценки эффективности апробируемых БАД
к пище определяется характером испытуемых БАД и клинико -
патогенетическими особенностями нозологических форм, при которых
они применяются;
- продолжительность клинической апробации устанавливается в
зависимости от типа БАД к пище и по согласованию с фирмой -
заявителем;
- в заключении по итогам испытания БАД должны быть
представлены результаты изучения переносимости БАД, ее
эффективности, рекомендуемая дозировка БАД, показания к
применению, возможные побочные эффекты.
Клиническая оценка эффективности БАД
к пище и их переносимости
1. Оценка органолептических свойств БАД и их переносимости
Изучение органолептических свойств БАД осуществляется с
использованием анкетно - опросного метода. Оценивается вкус,
запах, цвет, консистенция БАД, наличие посторонних запахов и т.д.
Переносимость БАД оценивается путем клинического наблюдения по
субъективным и объективным признакам. Исследуется:
состояние кожных покровов;
системы пищеварения;
сердечно - сосудистой системы и других органов и систем
организма.
2. Оценка БАД по общеклиническим показателям:
определение росто - весовых параметров (с использованием
индекса Кетле);
определение других антропометрических показателей (измерение
окружности плеча, талии, бедер);
определение тощей и жировой массы тела (по показаниям);
оценка влияния БАД на общее состояние наблюдаемого контингента
и состояние различных органов и систем организма;
общий анализ мочи и крови;
определение биохимических показателей - содержание в сыворотке
крови общего белка, холестерина, билирубина, глюкозы, активности
аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы, креатинина,
азота мочевины.
Все исследования осуществляются в динамике, как минимум 2
раза, до применения БАД и после завершения курса лечения.
3. Перечень дополнительных специальных тестов, используемых
при клинических испытаниях различных типов БАД
3.1. БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ДОБАВКИ
К ПИЩЕ - ИСТОЧНИКИ БЕЛКА И АМИНОКИСЛОТ
------------------------------------------------T----------------¬
¦ Показатель ¦ Литературный ¦
¦ ¦ источник ¦
+-----------------------------------------------+----------------+
¦Содержание в сыворотке крови ¦ ¦
+-----------------------------------------------+----------------+
¦Общий белок ¦(24) ¦
+-----------------------------------------------+----------------+
¦Белковые фракции (альбумины, глобулины) ¦(26 - 27) ¦
+-----------------------------------------------+----------------+
¦Креатинин ¦(100) ¦
+-----------------------------------------------+----------------+
¦Азот мочевины ¦(101) ¦
+-----------------------------------------------+----------------+
¦Мочевая кислота ¦(102) ¦
+-----------------------------------------------+----------------+
¦Отдельные аминокислоты (по показаниям) ¦(133) ¦
+-----------------------------------------------+----------------+
¦Содержание в моче (по показаниям) ¦ ¦
+-----------------------------------------------+----------------+
¦Креатинин ¦(100) ¦
+-----------------------------------------------+----------------+
¦Азот мочевины ¦(101) ¦
+-----------------------------------------------+----------------+
¦Отдельные аминокислоты ¦(23) ¦
+-----------------------------------------------+----------------+
¦Балансовые исследования обмена белка (по ¦(24) ¦
¦показаниям) ¦ ¦
L-----------------------------------------------+-----------------
3.2. БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ДОБАВКИ
К ПИЩЕ - ИСТОЧНИКИ ЛИПИДОВ
БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ
------------------------------------------------T----------------¬
¦ Показатель ¦ Литературный ¦
¦ ¦ источник ¦
+-----------------------------------------------+----------------+
¦Содержание в сыворотке крови ¦ ¦
+-----------------------------------------------+----------------+
¦Общий холестерин ¦(103) ¦
+-----------------------------------------------+----------------+
¦Триглицериды ¦(104) ¦
+-----------------------------------------------+----------------+
¦Липопротеиды высокой плотности (по показаниям) ¦(107, 108) ¦
+-----------------------------------------------+----------------+
¦Липопротеиды низкой и очень низкой плотности ¦(107, 108) ¦
¦(по показаниям) ¦ ¦
+-----------------------------------------------+----------------+
¦Продукты перекисного окисления липидов ¦(110) ¦
¦(по показаниям) малоновый диальдегид, диеновые ¦ ¦
¦конъюгаты ¦ ¦
