|
Стр. 2
Необходимое оборудование
1. Штатив.
2. Стеклянная воронка (диаметром 10 см).
3. Металлическое сито или сетка "мельничный газ".
4. Резиновая трубка с зажимом.
5. Предметные стекла.
6. Стеклянные или деревянные палочки.
7. Чашки Петри.
8. Центрифуга.
9. Микроскоп.
Подготовка к работе
Собрать аппарат Бермана, для чего закрепить в штативе
стеклянную воронку с металлическим ситом. На нижний конец воронки
надеть резиновую трубку с зажимом.
Ход исследования
Пробу фекалий 20 - 50 г поместить на металлическое сито или
мелкоячеистую металлическую сетку, или сетку "мельничный газ".
Сетку с пробой фекалий приподнять и в воронку налить нагретую
до 40 - 50 -С воду таким образом, чтобы нижняя часть сетки с калом
была погружена в воду.
Через 2 - 4 ч зажим на резиновой трубке быстро открыть и
жидкость спустить в центрифужную пробирку.
Полученную жидкость центрифугировать 1 - 2 мин.
Надосадочную жидкость быстро слить.
Осадок нанести на предметное стекло или в чашку Петри.
Микроскопировать при увеличении: объектив х 8 или х 10, окуляр
х 7 или х 10 (можно использовать стереоскопический микроскоп МБС),
уточнение морфологического строения при увеличении: объектив х 40,
окуляр х 10.
Эффективность метода
Является эффективным методом выявления рабдитовидных личинок
стронгилоидес.
Эффективность методики возрастает при увеличении экспозиции
фекалий в воде.
Применение метода
Применяется как специальный метод для диагностики
стронгилоидоза.
4.2.2.2. Метод Бермана в модификации Супряги
Необходимые реактивы и оборудование
1. Дистиллированная вода.
2. Химические стаканчики.
3. Стеклянные палочки.
4. Чашки Петри.
5. Пробирки центрифужные.
6. Стереоскопический микроскоп МБС.
Ход исследования
В химический стаканчик положить порцию фекалий 10 - 15 г
(величиной с орех).
Залить теплой (40 -С) дистиллированной водой, чтобы фекалии
были полностью покрыты.
Через 20 - 30 мин. слить жидкость в центрифужные пробирки.
Отстаивают 10 - 15 мин. или центрифугируют 1 мин. при 1500
об./мин.
Слить осторожно надосадочную жидкость, осадок поместить в чашку
Петри.
Исследовать осадок в чашке Петри под бинокулярным
стереоскопическим микроскопом МБС (с нижней подсветкой): объектив
х 2, окуляр х 12, х 14; обращая внимание на подвижных,
слабоподвижных и неподвижных личинок.
Неподвижные личинки микроскопируют с увеличением: объектив х 8,
х 10 и х 40; окуляр х 10.
Эффективность метода
Эффективен при высокой и средней интенсивности инвазии и менее
эффективен при низкой интенсивности инвазии.
Рекомендуется сочетать с исследованием дуоденального
содержимого.
Применение метода
Чаще используется для диагностики стронгилоидоза при массовых
обследованиях.
Данная методика может быть использована для диагностики
простейших - балантидий, при экспозиции фекалий в воде до 1,5 - 2
ч (п. 4.2.4.3).
4.2.2.3. Метод культивирования личинок на фильтровальной бумаге
(метод Харада-Мори в модификации Маруашвили)
Необходимое оборудование
1. Фильтровальная бумага (размером 16 х 3,5 см).
2. Стеклянная банка (0,7 - 0,8 л).
3. Полиэтиленовая пленка.
4. Термостат.
5. Центрифуга.
6. Водяная баня.
Ход исследования
На фильтровальную бумагу нанести свежевыделенные фекалии в виде
мазка, оставляя края фильтровальной бумаги свободными.
Смочить стенки банки водой, опустить в банку фильтровальную
бумагу и поверхностью без фекалий зафиксировать ее на стенках
банки.
Налить в банку воды так, чтобы в нее был погружен нижний конец
бумаги без фекалий.
Верх банки закрыть полиэтиленовой пленкой или чашкой Петри.
Банку поставить в термостат при температуре 28 -C на 5 - 6 дней
(в теплое время года банку можно оставлять при комнатной
температуре, увеличив экспозицию до 8 - 10 дней).
Часть личинок может подняться вверх по фильтровальной бумаге,
поэтому работа должна проводиться с соблюдением техники
безопасности.
Для безопасности можно предварительно убить личинки, поместив
пробирку в водяную баню при температуре 50 -C на 15 мин.
Эффективность метода
Эффективен для обнаружения и идентификации личинок
анкилостомид.
Применение
Для диагностики анкилостомидозов.
