|
Стр. 3
диаметры зон ингибиции роста) в отношении Pseudomonas spp.,
Acinetobacter spp. и неферментирующих бактерий, используемые для
интерпретации результатов оценки антибиотикочувствительности,
приведены в табл. 4.
6.4. Определение чувствительности Staphylococcus spp.
При оценке чувствительности Staphylococcus spp. в первую
очередь необходимо тестировать препараты, имеющие основное
клиническое значение: бета-лактамы, макролиды, фторхинолоны,
аминогликозиды и ванкомицин.
Критерии интерпретации результатов определения чувствительности
Staphylococcus spp. (пограничные значения диаметров зон подавления
роста и МПК АБП) приведены в табл. 5.
Бета-лактамы. Препаратами выбора для лечения стафилококковых
инфекций (вызванных как Staphylococcus aureus, так и
коагулазонегативными стафилококками) являются бета-лактамные
антибиотики, следовательно, в первую очередь необходимо определять
чувствительность стафилококков к этим препаратам.
Устойчивость стафилококков к бета-лактамным АБП связана либо с
продукцией бета-лактамаз, либо с наличием дополнительного
пенициллиносвязывающего белка - ПСБ2а. Выявление и
дифференцирование этих двух механизмов резистентности позволяет
надежно прогнозировать активность всех бета-лактамных антибиотиков
без непосредственной оценки чувствительности к каждому из этих
препаратов. При этом необходимо учитывать следующие
закономерности:
- штаммы Staphylococcus spp., лишенные механизмов
резистентности, чувствительны ко всем бета-лактамным АБП;
- бета-лактамазы (пенициллиназы) Staphylococcus spp. способны
гидролизовать природные и полусинтетические пенициллины, за
исключением оксациллина и метициллина. Чувствительность или
резистентность к бензилпенициллину является индикатором активности
природных и полусинтетических амино-, карбокси- и
уреидопенициллинов. Остальные бета-лактамы с потенциальной
антистафилококковой активностью (антистафилококковые пенициллины,
цефалоспорины I, II и IV поколений и карбапенемы) сохраняют
активность в отношении бета-лактамазпродуцирующих штаммов;
- штаммы Staphylococcus spp., обладающие ПСБ2а, клинически
устойчивы ко всем бета-лактамным АБП. Маркером наличия ПСБ2а
является устойчивость к оксациллину и метициллину. Такие штаммы
исторически получили название метициллинрезистентных
стафилококков.
Метициллин в настоящее время в клинической практике и в
лабораторной диагностике не применяется, его практически полностью
вытеснил оксациллин, соответственно появился термин
"оксациллинорезистентность", являющийся полным синонимом термина
"метициллинрезистентность".
Таким образом, определение чувствительности Staphylococcus spp.
к бета-лактамным АБП должно включать выполнение двух тестов
определения чувствительности:
- к бензилпенициллину или выявления продукции бета-лактамаз
(пенициллиназ);
- к оксациллину или выявления ПСБ2а или кодирующего его гена
mecА.
Определение чувствительности к бензилпенициллину или выявление
продукции бета-лактамаз (пенициллиназ)
Определение чувствительности Staphylococcus spp. к
бензилпенициллину несколько затруднено тем фактом, что синтез бета-
лактамаз у этого микроорганизма является индуцибельным процессом
(продукция фермента усиливается после контакта с антибиотиком). В
результате этого при использовании стандартных методов серийных
разведений и ДДМ возможно получение результатов ложной
чувствительности.
Решением данной проблемы может быть использование метода
непосредственного выявления бета-лактамаз, основанного на
использовании дисков с нитроцефином. Нитроцефин представляет собой
хромогенный цефалоспорин, который легко гидролизуется под
действием всех бета-лактамаз с образованием окрашенного продукта.
Постановка теста
Для проведения исследования используют чашку, на которой
оценивали чувствительность исследуемого штамма Staphylococcus spp.
к пенициллину и/или оксациллину ДДМ. С границы зоны ингибиции
роста вокруг диска с оксациллином бактериологической петлей
забирается незначительное количество культуры и наносится на
предварительно увлажненный диск с нитроцефином. Диск инкубируют
при комнатной температуре до 1 ч.
Интерпретация результатов
Появление красного окрашивания свидетельствует о продукции бета-
лактамаз исследуемым штаммом микроорганизма.
Штамм, продуцирующий бета-лактамазу, рассматривают как
устойчивый к природным и полусинтетическим пенициллинам (за
исключением оксациллина), независимо от конкретных результатов
тестирования к перечисленным АБП.
Определение чувствительности к оксациллину
При определении чувствительности к оксациллину стандартными
методами необходимо учитывать некоторые особенности:
- для приготовления инокулюма используют только прямой метод
суспендирования колоний;
- длительность инкубации до момента учета результатов
определения чувствительности к оксациллину должна составлять не
менее 24 ч.
