Законы России
 
Навигация
Популярное в сети
Курсы валют
27.06.2015
USD
54.81
EUR
61.41
CNY
8.83
JPY
0.44
GBP
86.35
TRY
20.6
PLN
14.72
 

МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ МЕДИЦИНСКИХ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ, ВВОДИМЫХ ЛЮДЯМ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУК 4.1/4.2.588-96 (УТВ. ГОСКОМСАНЭПИДНАДЗОРОМ РФ 31.10.1996)

По состоянию на ноябрь 2007 года
Стр. 1

                                                             Утверждаю
                                       Первый заместитель Председателя
                                          Госкомсанэпиднадзора России,
                                                  Заместитель Главного
                                          государственного санитарного
                                            врача Российской Федерации
                                                           С.В.СЕМЕНОВ
                                                  31 октября 1996 года
   
                                                         Дата введения
                                                 с момента утверждения
   
                    4. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МЕДИЦИНСКИЕ
                     ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ
                                   
            МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ МЕДИЦИНСКИХ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ
                      ПРЕПАРАТОВ, ВВОДИМЫХ ЛЮДЯМ
                                   
      TESTING OF INJECTABLE MEDICAL IMMUNOBIOLOGICAL PREPARATIONS
                                   
                         МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
                          МУК 4.1/4.2.588-96
   
       1.    Разработаны    Государственным   научно-исследовательским
   институтом  стандартизации  и  контроля  медицинских  биологических
   препаратов им. Л.А. Тарасевича.
       2. Утверждены первым заместителем Председателя Государственного
   комитета     санитарно-эпидемиологического    надзора    Российской
   Федерации 31 октября 1996 г.
       3. Введены впервые.
   
              Закон РСФСР "О санитарно-эпидемиологическом
                        благополучии населения"
   
       "Санитарные правила, нормы и гигиенические нормативы  (далее  -
   санитарные  правила)  - нормативные акты, устанавливающие  критерии
   безопасности и (или) безвредности для человека факторов  среды  его
   обитания  и  требования  к  обеспечению благоприятных  условий  его
   жизнедеятельности.
       Санитарные    правила   обязательны   для   соблюдения    всеми
   государственными    органами    и   общественными    объединениями,
   предприятиями  и  иными хозяйствующими субъектами, организациями  и
   учреждениями,  независимо от их подчиненности и форм собственности,
   должностными лицами и гражданами" (статья 3).
       "Санитарным  правонарушением  признается  посягающее  на  права
   граждан  и  интересы общества противоправное, виновное  (умышленное
   или  неосторожное) деяние (действие или бездействие),  связанное  с
   несоблюдением  санитарного  законодательства  РСФСР,  в  том  числе
   действующих санитарных правил...
       Должностные  лица  и  граждане  РСФСР,  допустившие  санитарное
   правонарушение,    могут   быть   привлечены   к    дисциплинарной,
   административной и уголовной ответственности" (статья 27).
   
                         1. Область применения
   
       Настоящие  Методические указания предназначены  для  работников
   предприятий,  осуществляющих контроль качества вакцин, анатоксинов,
   сывороток,  иммуноглобулинов,  аллергенов,  эубиотиков   и   других
   иммунобиологических препаратов, вводимых людям.
       Все   положения   настоящего  документа   распространяются   на
   предприятия,  производящие  МИБП, независимо  от  их  ведомственной
   принадлежности и формы собственности.
   
                         2. Нормативные ссылки
   
       2.1. Вакцинопрофилактика СП 3.1.1.95.
       2.2. Приказ Министерства здравоохранения СССР от 13.01.83 N 31.
       2.3.  Производство  и  контроль медицинских иммунобиологических
   препаратов для обеспечения их качества.
   
                          3. Общие положения
   
       3.1.  Целью  введения настоящих Методических указаний  является
   регламентация   методов  контроля  медицинских  иммунобиологических
   препаратов  на их соответствие требованиям нормативной  технической
   документации  и,  прежде  всего,  Фармакопейной  статьи  (Временной
   фармакопейной статьи).
       3.2.   Задачей  проведения  общих  методов  контроля   является
   преимущественно установление безопасности МИБП, вводимых людям.
       3.3.  Методические  указания содержат  описание  общих  методов
   контроля МИБП, вводимых людям. Особенности контроля качества  МИБП,
   не   охватываемые  настоящим  документом,  описаны  в   нормативно-
   технической документации на эти препараты.
   
                       4. Термины и определения
   
       4.1. Биологические термины и определения
       4.1.1.   Медицинские  иммунобиологические  препараты,  вводимые
   людям,   -   вакцины,   анатоксины,   иммуноглобулины,   сыворотки,
   аллергены,    эубиотики    и    другие   лекарственные    средства,
   предназначенные    для    иммунопрофилактики,    иммунотерапии    и
   иммунодиагностики   инфекционных   заболеваний   и    аллергических
   состояний.
       4.1.2.   Качество   МИБП  -  совокупность  свойств   продукции,
   обусловливающих    ее   способность   удовлетворять    определенные
   потребности в соответствии с ее назначением.
       4.1.3.   Готовая  серия  препарата  -  совокупность   емкостей,
   полученных из одного готового к розливу полуфабриката, разлитых  из
   одной емкости.
       4.2. Химические термины и определения
       4.2.1.   Концентрация.  Концентрация  растворов  в  весобъемных
   процентах.  Например, для приготовления 10%-ного  раствора  следует
   брать 10 г вещества и растворителя для получения 100 мл раствора.
       4.2.2.  Точная  навеска. Взвешивание на аналитических  весах  с
   точностью  до  0,0002  г.  Если не указано:  "точная  навеска",  то
   навеску берут с точностью до 0,01 г.
       4.2.3.    Постоянная    масса.   Разница    в    массе    между
   последовательными взвешиваниями, не превышающая 0,0005 г.
       4.2.4.  Растворитель - дистиллированная вода, если  нет  других
   указаний.
       4.2.5. Оценка результатов. Расчет результатов на основании  2-х
   параллельных определений.
       4.2.6.  Квалификация реактивов. Для анализа используют реактивы
   квалификации х.ч. и ч.д.а.
       4.2.7. Моющее средство. Хромовая смесь для обработки посуды (5%-
   ный раствор калия дихромата в концентрированной серной кислоте).
       4.2.8.  Контрольный  опыт. Определение, проводимое  с  теми  же
   количествами  реактивов  в  тех  же условиях,  но  без  испытуемого
   препарата. Вместо испытуемого препарата используется растворитель.
       4.2.9.  Хранение  растворов. Хранение растворов  реактивов  при
   температуре  18  -  20 -С в течение 6 мес., если нет  изменений  их
   физических свойств.
       4.2.10. Спирт - этиловый ректификованный, содержащий 96% спирта
   (по массе).
   