4.2.3. Исследование перианальных соскобов
Необходимые реактивы и оборудование
Кроме микроскопа, необходимое оборудование зависит от способа
получения соскоба: деревянный шпатель, шпатель с ватным тампоном,
предметные и покровные стекла, полоски прозрачной липкой ленты,
глазные палочки со специальным клеевым слоем и др.
Подготовка к работе
При массовых обследованиях населения (в основном детского)
заранее подготовить шпатели с тампонами и пробирки, или предметные
стекла с липкой лентой, флаконы, или специальные штативы с
глазными палочками, покрытыми клеевым слоем. Промаркировать
предметные стекла, пробирки или флаконы либо маркировать во время
забора материала у обследуемых согласно номеру по списку. Методы
отбора соскобов с перианальных складок - см. п. 2.1.2.
Ход исследования: зависит от способа отбора материала.
4.2.3.1. Метод перианального соскоба липкой лентой по Грэхем
Примечание. Пригодна полиэтиленовая прозрачная пленка с липким
слоем для детского технического творчества, но лучше использовать
операционную пленку ЛПО-1, ЛПО-2.
Подготовить отрезок липкой ленты длиной 8 - 10 см,
предварительно наклеить его на предметное стекло.
Перед взятием соскоба отклеить полоску липкой ленты от
предметного стекла, держа полоску за концы, плотно прижать всей
липкой поверхностью к анусу и перианальным складкам, стараясь
пальцами рук не касаться перианальной области.
Отклеить полоску от кожи перианальной области и перенести на
предметное стекло липким слоем вниз, приклеить к стеклу равномерно
для избежания образования воздушных пузырей, мешающих микроскопии.
Концы ленты, выходящие за края стекла, отрезать.
Микроскопировать при увеличении: объектив х 8 или х 10, окуляр
х 7 или х 10.
Примечание. Метод применяется как для индивидуального, так и
для массового обследования.
4.2.3.2. Метод перианального соскоба с применением стеклянных
глазных палочек с клеевым слоем по Рабиновичу
Пропись клея: клеол - 10 мл, касторовое масло - 2,5 мл,
этиловый эфир - 5 мл, этиловый спирт 96,5%-ный - 2,5 мл (хранение
во флаконе по 20,0 мл с плотно притертой пробкой).
Подготовить стеклянные глазные палочки (лучше с широкими
лопаточками): промыть, обезжирить и простерилизовать (кипячением
или автоклавированием), высушить; сухую лопаточку глазной палочки
обмакнуть в клей; просушить не менее 2 - 4 ч (глазная палочка при
этом должна находиться лопаточкой вверх для стекания избытка клея
и образования равномерной пленки).
Клей, обтекая лопаточку, образует прозрачную клейкую пленку,
сохраняющуюся после высыхания не менее недели (что позволяет
готовить палочки заранее).
Установить глазные палочки в специальный штатив, где каждая
ячейка имеет свой номер, или использовать пронумерованные
пенициллиновые флаконы, предварительно закрепив ручку глазной
палочки в резиновой пробке от этого пузырька.
Взять соскоб путем соприкосновения или "отпечатка" плоской
частью лопаточки обеих сторон с кожей перианальных складок.
Снова укрепить палочку в штативе или пенициллиновых пузырьках
(промаркированных соответственно номеру, присвоенному обследуемому
по списку, или регистрационному номеру в журнале) для доставки в
лабораторию.
Укрепить глазную палочку в специальном держателе для просмотра
под микроскопом.
Микроскопировать непосредственно плоскую поверхность лопаточки
поочередно с обеих сторон при увеличении: окуляр х 7 или х 10,
объектив х 8 или х 10.
Использованные палочки дезинфицировать кипячением в мыльном
растворе, тщательно промыть, прополоскать, обезжирить в смеси
Никифорова, просушить в сухожаровом шкафу. Штатив и кассеты
обработать 70%-ным спиртом и промыть мыльно-содовым раствором.
Пенициллиновые пузырьки и резиновые пробки дезинфицировать
кипячением или автоклавированием.
Примечание. Метод гигиеничен и достаточно прост в применении,
применяется как для индивидуального, так и для массового
обследования.
4.2.3.3. Метод перианального соскоба по Торгушину
Ватный тампон, накрученный на деревянном или стеклянном
шпателе, смочить в растворе глицерина.
Обтереть тампоном перианальные складки вокруг ануса.
На предметное стекло поместить каплю глицерина.
Слегка ударяя по предметному стеклу, обмыть тампон в капле
глицерина.
Полученный препарат микроскопировать без покровного стекла;
увеличение: объектив х 8 или х 10, окуляр х 7 или х 10.
Примечание. Недостаток метода: часть яиц остается на ватном
тампоне - неудобен при массовых обследованиях.
4.2.3.4. Метод перианального соскоба по Кеворковой
Налить в центрифужную пробирку около 5 мл кипяченой или
дистиллированной воды.
Поместить в него шпатель (палочку) с ватным тампоном.