Особенности тестирования ДДМ:
- необходимо использовать диски, содержащие 1 мкг оксациллина;
- при учете результатов необходимо обращать внимание даже на
единичные мелкие колонии стафилококков, обнаруженные в пределах
зоны подавления роста.
Особенности тестировании методами серийных разведений
В питательную среду целесообразно добавлять NaCl (до конечной
концентрации 2%).
Интерпретация результатов тестирования
стафилококков к оксациллину
Штаммы стафилококков, резистентные к оксациллину, должны
рассматриваться как устойчивые ко всем бета-лактамным АБП.
Результаты определения чувствительности стафилококков к
оксациллину и к другим бета-лактамным АБП могут быть
противоречивыми, при этом результаты определения чувствительности
к оксациллину являются решающими.
Определять чувствительность стафилококков к бета-лактамным АБП,
кроме бензилпенициллина и оксациллина, нецелесообразно.
Для метициллинрезистентных стафилококков характерно наличие
ассоциированной резистентности к АБП других групп. Выявление у
стафилококков множественной резистентности при чувствительности к
оксациллину требует проведения повторных исследований.
Следует обратить внимание на различия в критериях
метициллинрезистентности для S. aureus и коагулазонегативных
стафилококков.
При получении сомнительных результатов необходимо использовать
дополнительные методы (скрининг на агаре - метод приведен ниже,
прямое выявление гена mecА или белка ПСБ2а).
Выдача клиницистам результатов исследования и рекомендаций по
лечению.
При выделении пенициллино- и метициллино-чувствительных штаммов
стафилококков микроорганизм считается чувствительным ко всем бета-
лактамным АБП, а препаратами выбора будут природные и
аминопенициллины.
При выявлении продукции бета-лактамаз и чувствительности к
оксациллину микроорганизм является резистентным к природным
пенициллинам, амино-, карбокси- и уреидопенициллинам, но
чувствителен к оксациллину, ингибиторозащищенным пенициллинам и
цефалоспоринам I - II поколений, которые являются препаратами
выбора в данном случае. В отношении данных штаммов будут также
активны цефалоспорины IV поколения и карбапенемы, однако
преимуществами в сравнении с препаратами выбора они не обладают.
При выявлении метициллинрезистентности штамм считается
устойчивым ко всем бета-лактамным антибиотикам, для лечения
необходимо использовать препараты других групп, из которых
препаратами выбора считаются гликопептиды.
Дополнительные методы выявления метициллинрезистентности
Наиболее надежным методом выявления метициллинрезистентности у
стафилококков является непосредственное определение наличия гена
mecА молекулярно-генетическими методами (с помощью полимеразной
цепной реакции - ПЦР). Кроме того, разработан коммерческий метод
выявления дополнительного пенициллиносвязывающего белка - ПСБ2а в
реакции агглютинации.
В то же время скрининг на агаре для выявления
метициллинрезистентности является высокочувствительным и
специфичным методом, легко выполнимым в условиях рутинной работы
микробиологической лаборатории, однако он может быть использован
только для штаммов S. aureus.
Постановка теста
Для проведения скрининга готовят чашки с агаром Мюллера -
Хинтон, содержащие 4% NaCl и 6,0 мкг/мл оксациллина. Хлористый
натрий вносят в питательную среду в необходимом количестве до
автоклавирования. Рабочий раствор оксациллина добавляют в
питательную среду после автоклавирования и охлаждения среды до 45
- 50 -С. Для приготовления рабочего раствора оксациллина
используют субстанцию АБП с известной активностью.
Микробную взвесь следует готовить только методом прямого
суспендирования из нескольких однотипных изолированных колоний
стафилококка, выросших на чашке с неселективным питательным
агаром, в стерильном физиологическом растворе и доводить до
8
мутности 0,5 по Мак-Фарланду (1,5 x 10 КОЕ/мл).
Инокуляция
Для инокуляции чашек с агаром можно использовать два метода: 1)
с помощью микропипетки или 2) с помощью стерильного ватного
тампона.
1) Метод I (микропипеткой):
а) готовят разведение 1:100 стандартного инокулюма,
соответствующего стандарту мутности 0,5 по Мак-Фарланду для
6
получения бактериальной взвеси, содержащей 1,5 x 10 КОЕ/мл
(например, добавить 0,1 мл стандартной суспензии к 9,9 мл
стерильного физиологического раствора);
б) с помощью микропипетки наносят каплю (10 мкл) разведенной
стандартной суспензии на поверхность агара с оксациллином.
2) Метод II (с помощью тампона):
а) стерильный ватный тампон погружают в пробирку со
стандартизированной суспензией (0,5 по Мак-Фарланду), затем
отжимают избыток влаги о стенку пробирки;
б) культуру наносят тампоном либо на ограниченную поверхность
(диаметром 10 - 15 мм), либо на всю поверхность агара с
оксациллином в чашке Петри.
