|
Стр. 2
внимания на очень мелкие колонии, выявляемые в пределах зоны
задержки роста только при особых условиях освещения или
увеличении, и едва заметный налет у края зоны. Исключение
составляют случаи учета результатов определения чувствительности
стафилококков к оксациллину, когда необходимо учитывать и самые
мелкие колонии, выявляемые в пределах четкой зоны подавления
роста.
Крупные колонии, выявляемые в пределах четкой зоны подавления
роста, свидетельствуют о наличии посторонней микрофлоры или о
гетерорезистентности популяции микроорганизмов, в этом случае
необходимо повторить идентификацию микроорганизма, формирующего
эту колонию, и определение чувствительности этого штамма.
При определении чувствительности ДДМ роящихся штаммов протея
зона подавления роста может быть затянута тонкой вуалеобразной
пленкой, которая не мешает установлению границы зоны и не
учитывается при регистрации результатов.
При определении чувствительности к сульфаниламидам и их
комбинации с триметопримом границу зоны подавления роста следует
учитывать на уровне ингибиции роста на 80%. Это связано с тем, что
под действием этих препаратов перед полным подавлением роста
возможно завершение 1 - 2 циклов пролиферации микроорганизма.
5. Контроль качества определения чувствительности
При определении чувствительности микроорганизмов к АБП любым
методом необходимо выполнять процедуры внутреннего контроля
качества исследования.
Достоверность результатов исследования чувствительности
микроорганизмов к АБП зависит от следующих основных параметров:
- состава питательной среды;
- соответствия реальной активности используемых антибиотиков
(или их содержания в дисках) паспортным характеристикам
(активности);
- соблюдения стандартности выполнения всех лабораторных
процедур.
5.1. Контроль чистоты роста культуры
Образец инокулюма, использованного для оценки чувствительности,
необходимо засеять на чашку с неселективной питательной средой и
инкубировать в течение ночи. При выявлении на неселективной среде
смешанной культуры результаты оценки антибиотикочувствительности
не учитывают, исследование необходимо повторить.
5.2. Контроль качества питательных сред
Контроль роста
Каждую партию плотных питательных сред для определения
чувствительности должны проверять на пригодность для роста
тестируемых микроорганизмов. Для этого используют соответствующие
контрольные штаммы Е. coli, P. aeruginosa, S. aureus, E. faecalis,
S. pneumoniae, H. influenzae, N. gonorrhoeae. Из суточных культур
указанных микроорганизмов готовят микробную взвесь,
соответствующую по плотности 0,5 по стандарту Мак-Фарланда
8
(содержащую приблизительно 1,5 x 10 КОЕ/мл). Из полученной
микробной взвеси готовят серию последовательных разведений 1:10.
Затем на приготовленные чашки с соответствующим агаром высевают по
0,1 мл взвеси -5, -6, -7 разведений, содержащих соответственно 1 х
3 2 1
10 , 1 x 10 , 1 x 10 КОЕ/мл. При хороших питательных свойствах
среды должен отмечаться рост микроорганизмов из -6, -7 разведений.
Для контроля роста при определении чувствительности методами
разведений (в агаре, в жидкой питательной среде) используют чашки
с агаром, пробирки с бульоном или специально выделенные лунки
микротитровального планшета, в которые не внесен АБП.
Контроль стерильности
Для контроля стерильности проводят инкубацию при 35 -С в
течение 24 или более часов репрезентативного количества чашек с
агаром из каждой партии при определении чувствительности ДДМ,
чашек с агаром или пробирок с бульоном, не содержащих
антибиотиков, при тестировании методом разведений в агаре или
макроразведений в бульоне соответственно. При определении
чувствительности методом микроразведений контроль стерильности
производят по специально выделенным для этой цели лункам
микротитровального планшета, в которые не вносят растворы
антибиотиков и микробную взвесь.
Проверка pH агара
В условиях рутинной работы лаборатории допустимо не
контролировать pH приготовленного агара, если результаты
тестирования контрольных штаммов находятся в необходимых границах.
При возникновении проблем с результатами тестирования контрольных
штаммов, особенно к АБП, активность которых может существенно
изменяться под влиянием pH питательной среды (например,
аминогликозиды, макролиды, тетрациклины и др.), необходимо
провести определение pH среды после автоклавирования, внесения
всех необходимых добавок и охлаждения до комнатной температуры (25
-С). Для достоверного определения pH необходимо использовать pH-
метр с поверхностно-активным электродом, другие методы определения
pH (с помощью лакмусовой бумаги, обычного pH-метра) не должны
использоваться, так как не обеспечивают получения достаточно
точных результатов. Приемлемый диапазон pH для питательных сред
для определения чувствительности 7,2 - 7,4. При pH среды,
выходящей за указанные пределы, возможны существенные отклонения
результатов определения чувствительности от должных значений.