              5. Определение электрофоретической чистоты
            и молекулярных масс генно-инженерных препаратов
   
       Метод  используется для анализа генно-инженерных  продуктов,  а
   также   некоторых  высокоочищенных  биотехнологических  препаратов,
   предназначенных для введения людям.
       Для  определения  чистоты, гомогенности  и  молекулярной  массы
   генно-инженерных    продуктов   применяют    метод    вертикального
   электрофореза  в  полиакриламидном геле (ПААГ)  с  додецилсульфатом
   натрия   (SDS)   в   редуцирующих  и  нередуцирующих   условиях   с
   последующей  окраской геля как Кумасси ярко-голубым  R-250,  так  и
   нитратом  серебра.  Образование комплекса SDS  с  белком  устраняет
   различия  между  белками,  связанные  с  их  зарядом,  и  переводит
   молекулы  белков в конформацию, при которой радиус Стокса  является
   функцией  молекулярной  массы белка. При  соблюдении  этих  условий
   подвижность белков отражает их молекулярные массы.
       Испытания   проводят  на  полуфабрикате  препарата  (очищенного
   продукта)  до  добавления каких-либо стабилизаторов,  наполнителей,
   консервантов  и других компонентов, входящих в состав лекарственной
   формы.
       Электрофорез  проводят  в  редуцирующих  (в  присутствии  бета-
   меркаптоэтанола)    и    нередуцирующих   (в    отсутствии    бета-
   меркаптоэтанола)  условиях. Определение  молекулярных  масс  генно-
   инженерных белков проводят при окрашивании Кумасси ярко-голубым  R-
   250  с  нагрузкой  на  лунку 10 мкг, а определение  чистоты  -  при
   нагрузке 40 мкг.
       Параллельно, для оценки содержания примесей как белковой, так и
   небелковой  природы, проводят электрофорез в редуцирующих  условиях
   при  окрашивании нитратом серебра с нагрузкой на лунку 2  -  5  мкг
   белка.
       Методика  определения.  Полимеризацию  геля  ведут  в   ячейке,
   образованной  стеклами  и  прокладками,  определяющими   размер   и
   толщину  геля. Сборку ячейки проводят в соответствии с  инструкцией
   по   работе   с   конкретным   типом  прибора   для   вертикального
   электрофореза.  Описание  метода  проводится  на  примере  аппарата
   "Протеан  11"  фирмы  "Био-Рад", США. Для данного  прибора  размеры
   стекол  ячейки составляют: внешнее стекло - 22 x 20 см,  внутреннее
   стекло - 20 x 20 см. Размеры прокладок: длина - 20 см, ширина -  18
   см,  толщина  -  0,75  -  1,0 мм. При наличии  приборов  с  другими
   характеристиками  необходимо  внести соответствующие  коррективы  в
   постановку испытаний.
       Проведение электрофореза
       Нижнюю  камеру аппарата для электрофореза заполняют электродным
   буферным  раствором и вставляют в нее электрофоретическую ячейку  с
   гелем.  Верхний резервуар заполняют электродным буферным раствором,
   удаляют  из  лунок пузырьки воздуха. Под слой буферного раствора  в
   лунку   вносят  исследуемые  образцы.  Электрофорез  проводят   при
   температуре  10 - 14 -С в режиме постоянного тока. При  прохождении
   фронта  красителя через концентрирующий гель сила  тока  составляет
   10  -  12,5  мА  на 1 кв. см сечения геля (20 - 25 мА/гель).  После
   вхождения фронта красителя в нижний разделяющий слой на 5  -  7  мм
   силу  тока  увеличивают  до 20 мА на 1  кв.  см  сечения  геля  (40
   мА/гель).  После  продвижения красителя на 14 см  от  нижнего  края
   концентрирующего  геля  ток  отключают,  отделяют  гель  от  стекол
   ячейки  и переносят в кювету для окрашивания. Для того чтобы  можно
   было  выявить присутствие в исследуемом образце агрегатов и  других
   компонентов, не входящих в гель, концентрирующий гель полностью  не
   обрезают,  оставляя  0,5  -  10 мм. В  случае  необходимости  можно
   обрезать   часть  нижнего  геля  по  фронту  красителя.   Нанесение
   образцов  на  гель проводят в следующем порядке. В  лунки  1  и  10
   вносят соответствующий (с бета-меркаптоэтанолом или без) буфер  для
   приготовления  образцов,  разбавленный  деионизованной  водой  в  4
   раза.  В  лунки  2  и  9 вносят по 7 мкл смеси стандартных  белков,
   например  фирмы  "Фармация",  Швеция.  В  остальные  лунки   вносят
   исследуемые  образцы.  При окрашивании Кумасси  ярко-голубым  R-250
   вносят попарно такие объемы образца, чтобы количество белка  в  них
   составляло  соответственно  10  и  40  мкг.  При  окрашивании  геля
   нитратом серебра, в зависимости от препарата, в лунки вносят 2 -  5
   мкг  белка.  Параллельно в одну из лунок вносят 0,002  -  0,01  мкг
   белка  (в  зависимости  от чувствительности  выявления  минимальных
   количеств белка в данных условиях).
       Окрашивание геля
       1. Окрашивание Кумасси ярко-голубым R-250. Гель фиксируют 1 ч в
   фиксирующем растворе, после чего окрашивают в течение 16  ч.  Затем
   окрашивающий   раствор  сливают,  гель  2  -  3  раза  споласкивают
   обесцвечивающим  раствором и помещают в аппарат для обесцвечивания,
   заполненный  обесцвечивающим раствором. Обесцвечивание  проводят  в
   течение 15 мин. при напряжении 24 В. Гель вынимают из аппарата  для
   обесцвечивания  и  споласкивают  раствором  для  обесцвечивания   и
   деионизованной водой.
       2.  Окрашивание  нитратом  серебра. Окрашивание  геля  нитратом
   серебра  проводят  с использованием коммерческого набора  реагентов
   (фирмы   "Био-Рад",   США,   или   других)   согласно   прилагаемой
   инструкции. Следует обратить внимание на время выдерживания геля  в
   проявляющем  растворе. Окрашивание прекращают в  момент  проявления
   полосы  в  лунке  с  минимальным количеством  препарата  (например,
   0,005 мкг).
       Высушивание геля
       В кювету наливают 0,5 л раствора для высушивания геля, помещают
   лист  целлофановой  диализной мембраны, например фирмы  "Фармация",
   Швеция.  На  нем  размещают гель и сверху накрывают  вторым  листом
   целлофановой  диализной  мембраны.  Кювету  закрывают   крышкой   и
   помещают  на  качалку. При покачивании гель  выдерживают  20  -  30
   минут.  Стекло смачивают раствором для высушивания геля и  на  него
   плотно,   без   пузырьков   воздуха,  натягивают   смоченный   лист
   целлофановой  диализной  мембраны, на  нее  помещают  гель.  Сверху
   плотно,  без  пузырьков воздуха прикрывают вторым смоченным  листом
   целлофановой  диализной мембраны. Закрепляют и оставляют  на  столе
   при  комнатной  температуре не менее чем на 18 - 20  ч.  Высушенный
   гель снимают со стекла вместе с целлофановой диализной мембраной  и
   аккуратно  обрезают.  Гель  готов для  проведения  денситометрии  и
   оценки результатов.
       Денситометрия окрашенного геля
       Проводится  денситометром  фирмы ЛКБ,  Швеция,  или  другим  не
   меньшей  чувствительности. Денситометрию проводят в соответствии  с
   инструкцией  по  эксплуатации  данного  прибора  от  верхнего  края
   нижнего разделяющего геля по пути пробега белков в данной лунке.  В
   зависимости    от    конструкции   аппарата    может    проводиться
   денситометрия  влажного и высушенного геля.  Для  учета  фона  геля
   может  денситометрироваться дорожка с нанесенным буферным раствором
   для  образцов, разбавленным деионизованной водой в 4 раза (в  нашем
   примере  дорожки  1 и 10). Площадь интегрирования  самого  большого
   зарегистрированного    пика   является    нижним    пределом    для
   денситометрии анализируемых образцов. Однако при этом  на  дорожках
   с буферным раствором не должны обнаруживаться окрашенные полосы.
       Определение молекулярных масс генно-инженерных белков
       Молекулярные массы мономеров и олигомеров исследуемого продукта
   определяют   на  электрофореграмме,  полученной  после  окрашивания
   Кумасси ярко-голубым R-250 в редуцирующих условиях при нагрузке  на
   лунку 10 мкг белка. Для этого измеряют расстояние от верхнего  края
   нижнего  разделяющего  геля  до  белковых  зон  стандартных  белков
   (дорожки  2  и  9)  - величина Rбелка. Таким же образом  определяют
   расстояние  пробега  красителя (величина  Rстандарт).  Для  каждого
   стандартного  белка  определяют  коэффициент  подвижности  (Ra)  по
   формуле:
   
