|
Стр. 2
Доводят объем до 10 мл деионизованной водой, фильтруют через
стеклянный фильтр GF/B и хранят при 18 - 25 -С в течение месяца.
18. Очистка формамида.
5,0 г смешанной катионанионионообменной смолы помещают в
градуированный химический стакан и заливают 50,0 мл формамида,
перемешивают магнитной мешалкой 30 - 40 мин. при 18 - 25 -С.
Чистый формамид отделяют от смолы через стекловолокнистый фильтр
GF/B. Хранят раствор при -20 -С.
19. Раствор денатурированной спермы лосося.
400,0 мг ДНК спермы лосося помещают в емкость, прибавляют 20,0
мл деионизованной воды и перемешивают до полного растворения.
Затем кипятят раствор ДНК в течение 10 мин. на водяной бане,
разливают по 1,0 мл в пробирки для микропроб и хранят при -20 -С в
течение 2-х месяцев.
20. Раствор Денхарда 100х.
1,0 г фикола, 1,0 г поливинилпиролидона, 1,0 г БСА помещают в
градуированный химический стакан, прибавляют 30,0 мл
деионизованной воды и перемешивают до полного растворения. Доводят
объем до 50,0 мл деионизованной водой. Раствор фильтруют через
стеклянный фильтр GF/B и хранят при -20 -С в течение 2-х месяцев.
21. Раствор для предгибридизации.
В градуированный химический стакан вносят 25,0 мл раствора
формамида, 0,75 мл раствора денатурированной ДНК спермы лосося,
2,5 мл 10%-ного раствора SDS, 12,5 мл 20х раствора SSC, 2,5 мл
100х раствора Денхарда и доводят объем до 50,0 мл деионизованной
водой. Раствор фильтруют и хранят при -20 -С в течение месяца.
22. Раствор для гибридизации.
Это тот же раствор для предгибридизации, но содержащий меченую
-32
альфа Р ДНК. Меченную радиоактивным фосфором и очищенную ДНК
6
(2,0 x 10 имп./мл) перед добавлением в раствор для гибридизации
прогревают при 100 -С 5 мин. и быстро охлаждают на ледяной бане.
Раствор готовят перед использованием.
23. Раствор для отмывки мембраны.
Раствор А (2х раствор SSC с 0,5%-ным раствором SDS).
В градуированный химический стакан помещают 50,0 мл 20х
раствора SSC, 25,0 мл 10%-ного раствора SDS и доводят объем до
500,0 мл деионизованной водой. Раствор готовят перед
использованием.
Раствор Б (0,2х раствор SSC с 0,1%-ным раствором SDS).
В градуированный химический стакан помещают 5,0 мл 20х раствора
SSC, 10,0 мл 10%-ного раствора SDS и доводят объем до 1000,0 мл
деионизованной водой. Раствор готовят перед использованием.
24. Раствор проявителя.
К 700,0 мл деионизованной воды (температура воды 60 -С), 2,2 г
метола, 8,8 г гидрохинона, 72,0 г безводного сульфита натрия, 48,0
г карбоната натрия и 4,0 г бромистого калия по очереди помещают в
градуированный химический стакан и по очереди растворяют. Доводят
объем до 1000,0 мл деионизованной водой. Хранят раствор при 18 -
25 -С в темной посуде.
25. Раствор фиксатора.
160,0 г тиосульфата натрия, 40,0 г хлористого аммония помещают
в градуированный химический стакан, прибавляют 730,0 мл
деионизованной воды (температура воды 60 -С) и перемешивают до
полного растворения. Доводят объем до 1000,0 мл деионизованной
водой и хранят при 18 - 25 -С в темной посуде.
26. 10%-ный раствор ТХУ.
10,0 г трихлоруксусной кислоты помещают в градуированный
химический стакан, прибавляют 70,0 мл деионизованной воды и
перемешивают до полного растворения. Доводят объем до 100,0 мл
деионизованной водой. Раствор хранят при 4 - 6 -С.
27. Сцинтилляционный раствор.
4,0 г РРО (2,5-дифенилоксазола), 0,2 г РОРОР (1,4-ди(2-(5-
фенилоксазолил)бензина)) помещают в градуированный химический
стакан, прибавляют 730,0 мл толуола, перемешивают до полного
растворения стеклянной палочкой. Доводят объем до 1000,0 мл
толуолом. Хранят раствор при 18 - 25 -С в темной посуде.
При отборе проб используют автоматические пипетки с
соответствующими диапазонами объемов:
от 1 мкл до 10 мкл;
от 5 мкл до 40 мкл;
от 40 мкл до 200 мкл;
от 200 мкл до 1000 мкл;
от 1 мл до 5 мл.
7. Испытание на стерильность
Испытание на стерильность проводят с применением "Сухой
питательной среды для контроля стерильности (тиогликолевой)"
отечественного производства. Возможен выпуск варианта среды без
тиогликолята натрия в составе сухого вещества. В этом случае
тиогликолят натрия или тиогликолевую кислоту добавляют ex tempore.
Вместо коммерческой тиогликолевой среды может быть использована
тиогликолевая среда индивидуального приготовления.
Контроль стерильности МИБП проводят путем поэтапного
исследования образцов готового препарата в полуфабрикате и готовой
серии препарата.
Готовым препаратом в полуфабрикате считают препарат,
находящийся в одной производственной емкости (или разлитый в
бутылки из этой емкости), из которой производят розлив в ампулы
или флаконы.
Примечание. Контроль полуфабриката на более ранних стадиях
должен осуществляться в соответствии с технологическими
регламентами.