Контроль катионного состава
Для получения воспроизводимых результатов определения
чувствительности к АБП (особенно к аминогликозидам, фторхинолонам,
карбапенемам, тетрациклинам и некоторым другим) питательная среда
должна содержать строго стандартизированные концентрации
2+ 2+ 2+
двухвалентных катионов, прежде всего Ca и Mg (Ca = 20 -
2+
25 мг/л и Mg = 10,0 - 12,5 мг/л). Применение метода атомной
абсорбционной спектрофотометрии для непосредственной оценки
концентрации двухвалентных катионов в среде в повседневной
практике мало реально.
О содержании в среде двухвалентных катионов косвенно можно
судить по результатам тестирования чувствительности контрольного
штамма Pseudomonas aeruginosa к аминогликозидам (диаметр зоны
вокруг диска с гентамицином должен быть в пределах 16 - 21 мм, а
МПК гентамицина - в пределах 0,5 - 2,0 мкг/мл).
Контроль содержания тимина и тимидина
При определении чувствительности к АБП из группы антагонистов
фолиевой кислоты (антифолатов) - сульфаниламидов и триметоприма -
критически важным показателем является содержание антагонистов
действия этих препаратов - тимина и тимидина в питательной среде.
Питательные среды для определения чувствительности к
сульфаниламидам и триметоприму должны содержать минимальные
концентрации тимидина. О пригодности питательной среды для
определения чувствительности к антифолатам можно косвенно судить
по результатам тестирования контрольного штамма Enterococcus
жбегбмйу. Среда считается удовлетворительной по качеству при МПК
триметоприма/сульфаметоксазола в отношении Е. Faecalis < 0,5/9,5
мг/л и диаметре зоны подавления роста вокруг диска с этим АБП >= 0
мм.
5.3. Интегральный контроль качества
определения чувствительности
Наиболее доступным интегральным методом оценки качества
определения чувствительности является сопоставление результатов
определения чувствительности (МПК или диаметров зон подавления
роста) контрольных (референтных) штаммов микроорганизмов с
соответствующими показателями, приведенными в их паспортной
характеристике. Тестирование контрольных штаммов проводят в
соответствии с описанными выше методами, параллельно тестированию
клинических изолятов.
Контрольные (референтные) штаммы микроорганизмов
В качестве контрольных используют штаммы, отличающиеся
генетической стабильностью и хорошо изученными фенотипическими
характеристиками, в том числе и уровнем чувствительности к АБП.
Если при исследовании чувствительности к АБП контрольных штаммов
получены значения МПК или диаметров зон подавления роста,
соответствующие паспортным характеристикам этих штаммов, то это
свидетельствует о стандартности условий постановки эксперимента.
Результаты определения чувствительности клинических изолятов,
полученные в этих условиях, следует признать достоверными.
Выбор референтных штаммов для проведения контроля качества
тестирования определяется видом исследуемого микроорганизма.
При детекции отдельных механизмов резистентности (бета-
лактамазы расширенного спектра - БЛРС, метициллинрезистентности и
др.) возникает необходимость использования контрольных штаммов,
обладающих указанными механизмами.
Допустимые диапазоны значений МПК и диаметров зон подавления
роста для основных контрольных штаммов представлены в табл. 2 - 5.
5.4. Хранение контрольных штаммов
В условиях лаборатории штаммы должны храниться таким образом,
чтобы возможность мутаций и контаминации культуры была
минимальной. Для этого создается банк контрольных штаммов,
предназначенный для длительного хранения, а для ежедневной
рутинной работы используются регулярно субкультивируемые культуры.
Для длительного хранения штаммов существуют два основных
способа. Первый состоит в приготовлении суспензии микроорганизмов
в стабилизирующем растворе (50% фетальной телячьей сыворотки в
бульоне, 10 - 15% глицерина в триптиказо-соевом бульоне,
дефибринированная баранья или кроличья кровь). Наилучшую
сохранность культур удается получить при хранении в замороженном
состоянии при температуре -70 -С и ниже в морозильной камере или в
жидком азоте. Другой метод длительного хранения контрольных
штаммов - в лиофилизированном виде.
Для непродолжительного хранения "рабочих" контрольных штаммов
их выращивают в пробирке со скошенным агаром (триптиказо-соевым
или другим аналогичным для "непривередливых" микроорганизмов,
шоколадным для "привередливых" бактерий) и хранят в холодильнике
при температуре 2 - 8 -С, субкультивируя еженедельно.
В случае, если "рабочие" контрольные штаммы были
контаминированы или результаты определения чувствительности
контрольного штамма не попадают в необходимые пределы и это не
может быть объяснено нарушениями методики определения
чувствительности, "рабочий" штамм должен быть заменен на свежий из
банка контрольных штаммов.
Перед использованием для контроля качества определения
чувствительности хранившийся контрольный штамм должен быть дважды
субкультивирован на подходящих питательных средах.
5.5. Частота проведения контроля качества
Оптимальным является проведение контроля качества определения
чувствительности с использованием набора контрольных штаммов
ежедневно, параллельно с тестированием клинических изолятов.