Перед забором соскоба слегка отжать тампон о внутреннюю стенку
пробирки.
Обтереть тампоном перианальные складки.
Вложить шпатель с тампоном в пробирку с водой.
Тщательно прополоскать тампон в пробирке с водой и удалить
шпатель с тампоном из пробирки.
Полученный смыв центрифугировать в течение 3 мин. при 1500
об./мин.
Слить надосадочную жидкость.
Осадок перенести на предметное стекло, покрыть покровным
стеклом.
Микроскопировать при увеличении: объектив х 8 или х 10, окуляр
х 7 или х 10.
Примечание. Недостаток метода: неудобен при массовых
обследованиях.
Эффективность методов соскоба
Эффективны для выявления яиц гельминтов, находящихся на
перианальных складках: яйца остриц и онкосферы тениид.
Применение метода
Методы перианального соскоба применяются для диагностики
энтеробиоза, тениаринхоза и тениоза при индивидуальной диагностике
или массовом обследовании детского и взрослого населения.
4.2.4. Копропротозооскопия (исследование фекалий на кишечные
простейшие)
4.2.4.1. Метод нативного мазка с физраствором и раствором
Люголя
Необходимые реактивы и оборудование
1. Физиологический раствор.
2. Раствор Люголя 1%-ный.
3. Буферный раствор метиленового синего.
4. Уксусно-кислый спиртовой раствор йода.
5. Предметные и покровные стекла.
6. Деревянные палочки.
7. Стеклянные пипетки.
8. Стерильная стеклянная или пластиковая посуда (для забора
фекалий).
9. Микроскоп.
Подготовка к работе
Для исследования выбирают в первую очередь неоформленные
фекалии, участки слизи или прожилки крови в кале.
Фекалии исследуют теплыми, т.е. не позднее 15 - 20 мин. после
дефекации, когда возможно обнаружение подвижных вегетативных форм
(трофозоитов) простейших (время можно увеличить до 45 мин. и до 1
ч, если фекалии сохранялись это время в холодильнике при
температуре 4 - 5 -C).
Физиологический раствор подогреть до 36 - 37 -C.
Приготовление маточного 5%-ного раствора Люголя: 10 г иодида
калия растворить в 30 мл дистиллированной воды + 5 г
кристаллического йода, размешать до полного растворения и долить
до 100 мл дистиллированной водой. Хранить после приготовления в
склянке из темного стекла.
Приготовление рабочего 1%-ного раствора Люголя: 5 мл маточного
5%-ного раствора Люголя соединить с 20 мл физиологического
раствора, хорошо перемешать. Хранить в склянке из темного стекла
не более 14 дней.
Приготовление буферного метиленового синего: 50 мл
дистиллированной воды + 46,3 мл раствора уксусной кислоты (1,2 мл
ледяной уксусной кислоты + 98,8 мл дистиллированной воды) + 3,7 мл
раствора уксусно-кислого натрия (1,6 г уксусно-кислого натрия +
100 мл дистиллированной воды) + 0,5 г метиленового синего.
Приготовленный раствор хорошо перемешивается, настаивается 15 мин.
и фильтруется.
Приготовление уксусно-кислого спиртового раствора йода: 10 мл
спиртового раствора Люголя (40 мл 70%-ного этилового спирта +
несколько кристаллов йода хорошо перемешать, раствор должен иметь
цвет "крепкого чая") + 10 мл 25%-ного раствора уксусной кислоты.
Ход исследования
Нанести на предметное стекло 1 каплю изотонического теплого (36
- 37 -C) раствора в левой половине и 1 каплю 1%-ного раствора
Люголя в правой половине предметного стекла.
Выбрать из пробы фекалий деревянной палочкой патологические
примеси или немного фекалий (с булавочную головку) и перенести в
каплю физраствора и растереть до получения равномерной негустой
эмульсии, а затем поместить в каплю с Люголем и также растереть.
Накрыть капли покровным стеклом (через правильно приготовленный
мазок можно видеть газетный шрифт).
Микроскопировать при увеличении: сначала - объектив х 8 или х
10, окуляр х 10, затем объектив х 40, в т.ч. для дифференциальной
диагностики амеб и жгутиковых, включая лямблии и диэнтамебу.
Примечания.
1. Для дифференциальной диагностики трофозоитов дизентерийной
амебы с непатогенными амебами необходимо приготовить препарат с
буферным раствором метиленового синего: нанести на предметное
стекло большую каплю буферного раствора метиленового синего, в нее
внести деревянной палочкой небольшое количество слизи, фекалий с
прожилками крови, накрыть покровным стеклом, дать постоять 5 - 10
мин., чтобы краска проникла в трофозоиты, и сразу микроскопировать
для исключения перекрашивания трофозоитов.
Результат окрашивания: трофозоиты амеб окрашиваются в разные
оттенки синего - ядро синее, цитоплазма голубая, эритроциты синие.