                                  Rбелка
                            Ra = ---------.
                                 Rстандарт
   
       Строят  график зависимости Ra стандартного белка  от  логарифма
   молекулярной  массы  стандартного белка. Затем  определяют  Ra  для
   каждой  белковой  зоны  исследуемого образца  и  по  калибровочному
   графику   определяют  логарифмы  молекулярной  массы,  из   которых
   рассчитывают молекулярную массу соответствующих белков.
       Оценка результатов электрофореза
       После  завершения электрофореза исследуемые образцы  не  должны
   содержать неидентифицированных продуктов или их агрегатов в  лунках
   гребенки   геля  или  на  границе  при  вхождении   в   гель.   Для
   количественной  оценки  процента  содержания  целевого  белка,  его
   олигомеров,  фрагментов и примесей проводят сканирование  геля  при
   помощи   денситометра.  Содержание  генно-инженерного  продукта   в
   редуцирующих  условиях при окрашивании Кумасси  ярко-голубым  R-250
   должно   быть   не  менее  95%.  Требования  к  другим   параметрам
   (относительное   содержание  мономеров,   олигомеров,   фрагментов,
   белковых  и  небелковых  примесей, чистота  и  картина  дорожки  на
   электрофореграмме  в  нередуцирующих  условиях  и  при  окрашивании
   нитратом   серебра)  определяются  характеристиками  и  назначением
   конкретных   исследуемых  препаратов  и   указываются   в   частных
   фармакопейных статьях.
       Примечания. I. Приготовление нижнего разделяющего геля
       1.   Для  приготовления  15%-ного  геля  в  химический  стакан,
   емкостью    100    мл,    наливают   25   мл   30%-ного    раствора
   акриламида/бисакриламида,  12,5  мл  буферного  раствора   трис-HCl
   концентрации  1,5  моль/л, pH 8,8, 11,75 мл деионизованной  воды  и
   500  мкл  10%-ного раствора SDS. Полученный раствор  дегазируют  15
   мин.  под  вакуумом  в  колбе Бунзена. К  дегазированному  раствору
   прибавляют   250  мкл  10%-ного  раствора  ПСА  и  25  мкл   TEMED,
   перемешивают и заливают в электрофоретическую ячейку.
       2.   Для  приготовления  12%-ного  геля  в  химический  стакан,
   емкостью    100    мл,    наливают   20   мл   30%-ного    раствора
   акриламида/бисакриламида,  12,5  мл  буферного  раствора   трис-HCl
   концентрации  1,5  моль/л, pH 8,8, 16,75 мл деионизованной  воды  и
   500  мкл  10%-ного раствора SDS. Полученный раствор  дегазируют  15
   мин.  под  вакуумом  в  колбе Бунзена. К  дегазированному  раствору
   добавляют   250  мкл  10%-ного  раствора  ПСА  и  25   мкл   TEMED,
   перемешивают и заливают в электрофоретическую ячейку.
       Мениск раствора в ячейке должен находиться на расстоянии 3 -  4
   см  от  верхнего  края  внутреннего стекла.  На  раствор  в  ячейке
   наслаивают  1,0 мл деионизованной воды так, чтобы гель  и  вода  не
   перемешивались.  Полимеризация геля происходит в течение  30  -  40
   мин.  при  температуре 18 - 20 -С. Сначала граница  между  гелем  и
   водой   размывается,  а  затем  становится  резкой.  Это   является
   моментом окончания полимеризации.
       II. Приготовление верхнего концентрирующего геля
       После  окончания полимеризации нижнего разделяющего  геля  воду
   сливают,   поверхность   геля  тщательно  подсушивают   с   помощью
   фильтровальной  бумаги и заливают в ячейку 4%-ный раствор  верхнего
   концентрирующего  геля. Для его приготовления в химический  стакан,
   вместимостью   50   мл,   наливают   1,3   мл   30%-ного   раствора
   акриламида/бисакриламида,  2,5  мл раствора  трис-HCl  концентрации
   0,5  моль/л, pH 6,8, 6,1 мл деионизованной воды и 100 мкл  10%-ного
   раствора  SDS. Раствор дегазируют под вакуумом в колбе  Бунзена  15
   мин.  К дегазированному раствору добавляют 50 мкл 10%-ного раствора
   ПСА,  10  мкл  TEMED, перемешивают и заливают в электрофоретическую
   ячейку.  После  этого  в  ячейку вставляют гребенку  с  необходимым
   (например,  десятью) количеством зубьев и толщиной, равной  толщине
   прокладки.  Полимеризация геля происходит в течение 30  -  40  мин.
   при   температуре  18  -  20  -С.  После  завершения  полимеризации
   гребенку   удаляют   и  промывают  образовавшиеся   лунки   1   раз
   деионизованной водой и 10 раз электродным буферным раствором.
       III. Приготовление растворов
       1. Электродный буферный раствор (5х) pH 8,3.
       45,0 г трис(гидроксиметил)аминометана, 216,0 г глицина, 15,0  г
   SDS   помещают  в  градуированный  стакан,  прибавляют  2000,0   мл
   деионизованной  воды, перемешивают до полного растворения,  доводят
   объем  деионизованной водой до 3000,0 мл, фильтруют,  измеряют  pH,
   который  должен быть в пределах 8,3. Доводить pH раствора  кислотой
   или щелочью до необходимого значения не допускается.
       2. Электродный буферный раствор pH 8,3.
       К  600,0  мл  электродного буферного раствора  (5х)  прибавляют
   2400,0 мл деионизованной воды и перемешивают.
       3. 30%-ный раствор акриламида/бисакриламида.
       29,20   г   акриламида  и  0,80  г  бисакриламида  помещают   в
   градуированный   химический   стакан   и   прибавляют    80,0    мл