Однако на практике, при получении достаточно стабильных
результатов контроля качества в течение хотя бы одного месяца,
частота контрольных исследований может быть сокращена до 1 - 2 раз
в неделю. Контрольные исследования необходимо проводить при
использовании новых партий реагентов, прежде всего, питательных
сред.
В то же время, если при проведении подобного тестирования
получаемые результаты окажутся за пределами указанных границ,
необходимо вернуться к ежедневному контролю качества для выяснения
причины получения неправильных результатов.
6. Определение чувствительности
отдельных групп бактерий к антибактериальным
препаратам и интерпретация результатов
6.1. Принципы выбора АБП
для тестирования различных видов микроорганизмов
и интерпретации результатов
Выбор АБП
Основой для выбора АБП, подлежащих включению в исследование,
являются данные о природной чувствительности отдельных видов
микроорганизмов или их групп, о распространении среди них
приобретенной резистентности, а также о клинической эффективности
АБП.
В исследование целесообразно включать АБП, обладающие в
отношении выделенных микроорганизмов природной активностью и
клинически подтвержденной эффективностью при соответствующих
инфекциях. Учитывая значительное количество имеющихся в
клинической практике АБП, различия между лечебными учреждениями по
контингенту пациентов, особенностям этиологической структуры
инфекций и по распространенности приобретенной антибиотико-
резистентности, создать единые стандартные наборы АБП для всех
лечебных учреждений не представляется возможным.
В настоящее время перечень АБП, чувствительность к которым
рекомендуется определять у различных видов микроорганизмов,
принято подразделять на две группы: подлежащие изучению в первую
очередь (I группа) и дополнительные (II группа). Оценка
чувствительности к препаратам I группы позволяет получить
минимально необходимую информацию для обоснования рациональной
терапии инфекции, вызванной исследуемым микроорганизмом.
Информативность исследований возрастает по мере увеличения
количества включенных в исследование АБП из группы II.
Накопленные к настоящему времени данные свидетельствуют о том,
что прогнозирование клинической эффективности АБП на основе оценки
фенотипа (антибиотикограммы) менее информативно, чем ее
прогнозирование на основе выявления генотипа (набора детерминант
резистентности) данного патогена. Однако непосредственная детекция
детерминант резистентности генетическими методами
(генотипирование) в рутинной практике в большинстве случаев
неосуществима. В ряде случаев генотипирование может быть заменено
оценкой чувствительности к АБП, являющимся маркерами того или
иного механизма устойчивости.
Наиболее демонстративным примером указанного подхода является
использование оксациллина в качестве маркера устойчивости
Staphylococcus spp. ко всем бета-лактамным антибиотикам, связанной
с наличием mecА гена. На практике возможны ситуации, когда
исследуемый микроорганизм при обычном тестировании проявляет
устойчивость к оксациллину, но чувствителен к другим бета-
лактамам. В указанных случаях приоритет отдается результатам,
получаемым при тестировании оксациллина.
Следующей важной особенностью, которую необходимо учитывать при
составлении наборов АБП для изучения чувствительности являются
закономерности перекрестной резистентности бактерий к различным
представителям одной группы АБП. В пределах некоторых групп АБП
можно выделить подгруппы препаратов, в отношении которых бактерии
проявляют полную перекрестную резистентность. В этих случаях на
практике достаточно оценивать чувствительность только к одному АБП
данной подгруппы.
Окончательное формирование наборов АБП для определения
чувствительности различных видов микроорганизмов в конкретных
учреждениях является задачей врача-бактериолога, для ее решения
необходимо привлекать врачей клинических специальностей.
Интерпретация результатов
Интерпретация результатов оценки чувствительности заключается в
прогнозировании результата антибактериальной терапии на основе
данных исследования возбудителя инфекционной болезни in vitro.
Интерпретация результатов оценки антибиотикочувствительности
заключается в отнесении исследуемого микроорганизма к одной из
трех категорий.
Чувствительный - штамм подавляется при концентрациях АБП,
создающихся в органах и тканях человека при рекомендуемых режимах
дозирования. Лечение инфекции, вызванной микроорганизмом,
относящимся к этой категории, обычно эффективно при применении АБП
в рекомендуемых дозах.
Промежуточный - МПК АБП в отношении штаммов этой категории
выше, чем в отношении чувствительных, но находится в пределах,
достижимых при рекомендуемых режимах дозирования. Лечение
инфекции, вызванной микроорганизмом, относящимся к этой категории,
может быть эффективным при применении АБП в повышенных дозах либо
при локализации очага инфекции в тех органах или тканях, в которых
в силу физиологических особенностей создаются повышенные
концентрации АБП.
Устойчивый - штамм не подавляется при концентрациях АБП,
создающихся в органах и тканях при рекомендуемых режимах
дозирования. Для устойчивых штаммов характерно наличие
определенных механизмов резистентности. Лечение инфекции,
вызванной микроорганизмом, относящимся к этой категории, скорее
всего, будет неэффективным.