Цисты амеб, трофозоиты, цисты жгутиковых и ооцисты кокцидий не
окрашиваются.
2. Для выявления ооцист кокцидий: при выполнении вышеописанной
методики приготовления нативного мазка с физраствором и 1%-ным
раствором Люголя, в одну из капель вместо 1%-ного р-ра Люголя
вносится капля уксусно-кислого спиртового раствора йода. Палочкой
внести небольшое количество фекалий, растереть, накрыть покровным
стеклом; микроскопировать при тех же увеличениях. Ооцисты изоспоры
выявляются, благодаря хорошей окраске ядер.
Эффективность метода
Позволяет выявлять вегетативные формы патогенных простейших и
комменсалов, анализировать тип их движения (что имеет важное
значение при видовой идентификации простейших, особенно
жгутиковых).
Диагностика амебиаза эффективна только при строгом соблюдении
стерильного забора фекалий и микроскопического исследования не
позднее 15 - 20 мин. после дефекации.
Позволяет определять видовые признаки цист амеб и жгутиковых,
ооцист кокцидий, благодаря эффективной окраске йодом ядер,
жгутикового аппарата, гликогена.
Применение метода
Применяется для диагностики кишечных протозоозов: лямблиоза,
балантидиаза, амебиаза, кокцидиоза (изоспороза).
Для исследования на кишечные простейшие, в т.ч. на лямблии,
используются также методы: формалин-эфирного (уксусно-эфирного)
осаждения и исследование дуоденального содержимого (см. описание
методик в п. 4.2.1.2, 4.2.1.3, 5.1).
Примечание. В нативных препаратах с физиологическим раствором
при интенсивной инвазии также можно обнаружить яйца гельминтов и
личинки стронгилоидеса.
4.2.4.2. Комплексный метод исследования фекалий на кишечные
простейшие и гельминты из консерванта
Универсальный метод диагностики кишечных паразитозов,
вызываемых простейшими (амебы, жгутиковые, в т.ч. диентамеба,
балантидии и кокцидии) и гельминтами (нематоды, трематоды и
цестоды).
В основе метода лежит "диагностическая система" КТ-ФЭО-МЦН:
консервант Турдыева, формалин-эфирное обогащение, модифицированный
метод окраски Циля-Нильсена.
Принцип метода: отбор проб фекалий производят в консервант
Турдыева (п. 2.1.1), где паразиты фиксируются, и морфологические
признаки простейших, яиц и личинок гельминтов сохраняются
неизменными длительное время, это обеспечивает дальнейшее
исследование материала из единой пробы:
- методом влажного мазка из консерванта;
- методом мазка из осадка после эфир-формалинового обогащения
консервированного материала;
- модифицированным методом окрашивания по Цилю-Нильсену мазка
из осадка после обогащения материала из консерванта.
Эффективность комплексного метода
Выявляет весь спектр кишечных паразитов, в т.ч. редко
диагностируемых простейших (диэнтамеба, изоспора), яиц и личинок
гельминтов, не требующих специальных методов исследования
(например, культивирования и т.п.), включая возбудителей
оппортунистических инвазий (кокцидии, стронгилоидес).
Повышается выявляемость сочетанных инвазий.
Условия отбора материала: максимально быстро после дефекации с
помощью деревянной палочки фекалии переносят в стерильный флакон с
консервантом Турдыева (п. 2.1.1), если фекалии оформленные, то
количество должно быть в объеме с лесной орех, если жидкие -
объемом с чайную (столовую) ложку. Соблюдая соотношение: 3 части
консерванта и 1 часть фекалий. Флакон закрывают крышкой,
предварительно тщательно размешав фекалии деревянной палочкой до
гомогенной суспензии.
4.2.4.2.1. Метод влажного мазка из консерванта
Необходимое оборудование и реактивы
1. Консервант Турдыева.
2. Раствор Люголя 1%-ный.
3. Предметные и покровные стекла.
4. Деревянные палочки.
5. Микроскоп.
Ход исследования
На предметном стекле готовятся два препарата: пипеткой из
консерванта с фекалиями, очень осторожно, не взбалтывая содержимое
флакона, нанести две капли придонного осадка (в правой и левой
части стекла).
Растереть деревянной палочкой.
В одну из капель добавить каплю раствора Люголя 1%-ного.
Каждую каплю накрывают покровным стеклом (покровные стекла
можно окантовать вазелином для предотвращения высыхания и смещения
покровного стекла).
Микроскопируют при увеличении: объектив х 8 или х 10, окуляр х
7 или х 10, затем объектив х 40 (в отдельных случаях, например для
криптоспоридий, применяют увеличение объектива х 90 или х 100 и
микроскопируют с масляной иммерсией).
Эффективность метода
Эффективен для выявления цист и трофозоитов простейших, включая
редко выявляемую диентамебу, а также яиц и личинок гельминтов.