Инкубация
Штаммы S. aureus инкубируются при температуре 35 -С в течение
полных 24 ч, а коагулазанегативных стафилококков - в течение 48 ч.
Учет результатов
После инкубации чашки тщательно просматривают в проходящем
свете:
- появление видимого роста более 1 колонии или вуалеобразного
роста на месте нанесения культуры означает устойчивость данного
штамма к оксациллину (метициллину);
- при отсутствии роста на месте нанесения культуры исследуемый
штамм учитывается как чувствительный к метициллину (оксациллину);
- при сомнительных результатах, а также для штаммов, выделенных
у больных с клинически неэффективной терапией и у больных с
серьезными инфекциями, необходимо провести развернутое
исследование с определением МПК к оксациллину и гена mecА.
Контроль качества
Исследование проводят при обязательном контроле роста
испытуемых культур на агаре Мюллера - Хинтон с 4% NaCl без
оксациллина (культуру наносят так же, как на агар с оксациллином).
Параллельно с исследуемыми тестируют также контрольные штаммы
метициллин-чувствительных и метициллинрезистентных стафилококков.
Макролиды и линкозамиды. Макролиды и линкозамиды являются
альтернативными препаратами для лечения стафилококковых инфекций.
В исследование необходимо включать:
- один из представителей 14- и 15-членных макролидов. Полная
перекрестная резистентность между отдельными представителями;
- клиндамицин. Полная перекрестная резистентность между 16-
членными макролидами и линкозамидами.
Приведенный выбор препаратов определяется закономерностями
перекрестной резистентности между антибиотиками указанных
подгрупп.
Фторированные хинолоны. В последнее время отмечается повышение
интереса к фторхинолонам как к препаратам для лечения
стафилококковых инфекций (особенно кожи и мягких тканей). Новые
представители этой группы АБП (антипневмококковые фторхинолоны -
левофлоксацин, спарфлоксацин, моксифлоксацин и др.) обладают
повышенной активностью в отношении Staphylococcus spp. в сравнении
с традиционными препаратами. Между перечисленными подгруппами
препаратов нет полной перекрестной резистентности.
Антипневмококковые препараты часто сохраняют активность в
отношении штаммов, устойчивых к другим фторхинолонам.
Аминогликозиды. На практике необходимо учитывать некоторые
особенности интерпретации результатов, полученных in vitro. Так,
при детекции устойчивости к гентамицину выделенный штамм следует
рассматривать как устойчивый ко всем аминогликозидам. В этой связи
гентамицин должен включаться в набор для тестирования в
обязательном порядке. В то же время крайне редко могут встречаться
штаммы, устойчивые к другим аминогликозидам при чувствительности к
гентамицину.
Ванкомицин. Ванкомицин является одним из препаратов выбора
(наряду с оксазолидинонами) для лечения инфекций, вызываемых
оксациллинрезистентными штаммами. Появление сообщений об
устойчивости стафилококков к гликопептидам требует внимательного
отношения к оценке результатов исследования.
Дополнительные препараты
Линезолид. Оксазолидиноны являются важным достижением в лечении
инфекций, вызываемых оксациллин-резистентными штаммами, в том
числе и устойчивыми к гликопептидам. В то же время, необходимо
иметь в виду, что уже известно о формировании устойчивости к
антибиотикам этой группы.
Другие препараты
Ко-тримоксазол
Хлорамфеникол
Фузидиевая кислота
Тетрациклины
Рифампицин
Значение перечисленных препаратов в лечении стафилококковых
инфекций, вызванных метициллин-чувствительными штаммами, невелико,
так они уступают по активности бета-лактамам. Их клиническая
эффективность при инфекциях, вызываемых оксациллинрезистентными
штаммами, изучена недостаточно.
Рифампицин, ко-тримоксазол и фузидиевую кислоту нельзя
рекомендовать как средство монотерапии из-за высокой частоты
селекции резистентности в процессе лечения.
Формировать конкретный набор антибиотиков для оценки
антибиотикочувствительности стафилококков наиболее целесообразно
на основании данных о частоте распространения в стационаре
метициллинрезистентности. При отсутствии или низкой частоте
метициллинрезистентности вполне достаточно ограничиться оценкой
чувствительности к оксациллину (в плане надзора), макролидам и,
возможно, еще к 1 - 2 препаратам, реально применяемым в конкретном
стационаре для лечения стафилококковых инфекций. В случае же
высокой частоты распространения метициллинрезистентности в
исследование необходимо включать достаточно широкий круг
антибиотиков.
6.5. Определение чувствительности Enterococcus spp.