Интерпретация осуществляется на основании сопоставления
результатов исследования (величины МПК АБП или диаметра зоны
ингибиции роста) с пограничными значениями этих параметров,
отделяющих чувствительные штаммы от промежуточных и промежуточные
от устойчивых. При выборе значений пограничных концентраций АБП
учитывают микробиологические, фармакокинетические,
фармакодинамические, а также клинические факторы. Обоснование
значений пограничных концентраций является сложным и, во многом,
субъективным процессом.
Приведенные выше категории являются клинически ориентированными
и не всегда коррелируют с микробиологическими. Возможны как
ситуации, при которых чувствительный с микробиологической точки
зрения штамм будет отнесен к устойчивым, так и обратные, при
которых к чувствительным будет отнесен штамм, устойчивый с
микробиологической точки зрения.
6.2. Определение чувствительности представителей
семейства Enterobacteriaceae
Представители семейства Enterobacteriaceae являются одними из
ведущих этиологических агентов как внебольничных, так и
нозокомиальных инфекций, для них характерно крайнее разнообразие
возможных механизмов резистентности к АБП.
При тестировании микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae
рекомендуется использовать отдельные наборы АБП для определения
чувствительности возбудителей:
- внекишечных инфекций (кроме инфекций мочевыводящих путей);
- кишечных инфекций (Shigella spp., Salmonella spp.,
Escherichia spp.);
- внебольничных инфекций мочевыводящих путей (ИМП).
Необходимость такого разделения связана с особенностями
фармакокинетики отдельных АБП в желудочно-кишечном тракте и
мочевыводящих путях, а также различиями в их клинической
эффективности.
Критерии интерпретации результатов определения чувствительности
для штаммов Enterobacteriaceae (пограничные значения МПК АБП и
соответствующие диаметры зон подавления роста) приведены в табл.
2.
Оценка антибиотикочувствительности Enterobacteriaceae -
возбудителей внекишечных инфекций
Основу лечения внекишечных инфекций, вызываемых представителями
семейства Enterobacteriaceae, составляют бета-лактамные
антибиотики. Выбор препаратов для включения в исследование
чувствительности, а также принципы интерпретации результатов
основываются на данных о природной активности антибиотиков.
Несмотря на наличие природной активности в отношении некоторых
представителей Enterobacteriaceae такие препараты, как
незащищенные амино-, карбокси- и уреидопенициллины, а также
цефалоспорины I поколения практически полностью утратили значение
при лечении инфекций, вызываемых этими бактериями, в этой связи
оценка чувствительности к ним лишена практического смысла.
Препаратами альтернативными бета-лактамам являются
аминогликозиды и фторхинолоны.
Оценивать чувствительность возбудителей внекишечных инфекций к
тетрациклинам, хлорамфениколу и ко-тримоксазолу в настоящее время
нецелесообразно. Препараты относятся к бактериостатикам и
существенно уступают по эффективности антибиотикам других групп,
кроме этого среди микроорганизмов к ним широко распространена
резистентность. Перечень препаратов, предлагаемых для тестирования
в отношении представителей семейства Enterobacteriaceae, приведен
в табл. 13.
Характеристика препаратов первого ряда
В первую очередь чувствительность представителей семейства
Enterobacteriaceae необходимо оценивать к следующим препаратам.
Ампициллин. Является типовым представителем подгруппы
аминопенициллинов. Получаемые результаты можно полностью
экстраполировать на амоксициллин. Оценивать чувствительность к
амоксициллину нецелесообразно, поскольку критерии чувствительности
к этому антибиотику для Enterobacteriaceae не обоснованы.
Включение ампициллина в набор для тестирования Enterobacteriaceae
объясняется не столько клиническим значением этого антибиотика,
сколько важностью для оценки фенотипа исследуемого микроорганизма
и внутреннего контроля качества.
Ингибиторзащищенный аминопенициллин. Амоксициллин/клавуланат и
ампициллин/сульбактам во многом сходны по своим антибактериальным
свойствам. В то же время необходимо иметь в виду, что клавуланат
является более эффективным ингибитором бета-лактамаз. Возможны
отдельные случаи сохранения чувствительности к
амоксициллину/клавуланату при устойчивости к
ампициллину/сульбактаму.
Цефотаксим или цефтриаксон. Оба цефалоспорина практически
идентичны по своим антибактериальным свойствам. Результаты
исследования чувствительности к указанным антибиотикам необходимо
оценивать, учитывая возможную продукцию микроорганизмами БЛРС. При
подтверждении продукции БЛРС все цефалоспорины необходимо
рассматривать как клинически недостаточно эффективные независимо
от конкретных результатов тестирования.
Цефтазидим. Антибиотик не рекомендуется для лечения инфекций,
вызываемых Enterobacteriaceae. Однако поскольку цефтазидим высоко
чувствителен к действию большинства БЛРС, то он может служить
маркером продукции этих ферментов исследуемым микроорганизмом.