+-----------------------------------------------+----------------+
¦Аполипопротеины A1, B (по показаниям) ¦(133) ¦
+-----------------------------------------------+----------------+
¦Показатели антиоксидантной защиты организма ¦(36, 35, 42, ¦
¦(по показаниям): ферменты (каталаза, супер- ¦109, 111, 133) ¦
¦оксиддисмутаза, глутатионпероксидаза, глютати- ¦ ¦
¦онредуктаза) витамин А, витамин Е, витамин С, ¦ ¦
¦SH-группы, селен ¦ ¦
+-----------------------------------------------+----------------+
¦Эссенциальные жирные кислоты (по показаниям) ¦(28) ¦
+-----------------------------------------------+----------------+
¦Жирно - кислотный состав тромбоцитов и ¦(31) ¦
¦эритроцитов (по показаниям) ¦ ¦
+-----------------------------------------------+----------------+
¦Содержание и состав фосфолипидов в тканях ¦(32) ¦
¦(по показаниям) ¦ ¦
L-----------------------------------------------+-----------------
3.3. БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ДОБАВКИ
К ПИЩЕ - ИСТОЧНИКИ УГЛЕВОДОВ
-------------------------------------------------T---------------¬
¦ Показатель ¦ Литературный ¦
¦ ¦ источник ¦
+------------------------------------------------+---------------+
¦Содержание в сыворотке крови ¦ ¦
+------------------------------------------------+---------------+
¦Гликемия натощак ¦(57, 58) ¦
+------------------------------------------------+---------------+
¦Гликемический профиль ¦(57, 58) ¦
+------------------------------------------------+---------------+
¦Гликемические кривые с нагрузкой (по показаниям)¦(57, 58) ¦
+------------------------------------------------+---------------+
¦Триглицериды (по показаниям) ¦(104) ¦
+------------------------------------------------+---------------+
¦Гликозилированный гемоглобин (по показаниям) ¦(105) ¦
+------------------------------------------------+---------------+
¦Содержание в моче ¦ ¦
+------------------------------------------------+---------------+
¦Содержание глюкозы в суточном количестве мочи ¦(56, 57) ¦
+------------------------------------------------+---------------+
¦Реакция на ацетон (по показаниям) ¦(119) ¦
L------------------------------------------------+----------------
3.4. Биологически активные добавки к пище, содержащие пищевые
волокна (ПВ).
При оценке БАД, содержащих пищевые волокна, используются:
- изучение характера стула;
- капрологическое исследование;
- инструментально - графические тесты, характеризующие моторно
- эвакуаторную функцию желудочно - кишечного тракта (по
показаниям) (128);
- микробиологический анализ для характеристики изменений в
кишечной микрофлоре под влиянием БАД (по показаниям) (125);
- дуоденальное зондирование с определением химического состава
желчи (по показаниям): концентрация холестерина, холевой кислоты,
дезоксихолевой кислоты, фосфолипидов (124);
- микробиологический анализ желчи (по показаниям);
- изучение аноректического эффекта БАД;
- биохимические показатели:
------------------------------------------------T----------------¬
¦ Показатель ¦ Литературный ¦
¦ ¦ источник ¦
+-----------------------------------------------+----------------+
¦Содержание в сыворотке крови ¦ ¦
+-----------------------------------------------+----------------+
¦Холестерин ¦(103) ¦
+-----------------------------------------------+----------------+
¦Билирубин ¦(97) ¦
+-----------------------------------------------+----------------+
¦Щелочная фосфатаза ¦(98) ¦
+-----------------------------------------------+----------------+
¦Глюкоза (по показаниям) ¦(57, 58) ¦
+-----------------------------------------------+----------------+
¦Витамины группы В, С (по показаниям) ¦(35, 38, 39) ¦
+-----------------------------------------------+----------------+
¦Фолиевая кислота (по показаниям) ¦(35) ¦
+-----------------------------------------------+----------------+
¦Минеральные вещества (по показаниям) ¦(35, 41) ¦
+-----------------------------------------------+----------------+
¦Липиды в кале (по показаниям) ¦(120) ¦
L-----------------------------------------------+-----------------
3.5. Биологически активные добавки к пище - источники
витаминов.
При изучении эффективности БАД, основными компонентами которых
являются витамины, критерием оценки служит динамика изменения
витаминной обеспеченности организма под влиянием этих БАД к пище
по содержанию витаминов в сыворотке крови и выделению их с мочой.
3.6. Биологически активные добавки к пище - источники
|