7.1. Правила отбора образцов препарата для испытания на
стерильность
Образец для контроля - это количество препарата, необходимое
для первичного посева на питательную среду по представленной ниже
схеме (не менее 2 мл). В том случае, если емкости (ампулы или
флаконы) содержат меньший объем препарата, то образец составляют
из смеси содержимого нескольких емкостей.
7.1.1. Отбор образцов готового препарата в полуфабрикате
Объем выемки готового препарата в полуфабрикате для испытания
на стерильность должен быть достаточным, чтобы обеспечить
достоверность результатов контроля, но не менее 10 мл. Перед
отбором выемки содержимое производственной емкости, в которой
находится полуфабрикат, тщательно перемешивают. Взятая проба
должна быть посеяна в виде 5-ти или более образцов по схеме 7.4 и
с учетом антимикробного действия п. 7.2.
7.1.2. Отбор образцов препарата в процессе розлива
В процессе розлива препарата для испытания на стерильность
берут не менее чем по одному образцу в начале, середине и в конце
розлива. Для контроля могут быть взяты пробы, отобранные в
процессе розлива в отдельные лабораторные емкости (пробирки,
флаконы) или герметизированные емкости, в которые осуществляется
розлив препарата.
Примечание. При розливе препаратов, которые в дальнейшем
подвергаются лиофильному высушиванию, необходимо оставлять до
окончания контроля стерильности высушенной продукции утроенное
количество образцов (не менее 9-ти) разлитого жидкого препарата в
герметизированном виде. Эти образцы могут быть исследованы в
случае пророста образцов высушенного препарата для выяснения
причин контаминации.
7.1.3. Отбор образцов готового препарата
При контроле стерильности готового (разлитого, высушенного)
препарата количество контролируемых емкостей (ампул или флаконов)
определяется с учетом общего количества емкостей в серии. Для
определения минимального числа емкостей, необходимого для контроля
стерильности, следует произвести расчет по формуле:
__
n = 0,4 \/N ,
где:
n - необходимое для контроля число емкостей, не менее 10-ти и
не более 40;
N - число емкостей в серии.
Принимая во внимание, что за образец для контроля принято
количество препарата, необходимое для первичного посева на
питательную среду (не менее 2 мл), число контролируемых емкостей и
число засеваемых образцов может не совпадать. В случаях, когда
объем препарата в каждой емкости равен или превышает 2 мл, число
контролируемых емкостей и число засеваемых образцов будет
одинаковым или количество образцов будет превышать число емкостей,
взятых для испытания. При меньшем объеме розлива (менее 2 мл в
емкости) число засеваемых образцов будет меньше, чем число
контролируемых емкостей, за счет объединения нескольких емкостей в
один образец.
Для удобства расчетов предлагаются таблицы 1 и 2, позволяющие
определить число емкостей и образцов, необходимое для испытания на
стерильность с учетом объема серии и количества препарата в каждой
емкости.
Таблица 2
КОЛИЧЕСТВО ИСПЫТУЕМОГО ПРЕПАРАТА,
НЕОБХОДИМОЕ ДЛЯ ПОСЕВА, В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ОБЪЕМА
СОДЕРЖИМОГО ЕМКОСТЕЙ, СОСТАВЛЯЮЩИХ СЕРИЮ
-------------T----------------------------T----------------------¬
¦Объем содер-¦Минимальный объем препарата,¦ Минимальный объем ¦
¦жимого одной¦ взятый для посева из ¦ тиогликолевой среды ¦
¦емкости (мл)¦ каждой емкости (мл) ¦для каждой температуры¦
+------------+----------------------------+----------------------+
¦Менее 2 ¦Весь объем, объединения ¦В 10 раз больше объема¦
¦ ¦емкости до 2 ¦препарата, взятого для¦
¦2 - 24 ¦2 ¦посева из каждой ¦
¦25 - 100 ¦6 ¦емкости ¦
¦более 100 ¦10 ¦ ¦
L------------+----------------------------+-----------------------
Примечания. 1. Число емкостей, необходимое для контроля
стерильности на предприятии, представляет собой суммарное число
емкостей, контролируемых на разных этапах, - не менее n/2 в
производственном отделении и не менее n/2 в ОБК.
2. Если серия включает в себя менее 500 емкостей, количество
контролируемых емкостей должно быть не менее 10-ти.
3. При необходимости, с учетом особенностей технологического
изготовления отдельных видов препаратов и особенностей фасовки, в
соответствующей технической документации могут быть
регламентированы дополнительные требования в отношении
необходимого количества контролируемых емкостей, обеспечивающие
надежность контроля стерильности препарата.
4. При отбраковке разлитого препарата из-за несоответствия
физических свойств требованиям НТД (помутнение, появление хлопьев)
отбракованные ампулы или флаконы должны быть переданы в ОБК для
выяснения характера помутнений и, при необходимости, проведения
контроля стерильности.
Количество емкостей, отправленное в ГИСК им. Л.А. Тарасевича,
должно соответствовать общему количеству, контролируемому в
производственном отделе и в ОБК, с учетом величины серии и объема
препарата, разлитого в ампулы или флаконы.
7.2. Определение антимикробного действия МИБП
Во избежание неправильной оценки испытания на стерильность
необходимо определить для каждого наименования МИБП (в том числе и
для их полуфабрикатов), обладает ли он антимикробным действием.
Для этого в каждые две пробирки с 20 мл тиогликолевой среды
вносят по 1,0 мл исследуемого препарата и добавляют по 0,1 мл
микробной взвеси соответствующего тест-штамма в разведении 1000
клеток/мл. Содержимое пробирок осторожно перемешивают до
равномерного распределения препарата в питательной среде. Посевы
со штаммами для определения антимикробного действия инкубируют при
температуре от 30 до 35 -С в течение 48 часов, а для определения
антигрибкового действия от 20 до 25 -С в течение 72-х часов. В
контрольные образцы вместо исследуемого препарата вносят
аналогичное количество физиологического раствора и соответствующие
тест-штаммы.