Гентамицин. Результаты, получаемые при оценке чувствительности
к гентамицину, нельзя экстраполировать на другие аминогликозиды.
Фторхинолон. Применительно к Enterobacteriaceae существенных
различий в уровне антибактериальной активности между
ципрофлоксацином, офлоксацином, пефлоксацином, а также новыми
"антипневмококковыми" фторхинолонами нет. Между перечисленными
препаратами наблюдают практически полную перекрестную
резистентность. Выбор конкретного фторхинолона для включения в
исследования должен основываться на местных условиях.
Характеристика дополнительных препаратов
Включение в набор для исследования дополнительных антибиотиков
определяется особенностью ЛПУ.
В случае тяжелых, крайне тяжелых и, особенно, госпитальных
инфекций в исследование целесообразно включать следующие
антибиотики.
Карбапенемы. Поскольку устойчивость к этим антибиотикам среди
Enterobacteriaceae встречается очень редко и, как правило, носит
перекрестный характер между отдельными представителями группы, то
в исследование достаточно включать лишь один препарат.
Цефепим. Антибиотик обладает значительно большей устойчивостью
к хромосомным бета-лактамазам класса С в сравнении с
цефалоспоринами III поколения, может также сохранять активность в
отношении части продуцентов БЛРС.
Цефоперазон/сульбактам, тикарциллин/клавуланат. Препараты могут
сохранять активность in vitro в отношении части продуцентов БЛРС.
Однако клиническое значение этого феномена не определено. Данные,
подтверждающие наличие или отсутствие клинической эффективности
указанных АБП при инфекциях, вызываемых продуцентами БЛРС,
отсутствуют.
Цефокситин. Антибиотик не имеет реального значения в лечении
инфекций, вызванных Enterobacteriaceae, однако может быть
использован для дифференцирования продуцентов БЛРС и AmpC.
Продуценты БЛРС - чувствительны, продуценты AmpC - устойчивы.
Амикацин. К амикацину сохраняет чувствительность значительная
часть штаммов, устойчивых к гентамицину. Оценивать
чувствительность Enterobacteriaceae к другим аминогликозидам
нецелесообразно.
Для оценки чувствительности возбудителей инфекций легкой и
средней степеней тяжести в исследование следует включать
цефалоспорины II поколения и оральные цефалоспорины II - III
поколений.
При определении чувствительности микроорганизмов семейства
Enterobacteriaceae особенно важным является выявление штаммов,
вырабатывающих бета-лактамазы расширенного спектра (БЛРС).
Необходимость дополнительной детекции данного механизма
устойчивости связана с тем фактом, что часть продуцентов БЛРС при
применении существующих критериев попадает в категорию
чувствительных, однако клинические наблюдения свидетельствуют о
недостаточной эффективности цефалоспоринов II - IV при инфекциях,
вызываемых такими микроорганизмами. Для детекции БЛРС предлагается
последовательное проведение скрининга (выявление подозрительных
штаммов) и подтверждающих тестов в отношении подозрительных
штаммов. Для эффективного скрининга в рутинное микробиологическое
исследование необходимо включать несколько цефалоспориновых
антибиотиков, минимальный набор должен включать 3 цефалоспорина
III поколения: цефотаксим, цефтриаксон и цефтазидим.
Методы скрининга БЛРС и подтверждающие тесты приведены ниже.
В случае выявления или подозрения на продукцию БЛРС необходимо
информировать лечащих врачей о высокой вероятности клинической
неэффективности терапии пенициллинами и цефалоспоринами I - IV
поколений, независимо от конкретных результатов определения
чувствительности.
При выдаче результатов тестирования микроорганизмов группы
Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Morganella, Providencia
необходимо указывать, что при монотерапии генерализованных
инфекций, вызванных данными возбудителями, цефалоспоринами III
поколения возможно развитие резистентности в процессе лечения.
При интерпретации результатов оценки устойчивости к
аминогликозидам следует ориентироваться на следующие особенности.
Широкий субстратный профиль аминогликозидмодифицирующих ферментов,
возможность продукции микроорганизмами семейства Enterobacteriacae
одновременно нескольких энзимов приводят к частой перекрестной
резистентности между отдельными препаратами. На основании данных о
чувствительности или устойчивости исследуемого микроорганизма к
одному или нескольким аминогликозидам прогнозировать уровень
резистентности к другим антибиотикам этой группы практически
невозможно.
Интерпретация результатов оценки резистентности к хинолонам,
как правило, не вызывает затруднения. Штаммы, устойчивые к
нефторированным хинолонам, могут сохранять чувствительность к
фторированным. На практике можно считать, что между
ципрофлоксацином, офлоксацином, пефлоксацином и ломефлоксацином
имеется полная перекрестная резистентность. Современные
антипневмококковые фторхинолоны (левофлоксацин, спарфлоксацин и
моксифлоксацин) не имеют преимуществ перед перечисленными
препаратами и характеризуются перекрестной резистентностью.