Применение метода
Для диагностики кишечных протозоозов.
Примечание. Ооцисты при достаточном количестве обнаруживаются в
верхнем слое мазка непосредственно под покровным стеклом по
эффекту негативного окрашивания раствором Люголя.
4.2.4.2.2. Метод исследования материала из консерванта формалин-
эфирным обогащением
Необходимое оборудование и реактивы
1. Физиологический раствор.
2. Раствор Люголя 1%-ный.
3. Этиловый эфир.
4. Раствор формалина 10%-ный нейтральный (для нейтрализации -
во флакон темного стекла с раствором формалина на дно слоем в 1 -
2 см насыпать порошкообразный углекислый кальций).
5. Палочки деревянные.
6. Центрифужные градуированные пробирки.
7. Воронки стеклянные.
8. Бинт (марля).
9. Стекла предметные и покровные.
10. Пипетки стеклянные.
11. Пробки резиновые.
12. Центрифуга.
13. Микроскоп.
Ход исследования
Перенести пипеткой в центрифужную пробирку осадок фекалий со
дна флакона с консервантом в объеме 1,5 - 2 мл.
Добавить 6 - 7 мл 10%-ного нейтрального формалина.
Закрыть пробирку резиновой пробкой и тщательно перемешать,
энергично встряхивая пробирку в течение 5 с.
Полученную взвесь перелить в другую центрифужную пробирку через
стеклянную воронку с двухслойным бинтом (марлей).
Добавить 2 - 3 мл этилового эфира.
Закрыть пробирку пробкой и энергично встряхивать в течение 30
с.
Убрать пробку и дать постоять пробирке в течение 2 мин. в
вытяжном шкафу.
Затем центрифугировать 2 мин. при 1500 об./мин. или 1 - 1,5
мин. при 3000 об./мин.
Отделить палочкой образовавшуюся "каловую пробку" от стенок
пробирки.
Перевернуть пробирку дном вверх и вылить содержимое (можно
ватным тампоном обтереть стенки пробирки, чтобы жидкость не
стекала на дно и не увеличивала объем осадка), пробирку поставить
в штатив.
На предметное стекло по обе стороны от центра нанести по капле
физиологического раствора и раствора Люголя.
Перенести в каждую каплю осадок из центрифужной пробирки,
размешать деревянной палочкой и накрыть каждую каплю покровным
стеклом.
Микроскопировать при увеличении: объектив х 8 или х 10, окуляр
х 7 или х 10, затем с объективом х 40 (при необходимости
использовать окуляр х 90 или х 100 с масляной иммерсией).
Применение метода
Для диагностики цист кишечных простейших и яиц гельминтов.
4.2.4.2.3. Модифицированный метод окрашивания по Цилю-Нильсену
мазков из осадка после обогащения консервированного материала
Необходимые реактивы и оборудование
1. Смесь Никифорова.
2. Серная кислота 10%-ная.
3. Фуксин основной.
4. Фенол.
5. Палочки деревянные.
6. Предметные стекла.
7. Химические стаканчики или "мостики" для окрашивания мазков.
8. Стеклянные пипетки.
9. Кюветы эмалированные.
10. Микроскоп.
Ход исследования
На предметное стекло нанести пипеткой каплю осадка из
центрифужной пробирки после обогащения (п. 4.2.4.2.2) и круговым
движением палочки приготовить мазок (можно добавить каплю
физиологического раствора, чтобы мазок не был густым).
Высушить на воздухе (тщательно).
Фиксировать мазок в смеси Никифорова в течение 20 - 30 мин.
После фиксации мазок высушить на воздухе.
Окрашивать мазок в растворе карболового фуксина (приготовление
в п. 4.2.4.4), поместив мазок в химический стаканчик с этой
краской на 45 мин!
Промыть мазок проточной водой.
Обесцветить мазок в 10%-ном растворе серной кислоты до
прекращения отхождения розовых "облачков" красителя.
Промыть тщательно проточной водой.
Подкрасить мазок 5%-ным раствором малахитового зеленого,
приготовленного на 10%-ном этиловом спирте в течение 2 - 5 мин.
Промыть мазок в воде.
Высушить мазок на воздухе.
Микроскопировать при увеличении: окуляр х 10, объектив х 90 или
х 100 с масляной иммерсией.
Применение метода
Для выявления ооцист кокцидий, включая криптоспоридии и
изоспоры.
Эффективность
Предварительная фиксация в консерванте и обогащение осаждением
повышает выявляемость ооцист по сравнению со стандартной методикой
диагностики ооцист кокцидий, включая криптоспоридии и изоспоры.
4.2.4.3. Метод Бермана в модификации для исследования на
балантидиаз
Необходимые реактивы и оборудование
1. Дистиллированная вода.
2. Химические стаканчики.
3. Палочки деревянные.
4. Чашки Петри.
5. Пробирки центрифужные.
6. Центрифуга.