Для проверки антимикробного действия МИБП используют тест-
микроорганизмы: Staphylococcus aureus АТСС 6538 Р; Bacillus
subtilis. АТСС 6633; Escherichia coli АТСС 25922, а для
противогрибкового действия - Candida albicans АТСС 885-653.
При отсутствии антимикробного действия МИБП в опытных и
контрольных пробирках должен наблюдаться рост перечисленных тест-
микроорганизмов в указанные сроки. При наличии антимикробного
действия возможно торможение роста одного или нескольких тест-
штаммов, при сохранении их роста в контрольных образцах.
При выявлении антимикробного действия препарат разводят,
изменяя соотношение объемов посевного материала и питательной
среды. Первоначально увеличивают объем питательной среды до 250
мл. Если при этом сохраняется антимикробное действие МИБП,
уменьшают объем посевного материала до 0,5 мл в каждой из 2-х
пробирок (флаконов). Экспериментально установленное соотношение
объемов питательной среды и посевного материала, обеспечивающее
нейтрализацию антимикробного действия препарата, должно
соблюдаться при испытании его на стерильность методом прямого
посева.
В случае неэффективности разведения МИБП используют метод
мембранной фильтрации.
7.3. Техника проведения контроля стерильности
Перед внесением в бокс ампулы (флаконы) с препаратами должны
быть проверены на герметичность путем тщательного просмотра, а
препараты, высушенные под вакуумом, должны быть проверены на
вакуум. После этого ампулы (флаконы) обрабатывают методом
погружения в 3%-ный раствор перекиси водорода не менее чем на 2
мин.
Лица, проводящие контроль стерильности, непосредственно перед
работой в боксе тщательно моют руки с мылом при помощи щетки. В
предбокснике обувь меняют на специальную боксовую, надевают
стерильный халат, колпак или косынку и 4-слойную марлевую повязку
(маску), которая должна закрывать нос и рот. При работе в боксе
движения, разговоры, перемещения должны быть максимально
ограничены.
В начале и в конце посева образцов каждой серии проводится
обработка рук 70- спиртом, а поверхности рабочего стола 96-
спиртом с последующим прожиганием (при посеве, насчитывающем более
30 емкостей одной серии, подобная обработка проводится также и в
середине посева этой серии).
Перед вскрытием ампул или флаконов оттянутый конец ампулы или
горлышко флакона смачивают 96- спиртом и обжигают в пламени
горелки.
Исследуемый препарат набирают стерильной пипеткой при помощи
ножной или ручной груши, предварительно автоклавированной. Перед
забором препарата пустая пипетка проводится через пламя горелки,
но не прокаливается. Посев каждого образца препарата производят
отдельной стерильной пипеткой на внутреннюю стенку пробирки у
раздела сред (необходимо избегать вдувания воздуха в питательную
среду). Использованные пипетки, ампулы и флаконы от препаратов
помещают в 3%-ный раствор перекиси водорода и оставляют на 24
часа, после чего производится их дальнейшая обработка.
Примечания. 1. Запрещается прокаливать ампулы и пастеровские
пипетки в пламени горелки.
2. Запрещается производить посев пипеткой без груши (ртом).
Перед посевом жидких препаратов содержимое ампул или флаконов
необходимо встряхивать (т.к. микробы-контаминанты могут осесть на
дно).
Образцы сухих препаратов предварительно растворяют
тиогликолевой средой или стерильным растворителем (изотонический
раствор хлорида натрия, дистиллированная вода и т.п.) в объеме,
предусмотренном технической документацией, и после растворения
засевают на питательную среду. Стерильность используемого
растворителя проверяют путем его посева (по 1 мл) на 2 пробирки,
содержащие по 20 мл тиогликолевой среды. Пробирки выдерживают при
температуре 30 - 35 -С и 20 - 22 -С соответственно 14 сут.
одновременно с опытными пробирками. Посев растворителя для
контроля стерильности производят до начала работы и после ее
окончания. Если при посеве сухих препаратов используют несколько
флаконов растворителя, стерильность каждого должна быть проверена
аналогичным способом.
Примечание. Растворение препаратов тиогликолевой средой не
используют для метода мембранной фильтрации.
7.4. Схема контроля стерильности
7.4.1. Метод прямого посева
Контролируемый на стерильность образец засевают пипеткой по 1
мл на две пробирки, содержащие по 20,0 мл тиогликолевой среды,
одну из которых инкубируют при температуре от 30 до 35 -С для
выявления аэробных и анаэробных микроорганизмов, а другую - при
температуре от 20 до 25 -С для выявления грибов и бактерий с
оптимумом роста в данном температурном режиме. Продолжительность
инкубации посевов составляет не менее 14 сут. В течение всего
срока проводится их периодический просмотр.
Для препаратов, вызывающих помутнение питательной среды
(препараты, содержащие сорбенты, микробную массу, мозговую ткань и
т.п.), посев производят по указанной выше схеме, но на 5 - 7 сутки
из каждой пробирки производят пересев приблизительно по 0,5 мл на
две пробирки, содержащие по 10,0 мл тиогликолевой среды. Все
пробирки выдерживают после пересева при соответствующих
температурах до окончания инкубации (14 сут.) со дня первичного
посева.
Примечание. При необходимости, с учетом особенностей технологии
изготовления отдельных видов препаратов, в соответствующей
технической документации могут быть регламентированы
дополнительные экспериментально обоснованные требования в
отношении срока и режима инкубации.
7.4.2. Метод мембранной фильтрации
При определении стерильности МИБП, обладающих выраженным
антимикробным действием, и МИБП, разлитых в емкости более 100 мл,
используют метод мембранной фильтрации.