   деионизованной  воды, перемешивают до полного растворения,  доводят
   объем  до 100,0 мл деионизованной водой. Раствор фильтруют и хранят
   в темной посуде при 4 - 6 -С не более месяца.
       4. Буферный раствор трис-HCl концентрации 1,5 моль/л, pH 8,8.
       54,450    г    трис(гидроксиметил)аминометана    помещают     в
   градуированный    химический   стакан,    прибавляют    150,0    мл
   деионизованной  воды, перемешивают до полного растворения.  Доводят
   pH  до  8,8 раствором НСl концентрации 1 моль/л. Доводят  объем  до
   300,0  деионизованной водой. Раствор фильтруют и хранят  в  течение
   месяца при 4 - 6 -С.
       5. Буферный раствор трис-HCl концентрации 0,5 моль/л, pH 6,8.
       6,0  г трис(гидроксиметил)аминометана помещают в градуированный
   химический   стакан,   прибавляют  60,0  мл  деионизованной   воды,
   перемешивают  до полного растворения. Доводят pH до  6,8  раствором
   НСl   концентрации   1   моль/л.  Доводят   объем   до   100,0   мл
   деионизованной  водой. Раствор фильтруют и хранят в течение  месяца
   при 4 - 6 -С.
       6. 10%-ный раствор SDS.
       10,0   г   додецилсульфата  натрия  помещают  в  градуированный
   химический  стакан,  прибавляют  80,0  мл  деионизованной  воды   и
   тщательно  перемешивают до полного растворения.  Доводят  объем  до
   100,0 мл деионизованной водой. Хранят при температуре 18 - 25 -С.
       7. 10%-ный раствор ПСА.
       100,0 мг аммония персульфата растворяют в 1,0 мл деионизованной
   воды. Используется только свежеприготовленный раствор.
       8. 0,5%-ный бромфеноловый синий.
       0,25  г бромфенолового синего разводят в 50,0 мл деионизованной
   воды  до полного растворения. Раствор хранят при температуре  18  -
   25 -С.
       9.   Раствор   для   приготовления  образцов   при   проведении
   электрофореза в нередуцирующих условиях.
       В химический стакан помещают 4,2 мл деионизованной воды, 1,0 мл
   буферного  раствора трис-НСl концентрации 0,5 моль/л, pH  6,8,  0,8
   мл  глицерина,  1,6  мл  10%-ного раствора SDS,  0,4  мл  0,5%-ного
   раствора  бромфенолового синего. Раствор тщательно  перемешивают  и
   хранят при температуре 18 - 25 -С.
       10.   Раствор   для  приготовления  образцов   при   проведении
   электрофореза в редуцирующих условиях.
       В химический стакан помещают 3,8 мл деионизованной воды, 1,0 мл
   буферного  раствора трис-HCl концентрации 0,5 моль/л, pH  6,8,  0,8
   мл   глицерина,  1,6  мл  10%-ного  раствора  SDS,  0,4  мл   бета-
   меркаптоэтанола,  0,4 мл 0,5%-ного раствора бромфенолового  синего.
   Раствор  тщательно перемешивают и хранят при температуре  18  -  25
   -С.
       11.  Образец исследуемого препарата смешивают в соотношении 3:1
   с  раствором для проведения электрофореза в нередуцирующих условиях
   или   с  раствором  для  проведения  электрофореза  в  редуцирующих
   условиях. Смесь прогревают в кипящей водяной бане в течение  5  или
   10  мин.  (в  зависимости от исследуемого  белка)  и  охлаждают  до
   температуры 18 - 25 -С.
       12.    Приготовление    раствора   стандартных    белков    для
   электрофореза.
       Смесь стандартных белков для электрофореза ("Фармация", Швеция,
   или  подобные  другие)  с соответствующим для данного  исследования
   диапазоном  молекулярных  масс  (например,  от  14400   до   94000)
   растворяют   в  100  мкл  разбавленного  в  4  раза  раствора   для
   приготовления образцов при проведении электрофореза в  редуцирующих
   условиях  или  в  100  мкл разбавленного  в  4  раза  раствора  для
   приготовления    образцов    для   проведения    электрофореза    в
   нередуцирующих условиях. Раствор прогревают в кипящей водяной  бане
   в  течение  5 мин. и охлаждают до температуры 18 - 25 -С. Разливают
   аликвоты и хранят при -20 -С.
       13. Фиксирующий раствор.
       В  химический стакан наливают 250,0 мл этилового спирта,  100,0
   мл  ледяной  уксусной  кислоты, добавляют  деионизованной  воды  до
   объема 1000,0 мл. Хранят при температуре 18 - 25 -С.
       14. Окрашивающий раствор.
       1,0 г Кумасси ярко-голубого R-250 помещают в химический стакан,
   доводят до объема 250,0 мл этиловым спиртом, перемешивают не  менее
   3,5  часа  до  полного растворения красителя,  добавляют  100,0  мл
   ледяной  уксусной кислоты и доводят объем деионизованной  водой  до
   1000,0 мл. Хранят при температуре 18 - 25 -С.
       15. Обесцвечивающий раствор.
       В  химический стакан наливают 250,0 мл этилового спирта,  100,0
   мл  ледяной  уксусной кислоты и доводят объем деионизованной  водой
   до 1000 мл.
       16. Раствор для высушивания геля.
       В химический стакан наливают 150,0 мл этилового спирта, 50,0 мл
   глицерина,  перемешивают  и доводят объем деионизованной  водой  до
   500,0 мл. Хранят при температуре 18 - 25 -С.
       17.  При  отборе  проб  и  растворов используют  автоматические
   пипетки с соответствующими диапазонами объемов:
       - от 1 мкл до 10 мкл;
       - от 5 мкл до 40 мкл;
       - от 40 мкл до 200 мкл;
       - от 200 мкл до 1000 мкл;
       - от 1 мл до 5 мл.
   