Тестирование Enterobacteriaceae - возбудителей кишечных
инфекций
Основную роль в этиологии кишечных инфекций играют
представители родов Shigella, Salmonella, Escherichia и Yersinia,
относящихся к семейству Enterobacteriaceae, а также семейств
Spirillaceae (род Campylobacter) и Vibrionaceae. В рутинной
практике при кишечных инфекциях определение чувствительности
следует проводить только для штаммов семейства Enterobacteriaceae.
Перечень АБП, подлежащих исследованию, весьма ограничен и
включает препараты с подтвержденной клинической эффективностью
(табл. 14). При генерализованных инфекциях, вызванных
микроорганизмами рода Salmonella (выделение возбудителя из
стерильных локусов), в исследование необходимо включать
цефалоспорины III поколения (цефотаксим или цефтриаксон).
Дополнительно возможно включение хлорамфеникола и
тетрациклинов, однако их роль в лечении инфекций желудочно-
кишечного тракта представляется на сегодняшний день крайне
сомнительной. В то же время результаты определения
чувствительности к этим АБП могут иметь определенное значение для
эпидемиологического мониторинга.
Тестирование Enterobacteriaceae - возбудителей внебольничных
инфекций мочевыводящих путей (ИМП)
С практической точки зрения ИМП крайне важно разделять на
внебольничные и нозокомиальные. Для тестирования штаммов
Enterobacteriaceae, выделенных при нозокомиальных ИМП, следует
использовать тот же перечень АБП, что и для определения
чувствительности возбудителей инфекций различной локализации.
Формирование отдельного набора антибактериальных препаратов для
оценки чувствительности возбудителей внебольничных инфекций
мочевыводящих путей целесообразно при наличии значительного потока
таких исследований. Примерный перечень препаратов приведен в табл.
15.
Выявление БЛРС у штаммов Enterobacteriaceae фенотипическими
методами
Обоснованные рекомендации по выявлению БЛРС фенотипическими
методами распространяются только на штаммы Klebsiella spp. и E.
coli. Однако продукция БЛРС может отмечаться практически у всех
видов семейства Enterobacteriaceae и ряда других грамотрицательных
микроорганизмов. Учитывая распространенность ферментов этой
группы, представляется целесообразным проведение скрининга всех
выделенных в лаборатории штаммов Enterobacteriaceae с последующим
использованием специальных подтверждающих исследований у любых
штаммов, которые по данным предварительного тестирования проявляют
пониженную чувствительность хотя бы к одному из цефалоспоринов III
поколения (МПК >= 2 мг/л либо эквивалентное уменьшение диаметра
зоны подавления роста - табл. 3).
Скрининг не предполагает проведения специального исследования,
его основу должен составлять анализ данных, получаемых в рутинной
практике. В то же время для эффективного скрининга в рутинное
микробиологическое исследование необходимо включать несколько
цефалоспориновых антибиотиков, даже если использование некоторых
из них в качестве терапевтических препаратов не планируется.
Наиболее чувствительными к гидролизу БЛРС считаются цефподоксим и
цефтазидим. Соответственно, эти препараты целесообразно включать в
набор для определения чувствительности Enterobacteriaceae. При
отсутствии возможности тестирования цефподоксима минимальный набор
цефалоспоринов III поколения, используемых для определения
чувствительности грамотрицательных микроорганизмов, должен
включать цефотаксим, цефтриаксон и цефтазидим.
Чем больше цефалоспоринов использовано для тестирования, тем
более достоверными будут результаты выявления БЛРС. Некоторые
штаммы могут проявлять высокий уровень устойчивости ко всем АБП, у
других же обнаруживается лишь незначительное повышение МПК к 1 - 2
АБП цефалоспоринового ряда. Результаты тестирования Klebsiella
spp. и Е. coli к цефалоспоринам, указывающие на возможную
продукцию БЛРС этими штаммами, приведены в табл. 10.
После выявления штамма, подозрительного на продукцию БЛРС,
рекомендуется провести подтверждающий тест.
Тесты, подтверждающие продукцию БЛРС
Все фенотипические тесты для подтверждения продукции БЛРС
являются вариантами стандартных методов определения
чувствительности к АБП и основаны на ингибиции БЛРС клавуланатом.
При постановке этих тестов проводится сравнение чувствительности
исследуемых микроорганизмов к различным цефалоспоринам III
поколения и к комбинации этих антибиотиков с клавулановой
кислотой.
Диско-диффузионный метод предусматривает использование
стандартных дисков с обычным содержанием цефотаксима и цефтазидима
(30 мкг) или диска с цефподоксимом (10 мкг), а также диски,
содержащие комбинации: цефотаксим + клавуланат или цефтазидим +
клавуланат (30/10 мкг) или цефподоксим + клавуланат (10/10 мкг). В
исследование целесообразно включать одновременно и диски с
цефотаксимом и диски с цефтазидимом и их комбинациями с
клавуланатом.