Аппаратура
В работе используют любую, подходящую для этих целей
фильтрационную систему, состоящую из закрытого резервуара и
приемника, между которыми помещают закрепленную надлежащим образом
мембрану, а также насоса, обеспечивающего фильтрацию жидкости.
Фильтрационные системы делятся на два типа: в одних мембрану
после завершения процедуры фильтрации асептически извлекают, делят
пополам и погружают в две емкости со 100 мл тиогликолевой среды
для последующей инкубации при температурах от 30 до 35 -С и от 20
до 25 -С (тип I); в других - мембраны закреплены в двух
резервуарах, куда после фильтрации помещают по 100 мл
тиогликолевой среды, для последующей инкубации в этих же емкостях
при соответствующих температурах (тип II). Установки второго типа
могут быть многоразового использования (их стерилизуют в собранном
виде, вместе с мембраной, насыщенным паром при избыточном давлении
(0,11 +/- 0,02) МПа/(1,1 +/- 0,2) кгс/кв. см и температуре (121 +/-
1) -С в течение 18 - 20 мин.) или одноразовые стерильные системы
(например, стеритесты фирмы Millipore для Steritest Compact
System). Используют мембраны с размером пор 0,47 мкм, диаметром 47
мм, скорость прохождения потока 55 - 75 мл/мин. при давлении 93,3
кПа (70 см рт. ст.).
Примечание. При содержании в МИБП масел фильтр стерилизуют
отдельно, тщательно просушивают и с соблюдением асептики помещают
в фильтродержатель или используют одноразовые стеритесты.
Методика испытания
Используют то количество емкостей или то количество готового
препарата в полуфабрикате, которые требуются для проведения
испытания стерильности (п. 7.1.1 и п. 7.1.3). Если содержимое
емкости более 2 мл, но менее 500 мл, - фильтруется весь объем
препарата. Для емкостей более 500 мл фильтруют только 500 мл из
всего объема.
Фильтрование отобранных образцов проводят в асептических
условиях. Фильтрационную систему целесообразно устанавливать в
настольных ламинальных боксах. Обработку препаратов перед
внесением в бокс проводят в соответствии с п. 7.3.
Испытуемый препарат растворяют, если это необходимо,
соответствующим растворителем или 0,9%-ным раствором натрия
хлорида, а затем объединяют либо непосредственно в резервуаре для
установок I типа, либо в отдельной стерильной емкости, с
последующим разделением объема препарата на две половины для
фильтрации в 2-х резервуарах для установок II типа. Если емкости
больших объемов, то фильтрацию можно проводить без
предварительного объединения, разделив их содержимое
приблизительно поровну между двумя резервуарами, если не
предусмотрено автоматического разделения, как, например, в
установке Steritest Compact System ("Millipore"). Для препаратов,
представляющих собой вязкую жидкость или суспензию, не поддающихся
быстрой фильтрации, используют разведение достаточным количеством
жидкости 1 для увеличения скорости фильтрации. При фильтрации
препаратов, обладающих антимикробным действием, в конце процедуры
фильтр промывают 3 порциями по 100 мл жидкости 1. Если препарат
содержит лецитин или масла, вместо жидкости 1 используют жидкость
2 (Приложение).
Для контроля стерильности условий, в которых проводятся
испытания, необходимо фильтровать растворитель без испытуемого
МИБП, с последующим воспроизведением всех вышеописанных операций.
Тиогликолевую среду с помещенными в нее фильтрами выдерживают
при температурах от 30 до 35 -С и от 20 до 25 -С в течение 7 сут.
при ежедневном осмотре.
7.5. Учет результатов контроля стерильности
Посевы периодически просматривают в рассеянном свете и по
окончании периода инкубации. Наличие роста микроорганизмов
оценивается визуально по выявлению мутности, осадка, хлопьев и
других микроскопических изменений. Выявленный рост микроорганизмов
необходимо подтвердить микроскопированием мазков, окрашенных по
Граму. В протоколах испытания отмечается: при какой температуре
выявлен рост, его характер, морфологические признаки обнаруженных
микроорганизмов, окраска по Граму.
Испытуемый препарат считают удовлетворяющим требованиям
испытания на стерильность при отсутствии роста микроорганизмов во
всех образцах. При обнаружении роста хотя бы в одной пробирке
(колбе, флаконе) его подтверждают микроскопированием и повторяют
испытание на стерильность на том же количестве образцов, что и в
первый раз. При отсутствии роста микроорганизмов при повторном
посеве испытуемый препарат считают удовлетворяющим требованиям
испытания на стерильность. В случае роста микроорганизмов при
повторном посеве, морфологически сходных с выявленными при
первичном посеве, испытуемый препарат считают нестерильным.
Для готового препарата в полуфабрикате допускается только одно
повторное испытание на стерильность. В случае обнаружения роста
при испытании на стерильность готового препарата в полуфабрикате
при повторении теста, независимо от характера микрофлоры, его
бракуют.
Для готового препарата возможно проведение испытания на
стерильность в третий раз на удвоенном количестве образцов, если в
первый и во второй раз выявлен рост различных по морфологии
микроорганизмов. При отсутствии роста микроорганизмов после
инкубации в третьем испытании готовый препарат считают
удовлетворяющим требованиям испытания на стерильность. При наличии
роста хотя бы в одной пробирке (колбе, флаконе) испытуемый
препарат считают нестерильным.
Результаты контроля исследуемых препаратов регистрируются в
специальных производственных журналах.
7.6. Требования, предъявляемые к боксам
Испытание на стерильность МИБП должно проводиться
квалифицированным персоналом в специальных, предназначенных только
для данного вида работ, боксах с обеспечением строгих правил
асептики.