             6. Контроль содержания примесей клеточных ДНК
                    в биотехнологических препаратах
   
       Настоящему   испытанию  подлежат  генно-инженерные   препараты,
   моноклональные  антитела и биотехнологические продукты,  получаемые
   на  перевиваемых  клеточных  линиях, предназначенные  для  введения
   людям.  В  частных  фармакопейных статьях на  отдельные  препараты,
   учитывая    их    специфические   характеристики   и    особенности
   производства,  возможно  внесение  соответствующих  изменений   при
   проведении данного контроля.
       Испытание   проводят  на  полуфабрикате  препарата  (очищенного
   продукта)  до  добавления каких-либо стабилизаторов,  наполнителей,
   консервантов и других компонентов, которые могут входить  в  состав
   конечной лечебной формы.
       Выделение ДНК из клеток штамма продуцента
       1  г  биомассы клеток штамма продуцента суспендируют  в  20  мл
   буфера  ТЕ, добавляют 10%-ный раствор додецилсульфата натрия  (SDS)
   до   конечной  концентрации  1%,  лизируют  в  течение   15   мин.,
   перемешивая.  К  полученному лизату добавляют  равный  объем  смеси
   фенол-хлороформ  (1:1).  Смесь  встряхивают  в  течение  15   мин.,
   центрифугируют  при  5000  об./мин.  в  течение  5  мин.,  собирают
   верхний   слой  (без  интерфазы)  и  повторяют  экстракцию   фенол-
   хлороформом еще дважды. Собирают верхний слой, добавляют раствор  5
   моль/л ацетата аммония до конечной концентрации 0,25 моль/л и  2  -
   2,5  объема  охлажденного  до -20 -С этилового  спирта.  Полученную
   смесь оставляют на 1 час при -20 -С (можно оставить на ночь - 14  -
   16  часов), затем центрифугируют при 5000 об./мин. в течение 5 мин.
   Этиловый  спирт сливают, осадок подсушивают на воздухе и растворяют
   в  1,5  мл буфера ТЕ. К раствору ДНК добавляют раствор РНК-азы  (10
   мг/мл)  до  конечной концентрации 50 мкг/мл. Смесь выдерживают  при
   периодическом помешивании в течение одного часа при  37  -С,  после
   чего  к  ней  добавляют  сухую лиофилизированную  протеиназу  К  до
   конечной  концентрации  100 мкг/мл. Смесь инкубируют,  периодически
   помешивая,  в  течение  30 мин. при 37 -С,  затем  депротеинизируют
   равным  объемом смеси фенол-хлороформ (1:1) и далее равным  объемом
   хлороформа.  К  водной  фазе добавляют  раствор  5  моль/л  ацетата
   аммония   до   конечной  концентрации  0,25  моль/л  и   2   объема
   охлажденного  до  -20  -С  этилового спирта.  Выпавший  осадок  ДНК
   собирают  центрифугированием, промывают в 70%-ном растворе этанола,
   подсушивают при комнатной температуре до удаления остатков  этанола
   и растворяют в 2 мл буфера ТЕ.
       Измерение концентрации ДНК
       Концентрацию  ДНК  определяют спектрофотометрически  при  длине
   волны  256  нм  в кювете с толщиной слоя 1 см. 30 мкл раствора  ДНК
   разводят  буфером  ТЕ до 3,0 мл, помещают в кювету спектрофотометра
   и  определяют  оптическую плотность раствора. В  качестве  контроля
   используют  буфер ТЕ. Концентрацию полученного раствора ДНК  (СДНК,
   мкг/мл) вычисляют по формуле:
   
                           СДНК = А x Э x Р,
   
       где:
       А - оптическая плотность раствора при длине волны 256 нм;
       Э  -  50  мкг/мл  (при такой концентрации оптическая  плотность
   раствора ДНК при 256 нм равна одной оптической единице);
       Р - кратность разведения исследуемого раствора, в данном случае
   равная 100.
       Пример  расчета:  в результате спектрофотометрического  анализа
   раствора  ДНК  установлено, что оптическая плотность  раствора  при
   256 нм составляет 0,2 оптической единицы. Тогда:
   
            СДНК = 0,2 x 50 x 100 = 1000 мкг/мл (1 мг/мл).
   