Энтерококки характеризуются природной устойчивостью ко многим
АБП (цефалоспоринам, аминогликозидам), а клиническое значение
наблюдаемой in vitro чувствительности к тетрациклинам,
хлорамфениколу, макролидам и рифампицину окончательно не
определено. Таким образом, перечень препаратов, подлежащих
включению в исследование энтерококков, весьма ограничен (табл.
17).
При решении вопроса о необходимости определения
чувствительности Enterococcus spp. к АБП крайне важно оценить
клиническую значимость этих микроорганизмов. Так, энтерококки,
выделенные из нестерильных локусов организма, особенно в составе
ассоциаций, чаще всего следует рассматривать как контаминирующие
или колонизирующие микроорганизмы, соответственно, определять
чувствительность таких штаммов к АБП нецелесообразно. Проводить
определение чувствительности необходимо для штаммов Enterococcus
spp., выделенных из крови и других в норме стерильных жидкостей и
тканей организма, а также из мочи. При этом подходы к определению
чувствительности этих микроорганизмов и наборы АБП для
тестирования несколько различаются в зависимости от источника
выделения штаммов (табл. 17).
Пенициллин и ампициллин. Данные антибиотики являются
препаратами выбора для лечения энтерококковых инфекций. Между
пенициллином и ампициллином отмечается перекрестная
резистентность. Полученные результаты можно экстраполировать на
ингибиторозащищенные аминопенициллины и уреидопенициллины.
Поскольку известны случаи резистентности энтерококков к
пенициллинам, связанные с продукцией бета-лактамаз, резистентные
штаммы следует исследовать на продукцию пенициллиназы в тесте с
нитроцефином.
Аминогликозиды. Несмотря на то, что энтерококки обладают
природной устойчивостью к аминогликозидам, данный класс АБП широко
применяется в комбинированной терапии генерализованных
энтерококковых инфекций. Целесообразность таких схем лечения
объясняется выраженным синергизмом между аминогликозидами и
ампициллином или ванкомицином. Однако синергизм проявляется только
в том случае, если МПК аминогликозидов не превосходит 500 мкг/мл
для гентамицина и 1000 мкг/мл для стрептомицина. Указанное
обстоятельство требует проведения скрининга (методом серийных
разведений или ДДМ) на наличие у энтерококков высокого уровня
резистентности к стрептомицину и гентамицину.
Ванкомицин. Ванкомицин является препаратом выбора для лечения
инфекций, вызванных штаммами, резистентными к бета-лактамам и
аминогликозидам. В ряде географических регионов устойчивость
энтерококков к ванкомицину является серьезной клинической
проблемой. Имеются сообщения о выделении единичных штаммов
ванкомицинорезистентных энтерококков и в России. Для выявления
устойчивости энтерококков к ванкомицину целесообразно проводить
целенаправленный скрининг.
Линезолид. Препарат является средством выбора для лечения
инфекций штаммами, устойчивыми к ванкомицину. Линезолид также
рассматривается в качестве альтернативы ванкомицину при лечении
инфекций, вызываемых штаммами, устойчивыми к бета-лактамам и
аминогликозидам.
Другие препараты
В отношении ванкомицин-резистентных энтерококков, несмотря на
отсутствие убедительных данных, возможно оценивать активность
тетрациклинов, хлорамфеникола, эритромицина и рифампина.
Для штаммов энтерококков, выделенных при инфекциях
мочевыводящих путей, целесообразно исследовать чувствительность к
следующим антибиотикам:
- пенициллину или ампициллину;
- фторхинолонам;
- тетрациклинам;
- нитрофуранам;
- фосфомицину.
Критерии интерпретации результатов определения чувствительности
Enterococcus spp. (пограничные значения диаметров зон подавления
роста и МПК АБП) приведены в табл. 6.
Скрининг для выявления высокого уровня резистентности
к аминогликозидам у энтерококков
Скрининг можно проводить в агаре или бульоне.
Питательная среда
Агар или бульон на сердечно-мозговом экстракте. Питательная
среда готовится в соответствии с инструкцией производителя. После
автоклавирования и охлаждения до 45 - 50 -С в среду асептически
добавляют растворы антибиотиков до следующих конечных
концентраций:
- гентамицин для скрининга в агаре и бульоне - 500 мг/л;
- стрептомицин;
- для скрининга в агаре - 2000 мг/л;
- для скрининга в бульоне - 1000 мг/л.
Приготовление микробной взвеси, инокуляция и инкубация
Микробную взвесь готовят путем суспендирования изолированных
колоний из 24-часовой культуры, выращенной на неселективных средах
до концентрации 0,5 по Мак-Фарланду. Для скрининга на агаре на
поверхность среды наносят 10,0 мкл суспензии. Для скрининга в
5
бульоне в среду вносят инокулюм до конечной концентрации 5 x 10
КОЕ/мл. Инкубацию проводят при температуре 35 -С: для гентамицина
- в течение полных 24 ч, для стрептомицина - до 48 ч.