Боксы представляют собой изолированные застекленные камеры
достаточной площади и кубатуры для проведения в них
бактериологических исследований. Боксы должны быть хорошо освещены
и обеспечены вентиляцией. Оптимальным является оборудование боксов
приточно-вытяжной вентиляцией с подачей стерильного
кондиционированного воздуха и с преобладанием притока (не менее
1,27 мм водн. ст.). Скорость потока воздуха - 20 объемов в час.
Внутреннее устройство боксов должно обеспечивать легкость и
надежность поддержания чистоты и возможность дезинфекционной
обработки. С этой целью газовые и водопроводные трубы, а также
электропроводку размещают вне бокса или в толще его стен.
Отопительные батареи устанавливают гладкими без ребер, что
препятствует осаждению пыли. Стены бокса на высоту не менее
полутора метров от пола облицовывают метлахской плиткой, или, как
и потолок, окрашивают в светлые тона масляной краской. Полы
покрывают линолеумом, метлахской плиткой или пластиком. Такая
отделка поверхностей позволяет использовать при уборке помещения
дезинфицирующие растворы. В боксе должно находиться минимальное
количество мебели - стол и табуреты. Запрещается размещение в
боксах и предбоксниках водопроводных кранов и раковин, так как они
являются источником грибковой микрофлоры.
Работу рекомендуется проводить в настольных ламинарных боксах с
подачей стерильного воздуха в рабочую зону, что позволяет
проводить исследования в условиях, исключающих возможность
загрязнения испытуемого препарата.
Примечание. В боксах, предназначенных для проведения контроля
стерильности МИБП, работа с живыми микробными культурами не
допускается.
К боксу должен прилегать предбоксник, отделенный от него
стеклянной перегородкой с дверью и передаточными окнами, -
помещение, куда вносятся подготовленные для посевов препараты,
питательные среды, пипетки и биксы со стерильной одеждой для
работы. В предбокснике персонал переодевается в стерильную одежду
и специальную обувь для боксов.
К предбокснику должна примыкать комната, где хранятся
питательные среды, необходимые для работы, стерильная посуда. В
этой комнате проводят всю вспомогательную работу (деконтаминация
емкостей с МИБП, штативов для питательных сред, маркировка
пробирок и т.п.).
Ежедневно бокс и предбоксник подвергаются тщательной уборке и
деконтаминации путем протирания ветошью, смоченной в 3%-ной
перекиси водорода с 0,5% сульфанола или порошка "Лотос". При
приготовлении раствора воду добавляют в пергидроль, а затем моющее
средство. Этот раствор используют после приготовления.
Для приготовления 10 л раствора берут следующие количества
препаратов: 1200 мл пергидроля, 50 г моющего средства и 8750 мл
воды при температуре от 40 до 50 -С. Для простоты приготовления
используют вымеренную по объему ингредиентов посуду. Норма расхода
дезинфицирующего раствора - 70 - 100 мл/кв. м.
Готовят раствор и обрабатывают бокс и предбоксник с соблюдением
правил техники безопасности при работе с агрессивными веществами.
При отсутствии возможности использовать дезинфицирующий раствор
производят обработку горячим (50 - 60 -С) мыльносодовым раствором
(1% раствора соды или стирального порошка и 0,5% нашатырного
спирта) с последующим протиранием стен, полов, мебели одним из
следующих дезинфицирующих растворов:
- 2%-ный раствор хлорамина;
- 3%-ный раствор фенола;
- раствор антисептола.
Для приготовления антисептола берут 2 раствора: 50%-ный раствор
хлорной извести и 5%-ный раствор кальцинированной соды. Перед
употреблением растворы сливают в равных объемах и разбавляют в 50
раз водой. Работу с антисептолом производят в резиновых перчатках.
Для обеззараживания боксов и предбоксников применяют
бактерицидные лампы БУВ, установленные из расчета: 1 лампа БУВ-30
на 12 куб. м объема воздуха или 2 - 2,5 ватта мощности на кв. м
поверхности (числа в названиях ламп обозначают их мощность в
ваттах). Лампы размещают на потолках или стенах на уровне 1,5 м от
пола. Облучение бокса производят до начала работы в течение 1,5 -
2 ч. Во время работы лампы должны быть выключены. Необходимо
учитывать время эксплуатации ламп и, по окончании гарантийного
срока, заменять лампы новыми, если даже они продолжают "светить".
В боксах, оборудованных принудительной вентиляцией и
ламинарными настольными боксами, работа должна начинаться не ранее
чем через 30 мин. после их включения. Это минимальное время,
необходимое для замены воздуха стерильным, удаления пыли
поднявшимся потоком воздуха и установления стационарного потока
воздуха.
Ежедневно в начале и в конце работы контролируют бактериальную
чистоту воздуха в боксе и в предбокснике, используя метод
седиментации. Для этого чашки Петри с питательным агаром и средой
Сабуро помещают открытыми на 15 мин. в нескольких точках
(например, рабочий стол, ламинарный бокс и вблизи вентиляции).
Затем выдерживают в термостате 48 ч чашки с питательным агаром при
температуре от 30 до 35 -С и 72 ч чашки со средой Сабуро при
температуре от 20 до 25 -С. При появлении роста колоний делают
мазки, окрашенные по Граму, микроскопируют их и отмечают характер
микрофлоры в специальных журналах.
Допустимым считается рост не более 3-х колоний микробов
сапрофитов на одной чашке. Рост большего числа колоний указывает
на повышенную бактериальную загрязненность воздуха в боксе. В этих
случаях необходимо произвести дополнительную дезинфицирующую
уборку бокса и предбоксника, а также проанализировать случай
увеличения бактериальной контаминации и наметить мероприятия по ее
устранению. В случаях появления колоний грибов, помимо
дезинфекции, обращают особое внимание на снижение влажности в
боксе и предбокснике путем просушивания их электронагревательными
приборами. При проявлении спорообразующих микроорганизмов, а также
грибов при уборке помещения увеличивают концентрацию перекиси
водорода до 6%.