       Критерием  чистоты препарата ДНК является соотношение  значений
   оптической  плотности раствора ДНК при длинах волн 256  и  280  нм.
   Для   чистых  препаратов  ДНК  указанное  соотношение   выше   1,7.
   Например,  светопоглощение исследуемого разведенного  раствора  ДНК
   при  280  нм  равно  0,11  оптической  единицы.  Тогда  соотношение
   256/280 равно 0,20/0,11 = 1,81.
       Полученный   препарат  очищенной  клеточной  ДНК  в  дальнейшем
   используют   для  приготовления  меченой  ДНК-зонда  и   построения
   калибровочного графика.
       Получение меченой ДНК
       В     пробирку     для     микропроб      вносят      2,0  МБк
        -32
   альфа   Р-дезоксиаденозинтрифосфата    (удельная   радиоактивность
              7
   8 - 12 x 10  МБк/ммоль).
       Затем  пробирку  помещают  в ледяную баню  и  вносят  следующие
   компоненты  реакции:  5 мкл буфера для ник-трансляции,  1  мкг  ДНК
   клеток  штамма-продуцента, 1 мкл раствора дезоксицитидинтрифосфата,
   тимидинтрифосфата  и  дезоксигуанозинтрифосфата  в  концентрации  1
   моль/л  и  деионизованную  воду до 45 мкл.  Раствор  ДНК-азы  1  (1
   мг/мл)  разводят  деионизованной  водой  в  10000  раз  и  0,5  мкл
   полученного  раствора вносят в реакционную смесь.  Далее  добавляют
   15  ед.  ДНК-полимеразы  1  Е.coli и смесь тщательно  перемешивают.
   Реакционную  смесь инкубируют в течение 2-х часов  при  температуре
   15  -С. Реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь 2 мкл
   раствора ЭДТА концентрации 0,5 моль/л.
       Определение удельной радиоактивности меченой ДНК
       На 2 нитроцеллюлозных фильтра диаметром 2 см наносят по  1 мкл
   реакционной смеси. Один фильтр дважды отмывают в  20 мл  холодного
   10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты в течение 5 мин.,  далее
   2 мин. в 10 мл этанола и высушивают при комнатной температуре. Оба
   фильтра   помещают  в  сцинтилляционные  флаконы  для  определения
   радиоактивности,   наливают   во   флаконы  по  4  мл  толуолового
   сцинтилляционного раствора и  определяют  на  счетчике  количество
   импульсов  в  минуту.  По  полученным  данным  определяют  процент
   включения  метки,  рассчитывают  общую  радиоактивность  в 50  мкл
   реакционной смеси и, соответственно, удельную радиоактивность ДНК,
   т.е.  количество  импульсов  в  минуту  на  1  мкг  ДНК.  Удельная
                                                      8
   радиоактивность ДНК должна быть не  менее  2,0 x 10  имп./мин. Для
                                                          6
   реакции гибридизации необходимо  взять (2 +/- 0,5) x 10  имп./мин.
   на 1 мл гибридизационной смеси.
       Очистка меченой ДНК
       Предварительно   готовят  суспензию   сефадекса   G-25.   Носик
   наконечника автоматической пипетки, вместимостью 1,0 мл,  закрывают
   небольшим  кусочком стекловаты и заполняют суспензией сефадекса.  В
   полиэтиленовую   центрифужную  пробирку   помещают   пробирку   для
   микропроб  типа  "Эппендорф",  вместимостью  1,5  мл,   а   в   нее
   наконечник пипетки с сефадексом. Пробирку центрифугируют при  18000
   об./мин.  в  течение  2,5  мин.  Сефадекс  в  наконечнике  еще  раз
   промывают  буфером  ТЕ, содержащим 20 мкг/мл  денатурированной  ДНК
   спермы  лосося.  Жидкость из эппендорфовской  пробирки  удаляют,  в
   наконечник на гель наносят реакционную смесь с меченой ДНК и  опять
   центрифугируют  в том же режиме. Не включившиеся в  ДНК  меченые  и
   немеченые   нуклеозидтрифосфаты  остаются  в  геле,   меченая   ДНК
   собирается на дне пробирки в объеме 50 мкл.
       Иммобилизация ДНК на мембране
       К   полуфабрикату  исследуемого  препарата,  объемом  0,5   мл,
   добавляют  1 мкл раствора ДНК спермы лосося концентрации 20  мг/мл,
   затем  дважды проводят депротеинизацию равным объемом смеси  фенол-
   хлороформ  (1:1),  собирают водный слой после  центрифугирования  в
   течение  5 мин. при 5000 об./мин. и осаждают двумя объемами этанола
   в  присутствии ацетата аммония в конечной концентрации 0,3  моль/л.
   Пробы  выдерживают  1 ч при температуре -20 -С (можно  оставить  на
   ночь  -  14  -  16 часов). Осажденные нуклеиновые кислоты  собирают
   центрифугированием при 13000 об./мин. в микроцентрифуге  в  течение
   6  мин.  Супернатант  осторожно  сливают,  в  пробирки  с  осадками
   нуклеиновых кислот добавляют 50 мкл 0,5 моль/л раствора  гидроокиси
   натрия  и  выдерживают 20 мин. при температуре 18 -  25  -С.  Пробы
   нейтрализуют  на  холоду  равным объемом (50  мкл)  нейтрализующего
   раствора  и помещают в ледяную баню. Далее на нижнюю часть аппарата
   для   дот-гибридизации  кладут  смоченную  дистиллированной   водой
   фильтровальную   бумагу,   на   нее  помещают   мембрану   Hybond-N
   ("Амершам")   и  прижимают  верхней  частью  аппарата,   снабженной
   специальными  зажимами. Верхняя часть аппарата для дот-гибридизации
   представляет   собой  пластину  (132  x  100  x  18)   с   лунками.
   Исследуемые образцы вносят в лунки А (1 - 12) и в следующие ряды  в
   зависимости от количества исследуемых проб.
       Параллельно,  рядом  с  исследуемыми  образцами,  наносят   ряд
   известных разведений очищенной клеточной ДНК в концентрации  от  20
   нг  до  0  пкг. Разведения готовят с помощью буфера ТЕ, содержащего
   ДНК-носитель (20 мкг/мл ДНК спермы лосося) следующим образом.  В  8
   пробирок  для микропроб добавляют по 100 мкл буфера ТЕ, содержащего
   20  мкг/мл ДНК носителя. Раствор ДНК штамма-продуцента разводят  до
   концентрации 100 мкг/мл и 5 мкл этого раствора ДНК разводят до  500
   мкл  раствором ТЕ с 20 мкг/мл ДНК-носителя. Таким образом  получают
   раствор  с концентрацией 1000 нг/мл. 25 мкл этого раствора (25  нг)
   добавляют  в  первую пробирку, тщательно перемешивают, отбирают  25
   мкл  полученного  раствора (5 нг) и переносят во  вторую  пробирку,
   тщательно  перемешивают  и отбирают 1/5  часть  раствора  (25  мкл,
   содержащие  1  нг  ДНК)  и переносят в третью  пробирку,  тщательно
   перемешивают.  Таким  образом  разводят  до  восьмой  пробирки.   В
   восьмую   пробирку  ДНК  не  добавляют.  В  табл.  1   представлены
   концентрации стандартного ряда ДНК в 1 - 8 пробирках.
   
                                                             Таблица 1
   
               КОНЦЕНТРАЦИИ СТАНДАРТНОГО ДНК В ПРОБИРКАХ
   
   ---------------------T-------------------------------------------¬
   ¦     N пробирки     ¦         Количество ДНК в пробирке         ¦
   +--------------------+---------------------T---------------------+
   ¦         1          ¦        20           ¦          нг         ¦
   +--------------------+---------------------+---------------------+
   ¦         2          ¦         4           ¦          нг         ¦
   +--------------------+---------------------+---------------------+
   ¦         3          ¦         0,8         ¦          нг         ¦
   +--------------------+---------------------+---------------------+
   ¦         4          ¦       160           ¦          пг         ¦
   +--------------------+---------------------+---------------------+
   ¦         5          ¦        32           ¦          пг         ¦
   +--------------------+---------------------+---------------------+
   ¦         6          ¦         6,4         ¦          пг         ¦
   +--------------------+---------------------+---------------------+
   ¦         7          ¦         1,28        ¦          пг         ¦
   +--------------------+---------------------+---------------------+
   ¦         8          ¦         0           ¦          пг         ¦
   L--------------------+---------------------+----------------------
   