Учет результатов
Исследуемый штамм рассматривается как резистентный при
следующих условиях:
- при скрининге на агаре - рост более 1 колонии;
- при скрининге в бульоне - любой видимый рост.
Контроль качества
Для контроля качества используют штаммы чувствительных и
резистентных энтерококков.
Скрининг для выявления ванкомицинорезистентности
у энтерококков
Скрининг осуществляется на агаре.
Питательная среда
Агар на сердечно-мозговом экстракте. Питательная среда
готовится в соответствии с инструкцией производителя. После
автоклавирования и охлаждения до 45 - 50 -С в среду асептически
добавляют раствор ванкомицина до конечной концентрации 6,0 мг/л.
Приготовление микробной взвеси, инокуляция и инкубация
Микробную взвесь готовят путем суспендирования изолированных
колоний из 24-часовой культуры, выращенной на неселективных средах
до концентрации 0,5 по Мак-Фарланду. Для скрининга на поверхность
агара наносят 10,0 мкл суспензии. Инкубацию проводят при
температуре 35 -С в течение полных 24 ч.
Учет результатов
Исследуемый штамм рассматривается как резистентный при росте
более 1 колонии на агаре с ванкомицином.
Контроль качества
Для контроля качества используют штаммы чувствительных и
резистентных энтерококков.
6.6. Определение чувствительности микроорганизмов
со сложными питательными потребностями
Определение чувствительности микроорганизмов со сложными
питательными потребностями является методически одной из наиболее
трудных задач, т.к. в ряде случаев требует одновременного
использования метода серийных разведений и ДДМ, особой
тщательности в выполнении всех процедур, начиная от приготовления
питательных сред и инокулюма и заканчивая проведением контроля
качества. В то же время эффективность эмпирической
антибактериальной терапии многих инфекций, вызываемых
микроорганизмами этой группы, хорошо предсказуема. Учитывая эти
факты, при оценке необходимости определения чувствительности
микроорганизмов этой группы к АБП следует объективно оценить
соотношение стоимости и эффективности (клинической значимости)
таких исследований, а также сопоставить стоимость полноценного
материально-технического оснащения с доступными ресурсами.
Попытки даже незначительной модификации стандартных методов
(замена дорогостоящих реагентов на более дешевые) могут привести к
получению ошибочных, недостоверных результатов, способных ввести в
заблуждение и микробиологов, и клиницистов.
6.7. Определение чувствительности Streptococcus spp.
Питательные среды
Для определения чувствительности стрептококков используют
следующие питательные среды:
- для методов серийных разведений в бульоне необходимо
использовать бульон Мюллера - Хинтон с добавлением 2,0 - 5,0%
лизированной лошадиной крови. Кровь лизируют замораживанием-
оттаиванием с последующим центрифугированием для освобождения от
теней эритроцитов;
- для методов серийных разведений в агаре и ДДМ используют агар
Мюллера - Хинтон с добавлением 5% дефибринированной бараньей
крови.
Указанные добавки асептически вносят в питательную основу после
автоклавирования и охлаждения до 48 - 50 -С.
Определение чувствительности Streptococcus pneumoniae
Бета-лактамные антибиотики (в частности, пенициллин) являются
препаратами выбора для терапии пневмококковых инфекций. В то же
время критерии интерпретации результатов определения
чувствительности пневмококков к этим препаратам постоянно
пересматриваются в связи с появлением новых клинических и
экспериментальных данных об эффективности различных бета-лактамов
при пневмококковых инфекциях, вызванных штаммами с различным
уровнем чувствительности к пенициллину.
Механизм резистентности S. pneumoniae к пенициллину и другим
бета-лактамным антибиотикам обусловлен изменением
пенициллиносвязывающих белков (ПСБ) клеточной стенки. В результате
ступенчатых мутаций уменьшается сродство ПСБ к бета-лактамным
антибиотикам.
При этом установлено, что при лечении инфекций дыхательных
путей, вызванных штаммами S. pneumoniae с промежуточным уровнем
резистентности к пенициллину, бета-лактамные антибиотики остаются
клинически эффективными, но применение их при менингите приводит к
неудаче терапии.
В связи с этим, при разработке критериев интерпретации
результатов определения чувствительности S. pneumoniae к бета-
лактамным антибиотикам, было проведено подразделение штаммов по
источникам выделения (инфекции дыхательных путей, ликвор) и
пересмотрены критерии оценки чувствительности к амоксициллину,
цефотаксиму и цефтриаксону. Критерии интерпретации результатов
определения чувствительности к пенициллину не пересмотрены.
Следует обратить внимание на несколько важных особенностей
определения чувствительности S. pneumoniae:
- невозможность определения чувствительности к бета-лактамным
антибиотикам (пенициллину, аминопенициллинам, цефалоспоринам,
карбапенемам) ДДМ;
- невозможность определения чувствительности S. pneumoniae к
АБП методом разведений в агаре.