7. Микроскоп.
Ход исследования
В химический стаканчик или в чашку Петри положить порцию
фекалий 10 - 15 г (величиной с орех), предварительно перемешав
фекалии.
Залить теплой (45 -C) дистиллированной водой, чтобы фекалии
были полностью покрыты.
Через 1,5 - 2 ч слить жидкость в центрифужные пробирки.
Центрифугировать 2 мин. при 1500 об./мин.
Надосадочную жидкость слить, осадок с помощью стеклянной
пипетки перенести на предметное стекло (по 2 капли на каждое
стекло), накрыть покровными стеклами.
Микроскопировать при увеличении: объектив х 10, окуляр х 10;
для уточнения морфологических особенностей: объектив х 40; окуляр
х 10.
Эффективность метода
Позволяет выявлять трофозоиты балантидий при низкой
интенсивности инвазии.
Применение метода
Для диагностики балантидиаза.
4.2.4.4. Методы окрашенных мазков на криптоспоридиоз (по Цилю-
Нильсену; Романовскому-Гимзе)
Необходимые реактивы и оборудование
1. Реактивы: фуксин основной, этиловый спирт, фенол, раствор
серной кислоты 7%-ный (5 - 10%-ный), раствор малахитовой зелени 5%-
ный в 10%-ном этиловом спирте, водный раствор метиленового синего
0,2%-ный, раствор малахитового зеленого 5%-ный, азур-эозин по
Романовскому-Гимзе 10%-ный раствор, флотационные растворы.
2. Предметные стекла.
3. Стеклянные или деревянные палочки.
4. Горелка (спиртовка).
5. Кюветы эмалированные.
6. Мостики стеклянные или "контейнеры" для окраски мазков.
7. Пипетки, стеклянные капилляры.
8. Груши резиновые.
9. Химические стаканчики.
10. Центрифужные пробирки объемом 15 мл.
11. Металлические петли.
12. Центрифуга.
13. Микроскоп.
Подготовка к работе
Приготовление рабочего раствора краски по Цилю-Нильсену
Фуксина основного 2 г растворить в 12 мл спирта 96-градусного.
Фенола 5 г растворить в 50 мл дистиллированной воды.
Слить вместе растворы фуксина и фенола, долить дистиллированной
воды до 100 мл, перемешать.
Подготовка материала для исследования
Из фекалий приготовить мазок одним из следующих способов.
А) Нативный мазок
Нанести на предметное стекло небольшое количество фекалий.
Растереть фекалии тонким слоем (при необходимости к комочку
фекалий добавляют 1 - 2 капли физиологического раствора или воды).
Тщательно высушить мазок на воздухе (не менее 30 мин).
Б) Обогащение флотационным методом
Приготовить флотационный раствор (в качестве флотационного
раствора использовать насыщенный раствор хлористого натрия или
насыщенный раствор сульфата цинка - 331 г сульфата цинка на 1 л
водопроводной воды).
Разбавить фекалии водой, размешать.
Процедить разбавленные фекалии через 2-слойный бинт в
центрифужную пробирку.
Центрифугировать при 1500 об./мин. в течение 3 - 4 мин.
Удалить супернатант (объем оставшегося осадка не должен
превышать 1 мл).
Добавить флотационную жидкость до половины объема пробирки.
Размешать содержимое пробирки стеклянной палочкой.
Добавить флотационную жидкость до верхнего края пробирки.
Центрифугировать при 1500 об./мин. в течение 3 - 4 мин.
Собрать поверхностную пленку металлической петлей или
стеклянным капилляром и поместить на предметное стекло.
В) Обогащение методом седиментации
Поместить в пробирку 0,5 - 1 г фекалий.
Залить 10 - 12 мл изотонического раствора хлорида натрия.
Перемешать содержимое пробирки до образования однородной
суспензии.
Процедить суспензию через двойной слой марли в другую пробирку.
Центрифугировать.
Слить надосадочную жидкость.
Повторно залить осадок изотоническим раствором хлорида натрия.
Центрифугировать.
Слить надосадочную жидкость.
Перенести осадок пипеткой на предметное стекло.
Приготовить из осадка мазок.
Ход исследования
Высушить мазки на воздухе (мазки, приготовленные одним из
способов, описанных в п. п. "А", "Б", "В").
Фиксировать мазки в смеси Никифорова в течение 10 - 15 мин.
Высушить на воздухе.
Фиксированные и высушенные мазки быстро провести 3 - 5 раз над
пламенем горелки.
Поместить мазок в рабочий раствор карбол-фуксина на 5 - 10 мин.
Промыть мазок водопроводной водой.
Обесцветить мазок 7%-ным раствором серной кислоты в течение 20
- 60 с.
Промыть в воде.
Подкрасить в течение 5 мин. 5%-ным раствором малахитовой
зелени.
Промыть в воде.
Высушить на воздухе.