У лиц, работающих в боксе, периодически проверяют степень
бактериальной обсемененности рук после мытья. Эту проверку
проводят следующим образом: пальцами рук прикасаются к поверхности
плотной питательной среды в чашке Петри и делают несколько
круговых движений, "засеянные" чашки помещаются в термостат при
температуре 30 - 35 -С на 48 ч для питательного агара и при
температуре 20 - 25 -С на 72 ч для среды Сабуро. Появление более 3-
х колоний на одной чашке Петри указывает на недостаточную чистоту
рук для проведения асептической работы.
Результаты проверки контаминации воздуха бокса и предбоксника,
бактериальной обсемененности рук работников должны быть
зафиксированы в специальных журналах.
Постоянно следует обращать внимание на надежность стерилизации
используемых для работы инструментов, лабораторной посуды,
дистиллированной воды и различных растворов. Должен быть налажен
надежный контроль указанных материалов, а также тщательный
контроль стерильности используемых питательных сред.
Приложение
Жидкость 1
пептона ферментативного 1 г
воды дистиллированной до 1000 мл
pH после стерилизации 7,1 +/- 0,2
Жидкость 2
пептона ферментативного 5 г
твина-80 10 г
воды дистиллированной до 1000 мл
pH после стерилизации 7,1 +/- 0,2
Жидкости разливают в колбы или флаконы по 100 мл и стерилизуют
так же, как питательные среды.
Таблица 3
КОЛИЧЕСТВО ЕМКОСТЕЙ ДЛЯ КОНТРОЛЯ СТЕРИЛЬНОСТИ
В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ОБЩЕГО ЧИСЛА ЕМКОСТЕЙ В СЕРИИ И ОБЪЕМА
ПРЕПАРАТА В КАЖДОЙ ЕМКОСТИ
-------------T-----------------------------------------------------------------------------------------¬
¦ Кол-во ¦ Объем препарата в емкости ¦
¦ емкостей +-----------------------------T-----------------------------T-----------------------------+
¦ в серии ¦ 0,5 мл ¦ 1 - 1,5 мл ¦ 2,0 мл и более ¦
¦ +-----------------------------+-----------------------------+-----------------------------+
¦ ¦ Кол-во контролируемого ¦ Кол-во контролируемого ¦ Кол-во контролируемого ¦
¦ ¦ препарата ¦ препарата ¦ препарата ¦
¦ +---------T---------T---------+---------T---------T---------+---------T---------T---------+
¦ ¦ всего ¦ пр-во ¦ ОБК ¦ всего ¦ пр-во ¦ ОБК ¦ всего ¦ пр-во ¦ ОБК ¦
¦ +----T----+----T----+----T----+----T----+----T----+----T----+----T----+----T----+----T----+
¦ ¦об- ¦ем- ¦об- ¦ем- ¦об- ¦ем- ¦об- ¦ем- ¦об- ¦ем- ¦об- ¦ем- ¦об- ¦ем- ¦об- ¦ем- ¦об- ¦ем- ¦
¦ ¦раз-¦кос-¦раз-¦кос-¦раз-¦кос-¦раз-¦кос-¦раз-¦кос-¦раз-¦кос-¦раз-¦кос-¦раз-¦кос-¦раз-¦кос-¦
¦ ¦цов ¦тей ¦цов ¦тей ¦цов ¦тей ¦цов ¦тей ¦цов ¦тей ¦цов ¦тей ¦цов ¦тей ¦цов ¦тей ¦цов ¦тей ¦
+------------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+
¦501 - 1000 ¦4 ¦16 ¦2 ¦8 ¦2 ¦8 ¦6 ¦12 ¦3 ¦6 ¦3 ¦6 ¦12 ¦12 ¦6 ¦6 ¦6 ¦6 ¦
+------------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+
¦1001 - 2000 ¦6 ¦24 ¦3 ¦12 ¦3 ¦12 ¦8 ¦16 ¦4 ¦8 ¦4 ¦8 ¦18 ¦18 ¦9 ¦9 ¦9 ¦9 ¦
+------------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+
¦2001 - 3000 ¦6 ¦24 ¦3 ¦12 ¦3 ¦12 ¦10 ¦20 ¦5 ¦10 ¦5 ¦10 ¦22 ¦22 ¦11 ¦11 ¦11 ¦11 ¦
+------------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+
¦3001 - 4000 ¦6 ¦24 ¦3 ¦12 ¦3 ¦12 ¦12 ¦24 ¦6 ¦12 ¦6 ¦12 ¦26 ¦26 ¦13 ¦13 ¦13 ¦13 ¦
+------------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+
¦4001 - 5000 ¦8 ¦32 ¦4 ¦16 ¦4 ¦16 ¦14 ¦28 ¦7 ¦14 ¦7 ¦14 ¦28 ¦28 ¦14 ¦14 ¦14 ¦14 ¦
+------------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+
¦5001 - 6000 ¦8 ¦32 ¦4 ¦16 ¦4 ¦16 ¦16 ¦32 ¦8 ¦16 ¦8 ¦16 ¦32 ¦32 ¦16 ¦16 ¦16 ¦16 ¦
+------------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+
¦6001 - 7000 ¦8 ¦32 ¦4 ¦16 ¦4 ¦16 ¦16 ¦32 ¦8 ¦16 ¦8 ¦16 ¦34 ¦34 ¦17 ¦17 ¦17 ¦17 ¦
+------------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+
¦7001 - 8000 ¦10 ¦40 ¦5 ¦20 ¦5 ¦20 ¦18 ¦36 ¦9 ¦18 ¦9 ¦18 ¦36 ¦36 ¦18 ¦18 ¦18 ¦18 ¦
+------------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+
¦8001 - 9000 ¦10 ¦40 ¦5 ¦20 ¦5 ¦20 ¦20 ¦40 ¦10 ¦20 ¦10 ¦20 ¦38 ¦38 ¦19 ¦19 ¦19 ¦19 ¦
+------------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+
¦9001 - 10000¦10 ¦40 ¦5 ¦20 ¦5 ¦20 ¦20 ¦40 ¦10 ¦20 ¦10 ¦20 ¦40 ¦40 ¦20 ¦20 ¦20 ¦20 ¦
¦и более ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
L------------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+-----
Примечание. Расчет необходимого для контроля стерильности
количества емкостей препарата в случаях иной расфасовки необходимо
произвести по формуле, представленной в тексте инструкции.