Поэтому определение чувствительности пневмококков к пенициллину
и другим бета-лактамным антибиотикам подразумевает
последовательное (выделение S. pneumoniae из нестерильных локусов)
или одновременное (при тяжелых инфекциях, выделении пневмококков
из крови и ликвора) выполнение двух исследований:
- скрининга с диском, содержащим 1,0 мкг оксациллина, с целью
выявления возможной пенициллинорезистентности. Скрининговый метод
позволяет разделить микроорганизмы на две группы: группу
чувствительных штаммов и группу, в которую входят часть
чувствительных, а также умеренно-резистентные и резистентные
штаммы пневмококков;
- определение МПК пенициллина и других бета-лактамных
антибиотиков методом разведений в бульоне или с помощью Е-тестов у
штаммов, отнесенных ко второй группе по результатам скрининга.
Скрининг на наличие пенициллинорезистентности у штаммов S.
pneumoniae
Постановка теста
Методика проведения исследования не отличается от обычной
процедуры определения чувствительности пневмококков к АБП ДДМ.
Интерпретация результатов
При выявлении диаметра зоны подавления роста штамма пневмококка
вокруг диска с 1 мкг оксациллина >= 20 мм, S. pneumoniae
расценивается как чувствительный ко всем бета-лактамным
антибиотикам.
При выявлении диаметра зоны подавления роста < 20 мм необходимо
определение МПК всех бета-лактамных антибиотиков (пенициллина,
аминопенициллинов, цефалоспоринов II - IV поколений, карбапенемов)
методами серийных разведений в бульоне или с помощью Е-тестов.
Макролиды и линкозамиды. Вторыми по значимости в лечении
пневмококковых инфекций являются макролидные и линкозамидные
антибиотики. Оценка чувствительности S. pneumoniae к перечисленным
антибиотикам возможна как диско-диффузионным методом, так и
методом серийных разведений. В связи с разнообразием механизмов
устойчивости S. pneumoniae к макролидам в повседневной практике
могут встречаться различные варианты перекрестной резистентности
микроорганизмов к АБП этой группы.
Однако в практических целях для характеристики чувствительности
S. pneumoniae к рассматриваемой группе АБП достаточно оценить
чувствительность к эритромицину и клиндамицину, что позволяет
дифференцировать два основных фенотипа:
MLSB - перекрестная устойчивость ко всем макролидам,
линкозамидам и стрептограминам В, обусловленная метилированием
мишени действия препаратов.
М - устойчивость к 14- и 15-членным макролидам (сохранении
чувствительности к 16-членным макролидам, линкозамидам и
стрептограминам), обусловленная активным выведением АБП.
Фторхинолоны. Традиционные фторхинолоны (пефлоксацин,
офлоксацин, ципрофлоксацин и ломефлоксацин) не являются
адекватными для лечения пневмококковых инфекций, соответственно
оценивать чувствительность к этим препаратам нецелесообразно. В
последние годы в лечении пневмококковых инфекций важное место
заняли антипневмококковые фторхинолоны (левофлоксацин,
спарфлоксацин, моксифлоксацин и гатифлоксацин). Частота
устойчивости к перечисленным препаратам минимальна, однако
поскольку между ними не наблюдают полной перекрестной
резистентности, возникает необходимость включения в исследование
всей группы.
АБП других групп. Из антибиотиков других групп для лечения
пневмококковых инфекций применяют ко-тримоксазол, хлорамфеникол,
тетрациклины. Однако роль перечисленных препаратов в последние
годы резко снижается в связи с нарастанием устойчивости, меньшей
клинической эффективностью в сравнении с бета-лактамами,
макролидами и антипневмококковыми фторхинолонами, также
значительным числом нежелательных эффектов.
Для лечения тяжелых пневмококковых инфекций, вызванных штаммами
с высоким уровнем устойчивости к антибактериальным препаратам
других групп, в ряде случаев рекомендуется ванкомицин.
Критерии интерпретации результатов определения чувствительности
S. pneumoniae (пограничные значения диаметров зон подавления роста
и МПК АБП) приведены в табл. 7.
Определение чувствительности Streptococcus spp. группа
"viridans"
Проводить определение чувствительности штаммов стрептококков
группы "viridans", выделенных из нестерильных локусов, в рутинной
практике нецелесообразно. У штаммов, выделенных из стерильных в
норме локусов организма, необходимо, в первую очередь, исследовать
чувствительность к пенициллину. Воспроизводимые результаты при
определении чувствительности стрептококков группы "viridans" к
пенициллину удается получить только при помощи метода серийных
разведений, ДДМ не пригоден для этой цели.