Микроскопировать при увеличении: окуляр х 10, объектив х 90 или
х 100 с масляной иммерсией.
Эффективность метода
Метод окраски фиксированных мазков по Цилю-Нильсену считается
одним из наиболее надежных для выявления ооцист криптоспоридий.
Результат: ооцисты криптоспоридий окрашиваются в разные оттенки
ярко-красного цвета и имеют вид округлых образований диаметром
около 5 мкм. Оболочка ооцист окрашивается фуксином неравномерно.
Сопутствующая микрофлора окрашивается в зеленые цвета.
Применение метода
Применяется для диагностики криптоспоридиоза.
Примечание. Для окрашивания фиксированных мазков можно
применять и другие красители, например: азур-эозином по
Романовскому-Гимзе окрашивать от 10 до 30 - 45 мин. в 10%-ном
растворе красителя, при этом ооцисты не окрашиваются или слабо
окрашиваются и имеют вид округлых образований, внутри ооцист (по
периферии) могут быть в виде бледно-голубых удлиненных и слегка
изогнутых телец (спорозоиты) с красноватыми гранулами внутри.
4.2.5. Количественные копроовоскопические методы
Количественными методами определяют число яиц гельминтов в 1 г
или 1 мл фекалий. Данные методы дают ориентировочное представление
об интенсивности инвазии, позволяют судить об эффективности
лечения гельминтозов при частичном паразитологическом излечении.
4.2.5.1. Метод толстого мазка под целлофаном по Като-Кац
(количественная модификация метода Като и Миура)
Необходимые реактивы и оборудование
1. Раствор Като (см. п. 4.2.1.1).
2. Целлофан гидрофильный.
3. Предметные стекла.
4. Валик или резиновая пробка.
5. Микроскоп.
6. Пластинка размером 40 х 30 мм (из пластмассы или металла) с
отверстием в центре диаметром 6 мм.
Ход исследования
На предметное стекло поместить пластинку с отверстием.
Произвольную навеску фекалий поместить на отверстие пластинки.
Прокатать резиновой пробкой или пластмассовой разовой палочкой
материал так, чтобы через отверстие в пластинке на стекло
выдавилась стандартная навеска.
Пластинку убрать.
Препарат обработать по стандартной методике Като (см. п.
4.2.1.1).
При микроскопии просматривается весь мазок и ведется подсчет
обнаруженных яиц гельминтов.
Чтобы определить количество яиц в 1 г фекалий: число яиц,
обнаруженных в данном препарате, следует умножить на коэффициент,
равный 24.
Применение метода
Применяется для определения интенсивности инвазии при клинико-
диагностических обследованиях и при массовых обследованиях для
определения напряженности очага инвазии.
4.2.5.2. Методы формалин-эфирного и уксусно-эфирного осаждения
Методы основаны на исследовании 1 г фекалий (количество
фекалий, внесенное в пробирку и вызвавшее подъем жидкости на 1 мл,
равно 1 г). При просмотре всего осадка полностью методы дают
возможность провести количественный учет обнаруженных яиц, т.к.
количество яиц в осадке соответствует нахождению их в 1 г фекалий.
Описание методов - см. п. 4.2.1.2 и 4.2.1.3.
5. МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ДУОДЕНАЛЬНОГО
СОДЕРЖИМОГО, МОКРОТЫ И МОЧИ
5.1. Исследования дуоденального содержимого
Необходимые реактивы и оборудование
1. Этиловый эфир.
2. Центрифуга.
3. Центрифужные пробирки.
4. Предметные стекла.
5. Пипетки.
6. Чашки Петри.
7. Палочки стеклянные или деревянные.
8. Микроскоп.
Подготовка к работе
Желчь в лабораторию должна быть доставлена сразу после
зондирования. При подозрении на лямблиоз, стронгилоидоз,
анкилостомоз, трихостронгилез тщательно исследуют порцию "А",
исследование порций "Б" и "С" более информативно на печеночные
трематодозы.
В желчи, исследуемой сразу после зондирования, обычно
обнаруживаются вегетативные подвижные формы лямблий и подвижные
личинки стронгилоидеса. При исследовании желчи через несколько
часов после зондирования (но в день забора материала) обычно
подвижность личинок стронгилоидеса и вегетативных форм лямблий не
наблюдается.
Ход исследования
5.1.1. Исследования нативного мазка желчи
Выбрать сгустки слизи, волокон, патологические примеси.
Палочкой стеклянной или деревянной (можно пипеткой) нанести
тонким слоем желчь на предметное стекло (мазок не должен стекать с
предметного стекла).
При исследовании в чашке Петри налить желчь тонким слоем на дно
чашки.
Микроскопировать без покровного стекла при увеличении: объектив
х 8 или х 10, окуляр х 10; для уточнения морфологии яиц гельминтов
и для исследования на простейших - объектив х 40.