       Содержимое  каждой пробирки стандартного ряда ДНК  обрабатывают
   равным  объемом  смеси  фенол-хлороформ (1:1),  центрифугируют  при
   5000  об./мин.  в течение 5 мин., собирают водный слой  и  осаждают
   двумя  объемами  этанола в присутствии 0,3 моль/л ацетата  аммония.
   Пробы  выдерживают  1 ч при -20 -С. Осажденные нуклеиновые  кислоты
   собирают  центрифугированием на микроцентрифуге при 13000  об./мин.
   в   течение   6   мин.  Образцы  стандартного  ряда  с   известными
   концентрациями   клеточной  ДНК  денатурируют   аналогично   пробам
   полуфабрикатов исследуемых препаратов, то есть добавляют  в  каждую
   пробирку  50 мкл раствора 0,5 моль/л гидроокиси натрия и инкубируют
   20  мин.  при  температуре  18 - 25 -С. Далее  нейтрализуют  равным
   объемом нейтрализующего раствора и помещают на ледяную баню,  затем
   наносят  на  мембрану  через  лунки. Аппарат  для  дот-гибридизации
   подключают   к   водоструйному  насосу,  чтобы  растворы   образцов
   полностью  просочились  через мембрану.  Лунки  промывают  200  мкл
   раствора  5х  раствора  SSC. Далее мембрану вынимают  из  аппарата,
   высушивают  на фильтровальной бумаге при температуре 18  -  25  -С.
   Для    иммобилизации    ДНК   на   мембране    мембрану    облучают
   ультрафиолетовым светом в течение 2-х мин. или выдерживают 2 ч  при
   80 -С.
       Проведение реакции гибридизации
       Мембрану с образцами  ДНК  помещают  в  полиэтиленовый  пакет,
   запечатывают при  помощи  аппарата  "Молния",  оставляя  небольшое
   отверстие  для   внесения   в   пакет   растворов.   Раствор   для
   предгибридизации,   подогретый  до  42 -С,  вносят  автоматической
   пипеткой в пакет из расчета 0,20 мл на 1 см мембраны.  Выдавливают
   как можно  больше  воздуха  из  мембраны,  запечатывают  отверстие
   нагреванием, помещают пакет  между  двумя  стеклами  и  помещают в
   водяную  баню  при  42 -С  на  2 - 3 часа.  По  истечении  времени
   предгибридизации пакет вскрывают,  отрезав  один  угол  ножницами.
   Сливают раствор для предгибридизации как можно полнее  и  в  пакет
   вносят раствор для  гибридизации  из  расчета  0,10  мл  на  1  см
   мембраны.  Раствор для  гибридизации -  это  тот  же  раствор  для
                                                   -32
   предгибридизации, но содержащий  меченую  (альфа   Р) ДНК. Меченую
                                                   6
   радиоактивным фосфором и очищенную ДНК (2,0 x 10  имп./мл раствора
   предгибридизации) перед добавлением  в  раствор  для  гибридизации
   прогревают при температуре  100 -С 5 мин., с  последующим  быстрым
   охлаждением на ледяной бане. Из пакета удаляют  воздух,  запаивают
   отрезанный угол и инкубируют пакет с мембраной  между  стеклами  в
   водяной бане при температуре 42 -С в течение 24-х ч.
       Отмывка мембраны
       После  окончания  инкубации вынимают  пакет  из  водяной  бани,
   разрезают  его  вдоль  3-х сторон, вынимают мембрану  и  немедленно
   погружают  в сосуд с раствором А при температуре 18 - 25 -С.  Через
   5  мин. переносят мембрану в другой сосуд, содержащий раствор Б,  и
   инкубируют  в  течение  15  мин.  при  температуре  18  -  25   -С,
   периодически помешивая. Затем переносят мембрану в сосуд с  тем  же
   раствором  и  инкубируют  2  часа при  температуре  65  -С,  слегка
   покачивая. Меняют буфер на свежий и еще раз инкубируют 30 мин.  при
   температуре  18  - 25 -С, периодически помешивая. Нельзя  допускать
   высыхания  мембраны  ни на одном этапе промывания.  После  промывки
   мембрану высушивают на воздухе при температуре 18 - 25 -С.
       Радиоавтография
       Сухую   мембрану  заворачивают  в  пленку  типа  "Saran   wrap"
   ("Амершам",  США) и помещают в кассету для рентгеновской  пленки  с
   усиливающим  экраном Э4-В3А. Туда же помещают рентгеновскую  пленку
   (ТУ  6-17-1245-83) типа РМ-В, кассету закрывают и  экспонируют  при
   температуре  -70  -С в течение 1 - 3 суток. Далее пленку  проявляют
   погружением  в раствор проявителя на 5 - 6 мин. (в темноте).  Затем
   пленку  промывают  холодной  водопроводной  водой  и  погружают   в
   раствор  фиксатора на 10 мин., после чего промывают холодной  водой
   и высушивают.
       Оценка результатов
       На   местах   нанесения  ряда  известных  разведений  очищенных
   клеточных  ДНК  и  на местах нанесения ДНК из образцов  исследуемых
   препаратов  (если  она в них присутствует) на рентгеновской  пленке
   появляются   темные  пятна.  Количество  примеси  ДНК  в   образцах
   препаратов  определяют визуально или при помощи денситометра  путем
   сравнения   интенсивности  потемнения  пятен  в   месте   нанесения
   исследуемых   проб   с  калибровочным  рядом  известных   количеств
   клеточных ДНК.
       В  соответствии с требованиями ВОЗ и национальными руководящими
   документами  количество примесей клеточных ДНК в биотехнологических
   препаратах  должно  быть  менее 100 пкг на  дозу.  Для  препаратов,
   предназначенных   для  многократного  введения  людям,   содержание
   примеси клеточных ДНК должно быть менее 10 пкг на дозу.
       Примечания. I. Приготовление растворов
       1. Буферный раствор трис-HCl концентрации 1 моль/л, pH 8,0.
       121,1     г    трис(гидроксиметил)аминометана    помещают     в
   градуированный    химический   стакан,    прибавляют    700,0    мл
   деионизованной  воды, перемешивают до полного растворения.  Доводят
   pH  до  8,0 раствором НСl концентрации 1 моль/л. Доводят  объем  до
   1000  мл  деионизованной водой и фильтруют через стеклянный  фильтр