Штаммы, чувствительные к этому антибиотику, следует расценивать
как чувствительные ко всем бета-лактамным антибиотикам. Часть
штаммов, устойчивых к пенициллину, могут сохранять
чувствительность к некоторым цефалоспоринам III поколения
(цефотаксиму и цефтриаксону), IV поколения (цефепиму) и
карбапенемам. Критерии интерпретации результатов определения
чувствительности в настоящее время установлены только для
цефотаксима и цефтриаксона.
Определенный интерес может представлять изучение
чувствительности стрептококков группы "viridans" к эритромицину и
другим макролидам, клиндамицину, тетрациклину и хлорамфениколу,
однако клиническое значение получаемых при этом данных не
определено.
В случае сниженной чувствительности или резистентности
зеленящих стрептококков к пенициллину при выдаче результатов
тестирования клиницистам целесообразно рекомендовать проведение
комбинированной терапии бета-лактамами с аминогликозидами, которые
проявляют синергизм при совместном применении с бета-лактамами,
несмотря на отсутствие у аминогликозидов собственной значимой
активности в отношении стрептококков.
Определение чувствительности бета-гемолитических стрептококков
К бета-гемолитическим стрептококкам относятся микроорганизмы,
принадлежащие к различным серологическим группам по Лансфельд (А,
В, С, G). Среди них наибольшее клиническое значение имеют
стрептококки группы A (Streptococcus pyogenes) и группы В
(Streptococcus agalactiae).
Препаратами выбора для лечения инфекций, вызванных бета-
гемолитическими стрептококками, являются бета-лактамы, причем
достоверных случаев устойчивости к АБП этой группы не описано. Не
описана и устойчивость к ванкомицину. Следовательно, оценивать
чувствительность к указанным АБП в рутинной практике
нецелесообразно.
При выделении из нестерильных локусов необходимость в оценке
чувствительности возникает только для S. pyogenes и S. agalactiae.
Примерный перечень препаратов для определения чувствительности
этих микроорганизмов включает: макролиды (эритромицин) и
линкосамиды (клиндамицин). С целью мониторинга антибиотико-
резистентности возможно определение чувствительности к
хлорамфениколу и левофлоксацину. Для бета-гемолитических
стрептококков, выделенных из стерильных локусов, необходимо
определять чувствительность ко всем вышеперечисленным препаратам
одновременно.
Примерный перечень АБП, рекомендуемых для определения
чувствительности S. pneumoniae, стрептококков группы "viridans" и
бета-гемолитических стрептококков, выделенных из различных локусов
организма, представлен в табл. 18.
Критерии интерпретации результатов определения чувствительности
Streptococcus spp. (кроме S. pneumoniae) (пограничные значения
диаметров зон подавления роста и МПК АБП) приведены в табл. 8.
6.8. Определение чувствительности Haemophilus influenzae
Питательные среды
Для определения чувствительности Haemophilus spp. используют
специальную питательную среду, например НТМ, содержащую
необходимые для гемофил факторы роста.
Эту среду можно приготовить в лаборатории на основе среды
Мюллера - Хинтона:
- среду готовят на основе бульона или агара Мюллера - Хинтон.
После растворения основы в нее добавляют дрожжевой экстракт (до
конечной концентрации 5 мг/мл) и раствор гематина (до конечной
концентрации 15 мг/л). Для приготовления основного раствора
гематина 50 мг порошка помещают в 100,0 мл 0,01N NaOH (0,01
моль/л) и нагревают при тщательном перемешивании до полного
растворения. В подготовленную для автоклавирования среду на 1 л
вносят 30,0 мл основного раствора гематина;
- после автоклавирования и охлаждения основы до 48 - 50 -С в
нее асептически вносят раствор никотинамид аденин динуклеотида
(НАД) до конечной концентрации 15 мг/л. Раствор НАД стерилизуют
фильтрацией через мембранные фильтры с размером пор 0,45 мкм;
- при определении чувствительности к сульфаниламидам и
триметоприму в охлажденную до 48 - 50 -С среду асептически вносят
также раствор тимидин фосфорилазы до конечной концентрации 0,2
ед./мл.
Haemophilus spp. характеризуются природной чувствительностью к
большинству распространенных антибиотиков, в т.ч. и к бета-
лактамам. Практически важным исключением является отсутствие
активности в отношении Haemophilus spp. у цефалоспоринов I
поколения. Наибольшее значение имеет приобретенная резистентность
к ампициллину, обусловленная продукцией плазмидных бета-лактамаз
ТЕМ-1 и ROB-1. Кроме ампициллина эти ферменты частично гидролизуют
цефалоспорины I поколения, но не активны в отношении препаратов II
- III поколений.