Для обнаружения подвижных личинок стронгилоидеса можно
микроскопировать в чашках Петри под стереомикроскопом МБС (окуляр
х 2; объектив х 12,5 - 14).
5.1.2. Исследования желчи с центрифугированием
При наличии в желчи большого количества слизи или гноя
взболтать все порции с равным количеством эфира.
Центрифугировать в центрифужных пробирках все порции
дуоденального содержимого не менее 20 мин. при 1500 - 2000
об./мин.
Надосадочную часть желчи слить в отдельную емкость.
Осадок перенести пипеткой или прямо из пробирки на предметное
стекло.
Микроскопировать без покровного стекла при увеличении: объектив
х 8 или х 10, окуляр х 10; и для уточнения морфологии яиц
гельминтов и для исследования на простейших - объектив х 40.
Для обнаружения подвижных личинок стронгилоидеса можно
микроскопировать в чашках Петри под стереомикроскопом МБС (окуляр
х 2; объектив х 12,5 - 14).
Эффективность метода
Наиболее эффективно сочетание исследования желчи нативно и с
центрифугированием.
Исследование желчи на яйца трематод эффективно только при
центрифугировании.
Применение метода
Для выявления яиц трематод (описторхиса, клонорха, фасциол,
дикроцелий), вегетативных и цистных форм простейших - лямблий,
личинок стронгилоидеса, трихостронгилид и анкилостомид.
5.2. Исследование мокроты, промывных вод бронхов,
лаважной жидкости
5.2.1. Исследование мокроты
Необходимые реактивы и оборудование
1. Раствор NaOH или КОН 0,5%-ный.
2. Центрифужные пробирки.
3. Предметные стекла, большие предметные стекла.
4. Центрифуга.
5. Микроскоп.
Подготовка к работе
Мокроту, представляющую собой патологический секрет дыхательных
путей вместе с отделяемым носоглотки и полости рта, собрать в
стерильную (можно прокипяченную) стеклянную емкость с крышкой и
исследовать сразу после доставки в лабораторию.
Исследуется мокрота, выделенная при откашливании (не слюна и не
слизь с носоглотки).
При слизисто-гнойной мокроте для лучшего растворения слизи,
гноя:
- мокроту смешать с равным объемом 0,5%-ного раствора едкой
щелочи;
- слегка подогреть пробирку на водяной бане;
- пробирку энергично встряхивать в течение 5 мин.
5.2.1.1. Исследование нативного мазка мокроты
Ход исследования
Мокроту из стеклянной емкости пипеткой переносят на предметное
стекло (лучше большое).
Приготовить мазок путем равномерного растирания между двумя
предметными стеклами или нанесения и равномерного растирания
палочкой на большом предметном стекле.
Микроскопировать при увеличении: объектив х 8 или х 10, окуляр
х 10, для уточнения морфологических особенностей: окуляр х 40.
5.2.1.2. Исследование мокроты с центрифугированием
Ход исследования
Перелить мокроту в центрифужные пробирки.
Центрифугировать в течение 3 - 5 мин. при 1500 об./мин.
Слить надосадочную жидкость.
Перенести осадок пипеткой или сразу из пробирки на предметное
стекло.
Микроскопировать при увеличении: объектив х 8 или х 10, окуляр
х 10, для уточнения морфологических особенностей: окуляр х 40.
Эффективность метода
Эффективен для выявления яиц гельминтов, паразитирующих в
легких, бронхах (яйца парагонимуса, томинкса), иногда яиц
шистосом.
Менее эффективен при диагностике личиночных стадий кишечных
нематод в период миграции через легкие (личинки аскарид,
анкилостомид, стронгилоидеса).
Иногда можно обнаружить личиночные стадии эхинококков (сколексы
эхинококка, альвеококка) при поражении легких и прорыве пузырей в
бронх.
Применение метода
Для диагностики легочных гельминтозов.
5.2.1.3. Исследование окрашенных мазков на пневмоцистоз
Необходимые реактивы и оборудование
Химреактивы
1. Для приготовления мазков - муколитики (0,3%-ный дитиотреитол
в 0,02 М ЭДТА, рН = 7,0), или ацетилцистеин, или 4%-ный р-р NaOH;
формалин, спирт.
2. Для окраски мазков по Романовскому-Гимзе - смесь Никифорова;
сульфатно-уксусный реагент (45 мл ледяной уксусной кислоты и 15 мл
концентрированной серной кислоты) - 10%-ная краска Романовского-
Гимзы в фосфатном буфере рН = 7,2.
3. Для окраски мазков толуидиновым синим - толуидиновый синий
0,15%-ный (75 мг толуидинового синего + 15 мл дистиллированной
воды + 0,5 мл концентрированной соляной кислоты + 35 мл
абсолютного спирта); водный метиловый желтый 0,25%-ный.
4. Для окраски по Гомори-Грохотту - формалин 10%-ный;
|