7.7. Требования к качеству тиогликолевой среды
7.7.1. Готовая к употреблению тиогликолевая среда должна
отвечать следующим требованиям:
7.7.1.1. Стерильность. Должна быть стерильной.
7.7.1.2. Ростовые свойства. Питательная среда должна
обеспечивать рост аэробного и анаэробного тест-штаммов при посеве
их в количестве менее 100 жизнеспособных клеток.
7.7.1.3. Нейтрализующие свойства. Питательная среда должна
-5
нейтрализовать действие мертиолята в концентрации 0,5 x 10 г/мл
среды.
При контроле препаратов, не содержащих ртутный консервант
(мертиолят), проверку нейтрализующих свойств можно не
осуществлять. В этом случае тиогликолевая среда должна быть
использована в течение 2-х недель со дня приготовления.
Для препаратов с ртутным консервантом среду используют не
позднее 3-х суток. Конкретные сроки годности - сутки, двое или
трое суток - устанавливают при "входном" контроле новой серии
среды путем определения ее нейтрализующих свойств после хранения
приготовленной среды в течение одних, двух и трех суток.
Готовую к употреблению тиогликолевую среду следует хранить в
защищенном от света месте при температуре 18 - 25 -С.
7.7.2. Контроль качества тиогликолевой среды
7.7.2.1. Определение стерильности. Пробирки или другие емкости
со средой после ее стерилизации, в количестве не менее 2% от
партии, помещают в термостат при температуре (37 +/- 1) -С. Учет
результатов проводят через 46 - 50 ч путем визуального просмотра
всех пробирок со средой. В случае обнаружения пророста (помутнение
среды) бракуют всю партию.
Образцы среды, выдержанные при температуре (37 +/- 1) -С, для
испытания препаратов на стерильность не используют.
7.7.2.2. Определение ростовых свойств. Для определения ростовых
свойств тиогликолевой среды используют следующие тест-штаммы:
- Alcaligenes faecalis 415;
- Clostridium novyi 198.
Alcaligenes faecalis 415. Получен из института Листера (г.
Лондон) в 1946 г. Грамотрицательная палочка. Строгий аэроб.
Непатогенен для человека и животных.
Clostridium novyi 198. Выделен в 1930 г. Крупная
грамположительная спорообразующая палочка. Споры овальной формы,
расположены субтерминально. Строгий анаэроб. Непатогенен для
морских свинок и мышей.
Тест-штаммы получают из ГИСК им. Л.А. Тарасевича с
соответствующим паспортом. Замена указанных тест-штаммов другими
не допускается.
7.7.2.2.1. Хранение и подготовка тест-штаммов для контроля
качества тиогликолевой среды.
Alcaligenes faecatis 415.
Вскрывают ампулу с лиофилизированной культурой, стерильной
пастеровской пипеткой добавляют (приблизительно 0,5 мл) бульон
Хоттингера (Приложение, п. 2), тщательно перемешивают до получения
гомогенной суспензии и переносят в пробирку с бульоном Хоттингера
и со скошенным агаром Хоттингера (Приложение, п. 3). Посевы
инкубируют в течение 20 - 24 ч при температуре (37 +/- 1) -С.
Выросшую на скошенном агаре Хоттингера культуру пересевают в 2
- 3 пробирки с той же средой (агар Хоттингера) <*>. Посевы
инкубируют в течение 20 - 24 ч при температуре (37 +/- 1) -С,
после чего полученную культуру "уколом" пересевают в 8 - 10
пробирок со средой Романова (Приложение, п. 4). Через 20 - 24 ч
инкубации посевов при температуре (37 +/- 1) -С ватные пробки
пробирок с культурой накрывают полиэтиленовой пленкой (для
предотвращения высыхания). Пробирки с культурой хранят при
температуре 2 - 8 -С (6 - 8 месяцев). Допускается, в случае
необходимости (получение дополнительной партии пробирок с
культурой, закладываемых на хранение), произвести пересев тест-
штамма A.faecalis 415 со среды Романова на агар Хоттингера и вновь
на среду Романова. Большее количество пассажей культуры не
допускается.
--------------------------------
<*> В случае отсутствия роста на агаре Хоттингера для
последующего пассажа используют культуру, выращенную в бульоне.
Для получения рабочей культуры тест-штамм A.faecalis 415 со
среды Романова пересевают в 2 - 3 пробирки со скошенным агаром
Хоттингера. Посевы инкубируют в течение 20 - 24 ч при температуре
(37 +/- 1) -С, затем вновь пересевают в 2 - 3 пробирки с агаром
Хоттингера и, после выращивания в течение 18 - 24 ч при
температуре (37 +/- 1) -С, используют для оценки ростовых и
нейтрализующих свойств тиогликолевой среды.
Clostridium novyi 198.