Постановка теста
Методика приготовления микробной взвеси и инокуляции чашек с
агаром стандартные. На поверхность агара накладывают диски с
цефалоспоринами и их комбинациями с клавулановой кислотой. Чашки
инкубируют в термостате при 35 -С в течение 18 - 20 ч.
Интерпретация результатов
Различие в диаметрах зон подавления роста для дисков с
цефподоксимом/клавулановой кислотой и цефподоксимом на 6 мм и
более, для дисков с цефотаксимом/клавулановой кислотой и
цефотаксимом, цефтазидимом/клавулановой кислотой и цефтазидимом -
на 5 мм и более свидетельствует о продукции штаммом БЛРС.
Необходимо подчеркнуть, что результат считается положительным,
если указанные различия получены хотя бы для одной пары дисков.
Контроль качества
Для контроля качества исследования необходимо использовать два
штамма (отрицательный и положительный контроли):
- отрицательный контроль. При тестировании контрольного штамма
Е. coli, не продуцирующего бета-лактамаз, различия в диаметрах зон
между дисками с ингибитором и без него не должны превышать 2,0 мм;
- положительный контроль. При тестировании контрольного штамма
К. pneumoniae, продуцирующего БЛРС, различия в диаметрах зон между
дисками с цефподоксимом/клавулановой кислотой и цефподоксимом >= 6
мм, с цефотаксимом/клавулановой кислотой и цефотаксимом > 3 мм, с
цефтазидимом/клавулановой кислотой и цефтазидимом >= 5 мм.
Метод серийных разведений в бульоне предполагает использование
двойных серийных разведений препаратов в следующих диапазонах
концентраций: цефтазидима от 0,25 до 128,0 мг/л,
цефтазидима/клавуланата от 0,25/4,0 до 128,0/4,0 мг/л; цефотаксима
от 0,25 до 64,0 мг/л; цефотаксима/клавуланата от 0,25/4,0 до
64,0/4,0 мг/л. В исследование целесообразно включать оба
цефалоспорина и их комбинации с клавулановой кислотой.
Постановка теста
Методика выполнения исследования (приготовление разведений
антибиотиков в бульоне, микробной взвеси, инокуляция и инкубация)
- стандартная.
Интерпретация результатов
Снижение МПК цефтазидима или цефотаксима не менее чем в 8 раз
(на 3 последовательных двукратных разведения) в присутствии
ингибитора, в сравнении со значениями МПК соответствующих
цефалоспоринов без ингибиторов, свидетельствует о продукции
штаммом БЛРС.
Контроль качества
Отрицательный контроль. При тестировании контрольного штамма Е.
coli, не продуцирующего бета-лактамаз, соотношения МПК
соответствующих цефалоспоринов III поколения к МПК их комбинации с
клавуланатом должны быть < 8.
Положительный контроль. Для штамма К. pneumoniae,
продуцирующего БЛРС, соотношения значений МПК цефалоспоринов и МПК
их комбинаций с клавуланатом должны быть >= 8.
Метод двойных дисков
Хотя этот метод и не относится к хорошо стандартизованным,
чувствительность, специфичность и простота выполнения позволяют
рассматривать его приемлемым методом для рутинной практики. Метод
предполагает использование доступных коммерческих дисков с
цефалоспоринами III поколения и с амоксициллином/клавуланатом.
Метод "двойных дисков" представляет собой вариант классического
ДДМ определения чувствительности, который позволяет выявить
продукцию БЛРС по наличию расширенной зоны подавления роста вокруг
диска с каким-либо цефалоспорином III поколения напротив диска,
содержащего клавулановую кислоту (синергизм отмечается в участке
пересечения зон диффузии двух дисков, расположенных на небольшом
расстоянии друг от друга).
Постановка теста
Методика приготовления микробной взвеси, инокуляции и инкубации
чашек не имеет отличий от стандартного ДДМ. Особенностью метода
является то, что через 5 - 10 мин. после инокуляции на поверхность
агара накладывают диски с АБП: в центр - диск, содержащий
клавулановую кислоту, обычно в виде комбинации
амоксициллин/клавуланат (20/10 мкг), по бокам от него на
расстоянии 20 и 30 мм между центрами дисков - диски с цефтазидимом
(30 мкг) и цефотаксимом (30 мкг). Использование двух дисков
каждого АБП, расположенных на разном расстоянии от диска с
клавулановой кислотой, позволяет повысить эффективность
обнаружения БЛРС.
Интерпретация результатов
Если тестируемый микроорганизм вырабатывает БЛРС (действие
которых в большинстве случаев обратимо клавуланатом), зона
подавления роста вокруг диска с цефалоспорином III поколения
окажется "вытянутой" в сторону диска с амоксициллином/клавуланатом
(рис. 2) Причиной данного эффекта является дополнительное
подавление роста микроорганизма в той зоне, куда диффундируют и
клавуланат и цефалоспорин III поколения. Тест сугубо качественный
и требует определенных навыков при интерпретации.
Отрицательные результаты:
a) E. coli (БЛРС-)б;
b) E. cloacae (гиперпродукция AmpC).