   GF/B. Раствор хранят в течение месяца при 4 - 6 -С.
       2. Буферный раствор трис-HCl концентрации 1 моль/л, pH 7,2.
       121,1     г    трис(гидроксиметил)аминометана    помещают     в
   градуированный    химический   стакан,    прибавляют    700,0    мл
   деионизованной воды и перемешивают до полного растворения.  Доводят
   pH  до  7,2 раствором НСl концентрации 1 моль/л. Доводят  объем  до
   1000,0  мл деионизованной водой и фильтруют через стеклянный фильтр
   GF/B. Раствор хранят в течение месяца при 4 - 6 -С.
       3.  Раствор  динатриевой соли ЭДТА (трилон-Б) концентрации  0,5
   моль/л, pH 8,0.
       18,6   г   ЭДТА  динатриевой  соли  помещают  в  градуированный
   химический   стакан,   прибавляют  70,0  мл  деионизованной   воды,
   добавляют   45%-ный   раствор   гидроокиси   натрия   до    полного
   растворения. Доводят pH до 8,0 45%-ным раствором гидроокиси  натрия
   (NaOH).  Доводят объем до 100,0 мл деионизованной водой,  фильтруют
   через  стеклянный фильтр GF/B. Раствор хранят в течение месяца  при
   4 - 6 -С.
       4. Буферный раствор ТЕ.
       1,0  мл раствора трис-HCl концентрации 1 моль/л, pH 8,0, вносят
   в  градуированный  химический стакан, прибавляют 0,2  мл  буферного
   раствора  трилона-Б  концентрации 0,5 моль/л,  pH  8,0,  и  доводят
   деионизованной  водой до 100,0 мл. Раствор хранят в течение  месяца
   при 4 - 6 -С.
       5. 10%-ный раствор SDS.
       50,0   г   додецилсульфата  натрия  помещают  в  градуированный
   химический  стакан,  прибавляют  300,0  мл  деионизованной  воды  и
   перемешивают  до  полного растворения. Доводят объем  до  500,0  мл
   деионизованной водой. Раствор хранят при 18 - 25 -С.
       6. Раствор ацетата аммония концентрации 5 моль/л.
       38,5  г  ацетата  аммония помещают в градуированный  химический
   стакан,  прибавляют 70,0 мл деионизованной воды и  перемешивают  до
   полного  растворения.  Доводят объем  до  100,0  мл  деионизованной
   водой и фильтруют через стеклянный фильтр GF/B. Раствор хранят  при
   4 - 6 -С.
       7. Раствор водонасыщенного фенола.
       100,0  мл расплавленного фенола наливают в емкость и прибавляют
   100,0  мл  буферного раствора трис-HCl концентрации  1  моль/л,  pH
   8,0.  Содержимое емкости перемешивают стеклянной палочкой.  Раствор
   хранят при 4 - 6 -С в течение 1 - 2-х мес.
       8. Раствор РНК-азы 1.
       0,01 г РНК-азы 1 помещают в пробирку для микропроб и растворяют
   в 1,0 мл деионизованной воды. Раствор хранят при -20 -С.
       9. Раствор NaOH концентрации 5 моль/л.
       20,0  г  гидроокиси натрия помещают в градуированный химический
   стакан,  прибавляют 70,0 мл деионизованной воды и  перемешивают  до
   полного  растворения.  Доводят объем  до  100,0  мл  деионизованной
   водой. Раствор хранят при 18 - 25 -С.
       10. Раствор MgCl2 концентрации 1 моль/л.
       20,0 г магния хлористого шестиводного помещают в градуированный
   химический  стакан,  прибавляют  70,0  мл  деионизованной  воды   и
   перемешивают  до  полного растворения. Доводят объем  до  100,0  мл
   деионизованной  водой.  Плотность  раствора  ро  =  1,075.  Раствор
   фильтруют через стеклянный фильтр GF/B. Раствор хранят при  4  -  6
   -С в течение 1 - 2-х мес.
       11. Раствор ДНК-азы 1.
       0,001  г  ДНК-азы  1  помещают  в  пробирку  для  микропроб   и
   растворяют  в  0,1  мл  10%-ного раствора SDS,  прибавляют  0,4  мл
   деионизованной  воды  и  0,5  мл  глицерина.  Содержимое   пробирки
   перемешивают и хранят при -20 -С.
       12.  Раствор дезоксирибонуклеозидтрифосфатов концентрации 0,001
   моль/л.
       2,9  мг дезоксиаденозинтрифосфата, 3,1 тимидинтрифосфата и  3,0
   мг  дезоксигуанидинтрифосфата помещают в пробирку  и  растворяют  в
   5,0  мл деионизованной воды. Раствор разливают по 0,5 мл в пробирки
   для микропроб и хранят при -20 -С в течение шести месяцев.
       13. Буферный раствор для ник-трансляции.
       1,5  мг  бычьего  сывороточного  альбумина  (БСА)  помещают   в
   пробирку,  прибавляют  5,0  мл  раствора  трис-HCl  концентрации  1
   моль/л,  pH  7,2,  1,0 мл раствора MgCl2 концентрации  1  моль/л  и
   доводят  раствор  до 10 мл деионизованной водой. Раствор  хранят  в
   течение 6-ти месяцев при -20 -С.
       14. Приготовление сефадекса G-25.
       В  химический  стакан наливают 80,0 мл раствора ТЕ  и  медленно
   прибавляют 5,0 г сефадекса G-25. Оставляют на ночь при 18 - 25  -С.
   Хранят суспензию при 4-С.
       15.  20х раствор SSC (лимоннокислый натрий с натрием хлористым)
   концентрации 3 моль/л.
       173,0  г  натрия  хлористого  и 88,2  г  лимоннокислого  натрия
   помещают  в градуированный химический стакан, прибавляют  700,0  мл
   деионизованной воды и перемешивают до полного растворения.  Доводят
   объем  до  1000,0 мл деионизованной водой. Раствор фильтруют  через
   стеклянный фильтр GF/B. Хранят раствор при 18 - 25 -С в течение  2-
   х месяцев.
       16.  5х  раствор SSC (лимоннокислый натрий с натрием хлористым)
   концентрации 0,6 моль/л.
       5,0  мл  20х  раствора  SSC вносят в градуированный  химический
   стакан  и  доводят объем до 20,0 мл деионизованной  водой.  Раствор
   хранят при 18 - 25 -С в течение недели.
       17. Нейтрализующий раствор.
       0,87   г   хлорида  натрия  помещают  в  градуированную  мерную
   пробирку,  прибавляют  5,0  мл  раствора  трис-HCl  концентрации  1
   моль/л,  pH  8,0,  и  прибавляют  0,42  мл  концентрированной  НСl.
   Доводят  объем  до  10  мл  деионизованной водой,  фильтруют  через

Новости партнеров
Счетчики
 
Популярное в сети
Реклама
Разное