Известны штаммы Н. influezae, устойчивость которых к
ампициллину связана с изменением мишени действия бета-лактамных
антибиотиков (пенициллинсвязывающих белков) или снижением
проницаемости наружной клеточной стенки. Эти штаммы получили
название бета-лактамазонегативные ампициллинорезистентные (БЛНАР)
и считаются нечувствительными к ингибиторозащищенным пенициллинам
и таким цефалоспоринам, как цефаклор, цефуроксим, цефиксим,
цефтибутен. До настоящего времени не получено клинических штаммов
Н. influenzae, устойчивых к цефалоспоринам III - IV поколений и
карбапенемам.
Для выявления ампициллинорезистентности у гемофильной палочки в
рутинной лабораторной практике достаточно определения
чувствительности к ампициллину диско-диффузионным методом и теста
на продукцию бета-лактамаз с нитроцефином.
Эти два теста позволяют подразделить штаммы на
ампициллиночувствительные, бета-лактамазопродуцирующие
ампициллинорезистентные (чувствительные к ингибиторозащищенным
пенициллинам и цефалоспоринам II - IV поколений) и БЛНАР, которые
следует расценивать как резистентные к ингибиторозащищенным
пенициллинам и некоторым цефалоспоринам. Причем тестирование с
диском, содержащим ингибиторозащищенные пенициллины, например
амоксициллин/клавуланат, не позволяет отличить БЛНАР от
ампициллиночувствительных штаммов Н. influenzae.
Макролидные антибиотики, в целом, отличаются невысоким уровнем
активности в отношении Haemophilus spp., при этом между ними
выявляются незначительные различия (наибольшая активность
характерна для азитромицина). Низкий уровень активности макролидов
связан с наличием у этого микроорганизма фоновой активности
механизмов активного выведения. Подавляющее большинство штаммов Н.
influenzae с микробиологической точки зрения относятся к "дикой"
популяции, лишенной дополнительных детерминант резистентности к
этим АБП. Однако, in vivo, при приеме в рекомендуемых дозах
концентрации макролидов в органах и тканях оказываются
недостаточными для обеспечения эрадикации патогена. Учитывая
приведенные факты, обоснованность критериев чувствительности Н.
influenzae к азитромицину и кларитромицину вызывает сомнения.
Устойчивость к фторхинолонам среди Н. influenzae встречается
редко, однако частота встречаемости штаммов с повышенными
значениями МПК фторхинолонов возрастает, что обосновывает
необходимость тестирования указанных АБП. Наиболее вероятно, что
между отдельными представителями этой группы существует
перекрестная резистентность, характерная и для других
грамотрицательных бактерий.
Примерный перечень АБП, рекомендуемых для определения
чувствительности Н. influenzae, выделенных из различных локусов
организма, представлен в табл. 18.
Критерии интерпретации результатов определения чувствительности
Н. influenzae (пограничные значения диаметров зон подавления роста
и МПК АБП) приведены в табл. 9.
6.9. Определение чувствительности Neisseria gonorrhoeae
Оценка антибиотикочувствительности N. gonorrhoeae представляет
собой достаточно сложную методическую проблему. Методы определения
чувствительности гонококков в бульоне недостаточно надежны,
поэтому следует использовать только метод разведений в агаре или
ДДМ.
Питательные среды
Для определения чувствительности N. gonorrhoeae используют
гонококковый агар, состоящий из гонококковой агаровой основы и
комплексной питательной добавки следующего состава:
Глюкоза 100 г
L-цистеингидрохлорид 25,9 г
L-глютамин 10 г
L-цистин 1,1 г
Аденин 1 г
Никотинамидадениндинуклеотид 0,25 г
Витамин В12 0,1 г
Тиамина пирофосфат 0,1 г
Гуанина гидрохлорид 0,03 г
Fе(NO3)3 x 6H2O 0,02 г
Парааминобензойная кислота 0,013 г
Тиамина гидрохлорид 3 г.
При тестировании карбапенемов и клавулановой кислоты необходимо
использовать добавку, не содержащую цистеин.
Все ингредиенты растворяют в небольшом количестве
дистиллированной воды и затем доводят объем до 1 л. КПД
стерилизуют фильтрацией через бактериальный фильтр 0,02 мкм. КПД
нельзя хранить и автоклавировать, необходимо использовать ex
tempore. Полученную смесь асептически вносят в GC агар после
автоклавирования и охлаждения до 48 - 50 -С в количестве 1,0%
(объем/объем). Агар разливают в чашки Петри без добавления
антибиотиков для ДДМ и с добавлением АБП для метода разведения в
агаре.
Средствами выбора для лечения гонореи являются бета-лактамные
антибиотики. Однако среди штаммов N. gonorrhoeae широко
распространена резистентность к пенициллину, тетрациклинам и
макролидам. В ряде регионов Земного шара отмечают резкое
возрастание частоты резистентности гонококков к фторированным
хинолонам. Для практики крайне важно то, что до сих пор достоверно
|