Вскрывают ампулу с лиофилизированной культурой, стерильной
пастеровской пипеткой добавляют (приблизительно 1 мл)
предварительно регенерированную <*> среду Тароцци (Приложение, п.
5), тщательно перемешивают <**>. Полученную гомогенную суспензию
переносят в 2 пробирки со средой Тароцци (посевной материал вносят
в нижнюю часть пробирки). Посевы инкубируют в течение 44 - 48 ч
при температуре (37 +/- 1) -С.
--------------------------------
<*> Во всех случаях при посеве культуры C.novyi 198 на среду
Тароцци пользуются регенерированной средой. Регенерацию среды
осуществляют перед посевом путем выдерживания пробирок со средой в
кипящей водяной бане в течение 10 - 15 мин. и последующего
быстрого охлаждения в воде.
<**> Следует иметь в виду, что при работе с анаэробной
культурой перемешивание осуществляют с помощью пипетки; при этом
во избежание аэрации среды пипетку не вынимают из жидкости и
содержимое из пипетки не выдувают до конца.
Культуру из обеих пробирок, соблюдая правила асептики,
переносят во флакон, вместимостью 20 - 30 мл (кусочки мяса не
должны попадать), и центрифугируют при частоте вращения 3000
об./мин. в течение 20 мин. Затем с помощью пипетки отсасывают
надосадочную жидкость, а к полученной биомассе добавляют небольшое
количество стерильного раствора для разведения культуры -
разводящей жидкости (Приложение, п. 6), перемешивают, переносят в
пробирку и готовят микробную взвесь, соответствующую 10-ти
единицам по стандартному образцу мутности (ОСО 42-28-59-85).
По 1 мл полученной взвеси высевают <*> в 10 - 15 пробирок с 10
мл предварительно регенерированной <**> питательной среды для
получения культуры в споровой форме (Приложение, п. 7). Посевы
инкубируют в течение 44 - 48 ч при температуре (37 +/- 1) -С,
после чего содержимое пробирок перемешивают с помощью стерильной
пипетки, делают мазки культуры (окрашивание производят 1%-ным
раствором генцианвиолета в течение 30 с), микроскопируют и
определяют количество спор (М) в процентах по формуле:
--------------------------------
<*> Для определения чистоты культуры при всех пересевах тест-
штамма C.novyi 198 следует производить высев на скошенный агар
Хоттингера.
<**> Регенерацию среды для получения споровой культуры
осуществляют аналогично регенерации среды Тароцци.
n
М = - x 100%,
N
где:
n - число спор в 3 - 5 полях зрения;
N - общее число (не менее 100) сосчитанных клеток (палочки и
споры) в 3 - 5 полях зрения.
Пробирки с культурой, в которой не менее 5% спор, накрывают
полиэтиленовой пленкой и хранят при температуре 2 - 8 -С.
В случае необходимости иметь большее количество пробирок с
культурой, закладываемых на хранение (частый контроль), культуру в
споровой форме следует пересеять на среду Тароцци (5 - 6
пробирок), инкубировать посевы при температуре (37 +/- 1) -С в
течение 44 - 48 ч и далее получить споровую культуру по описанной
выше методике.
Для получения рабочей культуры С.novyi 198 споровую культуру
тест-штамма, хранящуюся в среде для получения спор, перемешивают с
помощью пипетки и по 1 мл пересевают в 2 - 3 пробирки с 10 мл
среды Тароцци. Содержимое одной пробирки со споровой культурой
С.novyi 198 используют для 2 - 3-х посевов. Посевы инкубируют в
течение 24 - 48 ч при температуре (37 +/- 1) -С до обнаружения
отчетливо видимого роста культуры в виде диффузного помутнения
среды с четко выраженной прозрачной зоной. После чего осуществляют
повторный пересев тест-штамма в 2 - 3 пробирки со средой Тароцци.
Через 17 - 19 ч инкубации при температуре (37 +/- 1) -С культуру
используют для оценки ростовых свойств тиогликолевой среды.
При необходимости (срочный контроль тиогликолевой среды)
культуру, выращенную в течение 24 - 48 ч после высева из ампулы,
следует пересеять в 2 - 3 пробирки со средой Тароцци, инкубировать
в течение 17 - 19 ч при температуре (37 +/- 1) -С и полученную
культуру использовать для посева в тиогликолевую среду.
7.7.2.2.2. Посев тест-штаммов в тиогликолевую среду.
Alcaligenes faecalis 415.
Выросшую на скошенном агаре Хоттингера при температуре
(37 +/- 1) -С в течение 18 - 24 ч культуру тест-штамма A.faecalis
415 смывают с поверхности среды стерильным 0,9%-ным раствором
хлорида натрия, доводят концентрацию микробной взвеси до 10 единиц
по стандартному образцу мутности. Из данной взвеси культуры
десятикратным разведением (9 мл 0,9%-ного раствора хлорида натрия
-1
и 1 мл микробной взвеси) получают разведение 10 . Микробную
-1
взвесь из разведения 10 разводят стерильным 0,9%-ным раствором
хлорида натрия в соотношении 1:1 (4,5 мл 0,9%-ного раствора
-2
хлорида натрия и 4,5 мл микробной взвеси) - разведение 10
(условно). Полученную взвесь культуры десятикратными разведениями
-8
доводят до разведения 10 , меняя пипетку для каждого разведения.
Для контроля тиогликолевой среды используют разведения культуры
-6 -7 -8
тест-штамма A.faecalis 415 - 10 , 10 и 10 .
Из каждого указанного разведения по 0,1 мл микробной взвеси
вносят в 3 пробирки с 10 мл тиогликолевой среды, погружая пипетку
в середину столбика среды. Посев осуществляют, начиная с
последнего разведения. Не позднее 48 ч инкубации при температуре
|