Положительные результаты:
с), d) К. pneumoniae (БЛРС+).
Обозначения дисков:
AMC - амоксициллин/клавулановая кислота (20/10 мкг);
CAZ - цефтазидим (30 мкг);
CTX - цефотаксим (30 мкг);
CPO - цефпиром (30 мкг).
Контроль качества
Параллельно с анализом исследуемых культур тестируют
контрольные штаммы.
К сожалению ни один из традиционных микробиологических методов,
основанных на оценке фенотипа микроорганизма, не обеспечивает
выявление БЛРС в 100% случаев. Ситуация существенно затрудняется
при наличии у микроорганизмов нескольких детерминант устойчивости
одновременно, что встречается достаточно часто. Например, при
продукции БЛРС и гиперпродукции хромосомных бета-лактамаз класса С
устойчивость последних к клавуланату маскирует присутствие БЛРС.
6.3. Определение чувствительности
P. aeruginosa, Pseudomonas spp., Acinetobacter spp.
и других неферментирующих бактерий (НФБ)
При определении чувствительности НФБ следует иметь в виду, что
ДДМ достаточно стандартизован лишь для P. aeruginosa и
Acinetobacter spp. При исследовании Stenotrophomonas maltophilia,
Pseudomonas spp. (кроме P. aeruginosa) и других НФБ, предпочтение
следует отдавать методам серийных разведений. Примерный перечень
АБП, рекомендуемых для определения чувствительности
рассматриваемой группы бактерий, приведен в табл. 12.
Препараты первого ряда
В первую очередь для оценки антибиотикочувствительности
Pseudomonas spp. и Acinetobacter spp. следует использовать
препараты, отличающиеся наибольшей природной активностью.
Цефтазидим. Является одним из основных АБП, используемых для
лечения инфекций, вызываемых рассматриваемой группой
микроорганизмов.
Цефепим. При сопоставимом с цефтазидимом уровне природной
активности в ряде случаев цефепим сохраняет активность в отношении
микроорганизмов, устойчивых к цефтазидиму.
Гентамицин, амикацин. Аминогликозиды для монотерапии инфекций,
вызываемых рассматриваемой группой бактерий, не применяются,
однако во многих случаях являются необходимым компонентом
комбинированных схем терапии. Целесообразность включения в
перечень препаратов первого ряда амикацина и гентамицина
обосновывается высокой частотой устойчивости к последнему
антибиотику в ряде учреждений.
Ципрофлоксацин. Среди фторхинолонов ципрофлоксацин является
препаратом выбора при лечении рассматриваемой группы инфекций.
Меропенем, имипенем. Меропенем характеризуются наибольшим
уровнем активности в отношении рассматриваемой группы
микроорганизмов, имипенем ему несколько уступает. Целесообразность
включения обоих карбапенемов объясняется отсутствием между ними в
некоторых случаях перекрестной резистентности.
Дополнительные препараты
Дополнительные препараты по уровню природной активности, как
правило, уступают антибиотикам первого ряда, однако во многих
случаях, прежде всего, по экономическим соображениям могут быть
использованы в терапии. Кроме этого необходимо учитывать, что
неферментирующие бактерии существенно различаются по уровню
природной чувствительности к АБП.
Азтреонам, цефоперазон. По основным свойствам близки к
цефтазидиму.
Цефоперазон/сульбактам, тикарциллин/клавуланат. Доступные
ингибиторы не способны подавлять активность большинства бета-
лактамаз, распространенных среди P. aeruginosa, и в силу этого
комбинированные препараты не обладают существенными преимуществами
в сравнении с исходными антибиотиками.
Цефоперазон/сульбактам (а также ампициллин/сульбактам) могут
иметь реальное значение в лечении инфекций, вызываемых
Acinetobacter spp., благодаря наличию у сульбактама собственной
активности в отношении указанного микроорганизма.
При инфекциях, вызываемых Stenotrophomonas maltophilia,
клиническое значение имеет ко-тримоксазол и
тикарциллин/клавуланат. Микроорганизм обладает природной
устойчивостью ко всем бета-лактамам, кроме
тикарциллина/клавуланата.
Карбенициллин. В силу выраженной токсичности и высокой частоты
устойчивости применение карбенициллина даже для лечения инфекций,
вызываемых P. Aeruginosa, следует признать нецелесообразным.
Очевидно, что "неферментирующие" микроорганизмы нельзя
рассматривать как единую группу с точки зрения их природной
чувствительности к антибиотикам. Оценка
антибиотикочувствительности редких видов "неферментирующих"
микроорганизмов требует индивидуального подхода.
Поскольку тяжелые инфекции, вызываемые псевдомонадами, являются
показанием для назначения комбинированной терапии, целесообразно
при выдаче ответа в клинику указывать на наиболее эффективную с
микробиологической точки зрения комбинацию антибиотиков.
Пограничные значения МПК антибиотиков (и соответствующие
диаметры зон ингибиции роста) в отношении Pseudomonas spp.,
|
